CN113897356B - 一种检测鸡传染性贫血病毒荧光定量pcr试剂盒及引物 - Google Patents

一种检测鸡传染性贫血病毒荧光定量pcr试剂盒及引物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测鸡传染性贫血病毒荧光定量PCR试剂盒及引物。所述引物包括CIAV‑124‑F和CIAV‑124‑R，能针对CIAV的VP1基因中高保守性的基因片段能够特异性扩增的引物对，有效提高使用分子生物学检测CIAV的抗干扰能力。所述荧光定量PCR试剂盒包括前述的引物对，经试验证实其检测最低浓度为2.0×10‑1copies/μL，相较于普通PCR的检测灵敏度提升达1000倍。且特异性良好，针对AIV‑5、AIV‑7、ILT、NDV、IBV、Fadv‑4等常见禽病不会出现明显的扩增曲线。

Description

一种检测鸡传染性贫血病毒荧光定量PCR试剂盒及引物
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，特别涉及一种检测鸡传染性贫血病毒荧光定量PCR试剂盒及引物。
背景技术
鸡传染性贫血病(chicken infectious anemia，CIA)是由鸡传染性贫血病病毒(chicken infectious anemia virus，CIAV)引起鸡的再生障碍性贫血和全身性淋巴组织萎缩为主要特征的免疫抑制病。CIAV为圆环病毒科，圆环形病毒属的环状单股DNA病毒，无囊膜，呈二十面体对称结构，是目前已知基因组最小的病毒之一。该病毒自1979年首次被日本报道以来，此后陆续在美国、英国、澳大利亚、德国、丹麦等国家也出现了相关报道。1992年我国科学家首次分离到该病毒。近年来，随着相关人员的深入研究与数据积累，对CIAV已有一定的理解，但还需要更多的流行病学调查与病毒相关致病机理等方面的深入研究，才有助于尽早消灭该病对于养禽业的影响。
针对CIAV的检测技术目前主要分为以下6种。
病毒分离鉴定：病毒分离培养是CIAV鉴定中常用的方法之一。一般情况采集疑似病鸡的肝脏、脾脏、法氏囊等器官组织，碾磨后离心取上清液进行鸡胚、细胞或者动物接种实验进行病源分离。CIAV可在在马立克氏病肿瘤细胞系MDCC-MSBl、MDCC-JP2、MDCC-RPl细胞系正常生长，目前普遍使用MDCC-MSB1传代细胞或者SPF鸡胚进行病毒体外培养。需要花费较长时间才能完成分离和培养的完整流程。
电镜观察：直接电镜观察主要用于对粪便、组织培养物中病毒的定性和新分离毒株进行鉴定，也可通过纯化细胞培养液中的病毒粒子，再经过负染后进行电镜观察。但由于CIAV病毒粒子小，并且无论是感染易感动物还是接种于敏感细胞，获得的病毒效价都比较低，因此直接进行电镜观察很难见到病毒粒子。而免疫电镜(IEM)观察比直接电镜观察的敏感性更高，病毒是免疫复合物的聚集状态，对传统电镜观察粒子较小病毒分辨率不足的缺点进行大幅改进。分离、纯化、培养等步骤较为耗时，同时电镜设备昂贵，不利于该技术的推广使用。
血液学检测：对疑似病鸡采集血液，加入抗凝剂，随后取1mL抗凝血加入红细胞压积管中，以3000rpm离心30min。红细胞压积值低于27％且刨检病鸡出现骨髓黄染则可确诊。
病毒中和试验(Virus Neutralization Test,VN)：病毒中和试验可有效检测CIAV抗原与抗体效价，SPF鸡或CIAV适应细胞系进行试验均可。但其对标准品的准确性与相关试验人员的操作技术具有一定门槛，容易出现假阴性或假阳性，导致其在基层推广检测过程中结果的可靠性与稳定性容易出现问题，影响最终判断。
酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)：酶联免疫吸附试验是将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。实际生产中可从疑似或待测鸡群进行血液采集，分离血清后，使用商品化的CIA抗体检测试剂盒进行检测，虽然该方法易于进行大批量检测，且准确性和高效性较中核试验都有所提高，但无法判断待测鸡群处于发病初期、后期还是耐过。
间接免疫荧光抗体试验(Indirect Immunoinfluscent Assay，IFA)：一种利用特异性抗体标记抗原，继而利用带有荧光信号的抗原与其特异性结合从而进行定位和定量分析的试验。该方法在免疫组化与病毒的初期鉴定分离具有定位定量、操作简便与反应时间短等优点，但应设立准确的阳性血清、阴性血清和非CAM感染细胞作对照，以排除非特异性荧光和可能掩盖特异性反应的背景染色。
发明内容
本发明目的在于提供一种鸡传染性贫血病毒荧光定量PCR快速检测体系，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。
本发明的第一目的在于提供一组引物对，包括：
CIAV-124-F：5’-TGCCGGTTCTTTAATCACCC-3’(SEQ ID NO.1)，
CIAV-124-R：5’-ATCCCTCATTCTTAGTGGCAA-3’(SEQ ID NO.2)。
前述的引物对能够特异性扩增CIAV的VP1基因，扩增标靶属于高保守性的基因片段，序列如SEQ ID NO.3所示，长度124bp。
本发明的第二目的在于提供一种检测鸡传染性贫血病毒荧光定量PCR试剂盒，包括前述的引物对CIAV-124-F和CIAV-124-R。
进一步，所述试剂盒还包括聚合酶、反应缓冲液、SYBR荧光染料和水。所述聚合酶为Taq DNA聚合酶；所述水为ddH2O。所述聚合酶、所述反应缓冲液、所述SYBR荧光染料共同组成SYBR Green Premix Pro Taq。
进一步，所述检测体系总体积20.0μL，具体为：10.0μL的SYBR Green Premix ProTaq，0.5μL的CIAV-124-F，0.5μL的CIAV-124-R，1.0μL的检测模板以及8.0μL的ddH2O。反应程序为：95℃维持2min；95℃维持30s，62℃维持20s，72℃维持30s，重复40个循环。
进一步，所述荧光定量PCR试剂盒还包括阳性标准质粒。
进一步，所述阳性标准质粒的制备方法包括步骤：
(1)获取如SEQ ID NO.3所示的目的片段；
(2)将所述目的片段与克隆载体连接，获得重组质粒；
(3)重组质粒经验证后即为阳性标准质粒。
所述荧光定量PCR试剂盒的标准曲线方程为：
Y＝-3.2514X+37.091；
相关系数R2＝0.9995；
扩增效率E＝103.03％；
X轴为阳性标准质粒的拷贝数；Y轴为循环阈值。不同浓度的标准品之间具有良好的线性关系，符合预期结果。
本发明包括以下有益效果：
本发明提供针对CIAV的VP1基因中高保守性的基因片段能够特异性扩增的引物对，有效提高使用分子生物学检测CIAV的抗干扰能力。经试验证实所述荧光定量PCR试剂盒的检测最低浓度为2.0×10-1copies/μL，相较于普通PCR最低检测浓度的2.0×102copies/μL，本试剂盒的灵敏度提升可达1000倍。且特异性良好，针对AIV-5、AIV-7、ILT、NDV、IBV、Fadv-4等常见禽病不会出现明显的扩增曲线。
附图说明
图1是实施例2所述试剂盒的荧光定量PCR标准曲线图；
图2是实施例3所述试剂盒的荧光定量PCR灵敏性检测图；
图3是实施例3中常规PCR灵敏性检测图；
图4是实施例4所述试剂盒的荧光定量PCR特异性扩增曲线图；
图5是实施例4所述试剂盒的荧光定量PCR溶解曲线图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1、阳性标准质粒的制备
(1)目的片段的PCR扩增以及纯化
使用特异性引物CIAV-124-F和CIAV-124-R对病毒基因组进行PCR扩增，常规PCR反应体系如表1：
表1常规PCR反应体系
反应程序为：95℃维持5min；94℃维持30s，55℃维持30s，72℃维持30s，重复35个循环；72℃维持10min。
PCR程序结束后，将管内产物进行凝胶电泳，电泳完成后对目的条带进行切胶回收，使用Omega胶回收试剂盒进行胶回收。具体步骤如下：
①将单一目的测DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净的离心管中，称量计算凝胶重量。
②向胶块中加入1倍体积Buffer PG。
③50℃水浴温浴，其间每隔2-3分钟温和地上下颠倒离心管，待溶胶液为黄色，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟直至胶块完全溶解。
④柱平衡：向已装入收集管中的吸附柱中加入200μL Buffer PS，13000rpm的转速离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
⑤将步骤③所得溶液加入到已装入收集管的吸附柱中，室温放置2分钟，13000rpm的转速离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
⑥向吸附柱中加入450μL Buffer PW，13000rpm的转速离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
⑦13000rpm的转速离心1分钟，倒掉收集管中的废液。
⑧将吸附柱放到一个新的1.5mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μLBuffer EB，室温放置2分钟。13000rpm离心1分钟。收集DNA溶液。-20℃保存DNA。
(2)目的片段的连接
使用TAKARA公司的pMD18-T Vector载体进行阳性标准质粒的构建，具体操作，如表2所示：
表2连接反应体系
混匀后，16℃反应4h，取出后-20℃保存，准备下一步实验。
(3)重组质粒的转化
①将获得的连接产物分别加入50μL感受态细胞中，做好编号。同时设立pMD18-T质粒的阳性对照和阴性对照。
②将连接产物和感受态细胞轻轻混匀后，立即冰浴30min，然后42℃热激90s，随后冰浴2min。
③每管加入700μL无菌LB液体培养基，在37℃恒温箱中140rpm培养60min。
④取100μL菌液涂布于含Amp(100μg/mL)的1.5％(W/V)LB琼脂平板中，37℃倒置过夜培养。
(4)可疑菌液的筛选和鉴定
挑取生长良好的单菌落接种于700μL含氨苄青霉素(AMP)的LB液体培养基中，置于37℃恒温摇床中振荡培养4～6h，待菌体量足够大后进行菌液PCR鉴定，具体反应体系见表3。
表3菌液PCR反应体系
将以上各组分混匀后，执行PCR程序：95℃维持5min；94℃维持30s，55℃维持30s，72℃维持30s，重复35个循环；72℃，10min。
将PCR鉴定为阳性的菌液送至广州天一辉远基因科技有限公司进行测序。
(5)阳性质粒的提取
将测序结果正确的菌液进行扩大培养后，进行质粒提取，具体步骤如下：
①柱平衡步骤：向吸附柱CP3中加入500μL的平衡液BL，12000rpm的转速离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
②取1～5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12000rpm离心1min，尽量吸除上清。
③使用TIANGEN质粒小提试剂盒(DP103)，向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
④向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6～8次使菌体充分裂解。
⑤向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10min。
⑥将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，注意尽量不要吸出沉淀。12000rpm离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
⑦向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
⑧重复一次步骤⑦。
⑨将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm的转速离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
⑩将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μL的ddH2O，室温放置2min，12000rpm的转速离心2min，将质粒溶液收集到离心管中，随后测定浓度并标记。
(6)阳性标准质粒的制备
使用超微量荧光分光光度计测量质粒浓度，并根据基因拷贝数(copies/μL)＝6.02×1023×质粒浓度(ng/μL)×10-9/[质粒大小(bp)×660]计算出其基因拷贝数，再以10倍倍比稀释至10-1copies/μL，-20℃保存备用。取任意浓度的阳性质粒进行引物浓度以及反应程序的优化。
实施例2、标准曲线的构建
取108、107、106、105、104、103、102，7个梯度的实施例1所得的阳性标准质粒作为模板检验检测鸡传染性贫血病毒荧光定量PCR试剂盒的扩增效果。所述检测鸡传染性贫血病毒荧光定量PCR试剂盒的反应体系如表4所示，结果如图1所示，标准曲线方程为Y＝-3.2514X+37.091；相关系数R2＝0.9995；扩增效率E＝103.03％，而且结果显示，不同浓度的标准品之间具有良好的线性关系，其中X轴为阳性标准质粒的拷贝数，Y轴为循环阈值，符合预期结果。
表4荧光定量PCR试剂盒反应体系
反应程序为：Preincubation：95℃，2min；3Step Amplifcation：95℃维持30s，62℃维持20s，72℃维持30s，重复40个循环s。
实施例3、敏感性试验
取拷贝数为109、108、107、106、105、104、103、102、101、100、10-1，的阳性标准质粒作为模板进行实时荧光定量PCR扩增，取同样的质粒进行普通PCR扩增，以此来测定实施例2所述检测鸡传染性贫血病毒荧光定量PCR试剂盒相较于普通PCR所能检测出来的阳性质粒的最低拷贝数。试剂盒的扩增结果如图2所示，图中标号1～11的曲线依次为2.0×109～2.0×10-1copies/μL的阳性标准质粒样品，标号12的曲线为阴性对照。普通PCR扩增的电泳结果如图3所示，标号M的为500DNAmarker，标号1～11的泳道依次为2.0×109～2.0×10-1copies/μL的阳性标准质粒样品，标号12的泳道为阴性对照。
从图2、3可知，本试剂盒能检测出阳性的最低拷贝数为2.0×10-1copies/μL，而普通PCR仅能检测到2.0×102copies/μL，表明其灵敏性是普通PCR的1000倍。
实施例4、特异性试验
利用已有Real-time PCR检测CIAV法进行特异性验证。选择常见禽类流行病病毒核酸样品：禽流感病毒(AIV)5型和7型、鸡传染性喉气管炎病毒(ILT)、鸡新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、安卡拉病毒(FadV)4型、鸡传染性贫血病(CIAV)的DNA/cDNA进行实时荧光定量PCR扩增，结果如图4和图5所示。图4和图5的标号1～8的曲线依次为AIV-5、AIV-7、ILT、NDV、IBV、Fadv-4、CIAV和阴性对照。
从图4和图5可见，只有代表CIAV的7号样本出现了明显的扩增曲线以及溶解曲线，所以表明本试剂盒具有良好的特异性。
实施例5、重复性试验
为了进一步验证该方法的稳定性，选择3份批次不同的质粒分别做3个组内重复和3个组间重复试验，比较Ct值和Tm值的变化情况，以批次内变异系数评价该方法的稳定性。
表5荧光定量PCR重复性试验结果
结果如表5所示，本方法组内变异系数与组件变异系数均少于2％，具有良好的重复性。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
SEQUENCE LISTING
<110> 佛山科学技术学院
<120> 一种检测鸡传染性贫血病毒荧光定量PCR试剂盒及引物
<130> 2021
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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<211> 1356
<212> DNA
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<400> 3
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acagctacat acgcgctaaa ggagccggta atgaagagcg attcatgggc agtggtgcgc 1260
gtccagtcgg tctggcaact gggtaacagg caaaggccat acccatggga cgtcaactgg 1320
gccaacagca ccatgtactg ggggtcgcag ccctga 1356

Claims (2)

1.一种检测鸡传染性贫血病毒荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包括引物对、聚合酶、反应缓冲液、SYBR荧光染料、水和阳性标准质粒，所述引物对为SEQ ID NO.1所示的上游引物CIAV-124-F和如SEQ ID NO.2所示下游引物CIAV-124-R，所述聚合酶为Taq DNA聚合酶，所述水为ddH2O；所述试剂盒的反应程序为：95 ℃维持2 min；95 ℃维持30 s，62 ℃维持20s，72℃维持30s，重复40个循环。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性标准质粒的制备方法包括步骤：
（1）获取如SEQ ID NO.3所示的目的片段；
（2）将所述目的片段与克隆载体连接，获得重组质粒；
（3）重组质粒经验证后即为阳性标准质粒。
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