CN113322302B - 一种hbv完整病毒颗粒的免疫捕获分子检测方法 - Google Patents

一种hbv完整病毒颗粒的免疫捕获分子检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113322302B
CN113322302B CN202110613870.6A CN202110613870A CN113322302B CN 113322302 B CN113322302 B CN 113322302B CN 202110613870 A CN202110613870 A CN 202110613870A CN 113322302 B CN113322302 B CN 113322302B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
hbv
magnetic
magnetic beads
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110613870.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113322302A (zh
Inventor
汪德强
刘俊叶
黄爱龙
伍晓莉
邹春红
师悦嫄
毛胜蓝
王雯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chongqing Medical University
Original Assignee
Chongqing Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chongqing Medical University filed Critical Chongqing Medical University
Priority to CN202110613870.6A priority Critical patent/CN113322302B/zh
Publication of CN113322302A publication Critical patent/CN113322302A/zh
Priority to PCT/CN2022/080846 priority patent/WO2022252745A1/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113322302B publication Critical patent/CN113322302B/zh
Priority to US18/475,264 priority patent/US20240018611A1/en
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供一种HBV完整病毒颗粒的免疫捕获分子检测方法，以羧基磁珠为介质，将特异性抗体与羧基磁珠偶联，进行病毒颗粒捕获分离，再进行QPCR检测。实验显示，本发明方法可以成功将样本中的病毒颗粒捕获分离，并且因磁珠偶联抗体的不同，可以将样本中不同组分的病毒颗粒区分。通过本发明方法，意外发现细胞上清、血清中病毒粒子成分有所不同，细胞上清中HBV DNA主要来源于衣壳病毒，完整病毒颗粒含量较少；而血清标本中衣壳病毒含量低于完整病毒颗粒。随着血清中HBV DNA拷贝数的增加，其血清中完整病毒颗粒的含量明显增加，提示完整病毒颗粒的检测可能作为新的血清标志物。

Description

一种HBV完整病毒颗粒的免疫捕获分子检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及HBV完整病毒颗粒，具体涉及一种HBV完整病毒颗粒的免疫捕获分子检测方法。
背景技术
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是一种具有双链DNA基因组的假逆转录病毒。其重要的特征是HBV感染肝细胞后可以分泌多种形式的病毒颗粒，大致可以分为包含基因组及无基因组的病毒粒子。根据基因组的种类又可以分为HBV RNA类病毒粒子、HBVDNA病毒粒子与无基因组病毒粒子。以有无乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)为标准，又可以将不同基因组的病毒粒子划分为核衣壳病毒、包膜化病毒与亚病毒粒子。其中最具代表性的有亚病毒颗粒、NCs(nucleocapsid)颗粒、HBV RNA病毒粒子与完整病毒颗粒(HBV Dane颗粒)。NCs主要为包裹基因组的核衣壳病毒，根据包裹的基因组种类的不同分为成熟与不成熟两种，成熟的NCs包裹双链脱氧核糖核酸(double-stranded DNA，dsDNA)，而未成熟的NCs含有的基因组则为HBV复制中间体。研究显示只有成熟的NCs才能被包膜化形成完整病毒颗粒(Ning X,Nguyen D,Mentzer L,et al.Secretion of genome-free hepatitis Bvirus-single strand blocking model for virion morphogenesisof para-retrovirus[J].Plos Pathogens,2011,7(9):e1002255)。HBV血清中含有较多的亚病毒颗粒，其主要成分为丰富的HBsAg蛋白(Heermann KH,Goldmann U,Schwartz W,etal.Large surface proteins of hepatitis B virus containing the pre-s sequence[J].Journal of Virology,1984,52(2):396)，它可以与宿主细胞分泌的表面抗体(hepatitis B surface antibody，HBsAb)反应，减少血清中HBsAb的含量，从而阻断这些抗体对HBV Dane颗粒的清除(Rydell GE,Prakash K,Norder H,et al.Hepatitis B surfaceantigen on subviral particles reduces the neutralizing effect of anti-HBsantibodies on hepatitis B viral particles in vitro[J].Virology,2017,509:67-70)。HBV Dane是一种球形颗粒，直径约为42nm，外含包膜蛋白(大、中、小表面蛋白)，内由乙肝核心抗原(hepatitis B virus core antigen,HBcAg)包裹部分双链DNA(partiallydouble-stranded DNA，rcDNA)形成的核衣壳组成。与HBsAg病毒颗粒相比，前者包含丰富的大表面蛋白(Large protein，Lp)，Lp蛋白是成熟NCs包膜化和完整病毒颗粒分泌不可缺少的成分(Bruss V,Ganem D.The role of envelope proteins in hepatitis B virusassembly[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1991,88(3):1059-63)。迄今为止，HBV Dane颗粒被认为是HBV分泌的多种病毒粒子中唯一具有传染性的病毒颗粒。其传染性大致有两个原因，一是包膜蛋白上含有可与肝细胞受体结合的结构域，从而介导HBV的感染；二为HBVDane颗粒可以将其内部携带的完整基因组运送到新的肝细胞，从而造成持续性感染。HBV不同形式的病毒粒子在病毒生命周期中各司其职，都有自己独特的作用，其中HBV Dane颗粒是HBV存在传染性最重要的成分，而NCs颗粒是保证其正确形成的关键性粒子。
技术方面，目前区分这些病毒颗粒的方法大多为密度梯度离心法，该方法缺乏相应的特异性，也尚未有直接的证据核实这些病毒颗粒的存在。临床方面，HBV的难以消除是由于共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的存在，因此对HBV的检测除了金标准肝组织活检外，主要为cccDNA的检测，而cccDNA的检测分直接检测与替代指标检测，如下图1所示，虽然上述的血清标志物对疾病检测有一定的指导作用，但也各自具有一定的局限性。基于HBV感染性主要源于完整病毒颗粒的原则，因此，HBV完整病毒颗粒的检测可能更能反应cccDNA的真实活性状态。而目前与HBV完整病毒颗粒相关的检测指标主要有LP与HBV DNA，因为这些方法只是对HBV Dane颗粒的部分结构进行检测，因此也存在不足。如HBV大蛋白的检测易出现假阳性，并且只能近似反映但不能代表HBV Dane的含量；现有的DNA检测方法只能检测血清中HBV DNA的总拷贝数，无法区分这些DNA来源于哪部分病毒颗粒，而存在感染性的HBV DNA主要包含在HBV Dane颗粒中。因此，HBV DNA的水平并不能代表真实的感染状态。综上可知，HBV Dane颗粒的检测至关重要。但是到目前为止，关于HBV完整病毒颗粒检测的研究甚少。基于此现状，很有必要建立一种HBV完整病毒颗粒直接检测的方法。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明提供一种HBV完整病毒颗粒的免疫捕获分子检测方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种HBV完整病毒颗粒的免疫捕获分子检测方法，包括抗体-磁珠偶联、HBV病毒粒子捕获和实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,QPCR)检测步骤，其特征在于：所述抗体-磁珠偶联为在缓冲液中将羧基磁珠、NHS与等量EDC混合反应以活化磁珠，在偶联缓冲液中将活化的磁珠与抗体混合反应，得到抗体-磁珠偶联反应物；所述抗体选自PreS1抗体或/和HBc抗体。
进一步，抗体-磁珠偶联步骤中磁珠活化的温度为25℃。待偶联的抗体用MES溶液稀释，抗体终浓度为0.6g/L。
更进一步，所述抗体-磁珠偶联步骤为：取磁珠至EP管中，磁力分离，用MES缓冲液洗涤3次；施加磁场，去上清，将NHS与等量EDC溶液迅速加入EP管中，剧烈震荡，25℃持续活化磁珠30min；借助磁力架，用MES溶液洗涤磁珠3次；将待偶联的抗体用MES溶液稀释至抗体终浓度为0.6g/L；活化好的磁珠用MES溶液重悬，剧烈摇晃，保证磁珠全部分散；取活化磁珠悬液，分5次加入稀释好的抗体悬液中，每次加入磁珠后,立即温和混匀，4℃，温和旋转混匀4h；配制5％的BSA溶液(10mL MES溶液+0.5g BSA)；施加磁场，将上清移去，迅速向管中加入BSA封闭液，25℃温和旋转30min；借助磁力架，用PBS将磁珠清洗三次；向管中转移保存液，将磁珠悬起，4℃保存。
根据本发明的一个实施方案，上述HBV病毒粒子捕获为样本中加入抗体磁珠偶联物，混匀，在25℃条件下结合40min进行病毒粒子捕获。
进一步，所述HBV病毒粒子捕获为取已偶联好的抗体磁珠保存液，磁力分离弃上清，PBS洗涤两次；取细胞上清或乙肝患者血清至EP管中，PBS稀释；向稀释的样本中加入抗体磁珠偶联物，混匀，25℃旋转结合40min进行病毒粒子捕获(复合物)。
根据本发明的一个实施方案，上述实时荧光定量PCR的程序为50℃UNG酶反应2min，1个循环；94℃Taq酶活化5min，1个循环；94℃变性15s，45个循环；57℃退火、延伸、荧光采集30s，45个循环；25℃仪器冷却10s，1个循环。
上述实时荧光定量PCR为：捕获的复合物用50μL PBS重悬后，转移到PCR 8联管中，借助PCR板磁力架，去上清；将所需试剂提前避光放置室温，设置标准品A-D、阴、阳性对照，8联管每孔加5μL样本释放剂，瞬时离心，敲打混匀，避光静置10min；制备PCR混合液，每人份：38μL反应液+2μL酶混合液+0.2μL内标；按照以下程序进行QPCR循环扩增检测：50℃UNG酶反应2min，1个循环；94℃Taq酶活化5min，1个循环；94℃变性15s，45个循环；57℃退火、延伸、荧光采集30s，45个循环；25℃仪器冷却10s，1个循环。
有益效果：
灵敏快捷的病毒检出方法对疾病的诊断是至关重要的。目前为止，实验室常用的对HBV病毒颗粒富集、分离的方法主要包括：超速离心法与PEG8000沉淀法。虽然超速离心法已被认为是一种较成熟的病毒分离、浓缩的方法，但仍存在耗时长，与PCR的兼容性差(假阳性数量增多)、降低病毒感染性等问题(Kobayashi S,Natori K,Takeda N,etal.Immunomagnetic capture rt-PCR for detection of norovirus from foodsimplicated in a foodborne outbreak[J].Microbiol Immunol,2004,48(3):201–204)。与之相比，沉淀法更加简单易行，但也会干扰随后的PCR扩增(J,SvobodováJ,LA,et al.A method for the preparation of purified antigens ofcoxsackievirus B3 from a large volume of cell culture supernatant[J].ActaVirol,1992,36(5):483–487)。故开发出新的操作更简单、兼容性更好的病毒富集、分离的检测方法是必要的。
本发明提供一种HBV完整病毒颗粒的免疫捕获分子检测方法，以羧基磁珠为介质，将特异性抗体与羧基磁珠偶联，进行病毒颗粒捕获分离，再进行QPCR检测。实验显示，本发明方法可以成功将样本中的病毒颗粒捕获分离，并且因磁珠偶联抗体的不同，可以将样本中不同组分的病毒颗粒区分。除此之外，随着加入的样本量与抗体-磁珠复合物的增加，可以达到病毒富集的效果。令人惊喜的是，通过本发明捕获方法，意外发现细胞上清、血清中病毒粒子成分有所不同，在细胞中NCs颗粒占较大比例，而血清中主要为HBV Dane颗粒，尤其是在高滴度血清载量时该现象尤为明显。细胞上清中NCs颗粒的高占比可能解释了细胞上清收集到的病毒感染性较低的原因。血清中NCs颗粒含量低的原因可能是因为大多数HBV感染患者的血液循环中具有强效和持久的抗核心抗体，因此，高免疫原性裸衣壳非常迅速地被清除。而且随着血清中HBV DNA拷贝数的增加，其血清中完整病毒颗粒的含量呈明显上升趋势，提示完整病毒颗粒的检测可能作为新的血清标志物。本发明具有重要的实用价值，值得临床大力推广。
附图说明
图1是现有技术的HBV检测方法分析图；
图2是偶联所需抗体梯度优化结果图；
图3是捕获病毒验证结果图；
图4是病毒捕获方法验证结果图；
图5是BC组病毒捕获体系优化结果图；
图6是BS组病毒捕获体系优化结果图；
图7是HepG2.2.15细胞中病毒粒子含量结果图；
图8是HepAD38细胞上清中病毒粒子含量结果图；
图9是血清样本中病毒粒子含量结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细地说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明所用原料及试剂均为市售产品。除特殊说明外，本发明所采用的百分数均为重量百分数。
主要试剂
主要仪器设备
主要耗材
主要试剂配制
实施例1
抗体-磁珠偶联
(1)剧烈震荡羧基磁珠，使其分散均匀。取3.3mg磁珠至2mL EP管中，磁力分离，用预冷MES缓冲液洗涤3次；
(2)施加磁场，去上清，将100μL NHS与等量EDC溶液迅速加入EP管中，剧烈震荡，25℃持续活化磁珠30min；
(3)借助磁力架，用预冷的MES溶液洗涤磁珠3次，并尽快用于抗体偶联；
(4)将待偶联的抗体用预冷MES溶液稀释至抗体终浓度约为0.6g/L，100μL；
(5)活化好的磁珠用100μL MES溶液重悬，剧烈摇晃，保证磁珠全部分散；
(6)每次取20μL活化磁珠悬液，分5次将活化磁珠悬液缓慢加入稀释好的抗体悬液中，每次加入磁珠后,立即温和混匀，4℃，温和旋转混匀4h；
(7)配制5％的BSA溶液(10mL MES溶液+0.5g BSA)；
(8)施加磁场，将上清移去，迅速向管中加入200μL BSA封闭液，25℃温和旋转30min；
(9)借助磁力架，用PBS将磁珠清洗三次；
(10)向管中转移120μL保存液，将磁珠悬起，4℃保存。
HBV病毒粒子的捕获
(1)取5μL上述已偶联好的抗体磁珠保存液，磁力分离弃上清，PBS洗涤两次；
(2)取细胞上清或乙肝患者血清5μL至2mL EP管中，PBS稀释至体系为500μL；
(3)向(2)中制好的样本中加入抗体磁珠偶联物，混匀，25℃旋转结合40min；
(4)施加磁场后，弃上清。将洗涤后的捕获物用PBS重悬，之后根据目的不同采用westernblot、QPCR等进行分析。
实时荧光定量PCR
(1)按上述方法捕获病毒，磁力分离，PBS 200μL洗涤2次；
(2)捕获的复合物用50μL PBS重悬后，转移到PCR 8联管中，借助PCR板磁力架，去上清；
(3)将所需试剂提前避光放置室温，方便后续使用；
(4)设置标准品A-D、阴、阳性对照，8联管每孔加5μL样本释放剂，瞬时离心，敲打混匀，避光静置10min；
(5)制备PCR混合液，每人份：38μL反应液+2μL酶混合液+0.2μL内标；
(6)QPCR循环参数设置
(7)运行。
核酸电泳
(1)配制1％的核酸凝胶；
(2)将上述QPCR产物作为样本，全部上样；
(3)恒压120V，20min；
(4)凝胶成像仪紫外拍照分析。
结果
病毒捕获原则
为了较特异的将HBV感染者体内不同的病毒颗粒分离出来，本发明开发了一种基于抗原抗体相互作用的免疫方法来捕获、分离不同的病毒粒子。据文献报道，PreS1被认为是HBV Dane特有的结构，NC颗粒因其基因组直接被HBc蛋白包裹形成核衣壳而未被包膜化，故可用HBc单克隆抗体对其进行识别。基于这一原理，发明人用分别偶联有PreS1、HBc鼠单克隆抗体的羧基磁珠与HBV患者血清孵育。在适当比例下，单克隆抗体与包膜蛋白或衣壳蛋白上相应的抗原形成复合物，磁力分离，弃上清，此时病毒被成功捕获到磁珠上，相应buffer重悬磁珠，用于后续相关实验研究。
磁珠偶联抗体浓度优化
不同的抗体由于其种类及氨基数量不同，与磁珠结合达到饱和时的浓度也不同。为了避免因磁珠偶联抗体量不同而造成的抗原捕获量的差异，首先对羧基磁珠偶联抗体所需浓度进行了优化。该实验所用的磁珠、PreS1抗体、HBc抗体浓度分别为2mg/mL、1mg/mL、2.7mg/mL。根据商品化羧基磁珠说明书推荐，18μg抗体可饱和1mg羧基磁珠。以此为标准，分别采用18μg、36μg、54μg、72μg、90μg、108μg的HBc抗体与1mg羧基磁珠偶联，将HBc抗体-磁珠偶联物及抗体偶联后的上清进行取样，考马斯亮蓝染色后对结果进行分析。如图2a)所示，当抗体的添加量增加时，其复合物中检测到的HBc抗体条带也逐渐加深。图2b)中，当HBc抗体量为54μg时(lane 3)，上清开始出现抗体条带，且条带的深浅趋势与加入的抗体总量、复合物中的Ab量一致，暗示着54μg HBc抗体可以饱和1mg羧基磁珠。本着节约试剂的原则，后续选用54μg HBc抗体与羧基磁珠偶联。基于同样的优化方法，图2c)显示，1mg羧基磁珠达到饱和所需的PreS1抗体约为18μg。
HBV病毒捕获方法验证
为了验证该磁珠(偶联有抗体)是否可以有效捕获HBV血清中核酸型的病毒粒子，对捕获产物进行QPCR定量后，以QPCR产物为样本进行核酸电泳。如图3，核酸结果显示，BP组(lane 2用偶联有无关抗体的磁珠捕获病毒)无目的条带，而BS组(lane 3用偶联有PreS1抗体的磁珠捕获病毒)、BC组(lane 4用偶联有HBc抗体的磁珠捕获病毒)与阳性对照组(lane5)均在100bp左右出现目的条带。综上，该课题建立的捕获体系是可行的。为了进一步验证该方法的特异性，以重组GST-PreS1蛋白、HBc蛋白的特异性抗体为探针，利用免疫印迹法对捕获物中的HBV病毒成分进行检测。HBV DNA型的NCs颗粒主要由HBc蛋白与HBV DNA组成，与之相比，HBV Dane颗粒还包含最外层的表面蛋白(S、M、L蛋白)。如图4，与阴性对照BP组相比，BS组在42kD处检测出PreS1蛋白(图a lane 4)(因为GST-PreS1不稳定，易降解，因此抗体纯度相比之下稍低)，约20kD处检测到HBc蛋白(图blane 4)，说明BS组捕获的病毒颗粒包含LHBs与HBc蛋白，结合核酸电泳结果，提示这部分病毒颗粒为HBV Dane颗粒。而BC组仅在约20kD处检测到目的条带(图b lane 5)，提示BC组可捕获NCs颗粒。总的来说，本发明开发的新捕获体系不仅可行，且具有较高的特异性。
HBV病毒捕获体系优化
基于抗原抗体反应的比例性原则，在对血清中HBV病毒颗粒的含量进行分析前，首先优化了抗原抗体反应所需最佳比例，以确保血清标本中不同成分病毒粒子被完全捕获。以一系列梯度体积(5μL、10μL、20μL、50μL、100μL)的107HBV DNA患者血清为样本，加入5μL抗体-磁珠复合物，病毒捕获40min，施加磁场，待磁珠用PBS清洗后，借助圣湘HBV核酸定量试剂盒对捕获物进行QPCR分析。图5、图6可以看出，BC组与BS组捕获产物的HBV拷贝数均随加入的血清体积的增加而呈上升趋势，表明5μL抗体-磁珠可以将血清中相应的病毒粒子完全捕获。本着微量的原则，后续实验将采用统一的捕获体系：5μL HBV标本(用500μL PBS稀释)，5μL抗体-磁珠悬液。
不同HBV病毒粒子在细胞上清中的含量
为了研究不同组分HBV DNA的动态变化，在HepG2.2.15与HepAD38两种稳定表达HBV的细胞系中，分别予以不同浓度梯度ETV(0.1μM、1μM、10μM及PBS对照组)预处理，24h后弃上清，代之以新鲜DMEM及不同浓度梯度的ETV。72h后将上清转移至EP管，分别用PreS1抗体-磁珠、HBc抗体-磁珠捕获上清中的病毒粒子后，对捕获产物进行QPCR检测。检测结果显示，当用ETV处理HepG2.2.15细胞后，上清液中HBV DNA的拷贝数以剂量依赖的方式减少(图7)，且BC组与BS组来源的HBV DNA拷贝数不同，BC组来源的DNA整体高于BS组，BC组DNA拷贝数的下降趋势与HBV DNA一致。以上研究成果意味着该捕获方法可以分离、捕获细胞上清中的病毒粒子。惊喜的是，该实验意外发现细胞上清中的HBV DNA可能主要来源于NCs颗粒，而HBV Dane颗粒的含量相对较少。在HepAD38细胞实验也得到相同结论(图8)。
外周血中不同HBV病毒粒子的含量
为了进一步探讨HBV不同病毒粒子在外周血中的含量，随机选取56例不同滴度的病人血清进行检测，如图9，QPCR结果显示，除个别病人外，与BC组相比，血清中BS组DNA含量较高，尤其是在高滴度血清载量时该现象尤为明显，而且随着血清中HBV DNA拷贝数的增加其血清中完整病毒颗粒的含量明显增加。

Claims (1)

1.一种非疾病诊断或治疗目的的HBV完整病毒颗粒的免疫捕获分子检测方法，其特征在于，采用如下步骤：
（1）抗体-磁珠偶联：
取磁珠至EP管中，磁力分离，用MES缓冲液洗涤3次；施加磁场，去上清，将NHS与等量EDC溶液迅速加入EP管中，剧烈震荡，25℃持续活化磁珠30 min；借助磁力架，用MES溶液洗涤磁珠3次；将待偶联的抗体用MES溶液稀释至抗体终浓度为0.6 g/L；活化好的磁珠用MES溶液重悬，剧烈摇晃，保证磁珠全部分散；取活化磁珠悬液，分5次加入稀释好的抗体悬液中，每次加入磁珠后，立即混匀，4℃，旋转混匀4 h；配制5%的BSA溶液；施加磁场，将上清移去，迅速向管中加入BSA封闭液，25℃旋转30 min；借助磁力架，用PBS将磁珠清洗三次；向管中转移保存液，将磁珠悬起，4℃保存；所述抗体选自PreS1抗体或/和HBc抗体；
（2）HBV病毒粒子捕获
取已偶联好的抗体磁珠保存液，磁力分离弃上清，PBS洗涤两次；取细胞上清或乙肝患者血清至EP管中，PBS稀释；向稀释的样本中加入抗体磁珠偶联物，混匀，25℃旋转结合40min进行病毒粒子捕获；
（3）实时荧光定量PCR：
捕获的复合物用50 μL PBS重悬后，转移到PCR 8联管中，借助PCR板磁力架，去上清；将所需试剂提前避光放置室温，设置标准品、阴性对照、阳性对照，8联管每孔加5 μL样本释放剂，瞬时离心，敲打混匀，避光静置10 min；制备PCR混合液，反应体系包括：38 μL反应液+2μL酶混合液+ 0.2 μL内标；按照以下程序进行QPCR循环扩增检测：50℃ UNG酶反应2min，1个循环；94℃ Taq酶活化5min，1个循环；94℃变性15s，45个循环；57℃退火、延伸、荧光采集30s，45个循环；25℃仪器冷却10s，1个循环。
CN202110613870.6A 2021-06-02 2021-06-02 一种hbv完整病毒颗粒的免疫捕获分子检测方法 Active CN113322302B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110613870.6A CN113322302B (zh) 2021-06-02 2021-06-02 一种hbv完整病毒颗粒的免疫捕获分子检测方法
PCT/CN2022/080846 WO2022252745A1 (zh) 2021-06-02 2022-03-15 一种免疫分子病毒颗粒检测试剂盒
US18/475,264 US20240018611A1 (en) 2021-06-02 2023-09-27 Immune molecule virus particle detection kit

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110613870.6A CN113322302B (zh) 2021-06-02 2021-06-02 一种hbv完整病毒颗粒的免疫捕获分子检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113322302A CN113322302A (zh) 2021-08-31
CN113322302B true CN113322302B (zh) 2023-08-11

Family

ID=77421404

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110613870.6A Active CN113322302B (zh) 2021-06-02 2021-06-02 一种hbv完整病毒颗粒的免疫捕获分子检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113322302B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114015725B (zh) * 2021-10-18 2024-04-26 重庆医科大学 一种新冠病毒SARS-CoV-2完整病毒颗粒的检测方法
CN114350855A (zh) * 2022-01-11 2022-04-15 重庆医科大学 一种免疫分子病毒颗粒检测试剂盒
CN114200127B (zh) * 2021-11-15 2024-04-02 杭州丹威生物科技有限公司 一种乙型肝炎病毒富集荧光pcr检测方法
CN115786326B (zh) * 2022-11-04 2023-10-03 重庆医科大学 一种病毒核酸提取试剂盒及利用该试剂盒提取完整病毒颗粒核酸的方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1694898A (zh) * 2002-09-06 2005-11-09 株式会社先端生命科学研究所 可形成颗粒的乙型肝炎病毒前核心蛋白
CN202141725U (zh) * 2011-06-09 2012-02-08 中国人民解放军第四军医大学 一种定性/定量检测乙型肝炎病毒表面抗原的磁珠免疫层析试剂盒
CN102816754A (zh) * 2012-07-16 2012-12-12 北京利德曼生化股份有限公司 提取乙肝病毒核酸的方法
CN103805574A (zh) * 2014-01-26 2014-05-21 江西农业大学 一种基于免疫磁珠富集水体甲肝病毒的方法
CN107674910A (zh) * 2017-09-22 2018-02-09 北京旌准医疗科技有限公司 一种检测和评价抗hbv药物活性的方法及试剂盒
WO2020198071A1 (en) * 2019-03-22 2020-10-01 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
CN112526136A (zh) * 2020-11-03 2021-03-19 广州市达瑞生物技术股份有限公司 一种联合检测乙型肝炎病毒核心相关抗原的样本预处理液及试剂盒

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102978295B (zh) * 2012-08-30 2015-02-11 重庆西南医院 病原微生物核酸无扩增检测与分型方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1694898A (zh) * 2002-09-06 2005-11-09 株式会社先端生命科学研究所 可形成颗粒的乙型肝炎病毒前核心蛋白
CN202141725U (zh) * 2011-06-09 2012-02-08 中国人民解放军第四军医大学 一种定性/定量检测乙型肝炎病毒表面抗原的磁珠免疫层析试剂盒
CN102816754A (zh) * 2012-07-16 2012-12-12 北京利德曼生化股份有限公司 提取乙肝病毒核酸的方法
CN103805574A (zh) * 2014-01-26 2014-05-21 江西农业大学 一种基于免疫磁珠富集水体甲肝病毒的方法
CN107674910A (zh) * 2017-09-22 2018-02-09 北京旌准医疗科技有限公司 一种检测和评价抗hbv药物活性的方法及试剂盒
WO2020198071A1 (en) * 2019-03-22 2020-10-01 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
CN112526136A (zh) * 2020-11-03 2021-03-19 广州市达瑞生物技术股份有限公司 一种联合检测乙型肝炎病毒核心相关抗原的样本预处理液及试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
杨朝晔等主编.乙型肝炎病毒.《全国高职高专护理类专业"十三五"规划教材 病原生物与免疫学》.中国医药科技出版社,2018,第176卷第234-238页. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113322302A (zh) 2021-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113322302B (zh) 一种hbv完整病毒颗粒的免疫捕获分子检测方法
Klingmüller et al. Hepadnavirus infection requires interaction between the viral pre-S domain and a specific hepatocellular receptor
Naoumov et al. Precore mutant hepatitis B virus infection and liver disease
Taylor et al. Replication of human hepatitis delta virus in primary cultures of woodchuck hepatocytes
McCaustland et al. Application of two RNA extraction methods prior to amplification of hepatitis E virus nucleic acid by the polymerase chain reaction
US8383333B2 (en) HBV precore protein capable of forming particles
KR950012971B1 (ko) 비-A, 비-B 간염 비루스 게놈 cDNA 및 항원 폴리펩티드
CN114350855A (zh) 一种免疫分子病毒颗粒检测试剂盒
Gudima et al. Assembly of hepatitis delta virus: particle characterization, including the ability to infect primary human hepatocytes
Boldorini et al. PCR detection of JC virus DNA in the brain tissue of a 9-year-old child with pleomorphic xanthoastrocytoma
Alberti et al. Full and empty Dane particles in chronic hepatitis B virus infection: relation to hepatitis B e antigen and presence of liver damage
Satoh et al. Virus concentration using polyethyleneimine-conjugated magnetic beads for improving the sensitivity of nucleic acid amplification tests
CN102121009A (zh) 特异结合丙型肝炎病毒核心蛋白的核酸适体及其应用
Coulepis et al. The polypeptides of hepatitis A virus
CN104004763A (zh) 一种亲和丙型病毒性肝炎核心蛋白的核酸适体及其应用
WO2012134416A2 (en) Peptide ligands
Dienes et al. Analysis of the precore DNA sequence and detection of precore antigen in liver specimens from patients with anti-hepatitis B e-positive chronic hepatitis
CN104181297B (zh) 一种检测羊伪狂犬病毒抗体的elisa试剂盒
US20240018611A1 (en) Immune molecule virus particle detection kit
Chesebro et al. Purification and infrastructure of Aleutian disease virus of mink
KR20170012141A (ko) 시험관내에서 생성된 바이러스의 정제 방법 및 그 바이러스에 대한 제거 분석 방법
Tratschin et al. Characterization and classification of virus particles associated with hepatitis A. III. Structural proteins
Gandhi et al. Hepatitis B virions isolated with antibodies to the pre‐S1 domain reveal occult viremia by PCR in Alaska Native HBV carriers who have seroconverted
JP4292670B2 (ja) 抗ＨＢｃ抗体の免疫測定法
CN105203769A (zh) 基于磁性分离和量子点标记的人肺炎衣原体快速检测方法和试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant