CN101059516A - 鸡传染性贫血病毒抗体斑点免疫胶体金渗滤试验检测方法 - Google Patents
鸡传染性贫血病毒抗体斑点免疫胶体金渗滤试验检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101059516A CN101059516A CN 200710057469 CN200710057469A CN101059516A CN 101059516 A CN101059516 A CN 101059516A CN 200710057469 CN200710057469 CN 200710057469 CN 200710057469 A CN200710057469 A CN 200710057469A CN 101059516 A CN101059516 A CN 101059516A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cav
- liquid
- film
- chicken
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种鸡传染性贫血病毒抗体斑点免疫胶体金渗滤试验检测方法,首先取1uL CAV层析抗原点在NC膜(0.45μm硝酸纤维素膜)斑点中央,室温下自然干燥0.5h,用PBS洗3min、除去未吸附上的抗原;将点样后的NC膜浸于封闭液(0.01Mol/L、pH7.4 PBS,含5%BSA、0.5%Tween-20)中,37℃作用下30min,用PBS洗3min、除去未吸附的封闭液、凉干;加待检血清标本100uL于NC膜的点样处,37℃作用下30min;加金标兔抗鸡IgG 100UL,37℃作用下15min,用去离子水洗3min;NC膜浸入硝酸银显影液中、室温下避光作用10min,移入定影液中、室温下作用5min,然后用去离子水冲洗,自然干燥后观察结果。若与金标抗体作用20min,经银染色后NC膜上呈现红色斑点的则为阳性、黑色斑点为强阳性,否则为阴性。本发明对CAV进行临床诊断不仅切实可行,且具有快速、准确、特异的优点,满足了临床诊断的要求,为检测CAV抗体提供了便利条件。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域,更具体地说,是涉及一种鸡传染性贫血病毒抗体斑点免疫胶体金渗滤试验(DIGFA)检测方法。
背景技术
鸡传染性贫血病(Chicken Infectious Anemia,CIA)是鸡传染性贫血病毒(Chicken Anemia Virus,CAV)引起的一种以再生障碍性贫血和全身淋巴器官萎缩,造成免疫抑制为主要特征的病毒性传染病。其病原一鸡传染性贫血病毒1979年由日本学者Yuasa等首次报道以后,相继在西德、瑞典、英国、丹麦、波兰、美国、澳大利亚、荷兰及巴西等国陆续证实了本病的发生。我国于1992年首次分离到此病毒。CAV为环状单股DNA病毒,在国际病毒分类委员会(ICTV)发表的第六次病毒分类报告中将其与猪环状病毒、鹦鹉喙羽病病毒一起设立了一个新科,即圆环病毒科(Circoviridae)。
目前可以用于鸡传染性贫血的诊断方法主要有:CAV病毒的分离和鉴定、电镜观察、免疫荧光或过氧化物酶染色法和聚合酶链式反应(PCR)方法等。上述方法都需要荧光显微镜、酶标仪、PCR仪等昂贵的仪器设备,反应条件相对苛刻,再加上操作步骤繁琐,试验时间长等,因而使其在基层的应用受到一定的局限性。鉴于上述原因,研究新的快速、敏感、特异、简便、容易操作的CAV检测技术就显得十分必要,也是当前亟待解决的问题,这对于加强该病的诊断和预防研究具有极为重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是,克服现有技术中存在的不足,提供一种快速、简便、敏感性高的鸡传染性贫血病毒抗体斑点免疫胶体金渗滤试验检测方法。
本发明鸡传染性贫血病毒抗体斑点免疫胶体金渗滤试验检测方法,通过下述步骤予以实现:
(1)点样:取1uL鸡传染性贫血病毒(CAV)层析抗原点在NC膜斑点中央,室温下自然干燥0.5h,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3min、除去未吸附上的抗原;
其中CAV层析抗原按照下述步骤制备:
a、CAV VP1基因的克隆及原核表达载体的构建:根据发表的CAV VP1基因组序列分别设计引物,以CAV天津分离TJBD33株为模板,采用聚合酶链式反应方法扩增出690bp的DNA片段;将扩增的DNA片段纯化后克隆至pGM-T Easy载体中构建重组克隆质粒;通过酶切、克隆将CAV VP1基因片段分别插入原核表达载体,转化感受态大肠杆菌DH5α,用聚合酶链式反应方法挑选阳性菌落,培养后提取表达CAV VP1基因的重组质粒;
b、CAV VP1表达蛋白的制备:将上述阳性菌落接种于Luria-Bertani(LB)液体培养基中培养至OD600值为0.6,然后加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)于26℃条件下诱导3.5h,获得表达CAV VP1蛋白的菌体;培养表达重组蛋白的细菌,裂解后用几丁柱方法进行纯化,得到CAV层析抗原;
(2)封闭:将点样后的NC膜浸于封闭液中,封闭液为0.01Mol/L、pH7.4的PBS溶液,PBS溶液中含5%牛血清白蛋白(BSA)、0.5%吐温-20(Tween-20),在37℃下作用30min,用PBS溶液洗3min、除去未吸附的封闭液后晾干;
(3)加待检血清:加待检血清标本100uL于NC膜的点样处,37℃下作用30min;
(4)加金标抗体:加金标兔抗鸡免疫球蛋白(IgG)100uL,37℃作用下15min,用去离子水洗3min;
其中金标兔抗鸡免疫球蛋白(IgG)按照下述步骤制备:
a、胶体金颗粒的制备:分别按要求制备A液和B液;A液:1%HAuCl4水溶液1mL加入79mL双馏水中混匀;B液:1%枸橼酸三钠4mL,0.1Mol/LK2CO30.025mL,1%鞣酸0.1mL,双馏水15.875mL;将A液、B液分别加热至60℃,在电磁搅拌下迅速将B液加入A液中,溶液变蓝,继续加热搅拌、煮沸直至溶液呈亮红色且颜色再不发生变化为止,室温下冷却,分装为每份1mL保存于4℃;
b、金标兔抗鸡IgG的制备与纯化:分别取10mL上述胶体金溶液和兔抗鸡IgG抗体,并将胶体金和兔抗鸡IgG抗体溶液分别以0.1Mol/L K2CO3调pH至9.0,在电磁搅拌下将兔抗鸡IgG抗体溶液,加入胶体金溶液混合,搅拌10min,并加入一定量5%BSA使溶液终浓度为1%,以防止兔抗鸡IgG抗体与胶体金聚合发生沉淀;将胶体金兔抗鸡IgG结合物先1500r/min4℃离心30min,弃掉由凝聚形成的沉淀;将上清液于4℃、15000r/min离心1h,小心吸取上清液并弃掉,取沉淀;将沉淀物用含1%BSA、0.05%NaN3的0.01Mol/L pH8.2的PB液重悬沉淀至原量,于4℃下平衡过夜,然后重复4℃、15000r/min离心1h一次,再将沉淀物重悬为原来体积的1/5,分装为每份10mL后于4℃保存;
(5)银加强染色:NC膜浸入硝酸银显影液中、室温下避光作用10min,移入定影液中、室温下作用5min,然后用去离子水冲洗,自然干燥后观察结果;
(6)结果判定:若与金标抗体作用20min,经银染色后NC膜上呈现红色斑点的则为阳性、黑色斑点为强阳性,否则为阴性。
本发明所述NC膜为0.45um的硝酸纤维素膜。
本发明的有益效果是:通过临床检测结果表明,本发明鸡传染性贫血DIGFA检测方法,不需要任何特殊仪器设备,且操作简便快速,所用试剂价格低廉,结果易于观察,可在数分钟内报告结果,具有快速,简便,敏感性高,特异性强和重复性好等优点,尤其适用于基层单位推广应用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述。
首先进行检测中自制试剂的制备:
1.CAV层析抗原的制备:
a、鸡传染性贫血病毒VP1基因的克隆及原核表达载体的构建:根据发表的鸡贫血病毒(CAV)VP1基因组序列分别设计引物,以CAV天津分离TJBD33株为模板,采用PCR方法扩增出与预期设计大小相符的DNA片段;将扩增的DNA片段纯化后克隆至pGM-T easy载体中构建重组克隆质粒;通过酶切、克隆将CAV VP1基因片段分别插入原核表达载体,转化感受态大肠杆菌DH5α,用聚合酶链式反应方法挑选阳性菌落,培养后提取表达CAVVP1基因的重组质粒;
b、鸡传染性贫血病毒VP1表达蛋白的制备:将上述阳性菌落接种于Luria-Bertani(LB)液体培养基中培养,然后加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导,获得表达CAV VP1蛋白的菌体;培养表达重组蛋白的细菌,裂解后用几丁柱方法进行纯化,得到CAV层析抗原。
2.金标兔抗鸡免疫球蛋白(IgG)的制备:
a、胶体金颗粒的制备:分别按要求制备A液和B液;A液:1%HAuCl4水溶液1mL加入79mL双馏水中混匀;B液:1%枸橼酸三钠4mL,0.1Mol/LK2CO30.025mL,1%鞣酸0.1mL,双馏水15.875mL;将A液、B液分别加热至60℃,在电磁搅拌下迅速将B液加入A液中,溶液变蓝,继续加热搅拌、煮沸直至溶液呈亮红色且颜色再不发生变化为止,室温下冷却,分装(每份1mL)保存于4℃;
b、金标兔抗鸡IgG的制备与纯化:分别取10mL的上述胶体金溶液和兔抗鸡IgG抗体,并将胶体金和兔抗鸡IgG抗体溶液分别以0.1Mol/L K2CO3调pH至9.0,在电磁搅拌下将兔抗鸡IgG抗体溶液,加入胶体金溶液混合,搅拌10min,并加入一定量5%BSA使溶液终浓度为1%,以防止兔抗鸡IgG抗体与胶体金聚合发生沉淀;将胶体金兔抗鸡IgG结合物先1500r/min4℃离心30min,弃掉由凝聚形成的沉淀;将上清液于4℃、15000r/min离心1h,小心吸取上清液并弃掉,取沉淀;将沉淀物用含1%BSA、0.05%NaN3的0.01 Mol/L pH8.2的PB液重悬沉淀至原量,于4℃下平衡过夜,然后重复4℃、15000r/min离心1h一次,再将沉淀物重悬为原来体积的1/5,分装(每份10mL)后于4℃保存。
实施例1:某鸡场的鸡出现精神沉郁、衰弱、消瘦、体重减轻、死亡率高等临床症状。经病理剖检可见:喙、肉髯和可视黏膜苍白;血液稀薄,血凝时间延长;骨髓呈黄白色。采取了病鸡的10份血清,100倍稀释后进行CAV DOT-DIGFA检测。检测程序如下:
(1)点样:取1uL CAV层析抗原点在NC膜(0.45um硝酸纤维素膜)斑点中央,室温下自然干燥0.5h,用PBS洗3min、除去未吸附上的抗原。
(2)封闭:将点样后的NC膜浸于封闭液(0.01Mol/L、pH7.4PBS,含5%BSA、0.5%Tween-20)中,37℃作用下30min,用PBS洗3min、除去未吸附的封闭液、晾干;
(3)加待检血清:加待检血清标本100uL于NC膜的点样处,37℃作用下30min。
(4)加金标抗体:加金标兔抗鸡IgG 100UL,37℃作用下15min,用去离子水洗3min。
(5)银加强染色:NC膜浸入硝酸银显影液中、室温下避光作用10min,移入定影液中、室温下作用5min,然后用去离子水冲洗,自然干燥后观察结果。
(6)结果判定:若与金标抗体作用20min,经银染色后NC膜上呈现红色斑点的则为阳性、黑色斑点为强阳性,否则为阴性。
结果NC膜上呈现红色斑点,表明10份血清均为阳性。由于该鸡群从未做过CAV免疫,说明感染了CAV。
实施例2:某鸡场的鸡发生死亡,经剖检发现,股骨的骨髓被脂肪组织取代,呈脂肪色、淡黄色。胸腺萎缩甚至完全退化,颜色呈深红褐色,法氏囊的外壁呈半透明状态,肝脏肿胀、褪色,腺胃黏膜出血,疑似为鸡传染性贫血。随机采集了20只鸡的血清,100倍稀释后用DOT-DIGFA方法进行CAV抗体检测。检测步骤如下:
取1uL CAV层析抗原点在NC膜(0.45um硝酸纤维素膜)斑点中央,室温下自然干燥0.5h,用PBS洗3min、除去未吸附上的抗原;
将点样后的NC膜浸于封闭液(0.01mol/L、pH7.4PBS,含5%BSA、0.5%Tween-20)中,37℃作用下30min,用PBS洗3min、除去未吸附的封闭液、晾干;
加待检血清标本100uL于NC膜的点样处,37℃作用下30min;加金标兔抗鸡IgG 100uL,37℃作用下15min,用去离子水洗3min;
银加强染色:NC膜浸入硝酸银显影液中、室温下避光作用10min,移入定影液中、室温下作用5min,然后用去离子水冲洗,自然干燥后观察结果。
结果判定:若与金标抗体作用20min,经银染色后NC膜上呈现红色斑点的则为阳性、黑色斑点为强阳性,否则为阴性。
结果NC膜上呈现红色斑点,表明20份血清均为阳性。由于该鸡群从未做过CAV免疫,说明感染了CAV。
Claims (2)
1.一种鸡传染性贫血病毒抗体斑点免疫胶体金渗滤试验检测方法,其特征是,按照下述步骤进行:
(1)点样:取1uL鸡传染性贫血病毒(CAV)层析抗原点在NC膜斑点中央,室温下自然干燥0.5h,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3min、除去未吸附上的抗原;
其中CAV层析抗原按照下述步骤制备:
a、CAV VP1基因的克隆及原核表达载体的构建:根据发表的CAV VP1基因组序列分别设计引物,以CAV天津分离TJBD 33株为模板,采用聚合酶链式反应方法扩增出690bp的DNA片段;将扩增的DNA片段纯化后克隆至pGM-TEasy载体中构建重组克隆质粒;通过酶切、克隆将CAV VP1基因片段分别插入原核表达载体,转化感受态大肠杆菌DH5α,用聚合酶链式反应方法挑选阳性菌落,培养后提取表达CAV VP1基因的重组质粒;
b、CAV VP1表达蛋白的制备:将上述阳性菌落接种于Luria-Bertani(LB)液体培养基中培养至OD600值为0.6,然后加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)于26℃条件下诱导3.5h,获得表达CAV VP1蛋白的菌体;培养表达重组蛋白的细菌,裂解后用几丁柱方法进行纯化,得到CAV层析抗原;
(2)封闭:将点样后的NC膜浸于封闭液中,封闭液为0.01Mol/L、pH7.4的PBS溶液,PBS溶液中含5%牛血清白蛋白(BSA)、0.5%吐温-20(Tween-20),在37℃下作用30min,用PBS溶液洗3min、除去未吸附的封闭液后晾干;
(3)加待检血清:加待检血清标本100uL于NC膜的点样处,37℃下作用30min;
(4)加金标抗体:加金标兔抗鸡免疫球蛋白(IgG)100uL,37℃作用下15min,用去离子水洗3min;
其中金标兔抗鸡免疫球蛋白(IgG)按照下述步骤制备:
a、胶体金颗粒的制备:分别按要求制备A液和B液;A液:1%HAuCl4水溶液1mL加入79mL双馏水中混匀;B液:1%枸橼酸三钠4mL,0.1Mol/LK2CO3 0.025mL,1%鞣酸0.1mL,双馏水15.875mL;将A液、B液分别加热至60℃,在电磁搅拌下迅速将B液加入A液中,溶液变蓝,继续加热搅拌、煮沸直至溶液呈亮红色且颜色再不发生变化为止,室温下冷却,分装为每份1mL保存于4℃;
b、金标兔抗鸡IgG的制备与纯化:分别取10mL上述胶体金溶液和兔抗鸡IgG抗体,并将胶体金和兔抗鸡IgG抗体溶液分别以0.1Mol/L K2CO3调pH至9.0,在电磁搅拌下将兔抗鸡IgG抗体溶液,加入胶体金溶液混合,搅拌10min,并加入一定量5%BSA使溶液终浓度为1%,以防止兔抗鸡IgG抗体与胶体金聚合发生沉淀;将胶体金兔抗鸡IgG结合物先1500r/min 4℃离心30min,弃掉由凝聚形成的沉淀;将上清液于4℃、15000r/min离心1h,小心吸取上清液并弃掉,取沉淀;将沉淀物用含1%BSA、0.05%NaN3的0.01Mol/L pH8.2的PB液重悬沉淀至原量,于4℃下平衡过夜,然后重复4℃、15000r/min离心1h一次,再将沉淀物重悬为原来体积的1/5,分装为每份10mL后于4℃保存;
(5)银加强染色:NC膜浸入硝酸银显影液中、室温下避光作用10min,移入定影液中、室温下作用5min,然后用去离子水冲洗,自然干燥后观察结果;
(6)结果判定:若与金标抗体作用20min,经银染色后NC膜上呈现红色斑点的则为阳性、黑色斑点为强阳性,否则为阴性。
2.根据权利要求1所述的鸡传染性贫血病毒抗体斑点免疫胶体金渗滤试验检测方法,其特征是,所述NC膜为0.45um的硝酸纤维素膜。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 200710057469 CN101059516A (zh) | 2007-05-25 | 2007-05-25 | 鸡传染性贫血病毒抗体斑点免疫胶体金渗滤试验检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 200710057469 CN101059516A (zh) | 2007-05-25 | 2007-05-25 | 鸡传染性贫血病毒抗体斑点免疫胶体金渗滤试验检测方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101059516A true CN101059516A (zh) | 2007-10-24 |
Family
ID=38865733
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN 200710057469 Pending CN101059516A (zh) | 2007-05-25 | 2007-05-25 | 鸡传染性贫血病毒抗体斑点免疫胶体金渗滤试验检测方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN101059516A (zh) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104730261A (zh) * | 2015-03-17 | 2015-06-24 | 孙素玲 | 一种鸡传染性贫血病毒检测胶体金试纸条 |
CN107942060A (zh) * | 2017-11-16 | 2018-04-20 | 广西大学 | 一种利用免疫胶体金渗滤法检测罗非鱼无乳链球菌抗体的方法 |
CN111537720A (zh) * | 2020-05-25 | 2020-08-14 | 浙江峻山生物科技有限公司 | 一种新型冠状病毒2019-nCoV IgM/IgG抗体联合检测试剂盒的制备方法 |
CN113875700A (zh) * | 2021-11-09 | 2022-01-04 | 福建省连江县刘氏兔业养殖场 | 一种新品系鸡的培育方法和应用 |
CN113897356A (zh) * | 2021-10-20 | 2022-01-07 | 佛山科学技术学院 | 一种检测鸡传染性贫血病毒荧光定量pcr试剂盒及引物 |
-
2007
- 2007-05-25 CN CN 200710057469 patent/CN101059516A/zh active Pending
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104730261A (zh) * | 2015-03-17 | 2015-06-24 | 孙素玲 | 一种鸡传染性贫血病毒检测胶体金试纸条 |
CN107942060A (zh) * | 2017-11-16 | 2018-04-20 | 广西大学 | 一种利用免疫胶体金渗滤法检测罗非鱼无乳链球菌抗体的方法 |
CN111537720A (zh) * | 2020-05-25 | 2020-08-14 | 浙江峻山生物科技有限公司 | 一种新型冠状病毒2019-nCoV IgM/IgG抗体联合检测试剂盒的制备方法 |
CN113897356A (zh) * | 2021-10-20 | 2022-01-07 | 佛山科学技术学院 | 一种检测鸡传染性贫血病毒荧光定量pcr试剂盒及引物 |
CN113897356B (zh) * | 2021-10-20 | 2024-04-30 | 佛山科学技术学院 | 一种检测鸡传染性贫血病毒荧光定量pcr试剂盒及引物 |
CN113875700A (zh) * | 2021-11-09 | 2022-01-04 | 福建省连江县刘氏兔业养殖场 | 一种新品系鸡的培育方法和应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101059516A (zh) | 鸡传染性贫血病毒抗体斑点免疫胶体金渗滤试验检测方法 | |
CN112011544B (zh) | 在日本血吸虫童虫中高表达的基因及其编码蛋白与应用 | |
CN112080506B (zh) | 在日本血吸虫童虫中高表达的基因及其编码蛋白与应用 | |
Anderson et al. | Specific identification of enteroviruses by immuno-electron microscopy using a serum-in-agar diffusion method | |
CN110257276B (zh) | 一种惰性载体大肠杆菌及其潜在应用 | |
CN113322302B (zh) | 一种hbv完整病毒颗粒的免疫捕获分子检测方法 | |
CN106483190A (zh) | 快速准确鉴定样品中微生物的方法 | |
CN103245783A (zh) | 一种猪2型细环病毒抗体胶体金快速诊断试纸及其制备方法 | |
CN102586157A (zh) | 一种高通量富集、捕获副溶血性弧菌的方法 | |
CN113637781B (zh) | 猪易感相关致病菌检测的lamp引物组及基于此的试剂盒和lamp芯片和应用 | |
CN102680699B (zh) | 鉴别i群禽腺病毒感染的elisa检测方法 | |
CN104263839A (zh) | 布鲁氏杆菌 lamp-lfd检测试剂盒及其检测方法 | |
CN109507258B (zh) | 一种电化学免疫传感器及其制备方法和其应用 | |
CN108226495A (zh) | 一种基于金纳米探针鉴定单个肺炎衣原体的方法 | |
CN114088943B (zh) | 一种用于检测克氏原螯虾白斑综合征病毒的金纳米探针及其制备方法和应用 | |
CN111996238A (zh) | 一种运用电化学发光扫描成像系统的新发病毒痕量检测方法 | |
CN114778852B (zh) | 一种检测prrsv plp2抗体的间接elisa方法 | |
Wang et al. | Preparation of a visual protein chip for detection of IgG against Treponema pallidum | |
CN116430039A (zh) | 一种用于检测新型冠状病毒的受体试剂及其应用 | |
RU2778251C2 (ru) | Рекомбинантный химерный белок, состоящий из большой экстраклеточной петли человеческого рецептора CD81 и стрептавидина | |
RU2717336C1 (ru) | Способ выявления днк torque teno mini virus рода betatorquevirus семейства anelloviridae в крови и других биоматериалах методом пцр-рв | |
CN1257409C (zh) | 白斑症病毒快速检测试剂盒及其制备使用方法 | |
CN109799345B (zh) | 一种基于病毒样颗粒的c型口蹄疫病毒抗体竞争elisa检测试剂盒 | |
RU2715860C1 (ru) | Способ выявления днк torque teno midi virus рода gammatorquevirus семейства anelloviridae в крови и других биоматериалах методом пцр-рв | |
CN102329894A (zh) | 凡纳滨对虾诺达病毒现场快速检测试剂盒及检测方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20071024 |