CN116064940A - 不同基因型鹅星状病毒多重荧光pcr检测引物探针组、试剂盒及应用 - Google Patents

不同基因型鹅星状病毒多重荧光pcr检测引物探针组、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了不同基因型鹅星状病毒多重荧光PCR检测引物探针组、试剂盒及应用，涉及分子生物学领域；该引物探针组包括检测1型鹅星状病毒(GoAstV‑1)和2型鹅星状病毒(GoAstV‑2)的引物对和探针；检测GoAstV‑1的引物对如SEQIDNO.1‑2所示，探针如SEQIDNO.3所示；检测GoAstV‑2的引物对如SEQIDNO.4‑5所示，探针如SEQIDNO.6所示。采用本发明的引物探针组可以实现不同基因型鹅星状病毒多重荧光PCR检测，其检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性，为GoAstV的临床诊断、病毒载量的测定和流行病学调查提供了技术支持。

Description

不同基因型鹅星状病毒多重荧光PCR检测引物探针组、试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及不同基因型鹅星状病毒多重荧光PCR检测引物探针组、试剂盒及应用。
背景技术
鹅星状病毒病是由鹅星状病毒(Goose astrovirus，GoAstV)感染引起的以多品种鹅关节和内脏痛风为主要特征的致死性传染病。发病鹅群感染率和死亡率最高分别可达80％和50％，给养鹅业造成了巨大的经济损失。GoAstV主要感染3周龄以内的雏鹅，造成心脏、肝脏、肾脏表面和关节腔大量尿酸盐沉积。此外，GoAstV也可感染鸡、鸭等其他家禽，表明GoAstV存在跨物种传播的可能，给该病的防控带来了新挑战。
GoAstV属于星状病毒科星状病毒属，为无囊膜单股正链RNA病毒。根据星状病毒感染的宿主不同将其分为两个属，哺乳动物星状病毒属(Mamastrovirus，MAstV)和禽星状病毒属(Avastrovirus，AAstV)。目前，国际病毒分类委员会第九次报告将禽星状病毒属分为3个群，分别为禽星状病毒1群(AAstV-1)、禽星状病毒2群(AAstV-2)和禽星状病毒3群(AAstV-3)。GoAstV属于禽星状病毒1群，是一种新发的星状病毒。首个GoAstV全基因组序列于2017年由张大丙报道，命名FLX。此后，多株GoAstV全基因组序列被陆续报道，如GD、SDPY、HN1G、SD01、GsFJ02等。遗传进化分析表明，所有已知的GoAstVs序列均属于2个不同的系统进化分支，根据遗传演化关系将GoAstV分为2个型，FLX类毒株命名为GoAstV-1，SD01类毒株命名为GoAstV-2，又称之为新型GoAstV。由于GoAstV-1毒株缺乏适合增殖的细胞培养系统，GoAstV-1毒株分离培养困难，其致病性也很难得到验证。第一株鹅源星状病毒毒株(SD-01)于2018年由张清水等人分离获得，随后多株GoAstV-2毒株被成功分离，如SDPY、GD、CXZ18等。
GoAstV的实验室诊断方法主要有病毒分离鉴定、电镜观察和分子生物学方法，病毒的分离鉴定是GoAstV的传统检测方法，该方法主要通过接种鹅胚或鸡肝癌细胞，一般需要传至3代左右才可出现鹅胚死亡或出现明显病变，比较耗费时间。电镜观察法是星状病毒早期的检测方法之一，然而Yuan等使用鹅肝脏超薄切片进行观察，却无法观察到星状病毒特有的形态，因此该方法存在一定的缺陷。GoAstV的分子生物学检测方法主要有RT-PCR、荧光定量RT-PCR、RT-LAMP等，RT-PCR方法可直接检测鹅病变组织中的GoAstV，且敏感性高、特异性好。针对GoAstV-1诊断主要集中于多克隆抗体的制备，刘莉等利用原核表达系统表达GoAstV-1结构蛋白ORF2，并制备其多克隆抗体，但是关于GoAstV-1的分子生物学诊断技术研究报道较少。目前针对GoAstV的诊断研究主要集中在GoAstV-2，余明兴等根据ORF2基因序列设计并筛选出特异性扩增引物，通过优化扩增条件，建立检测GoAstV-2的RT-PCR方法，该方法特异性强，检测灵敏度为62fg/μL，张玉霞等根据GoAstV ORF1b基因的保守序列设计了一组特异性的LAMP引物，建立GoAstV-2的LAMP快速检测方法，该方法特异性强，灵敏度为1ng/μL。RT-PCR和RT-LAMP不能对其定量检测，因此建立快速、敏感、特异的荧光定量分子诊断方法是有效预防和控制该病的主要措施之一。目前有研究者建立了SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法，Yuan等建立了GoAstV-2实时荧光定量PCR方法，但相比于该方法，TaqMan探针荧光定量在对目的基因进行绝对定量方面优势明显，苏世博等建立了GoAstV-2TaqMan荧光定量PCR检测方法，该方法特异性强，检测限为1.5×102copies/μL。
目前尚无针对该病的治疗措施及疫苗，防治重点在于疫情的检测和控制。因此建立一种快速、准确和省时的检测方法对疫情的防控尤为重要。TaqMan荧光定量PCR具有特异性强、敏感性高等优点，且在对目的基因进行绝对定量方面优势明显，已被广泛用于动物疾病的临床诊断和病毒载量的测定研究。根据流行病学调查结果显示，1型鹅星状病毒和2型鹅星状病毒的混合感染严重，因此，本发明旨在建立一种不同基因型GoAstV TaqMan的实时荧光定量PCR方法，为GoAstV的临床诊断、病毒载量的测定和流行病学调查提供技术支持。多重荧光PCR一次反应可以同时对2种以上的病原体进行定性和定量检测，但其实现难度较大，主要体现在以下几个方面：(1)需要对不同病毒设计各自保守的引物与探针；(2)多重PCR的各个引物之间不能相互干扰和各个探针之间无相互干扰；(3)qPCR扩增效率和检测灵敏度等技术参数不因多重PCR而影响太大。
发明内容
本发明的目的是提供不同基因型鹅星状病毒多重荧光PCR检测引物探针组、试剂盒及应用，以解决上述现有技术存在的问题，采用本发明的引物探针组可以实现不同基因型鹅星状病毒多重荧光PCR检测，其检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种不同基因型鹅星状病毒多重荧光PCR检测的引物探针组，包括检测GoAstV-1和GoAstV-2的引物对和探针；检测GoAstV-1的引物对如SEQ ID NO.1-2所示，探针如SEQ ID NO.3所示；检测GoAstV-2的引物对如SEQ ID NO.4-5所示，探针如SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供上述的引物探针组在制备不同基因型鹅星状病毒多重荧光PCR检测试剂盒中的应用。
本发明还提供一种不同基因型鹅星状病毒多重荧光PCR检测试剂盒，包括上述的引物探针组。
进一步地，所述试剂盒还包括GoAstV-1和GoAstV-2的标准质粒，其中GoAstV-1的标准质粒含有如SEQ ID NO.7所示序列；GoAstV-2的标准质粒含有如SEQ ID NO.8所示序列。
进一步地，所述试剂盒的多重荧光PCR的反应体系为：10pmol/μL GoAstV-1上游引物0.4μL，10pmol/μL GoAstV-1下游引物0.4μL，10pmol/μL GoAstV-1探针0.2μL，10pmol/μLGoAstV-2上游引物0.4μL，10pmol/μL GoAstV-2下游引物0.4μL，10pmol/μLGoAstV-2探针0.2μL，Template 2μL，2×AceQ qPCR Probe Master Mix 10μL，50×ROXReference Dye20.4μL，50mmol/LMgCl21μL，ddH2O补足至20μL。
进一步地，所述试剂盒的多重荧光PCR的反应程序为：95℃5min；95℃10sec，60℃30sec，40个循环。
本发明公开了以下技术效果：
本发明提供了不同基因型鹅星状病毒多重荧光PCR检测引物探针组，采用本发明的引物探针组可以实现不同基因型GoAstV TaqMan的实时荧光定量PCR检测，该检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性，为GoAstV的临床诊断、病毒载量的测定和流行病学调查提供了技术支持。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为GoAstV-1扩增曲线(引物和探针为SEQ ID NO.1-3所示)；其中，1-9表示101-109DNA拷贝数/μL标准质粒；
图2为GoAstV-1标准曲线；
图3为GoAstV-2扩增曲线(引物和探针为SEQ ID NO.4-6所示)；其中，1-9表示101-109DNA拷贝数/μL标准质粒；
图4为GoAstV-2标准曲线；
图5为GoAstV-1和GoAstV-2的标准曲线合并绘制图；
图6为利用SEQ ID NO.9-14所示引物和探针得到的扩增曲线，其中，A为GoAstV-1；B为GoAstV-2；
图7为多重荧光PCR的特异性试验；其中，1：GoAstV-1；2：GoAstV-2；3：鹅细小病毒(GPV)；4：鹅副黏病毒(NDV)；5：禽呼肠孤病毒(ARV)；6：阴性对照；
图8为多重荧光PCR的敏感性试验；其中，1-9表示108-100DNA拷贝数/μL标准质粒；10表示阴性对照；A为GoAstV-1；B为GoAstV-2；
图9为重复性试验结果；其中，A为GoAstV-1；B为GoAstV-2；
图10为临床样本中GoAstV-1和GoAstV-2的检测；
图11为2型GoAstV细胞毒CT值检测。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
1.引物设计方法
通过对NCBI核酸数据库进行检索，一共找到1型鹅星状病毒(GoAstV-1)全基因组序列有7条，下载全基因组序列并用mafft软件进行多序列比对，再根据同源性较高的区域设计引物。这7条序列的登录号(Accession No.)如下：
OL762471.1、OL762472.1、OK571391.1、MH410610.1、MW340534.1、MW353015.1、KY271027.1。
相同方法，对NCBI核酸数据库进行检索，一共找到2型鹅星状病毒(GoAstV-2)全基因组序列有62条，下载全基因组序列并用mafft软件进行多序列比对，再根据同源性较高的区域设计引物。这62条序列的登录号(Accession No.)如下：
MZ576222.1、MW592379.1、OK571390.1、MW413813.1、MW592377.1、MW592378.1、MZ367612.1、OK571389.1、MN307117.1、MN307119.1、MT708902.1、MN307120.1、MN428645.1、MW345727.1、MN428642.1、MN127956.1、MN127957.1、MN127958.1、MN127954.1、MN127955.1、MN127952.1、MN127953.1、OM273305.1、OM273306.1、OM273304.1、OM273302.1、OM273303.1、MZ540211.1、MN175321.1、MN307116.1、MN428643.1、MT934439.1、MT934438.1、MT934437.1、OM273308.1、OM273309.1、OM273307.1、OM273310.1、MN307118.1、MN428644.1、MN428641.1、MN307114.1、MN307115.1、MN894548.1、MK125058.1、MG934571.1、MN109955.1、MN109956.1、MN103532.1、MN109957.1、MN127951.1、MN109954.1、MF772821.1、MN068024.1、MN068023.1、MH052598.1、MH807626.1、MN399857.1、MN809622.1、MN337323.1、MN127959.1、KY807085.1。
设计得到的引物和探针序列见表1，多重RT-qPCR反应体系见表2。
表1引物和探针序列
Figure BDA0003817742260000051
Figure BDA0003817742260000061
表2多重RT-qPCR反应体系
Figure BDA0003817742260000062
总体系：20μL，a.两种模板各加1μL，b.ABI 7500仪器用Dye 2。
2.荧光定量PCR反应条件(见表3)
表3荧光定量PCR反应条件
Figure BDA0003817742260000063
Figure BDA0003817742260000071
3.标准质粒制备
根据表1中引物的扩增区域，并适当往上下游延伸部分序列，把目的序列发送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行全基因合成及构建质粒。
1型合成的全长片段序列如下，其中加粗部分是上下游引物结合序列，下划线部分是探针结合序列：
Figure BDA0003817742260000072
2型合成的全片段序列如下，其中加粗部分是上下游引物结合序列，下划线部分是探针结合序列：
Figure BDA0003817742260000073
质粒合成后通过测定质粒的浓度，计算质粒的拷贝数，然后依次10倍稀释成109～101DNAcopies/μL。
4.多重荧光PCR
(1)多重荧光PCR方法的建立
按照表2的体系添加各种组分，并进行荧光定量PCR，反应程序如表3所示。模板为101～109Copies/μL标准质粒。根据结果绘制标准曲线，并求得标准方程。其中，SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.6所示的引物和探针能够很好地实现多重PCR扩增，1型扩增曲线见图1，1型标准曲线见图2；2型扩增曲线见图3，2型标准曲线见图4，1型和2型的标准曲线合并绘制结果见图5。
GoAstV-1的标准方程：Y＝-3.54X+40.568，R2＝0.999，Eff＝91.629。
GoAstV-2的标准方程：Y＝-3.36X+39.471，R2＝0.998，Eff＝98.439。
SEQ ID NO.9-14、SEQ ID NO.15-20和SEQ ID NO.21-26是失败的引物和探针，其中利用SEQ ID NO.9-14的扩增结果见图6。
(2)特异性试验
采用步骤(1)建立的多重荧光定量PCR方法，分别对GoAstV-1、GoAstV-2、GPV、NDV和ARV核酸进行荧光定量PCR扩增，并设立无模板量的阴性对照，检验所建立方法的特异性。
特异性试验结果见图7，结果显示，一共测试了5种模板和1个阴性对照，除了GoAstV-1和GoAstV-2有扩增出来，其他的均没有扩增出，说明本方法特异性好。
(3)敏感性试验
选取9个稀释度(100～108)标准品为模板以及加水为无模板的阴性对照，进行荧光定量PCR扩增，确定该方法对GoAstV-1和GoAstV-2的最低检出量，同时用常规PCR进行检测，比较其敏感性。
敏感性试验结果见图8，9个稀释度中的101～108标准品均有扩增曲线。而100稀释度的模板，即只有1个Copy的模板在38个循环后稍有抬升，说明本方法最低检出量可以达到101Copies/μL以下。
(4)重复性试验
选取(1)中的5个稀释度(104～108)标准品进行荧光定量PCR反应，重复扩增3次，且每个稀释度在同等扩增条件下进行3次平行试验，计算变异系数，评估批内检测可重复性。对来自不同地区的3份阳性病料分别构建重组质粒pMD-GoAstV-1、pMD-GoAstV-2，稀释后进行荧光定量PCR检测，计算变异系数，评估批间检测可重复性。
重复性试验结果见表4和图9，GoAstV-1变异系数在0.123～1.015％；GoAstV-2变异系数在0.131～0.913％；说明本方法的重复性较好。
表4多重荧光PCR的重复性试验
Figure BDA0003817742260000081
Figure BDA0003817742260000091
实施例2临床样品检测
对来自2020-2022年江西地区鹅场的70份刍鹅痛风样品进行多重荧光定量PCR检测，临床样本中GoAstV-1和GoAstV-2的检测结果见图10，2型GoAstV细胞毒CT值检测结果见图11。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一种不同基因型鹅星状病毒多重荧光PCR检测的引物探针组，其特征在于，包括检测GoAstV-1和GoAstV-2的引物对和探针；检测GoAstV-1的引物对如SEQ ID NO.1-2所示，探针如SEQ ID NO.3所示；检测GoAstV-2的引物对如SEQ ID NO.4-5所示，探针如SEQ ID NO.6所示。
2.如权利要求1所述的引物探针组在制备不同基因型鹅星状病毒多重荧光PCR检测试剂盒中的应用。
3.一种不同基因型鹅星状病毒多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物探针组。
4.根据权利要求3所述的不同基因型鹅星状病毒多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括GoAstV-1和GoAstV-2的标准质粒，其中GoAstV-1的标准质粒含有如SEQ ID NO.7所示序列；GoAstV-2的标准质粒含有如SEQ ID NO.8所示序列。
5.根据权利要求3所述的不同基因型鹅星状病毒多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的多重荧光PCR的反应体系为：10pmol/μL GoAstV-1上游引物0.4μL，10pmol/μL GoAstV-1下游引物0.4μL，10pmol/μL GoAstV-1探针0.2μL，10pmol/μLGoAstV-2上游引物0.4μL，10pmol/μL GoAstV-2下游引物0.4μL，10pmol/μL GoAstV-2探针0.2μL，Template 2μL，2×AceQ qPCR Probe Master Mix 10μL，50×ROX Reference Dye 20.4μL，50mmol/LMgCl21μL，ddH2O补足至20μL。
6.根据权利要求3所述的不同基因型鹅星状病毒多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的多重荧光PCR的反应程序为：95℃5min；95℃10sec，60℃30sec，40个循环。
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