CN117512221A - 白斑综合征病毒和十足目虹彩病毒1的双重实时荧光pcr检测引物、探针、试剂盒和方法 - Google Patents

白斑综合征病毒和十足目虹彩病毒1的双重实时荧光pcr检测引物、探针、试剂盒和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了白斑综合征病毒和十足目虹彩病毒1的双重实时荧光PCR检测引物、探针、试剂盒和方法。本发明通过设计WSSV和DIV1的最佳引物和探针浓度组合，优化反应条件，成功建立双重实时荧光定量PCR方法。该方法大大缩短了检测时间，全程约需1.5h，具有良好的特异性，不与IHHNV、HPV、BP、MBV、EHP和SVCV等其它常见水生动物疫病病毒发生交叉反应；具有极高的敏感性，检测限为5copies/μL；具有良好的重复性，WSSV和DIV1批内和批间重复性试显示其变异系数均小于3％。本方法在具有极高的灵敏度的基础上，能同时检测两种虾类重要疫病，能显著节约检测时间和成本，提高检测效率和质量。

Description

白斑综合征病毒和十足目虹彩病毒1的双重实时荧光PCR检测 引物、探针、试剂盒和方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及白斑综合征病毒和十足目虹彩病毒1的双重实时荧光PCR检测引物、探针、试剂盒和方法。
背景技术
白斑综合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)、十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1，DIV1)是当前严重危害甲壳类水生动物养殖业的两种常见、重要的病毒，分别可引发易感动物的白斑综合征、十足目虹彩病毒病。根据农业农村部第573号公告公布的《一、二、三类动物疫病病种名录》，甲壳类动物的二类病共3种，其中两种就是白斑综合征和十足目虹彩病毒病；在《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》中，两者同被列为“二类传染病”。
WSSV是全球对虾养殖业所面临的危害性最大的病害之一，主要引起对虾甲壳内侧白斑病变，自20世纪90年代初发生以来，至今已席卷了世界各国的对虾养殖地区，死亡率高达100％，造成了巨大的经济损失，同时也给海洋生态平衡带来了一定的威胁。WSSV的宿主范围广泛，除对虾外，其他水生甲壳动物如蟹类、螯虾和龙虾等均可感染，宿主种类数量多达40余种。由于危害巨大，白斑综合征一度被列为一类动物疫病进行管理。虾虹彩病毒的报道始现于上世纪90年代；2014年浙江省凡纳滨对虾爆发了一种致死率较高的病毒病，其病原为一种新的虹彩病毒并命名为虾血细胞虹彩病毒(Shrimp hemocyte iridovirus,SHIV)；2019年3月国际病毒分类学会(ICTV)将DIV1和2016年发现的红螯光壳螯虾虹彩病毒(Cherax quadricarinatus iridovirus，CQIV)均归类为虹彩病毒科的一个新属——十足目虹彩病毒属(Decapodiridovirus)，且DIV1和CQIV被认为是同种不同株，统一命名为十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1，DIV1)。DIV1患病对虾生长缓慢，参差不齐，甚至生长停滞，偶尔伴有白便，在应激条件下才出现大量死亡，养殖投入高但收获甚微。近年来随着对虾种苗和水产品国际贸易交流增多，对虾养殖中WSSV和DIV1常有发生甚至混合感染，不但给它们之间的鉴别诊断和有效防治增加困难，也给对虾养殖业造成了严重的经济损失。
目前，虾类病害诊断手段主要包括病理学和生物学方法、免疫诊断法分子杂交、电镜观察及PCR技术。目前常用的(套式)PCR技术，灵敏性较高，多为一次检测一种病原，但是其耗时较长，需要进行琼脂糖凝胶电泳，容易对操作人员和环境造成危害。实时荧光PCR具有操作简便、结果直观、敏感性高、特异性强、重复性好等优点，大大提高了操作简便性和检测结果的敏感性和准确性，更利于对病原的早期诊断，便于及时采取有效的防治措施，已成为动物病原检测的重要方法。由于白斑综合征和十足目虹彩病毒病均为《国家水生动物疫病监测计划中》和省级水生动物疫病监测计划中的虾类的重要监测疫病，且均为海关《国门生物安全监测方案》中出境虾类的主要监测疫病，因此对这两种疫病的检测、监测需求非常巨大，而目前国内外都未见应用双重实时荧光PCR方法同时检测对虾WSSV和DIV1的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性好、灵敏度高、稳定性强，能同时快速检测WSSV和DIV1的双重实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒，从而提高对这两种虾类重要疫病的检测准确性和监测效率、缩短检测周期。
为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
一种白斑综合征病毒和十足目虹彩病毒1的双重实时荧光PCR检测引物探针组，包括：
用于检测白斑综合征病毒的引物：
WSSV-F：5’-TGAACCATCAAGACTCGCCC-3’(SEQ ID NO.1)；
WSSV-R：5’-TTTCCATCGGTTGCCTGGAA-3’(SEQ ID NO.2)；
用于检测白斑综合征病毒的探针：
WSSF-P：5’-CGTGTGCACCGCCGACGCCAAGGG-3’(SEQ ID NO.3)；
用于检测十足目虹彩病毒1的引物：
DIV1-F：5’-CGGGTAAAAAGGCAAACATGG-3’(SEQ ID NO.4)；
DIV1-R：5’-CGAATCGTTTCCCGTGAGAC-3’(SEQ ID NO.5)；
用于检测十足目虹彩病毒1的探针：
DIV1-P：5’-GCTGCAAGTCCCGAATTGGCCAGGGCG-3’(SEQ ID NO.6)；
探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
优选的，所述荧光报告基团为FAM或HEX，所述荧光淬灭基团为TAMRA或BHQ。
优选的，所述白斑综合征病毒检测探针的5’端连接FAM荧光基团，3’端连接TAMRA猝灭基团；所述十足目虹彩病毒1检测探针的5’端连接HEX荧光基团，3’端连接BHQ猝灭基团。
本发明还提供了一种白斑综合征病毒和十足目虹彩病毒1的双重实时荧光PCR检测试剂盒，其包含上述的检测引物探针组。
优选的，所述试剂盒还包含Pro Taq HS Premix、阳性标准品和阴性标准品。
优选的，所述阴性标准品为DEPC水；
优选的，所述阳性标准品为含有白斑综合征病毒基因片段和含有十足目虹彩病毒1基因片段的质粒的混合物。
本发明还提供了一种非疾病诊断和治疗目的的白斑综合征病毒和十足目虹彩病毒1的双重实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤：
(1)提取样品中的病毒DNA作为模板；
(2)使用权利要求1所述的检测引物探针组进行实时荧光定量PCR扩增；
(3)根据荧光PCR扩增曲线和Ct值情况判断样品中的病毒类型。
优选的，步骤(2)的荧光定量PCR扩增反应体系为：2×Pro Taq HS Probe Premix10μL，WSSV-F/WSSV-R的终浓度为0.2μmoL/L，WSSV-P的终浓度为0.1μmol/L，DIV1-F/DIV1-R的终浓度为0.4μmoL/L，DIV1-P的终浓度为0.2μmoL/L，模板DNA为2μL，无RNase的ddH2O补足20μL。
优选的，步骤(2)的荧光定量PCR扩增反应程序为95℃预变性2min；95℃变性15s，56℃退火30s，40个循环，于56℃收集荧光信号。
优选的，步骤(3)的判断标准为：若出现S型扩增曲线，且在FAM通道下有Ct≤35的读数，则待测样本中含有白斑综合征病毒；若出现S型扩增曲线，且在HEX通道下有Ct≤35的读数，则待测样本中含有十足目虹彩病毒1；若同时在不同通道出现S型扩增曲线，且得到Ct≤35的读数，则待测样本中同时含有白斑综合征病毒和十足目虹彩病毒1。
本发明根据公布的WSSV和DIV1相关基因序列，应用引物设计软件分别设计筛选1对特异性引物和1条Taqman探针。筛选出了WSSV和DIV1的最佳引物和探针浓度组合，优化反应条件，成功建立双重实时荧光定量PCR方法。该方法大大缩短了检测时间，全程约需1.5h，与单重荧光定量PCR方法分别检测两种病毒相比，减少1.5h，与套式PCR方法相比则减少约4h；具有良好的特异性，不与IHHNV、HPV、BP、MBV、EHP和SVCV等其它常见水生动物疫病病毒发生交叉反应；具有极高的敏感性，可检测到5copies/μL的WSSV或DIV1，其中对WSSV的检测敏感度比世界动物卫生组织《水生动物疫病诊断手册》推荐的套式PCR方法(检测灵敏度104copies/μL)或国标GB/T28630.2-2012规定的套式PCR方法(检测灵敏度103copies/μL)分别敏感2000倍和200倍，且比单重荧光PCR方法的敏感度(10copies/μL)高1倍；本方法对DIV1的检测灵敏度高于重组酶检测方法(7copies/μL)和行业标准SC/T7237-2020推荐的巢式PCR方法(70copies/μL)，且高于LAMP检测方法(254copies/μL)。可见本方法在具有极高的灵敏度的基础上，能同时检测两种虾类重要疫病，能显著节约检测时间和成本，提高检测效率和质量。
试验结果表明本方法具有良好的重复性，WSSV和DIV1批内和批间重复性试显示其变异系数均小于3％；当发生混合感染时，在同一样品中两种病原的含量可能相差较大，因此本研究通过干扰性试验，探讨当两种病原模板浓度相差较大时，高浓度模板对低浓度模板是否存在干扰现象。结果表明，当两种模板浓度相差很大时，该方法依然能够检出低浓度模板，且与单重实时荧光定量PCR扩增所获得的Ct值的变异系数小于3％。对分析WSSV和DIV1载量和开展病原防控研究具有重要意义。由于荧光PCR扩增产物不需电泳，有效避免普通PCR方法可能产生的气溶胶污染风险。大大提高了WSSV和DIV1检测效率，可满足高通量检测。临床样品检测结果表明，本发明建立的双重实时荧光定量PCR法检测结果与实验室常规方法检测结果一致，已知感染或混合感染的样品均与预期一致。
综上，本发明通过特异的荧光探针和引物的设计和筛选、反应体系的优化、阳性标准品的制备和标准曲线的建立，以及特异性试验、灵敏度试验、重复性和干扰性的验证。我们建立的用于WSSV和对DIV1检测的实时荧光定量方法是成功可行的。为今后的亲虾筛选、虾苗培育、流行病学调查及防治效果评价等研究提供新的技术平台，对我国的对虾养殖事业的健康发展有着一定的现实意义。同时，该技术可同时检测两种以上的模板，提高了效率，尤其适合检验检疫部门必须同时检测多种病原的需求。
附图说明
图1是反应体系的优化结果。A：WSSV引物浓度为0.2μmoL/L、探针浓度为0.1μmol/L；DIV1引物浓度为0.4μmoL/L、探针浓度为0.2μmoL/L。B：WSSV引物浓度为0.2μmoL/L、探针浓度为0.1μmol/L；DIV1引物浓度为0.6μmoL/L、探针浓度为0.3μmoL/L。C：WSSV引物浓度为0.4μmoL/L、探针浓度为0.2μmol/L；DIV1引物浓度为0.4μmoL/L、探针浓度为0.2μmoL/L。
图2是WSSV和DIV1双重实时荧光PCR检测方法的特异性试验结果。
图3是WSSV和DIV1的敏感性试验结果。A：从左至右扩增曲线代表的WSSV模板拷贝数依次为0.5×108、0.5×107、0.5×106、0.5×105、0.5×104、0.5×103、0.5×102、0.5×10copies/μL。B：从左至右扩增曲线代表的DIV1模板拷贝数浓度依次为0.5×108、0.5×107、0.5×106、0.5×105、0.5×104、0.5×103、0.5×102、0.5×10copies/μL。
图4是WSSV和DIV1的定量标准曲线。A：WSSV的定量标准曲线。B：DIV1的定量标准曲线。
图5是WSSV和DIV1双重实时荧光PCR的重复性试验结果。A：第1天。B：第7天。C：第14天。
图6是WSSV和DIV1双重实时荧光PCR的干扰性试验结果。A：WSSV和DIV1的浓度分别为102和105copies/μL。B：WSSV和DIV1的浓度分别为105和102copies/μL。
图7是24份临床样品的WSSV和DIV1双重实时荧光定量PCR检测结果。
图8是24份样品WSSV单重荧光定量PCR检测结果(WOAH《水生动物疫病诊断手册》)。
图9是24份样品DIV1套式PCR扩增结果(SC/T 7237-2020)。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实验材料：白斑综合征病毒(WSSV)、十足目虹彩病毒1(DIV1)、传染性皮下及造血组织坏死病病毒(IHHNV)、肝胰腺细小病毒(HPV)、对虾杆状病毒(BP)、斑节对虾杆状病毒(MBV)、虾肝肠胞虫(EHP)和鲤春病毒血症病毒(SVCV)阳性样品，均由本实验室保存，经PCR检测并测序后确认为阳性的样品。白斑综合征病毒(WSSV)和十足目虹彩病毒1(DIV1)质粒标准品由北京六合华大基因科技有限公司合成。
主要试剂与仪器：
病毒DNA/RNA提取试剂盒(4.0)：天隆科技有限公司。
荧光PCR反应体系2×Pro Taq HS Probe Premix：艾科瑞公司。
ABI V7荧光定量PCR仪：Life Technologies公司。
天隆NP968核酸自动提取仪：西安天隆科技公司。
组织匀浆器：上海净信公司。
ND-1000紫外可见分光光度计：美国Nano Drop。
实施例1：双重实时荧光定量PCR方法的建立
1、引物与Taqman探针的设计与合成
根据Genbank中公布的WSSV全基因组序列(GenBank登录号：MN840357.1)和DIV1ATPase基因序列(GenBank登录号：KY681040.1)，在其保守序列区间应用PrimerPremier6.0和Oligo7设计软件设计特异性引物和荧光探针(表1)，送北京六合华大基因科技有限公司合成。
表1.引物和TaqMan探针序列
2、总核酸的提取及模板的制备
(1)组织样品的处理：先在2mL匀浆管中加入约3粒钢珠，大钢珠1粒(直径4.5mm)，小钢珠2粒(直径2.5mm)；取发病虾组织(肝胰腺、腮、肠道、肌肉等)约100mg病料至管中，加入500μL PBS；将匀浆管置于组织匀浆器中匀浆1min，-40℃冻存至少30min，再放回常温溶解，反复冻融2～3次，每次冻融均置于组织匀浆器匀浆1次；10000×g离心5min，取约200μL上清液于1.5mL离心管中，编号备用。
(2)核酸提取：
可采用CTAB方法提取样品DNA。取步骤(1)的上清液200μL用于提取DNA。加入600μLCTAB提取缓冲液，置于恒温混匀仪中，65℃，650r/min，温育1h；13000g离心10min。转移上清液至2mL离心管中；加入0.7倍体积的二氯甲烷，剧烈震荡混匀，室温13000g离心10min。加入等体积CTAB沉淀液混匀，13000g离心10min。弃上清，加入350μL 1.2mol/L NaCl溶液，充分溶解沉淀。加入0.8倍体积的异丙醇混匀，-20℃放置0.5h，4℃，13000g离心15min。弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀一次，4℃，13000g离心10min。弃上清，室温下晾干。加入100μL无离子水，溶解沉淀，该溶液为DNA溶液，用于做PCR实验模板。
使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A260和A280。DNA的浓度按照式(1)计算：
c ＝ A× N × 50/1000 (1)
公式中：c为DNA浓度，单位为μg/μL；A为260nm处的吸光值；N为核酸稀释倍数。当A260/A280比值在1.7～2.0之间时，适宜于PCR扩增。
也可以依据天隆病毒DNA/RNA提取试剂盒提取核酸，置于-20℃保存备检。
3、双重实时荧光定量PCR反应条件及引物浓度优化
以提取的WSSV和DIV1的核酸DNA为模板，反应体系如下：艾科瑞2×Pro Taq HSProbe Premix 10μL，将上下游引物和探针稀释至终浓度为0.1～0.6μmol/L，模板DNA为2μL，无RNase的ddH2O补足20μL。实时荧光定量PCR扩增程序：95℃预变性2min；95℃变性15s，52℃～62℃退火30s，40个循环，按照不同引物浓度配比、不同的退火温度进行实时荧光定量PCR反应条件优化，其中引物/探针浓度组合分别为：(1)WSSV：0.2μmoL/L、0.1μmol/L，DIV1：0.4μmoL/L、0.2μmol/L；(2)WSSV：0.2μmoL/L、0.1μmol/L，DIV1：0.6μmoL/L、0.3μmol/L；(3)WSSV：0.4μmoL/L、0.2μmol/L，DIV1：0.4μmoL/L、0.2μmol/L。根据荧光PCR扩增曲线和Ct值情况筛选出最佳反应体系和反应程序。
通过对WSSV和DIV1双重实时荧光定量PCR的条件优化，试验结果表明，WSSV-F/WSSV-R的终浓度为0.2μmoL/L，探针终浓度为0.1μmol/L，DIV1-F/DIV1-R的终浓度为0.4μmoL/L，探针终浓度为0.2μmoL/L，退火温度为56℃时，对同一标准品的检测信号值最强，Ct值最小，该引物/探针体系为最佳组合(图1)。建立反应体系及程序：反应体系2×Pro TaqHS Probe Premix 10μL，WSSV-F/WSSV-R的终浓度为0.2μmoL/L，探针终浓度为0.1μmol/L，DIV1-F/DIV1-R的终浓度为0.4μmoL/L，探针终浓度为0.2μmoL/L，模板DNA为2μL，无RNase的ddH2O补足20μL。实时荧光定量PCR扩增程序：95℃预变性2min；95℃变性15s，56℃退火30s(收集荧光)，40个循环。
实施例2：特异性试验
采用实施例1建立的方法，对WSSV、DIV1、IHHNV、HPV、BP、MBV、EHP和SVCV等病毒提取的DNA/RNA作为模板进行特异性验证。按照优化好的反应条件进行WSSV和DIV1双重实时荧光PCR扩增，每个样品孔同时收集FAM和HEX两种荧光信号，确定该方法的引物与探针在WSSV和DIV1之间的特异性。
采用建立的方法，对WSSV、DIV1、IHHNV、HPV、BP、MBV、EHP和SVCV等病毒提取的核酸作为模板进行PCR扩增时，仅有WSSV或DIV1的DNA模板得到相应的特异性荧光曲线，而IHHNV、HPV、BP、MBV、EHP和SVCV等DNA病毒阳性样品和阴性对照以及空白对照均不能产生扩增曲线，呈现阴性结果，见图2，表明本研究建立的双重实时荧光定量PCR法具有良好的特异性。
实施例3：敏感性试验与标准曲线的建立
1、标准品的制备
根据设计的引物序列，委托北京六合华大基因科技有限公司合成WSSV基因序列(195bp)和DIV1基因序列(143bp)，分别克隆至pMD18-T载体中，转化到DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆重组质粒，分别命名为pMD-WSSV和pMD-DIV1。对阳性质粒进行浓度测定，根据质粒浓度计算其拷贝数，对其进行10倍梯度稀释，获得1×108copies/μL～1×100copies/μL浓度的系列模板，于-20℃保存备用。
2、将测定好DNA浓度的WSSV和DIV1质粒进行10倍梯度稀释，将相同稀释倍数(1×108copies/μL～1×100copies/μL)的质粒等体积混合作为模板，按照已优化好的双重实时荧光定量PCR反应条件进行扩增，建立标准曲线。
以10倍梯度稀释(1×108copies/μL～1×100copies/μL)的WSSV和DIV1质粒等体积混合液(各自终浓度为0.5×108copies/μL～0.5×100copies/μL)作为模板，按照优化好的最佳反应体系：WSSV-F/WSSV-R的终浓度为0.2μmoL/L，探针终浓度为0.1μmol/L，DIV1-F/DIV1-R的终浓度为0.4μmoL/L，探针终浓度为0.2μmoL/L，模板2μL，无RNase的ddH2O补足20μL。通过设置如下反应程序：95℃预变性2min；95℃变性15s，56℃退火30s(收集荧光)，40个循环，进行双重荧光定量PCR扩增。结果表明，WSSV和DIV1的终浓度在0.5×108copies/μL～0.5×101copies/μL之间均有特异性扩增曲线及Ct值，终浓度为0.5×100copies/μL时未见特异性扩增曲线(图3)，即该方法能检测到的目标病毒粒子最低浓度为0.5×101copies/μL。以WSSV质粒拷贝数的lg值为横坐标，Ct值为纵坐标建立标准曲线，回归方程为：y＝-3.373x+36.754，R2＝0.998；以DIV1质粒拷贝数的lg值为横坐标，Ct值为纵坐标建立标准曲线，回归方程为：y＝-3.476x+38.178，R2＝0.990(图4)。
实施例4：重复性试验
将终浓度为1×106copies/μL的WSSV和DIV1质粒等体积混合液作为模板，分为5个样本同时检测。在第7d、第14d重复检测保存于-20℃的模板，通过计算Ct值的标准差(SD)和变异系数(CV)验证方法的批内重复性和批间重复性。
以提取DNA(106copies/μL质粒混合液)作为模板，于第1d、7d、14d进行批内、批间重复性试验，试验结果见图5。结果表明，第1d的5个平行样品均获得目标扩增曲线，WSSV的SD为0.55，CV为0.95％；DIV1的SD为0.113，CV为1.73％；第1d、7d、14d批间重复性试验，3批间重复性试验WSSV的SD为0.55，CV为0.95％；DIV1的SD为0.084，CV为1.29％(分别见表2和表3)。结果表明，本研究建立的双重实时荧光定量PCR法具有良好的重复性。
表2.WSSV、DIV1批内重复性试验
表3.WSSV、DIV1批间重复性试验
实施例5：干扰性试验
将质粒粒WSSV和DIV1按不同浓度进行组合(105copies/μL和102copies/μL；102copies/μL和105copies/μL)，分别进行单重和双重荧光定量PCR检测，确定当模板浓度相差较大时WSSV和DIV1之间的检测是否存在干扰现象。
将质粒WSSV和DIV1按不同浓度进行组合(102copies/μL和105copies/μL)进行荧光定量PCR检测，发现当两种模板浓度相差很大时(1000倍)，该方法依然能够检出低浓度模板，且低浓度模板荧光定量PCR双重与单重荧光定量PCR扩增所获得的Ct值的变异系数均小于3％(见表4、图6)。
表4.WSSV、DIV1低浓度模板干扰性试验
实施例6：临床样品检测应用
选取已知的WSSV和DIV1阳性、阴性的样品共24份样品，采用本研究建立的双重实时荧光定量PCR方法进行临床检测，并将结果与相关标准推荐的单重检测方法进行比较，评价该方法的可靠性。
采用研究建立的WSSV和DIV1双重实时荧光定量PCR法，对实验室保藏的24份临床样品进行检测，同步采用世界动物卫生组织(WOAH)《水生动物疫病诊断手册》(2021年版)第2.2.8章推荐的WSSV实时荧光PCR法和行业标准SC/T 7237-2020《虾虹彩病毒病诊断规程》规定的DIV1套式PCR方法对相关样品进行检测，比较检测结果。检测结果见图7～图9。经双重实时荧光定量PCR扩增，24份样品中有11份样品在FAM荧光通道有特异的荧光曲线和Ct值，有12份样品在HEX荧光通道有特异性的荧光曲线和Ct值，其中有2份样品在FAM荧光通道和HEX荧光通道均有特异的荧光曲线和Ct值，为WSSV和DIV1混合感染样品；3份样品FAM荧光通道和HEX荧光通道均无特异的荧光曲线和Ct值，为WSSV和DIV1阴性样品。24份样品的WSSV和DIV1双重荧光PCR检测结果与相关标准方法的检测结果完全一致(见表5)。
表5临床样品检测结果
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.白斑综合征病毒和十足目虹彩病毒1的双重实时荧光PCR检测引物探针组，其特征在于，所述检测引物探针组包括：
用于检测白斑综合征病毒的引物：
WSSV-F：5’-TGAACCATCAAGACTCGCCC-3’；
WSSV-R：5’-TTTCCATCGGTTGCCTGGAA-3’；
用于检测白斑综合征病毒的探针：
WSSF-P：5’-CGTGTGCACCGCCGACGCCAAGGG-3’；
用于检测十足目虹彩病毒1的引物：
DIV1-F：5’-CGGGTAAAAAGGCAAACATGG-3’；
DIV1-R：5’-CGAATCGTTTCCCGTGAGAC-3’；
用于检测十足目虹彩病毒1的探针：
DIV1-P：5’-GCTGCAAGTCCCGAATTGGCCAGGGCG-3’；
探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的检测引物探针组，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM或HEX，所述荧光淬灭基团为TAMRA或BHQ。
3.根据权利要求1或2所述的检测引物探针组，其特征在于，所述白斑综合征病毒检测探针的5’端连接FAM荧光基团，3’端连接TAMRA猝灭基团；所述十足目虹彩病毒1检测探针的5’端连接HEX荧光基团，3’端连接BHQ猝灭基团。
4.一种白斑综合征病毒和十足目虹彩病毒1的双重实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的检测引物探针组。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包含Pro Taq HS Premix、阳性标准品和阴性标准品。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性标准品为DEPC水；所述阳性标准品为含有白斑综合征病毒基因片段和含有十足目虹彩病毒1基因片段的质粒的混合物。
7.一种非疾病诊断和治疗目的的白斑综合征病毒和十足目虹彩病毒1的双重实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取样品中的病毒DNA作为模板；
(2)使用权利要求1所述的检测引物探针组进行实时荧光定量PCR扩增；
(3)根据荧光PCR扩增曲线和Ct值情况判断样品中的病毒类型。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)的荧光定量PCR扩增反应体系为：2×Pro Taq HS Probe Premix 10μL，WSSV-F/WSSV-R的终浓度为0.2μmoL/L，WSSV-P的终浓度为0.1μmol/L，DIV1-F/DIV1-R的终浓度为0.4μmoL/L，DIV1-P的终浓度为0.2μmoL/L，模板DNA为2μL，无RNase的ddH2O补足20μL。
9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)的荧光定量PCR扩增反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性15s，56℃退火30s，40个循环，于56℃收集荧光信号。
10.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)的判断标准为：若出现S型扩增曲线，且在FAM通道下有Ct≤35的读数，则待测样本中含有白斑综合征病毒；若出现S型扩增曲线，且在HEX通道下有Ct≤35的读数，则待测样本中含有十足目虹彩病毒1；若同时在不同通道出现S型扩增曲线，且得到Ct≤35的读数，则待测样本中同时含有白斑综合征病毒和十足目虹彩病毒1。
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