CN117568526A - 一种用于鹅星状病毒mira-lfd检测的引物/探针组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开一种用于鹅星状病毒MIRA‑LFD检测的引物组合物及其应用，引物组合物，包括引物对和探针；所述引物对的)序列如下：G‑F2：GAAGGGAAATCCAAGTGGCCAATATTCAAC；G‑R3：Biotin‑GAAAGTCATACCCTCAATATCATCAGAGA。本申请根据GenBank中GAstVⅡ基因组的RdRp基因序列设计特异性引物和探针，经筛选试验建立具有高灵敏性和特异性的MIRA‑LFD检测方法，用于检测GAstVⅡ，为养殖场临床病原检测及监测提供更加高效精准的技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及一种鹅星状病毒MIRA检测引物及其与胶体金试纸联用试剂盒。
背景技术
鹅星状病毒(Goose Astroviruses，GAstV)是一种可对雏鹅造成极大危害的传染性病原，自2016年在我国首次出现后开始呈现蔓延趋势，陆续在江苏、安徽、福建、广东、黑龙江、山东、河南、浙江等主要养鹅地区爆发。该病原可引起20日龄内雏鹅发生内脏型痛风为主要症状的传染病，患病雏鹅精神沉郁，卧地倦动，采食及饮水量降低，严重影响雏鹅的生长发育，剖检可见患病雏鹅胸、腹腔及关节腔内出现严重尿酸盐沉积。当前该病毒导致的致死率高达50％以上，并且GAstV不仅可引起种间水平传播，还能垂直传播，已经造成了巨大的经济损失。
星状病毒为单股正链无囊膜RNA病毒，病毒粒子约30nm，基因组全长约7kb，两侧为5'非翻译区(5'-UTR)和3'非翻译区(3'-UTR)(具PolyA尾)，包含ORF1a、ORF1b和ORF2共3个开放阅读框(ORF)，其中，ORF1a主要为非结构蛋白，ORF1b包含极保守的RNA依赖性RNA聚合酶，适合用于检测，ORF2则为高变异的衣壳蛋白。星状病毒基因组小，易变异，对环境和宿主的适应能力强，甚至会发生跨物种的传播。已有调查报道显示该病毒存在两种基因型(GAstVⅠ和GAstV II)，其中主要由GAstV II单一感染引起发病，也存在部分GAstVⅠ和GAstVII混合感染情况。
目前尚无有效的疫苗、抗体或抗病毒药物可以有效控制该传染病，故加强对GAstV的病原检测及监测、及时隔离扑杀患病雏鹅成为控制该病的防控重点。目前针对GAstV的病原检测主要有荧光定量PCR，常规RT-PCR，及ELISA方法，但上述均存在各自的局限性，主要表现在工序复杂、仪器依赖性强，成本高、费时费力等问题，因此为更有效快速的监测GAstV发病情况，需要研发更便利精准的检测方法以满足养殖一线的应用显得尤为重要。
等温扩增技术对设备依赖性小，操作便捷，反应迅速，适于临床养殖使用，现有广泛应用的主要有环介导等温扩增(LAMP)、重组酶等温扩增(RPA)和多酶等温快速扩增(MIRA)。MIRA在高效逆转录酶作用下可实现将微量RNA逆转录为cDNA、单链核酸重组酶和引物识别cDNA形成蛋白/核酸复合物，并在辅助蛋白和单链结合蛋白SSB作用下及DNA聚合酶等多个反应酶作用下，在等温条件下12分钟内实现目的基因序列指数扩增反应，产物可使用水平侧向横流胶体金检测试纸(LFD)进行显色观察，MIRA-LFD的组合应用基本摆脱对昂贵仪器及对实验室操作技术娴熟度要求的依赖且适用于DNA和RNA的检测。此外，为尽可能实现发病早期检测，对检测方法的灵敏性和特异性具有较高要求。
发明内容
本申请提供一种用于鹅星状病毒MIRA-LFD检测的引物组合物及其应用，根据GenBank中GAstVⅡ基因组的RdRp基因序列设计特异性引物和探针，经筛选试验建立具有高灵敏性和特异性的MIRA-LFD检测方法，用于检测GAstVⅡ，为养殖场临床病原检测及监测提供更加高效精准的技术支撑。
一种用于鹅星状病毒MIRA-LFD检测的引物组合物，包括引物对和探针；所述引物对的(G-F2/G-R3
)序列如下：
G-F2：GAAGGGAAATCCAAGTGGCCAATATTCAAC；
G-R3：Biotin-GAAAGTCATACCCTCAATATCATCAGAGA。
可选的，所述探针的序列如下：
GAstV-Probe：FAM-CATGGGTCATTGCCGACGCTCAGATTACTCA[THF]GGATAATGTCACCATG-C3Spacer。
本申请还提供一种如所述引物组合物在制备基于MIRA-LFD检测鹅星状病毒(Goose Astroviruses，GAstV)产品中的应用。
可选的，所述基于MIRA-LFD检测鹅星状病毒(Goose Astroviruses，GAstV)产品为试剂盒。
本申请还提供一种用于鹅星状病毒MIRA-LFD检测的试剂盒，包括所述引物组合物和胶体金试纸条。
可选的，所述胶体金试纸条为水平侧向横流胶体金检测试纸LFD。
可选的，所述试剂盒还包括MIRA反应试剂，所述MIRA试剂可采用商购MIRA反应试剂(WLRN8209KIT)。
本申请还提供一种非诊断目的的基于MIRA-LFD检测鹅星状病毒的方法，包括：
提取待测样品DNA，采用如前所述的引物对和探针进行MIRA扩增；所得扩增产物滴至胶体金试纸条或将胶体金试纸条浸入扩增产物中反应；观察所述胶体金试纸条的显色反应。
可选的，所述MIRA扩增的反应体系：50ul反应体系如下：冻干粉试剂、缓冲液A29.4μL，缓冲液B 2.5μL，无RNA酶去离子水11.5μL，10μM上下游引物各2μL，10μM探针0.6μL和核酸2μL。
可选的，所述MIRA扩增的反应条件：所述体系于42℃恒温反应12分钟后，使用无RNA酶去离子水1：20稀释最终反应产物，并取50μL滴至胶体金试纸条反应。
与现有技术相比，本申请至少具有如下有益效果之一：
(1)本申请通过设计并筛选针对GAstV II的合适引物并搭配探针，经MIRA反应后可有效检测GAstV II的核酸，反应无需特殊专业设备，在水浴锅及其他恒温容器中即可完成，并且最终可肉眼可见光直接观察结果。同时其灵敏性极佳，最低可达0.1copies/ul；特异性强，不存在因其他病原核酸的干扰而出现非特异假阳性。
(2)作为同样可实现等温扩增的LAMP和RPA，MIRA在引物设计上比LAMP需要4-6对引物共同作用更为简单，且反应时间优势突出；并且相较于前代RPA，MIRA可实现RNA为模板的检测，因反应中包含更多种类生物酶，克服了RPA扩增效果弱，灵敏度低的弱势，速度也更快；配合胶体金试纸条进行显色更为直观简便，完全摆脱仪器依赖。
(3)相较于最常用的Taqman probe-based qRT-PCR及其他上述检测方法，本申请筛选使用的引物及建立的MIRA-LFD方法在灵敏度上有明显提升，且MIRA-LFD反应时间更短，检测速度更快。因此本申请设计并完成的MIRA-LFD方法GAstV II检测作为动物临床检测具有显著优势，具有更广泛的应用场景。
附图说明
图1为本申请MIRA引物及探针位置及筛选过程示意图；
图2为本申请MIRA最佳引物筛选结果图：A.不同引物配对反应后2％琼脂糖凝胶检测，1：G-F1/G-R3，2：G-F1/G-R2，3：G-F1/G-R3，4：G-F2/G-R3，5：G-F2/G-R2，6：G-F2/G-R1，7：G-F3/G-R3，8：G-F3/G-R2，9：G-F3/G-R1；B.不同适配引物经LFD显色检测；
图3为本申请核酸灵敏性检测结果图；
图4为最快反应时间测试结果图；
图5为不同种属病毒特异性检测结果图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。
试剂、病毒及质粒：
磁珠法病毒RNA抽提试剂盒购自济帆科技生物有限公司(广州)；MiniplasmidPurification Kit Ver.4.0、DNA Marker 2000(TaKaRa)购自宝生物工程有限公司(大连)；DH5α感受态细胞购自诺唯赞生物科技股份有限公司(南京)；Zero CloningKit购自北京全式金生物技术有限公司(北京)，MIRA反应试剂(WLRN8209KIT)和胶体金试纸条(LFD)(WLFS8201)均购自安普未来生物科技有限公司(常州)。GAstV II病毒、GAstV I病毒、鹅细小病毒(goose parvovirus,GPV)、鹅坦布苏病毒(goose tembusu virus,GTMUV)、经典呼肠孤病毒(classic duck reovirus,CDRV)、新型呼肠孤病毒(novel duckreovirus,NDRV)、鸭瘟(duck enteritis virus,DEV)、H9亚型禽流感病毒(avianinfluenza virus,AIV)、新城疫病毒(Newcastledisease virus,NDV)、鸭肝炎病毒(Duckhepatitis virus,DHV)均由本实验室保存，也可采用其他公众途径获得的材料作为检测病毒。此外，采集江浙地区部分雏鹅养殖农场疑似发病样本作为临床检测样品。
病毒核酸提取：
取GAstV不同基因型毒株及其他GPV、GTMUV、CDRV、NDRV、DEV、AIV、NDV、DHV的阳性样品各200μL，按照抽提试剂盒的说明，使用磁珠法自动提取纯化系统抽提样品核酸，所得核酸放于-80℃保存备用。
质粒构建：
参照GenBank上发布的GAstVⅡ的ORF1b基因序列，制备含有目的扩增片段的质粒作为标准品。按照常规基因工程手段，扩增目的片段，将目的片段分别连接到载体上，命名为pEASY-T5-RdRp，于-20℃保存备用。根据测定的质粒浓度和拷贝数计算公式，计算并稀释质粒拷贝数为108copies/μL。
GAstV作为能够引起雏鹅痛风的新发疫病病原，近几年来给我国鹅养殖产业带来了巨大的经济损失。此外，已有的流行病学调查显示GAstV也可引起不同品种雏鸭发病，因此及时发现并鉴定该病原有助于对GAstV的临床防控。已有的调查分析显示，虽然GAstV存在两种基因型，但主要以GAstV II单独感染或部分GAstV I和II型混合感染，因此临床检测应重点关注GAstV II的流行情况。自从GAstV出现严重感染以来，不同的检测方法也已经陆续建立，如普通RT-PCR，一步法SYBR Green qRT-PCR，Taqman probe-based qRT-PCR，等温LAMP甚至血清学ELISA检测方法，但上述方法相对价格昂贵，操作繁琐，费时费力，部分灵敏性不足，且都需要依托实验室专业设备完成，对操作人员的专业技能要求更高，因此本申请尝试将MIRA反应和LFD显色结合起来，建立一种更为简便，快速，结果可靠灵敏的方法，用于检测GAstV，适用于临床推广快速引用。
以下以具体实施例进行说明：
实施例1 MIRA引物及探针设计合成
根据GenBank上发布的GAstV II型基因序列，选取保守基因ORF1b，经序列比对分析选择其RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)区域进行引物及探针设计(见图1和表1)，用于后续MIRA试验。引物由上海生工生物技术有限公司合成。
表1 MIRA反应引物及探针
实施例2 MIRA反应及引物筛选
MIRA反应根据安普未来试剂盒操作说明，50ul反应体系如下：缓冲液A 29.4μL，缓冲液B 2.5μL，无RNA酶去离子水12.1μL，10μM上下游引物各2μL和核酸2μL；体系于42℃恒温反应12分钟，取反应产物纯化后进行2％(g/g)的琼脂糖核酸电泳，使用凝胶成像仪分析引物适配性(Bio-Rad)，结果如图2中A。引物配对顺序为：G-F1/G-R3,G-F1/G-R2,G-F1/G-R1,G-F2/G-R3,G-F2/G-R2,G-F2/G-R1,G-F3/G-R3,G-F3/G-R2,G-F3/G-R1。
MIRA-LFD试验
MIRA-LFD组合试验反应体系如下：50ul反应体系如下：取用50ul冻干粉试剂经抽真空冻干后分别加入缓冲液A 29.4μL，缓冲液B 2.5μL，无RNA酶去离子水11.5μL，10μM上下游引物各2μL，10μM探针0.6μL和核酸2μL；体系于42℃恒温反应12分钟后，使用无RNA酶去离子水1：20稀释最终反应产物，并取50μL滴至胶体金试纸条(LFD)反应，观察5分钟内反应结果，结果如图2中B。
除引物和探针外，上述反应体系中的其他试剂均采用商购的MIRA反应试剂(WLRN8209KIT)，胶体金试纸条采用商购的胶体金试纸条(LFD)(WLFS8201)。
冻干粉试剂包括逆转录酶、重组酶、聚合酶、单链结合蛋白、核酸外切酶和重组酶辅酶等多种酶及dNTPs、ATP、海藻糖、PEG、DTT等反应底物；缓冲液A为PEG、Tris-HCl和甘露醇的混合缓冲液，缓冲液A为基础缓冲液，缓冲液A中终浓度为Tris-HCl为100mM，PEG为6.5％，甘露醇为1.5％；缓冲液B为终浓度21mM的醋酸镁水溶液。
实施例1中共设计上下游引物各3条，可组成9对反应引物进行MIRA反应。经初步试验，2％琼脂糖凝胶跑胶结果如图2中A所示，由图可知，G-F1/G-R3、G-F2/G-R3、G-F2/G-R2、G-F3/G-R3、G-F3/G-R2引物对产生的反应产物更多，条带较亮。分析可知G-R3引物适配性较为突出，为进一步确定最佳上游引物，经MIRA-LFD试验后发现引物对G-F2/G-R3反应所得产物在LFD上显色更快颜色更深，结果如图2中B所示，因此后续试验使用G-F2/G-R3引物(即图2中序号4对应的引物对)进行。
实施例3灵敏性试验
使用无RNA酶去离子水对质粒pEASY-T5-RdRp进行10倍比稀释，稀释至107-0.01copies/ul，每个稀释度的标准品各取2μL制备混和模板，进行MIRA-LFD反应，验证检测方法的敏感性。
本实施例中，为测试MIRA-LFD可检测的最低核酸量，将pEASY-T5-RdRp质粒梯度稀释后逐一进行MIRA反应，反应时间12分钟，经LFD显色可知(图3)，其最低可检测核酸拷贝数为0.1copies/μL，但阳性条带色浅，呈弱阳，而核酸拷贝数1copies/μL即为强阳性，表明该检测方法具有较高的灵敏性。
实施例4反应时间试验
根据实施例2中结果选择最适引物，并使用实施例3中最低检测核酸作为待检模板，分别设置不同反应不同时间4分钟、6分钟、8分钟、10分钟、12分钟进行MIRA-LFD反应(其他条件参照实施例2)，测定最快反应时间。
本实施例中，为测试MIRA-LFD反应温度，使用G-F2/G-R3引物，核酸模板为1copies/μL进行试验，在42℃反应下，设置不同作用时间后，MIRA反应产物立即于LFD显色观察，结果如图4所示，由结果可知反应4分钟时至6分钟无阳性条带显现，反应8分钟则出现弱阳性条带，10分钟开始则出现强阳性条带，清晰、色深，因此反应8分钟为最快反应时间。
实施例5特异性试验
分别以GAstV及其他毒株GPV、GTMUV、CDRV、NDRV、DEV、AIV、NDV、DHV提取的病毒DNA或RNA为样品，以无RNA酶去离子水作为阴性对照，进行一步法MIRA-LFD反应(反应条件参照实施例2)，扩增体系和反应条件同2.6，验证引物及探针和鉴别诊断方法的特异性。
本实施例提取GAstV、GPV、GTMUV、CDRV、NDRV、DEV、AIV、NDV和DHV阳性样品的核酸，作为待检测模板，根据上述试验结果选择G-F2/G-R3引物进行MIRA反应，反应12分钟后LFD观察，结果如图5所示，由图5可知只有GAstV II核酸检测为阳性条带，其余皆为阴性。该结果表明本试验建立的试剂盒的特异性为100％，具有强特异性，方法中引物和探针能够与对应病毒核酸特异性结合与其他常见禽源病毒核酸均无交叉反应。
实施例6临床样品检测
对本实验室所收集到的90份GAstV雏鹅组织进行检测。将组织样品称取1克加入1mL PBS，研磨匀浆后12,000rpm离心取5分钟取上清提取核酸。应用本申请建立的MIRA-LFD方法和荧光定量RT-PCR方法对上述样品进行检测比较分析阳性率。
本实施例使用MIRA-LFD方法(参照实施例2)对90份疑似发病的临床样品进行检测，结果有77份样品为GAstV II阳性，阳性率为85.56％。本方法与荧光定量RT-PCR相比较(表2)，阳性样品的检出准确度是相同的，表明本方法与qRT-PCR对阳性样品的检出准确度相同。
表2 MIRA-LFD与qRT-PCR之间阳性检出符合率(C.R.)比较
综上：
研究结果显示，本申请通过设计并筛选针对GAstV II的合适引物并搭配探针，经MIRA反应后可有效检测GAstV II的核酸，反应无需特殊专业设备在水浴锅及其他恒温容器中即可完成，并且最终可肉眼可见光直接观察结果。同时其灵敏性极佳，最低可达0.1copies/ul；特异性强，不存在因其他病原核酸的干扰而出现非特异假阳性。
作为同样可实现等温扩增的LAMP和RPA，MIRA在引物设计上比LAMP需要4-6对引物共同作用更为简单，且反应时间优势突出；并且相较于前代RPA，MIRA可实现RNA为模板的检测，因反应中包含更多种类生物酶，克服了RPA扩增效果弱，灵敏度低的弱势，速度也更快；配合胶体金试纸条进行显色更为直观简便，完全摆脱仪器依赖。
相较于最常用的Taqman probe-based qRT-PCR及其他上述检测方法，本申请筛选使用的引物及建立的MIRA-LFD方法在灵敏度上有明显提升，且MIRA-LFD反应时间更短，检测速度更快。因此本申请设计并完成的MIRA-LFD方法GAstV II检测作为动物临床检测具有显著优势，具有更广泛的应用场景。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.一种用于鹅星状病毒(Goose Astroviruses)MIRA-LFD检测的引物/探针组合物，包括引物对和探针，其特征在于，所述引物对的序列如下：
G-F2：GAAGGGAAATCCAAGTGGCCAATATTCAAC；
G-R3：Biotin-GAAAGTCATACCCTCAATATCATCAGAGA。
2.根据权利要求1所述的引物/探针组合物，其特征在于，所述探针的序列如下：
GAstV-Probe：FAM-CATGGGTCATTGCCGACGCTCAGATTACTCA[THF]GGATAATGTCACC ATG-C3Spacer。
3.如权利要求1或2所述引物/探针组合物在制备基于MIRA-LFD检测鹅星状病毒产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述基于MIRA-LFD检测鹅星状病毒产品为试剂盒。
5.一种用于鹅星状病毒MIRA-LFD检测的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1或2所述引物/探针组合物和胶体金试纸条。
6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述胶体金试纸条为水平侧向横流胶体金检测试纸LFD。
7.一种非诊断目的的基于MIRA-LFD检测鹅星状病毒的方法，其特征在于，包括：
提取待测样品DNA，采用如权利要求1所述引物对和探针进行MIRA扩增；所得扩增产物滴至胶体金试纸条或将胶体金试纸条浸入扩增产物中反应；观察所述胶体金试纸条的显色反应。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，
所述MIRA扩增的反应体系：50ul反应体系如下：冻干粉试剂、缓冲液A 29.4μL，缓冲液B2.5μL，无RNA酶去离子水11.5μL，10μM上下游引物各2μL，10μM探针0.6μL和核酸2μL。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，
所述MIRA扩增的反应条件：所述体系于42℃恒温反应12分钟后，使用无RNA酶去离子水1：20稀释最终反应产物，并取50μL滴至胶体金试纸条反应。
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