KR20170012141A - 시험관내에서 생성된 바이러스의 정제 방법 및 그 바이러스에 대한 제거 분석 방법 - Google Patents
시험관내에서 생성된 바이러스의 정제 방법 및 그 바이러스에 대한 제거 분석 방법 Download PDFInfo
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Abstract
시험관내에서 생성된 바이러스의 정제 방법 및 그 바이러스에 대한 제거 분석 방법
본원에서는 시험관내에서 생성된 비외피형 또는 유사 외피형 바이러스를 적어도 한 종의 세정제를 갖는 조성물을 이용하여 정제하는 방법이 제공된다. 또한, 다수의 세정제들을 사용할 수 있는 정제 방법 및 시료내의 비외피형 또는 유사 외피형 바이러스의 존재 및/또는 수준을 측정하는 방법이 제공된다.
본원에서는 시험관내에서 생성된 비외피형 또는 유사 외피형 바이러스를 적어도 한 종의 세정제를 갖는 조성물을 이용하여 정제하는 방법이 제공된다. 또한, 다수의 세정제들을 사용할 수 있는 정제 방법 및 시료내의 비외피형 또는 유사 외피형 바이러스의 존재 및/또는 수준을 측정하는 방법이 제공된다.
Description
우선권 및 관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2015년 7월 23일 자로 출원된 미국 가출원 제 62/196,004호의 우선권의 이점을 주장하며, 상기 가출원은 그 전체가 본원에 참조로 특별히 포함된다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 전자 서식의 서열 목록과 함께 출원된다. 그 서열 목록은 크기가 1,081 바이트이고, 2016년 5월 31일 자로 생성되고 2016년 5월 31일 자로 최종 수정된 DURC6_007AUS_SEQLIST.txt 라는 제목의 파일로서 제공된다. 그 서열 목록의 전자 서식 내의 정보는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
분야
본 발명은 바이러스학의 분야에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 세포 배양물에서 증식되고 바이러스 제거(virus clearance) 연구에서 사용되는 E형 간염 바이러스(hepatitis E virus; HEV), A형 간염 바이러스(hepatitis A virus; HAV) 및 돼지 파보바이러스(porcine parvovirus; PPV)와 같은 비외피형(non-enveloped) 또는 유사 외피형(pseudo-enveloped) 바이러스의 정제 방법에 관한 것이다.
관련 기술의 설명
모든 혈액 및 혈장 유래 제품의 임상적 사용은 감염성 혈중 병원균을 전달하는 잠재적인 위험이 있다. 그 위험의 완화는 혈액 및 혈장 유래 제품의 제조 공정 시 병원균 감소 단계를 실시함으로써 달성될 수 있다. 이러한 병원균 감소 단계의 유효성을 개발 및 입증하기 위하여, 바이러스 제거(virus clearance) 연구가 수행된다. 이러한 연구 동안에, 알려진 양의 바이러스가 혈액 또는 혈장 생성물 중간체 내로 스파이크(spike)된 다음, 그 스파이크된 시료는 병원균 감소 단계를 포함하는 제조 공정의 벤치 규모 모델(축소 모델)을 이용하여 처리된다. 병원균 감소 단계 동안의 바이러스 감소 및/또는 제거는 그 단계 전과 후의 바이러스의 양을 비교함으로써 결정된다.
바이러스 제거 데이터의 유효성을 확인하기 위하여, 그 축소 모델은 대규모 단위 조작을 정확히 나타내야 하고 그 바이러스 스파이크는 잠재적인 오염물을 대표하여야 한다. 예를 들어, 바이러스 스파이크의 시험관내 배양은 혈청을 필요로할 수 있고, 그 바이러스 스파이크내의 혈청의 존재는 무혈청 생성물 중간체를 이용하는 제거 연구에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 외래 숙주 세포막, 단백질 및 핵산과 같은 비바이러스성 오염물들의 존재는, 생성물 중간체가 아마도 고도로 정제되는 하류측 단계 동안 바이러스 제거의 정확한 평가를 방해할 수 있다. 그러므로, 축소 모델의 성능 및 적절성에 영향을 미칠 수 있는 바이러스 스파이크 오염물을 제거하는 것이 중요하다.
요약
몇몇 실시예에서, 본 발명은 비외피형(non-enveloped) 또는 유사 외피형(pseudo-enveloped) 바이러스를 포함하는 시료를 세정제(detergent)로 처리하는 방법에 기초하여, 세포 배양물에서 증식된 비외피형 또는 유사 외피형 바이러스를 정제하는 방법을 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 세포 배양물에서 증식된 바이러스는 A형 간염 바이러스(HAV) 이다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 세포 배양물에서 증식된 바이러스는 돼지 파보바이러스(PPV) 이다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 세포 배양물에서 증식된 바이러스는 E형 간염 바이러스(HEV) 이다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 바이러스는 시험관내 세포 배양물에서 생성된다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 시험관내 세포 배양물은 확립된 세포주를 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 확립된 세포주는 HepG2 (ATCC 번호 HB-8065) 및 HepG2/C3A (ATCC 번호 CRL-10741)로 이루어진 군에서 선택된다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 세정제는 도데실 황산 리튬, Triton X-100 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, Triton X-100의 농도는 0.5% 이고, 도데실 황산 리튬의 농도는 0.1% 이다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 처리 단계는 1 시간 동안 수행된다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 시료는 청정화된 바이러스-감염 세포 용해물 현탁액(clarified virus-infected cell lysate suspension)의 초원심분리(ultra-centrifugation)로부터 얻은 상등액이다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 선택적으로, 상기 시료는 상기 시료는 청정화된 바이러스-감염 세포 용해물 현탁액의 트랜스 플로우(transflow) 여과로부터 얻은 잔류물이다.
시료내의 비외피형 또는 유사 외피형 바이러스의 수준을 측정하는 방법으로서, 상기 방법은 a) 세포주 및 배양 배지를 포함하는 혼합물에 상기 시료를 제공하는 단계; b) 비외피형 또는 유사 외피형 바이러스가 상기 시료 내에 존재하는 경우 이를 증식시키도록 배양하여 배양된 부분을 얻는 단계; c) 적어도 한 종의 세정제로서 처리하여 처리된 부분을 얻는 단계; d) 상기 처리된 부분의 일부를 회수하여 회수된 부분을 얻는 단계; e) 상기 회수된 부분 내의 비외피형 또는 유사 외피형 바이러스의 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 시료는 포유동물로부터 얻어진다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 시료는 혈장 또는 혈액을 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 비외피형 또는 유사 외피형 바이러스는 HAV 이다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 비외피형 또는 유사 외피형 바이러스는 PPV 이다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 비외피형 또는 유사 외피형 바이러스는 HEV 이다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 바이러스는 확립된 세포주를 포함하는 시험관내 세포 배양물에서 증식된다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 세포주는 HepG2 (ATCC 번호 HB-8065) 및 HepG2/C3A (ATCC 번호 CRL-10741)로 이루어진 군에서 선택된다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 시료는 상기 배양 부분의 일부를 막을 통해 트랜스 플로우 여과하여 얻은 제 1 잔류물을 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 선택적으로, 상기 시료는 상기 배양 부분의 일부를 막을 통해 트랜스 플로우 여과하여 제 1 잔류물을 얻고 상기 제 1 잔류물을 원심분리하여 얻은 제 1 상등액을 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 시료는 적어도 한 종의 세정제 또는 선택적으로 세정제들의 혼합물로서 처리되어 제 1 용액을 얻고, 상기 방법은 a) 상기 제 1 용액을 원심분리하여 얻은 제 1 펠릿을 제공하고; b) 상기 제 1 펠릿을 PBS(인산염 완충 염수)에 재현탁하여 얻은 제 2 용액을 제공하고; c) 상기 제 2 용액을 청정화하여 얻은 제 3 용액을 제공하고; d) 상기 제 3 용액을 막을 이용하여 여과하여 얻은 제 1 여과액을 제공하고; e) 상기 제 1 여과액을 한외여과하여 얻은 제 2 잔류물을 제공하는 것을 추가로 포함하고, 상기 제 2 잔류물은 상기 처리된 부분을 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 비외피형 또는 유사 외피형 바이러스의 수준을 측정하는 것은 생물학적 물질을 검출하는 것을 포함하고, 상기 생물학적 물질은 바이러스의 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 폴리펩티드 서열을 포함하고, 상기 생물학적 물질은 HEV 리보핵산이다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 생물학적 물질을 측정하는 것은 a) 상기 처리 부분의 일부를 용해 용액과 혼합하여 얻은 HEV 리보핵산을 포함하는 제 1 반응 혼합물을 제공하고; b) 상기 제 1 반응 혼합물에 제 1 시약을 첨가하여 얻어지고, HEV 리보핵산에 상보적인 데옥시리보핵산을 포함하는 제 2 반응 혼합물을 제공하고; c) 상기 데옥시리보핵산 내의 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 제 2 시약을 상기 제 2 반응 혼합물에 첨가하고; d) 상기 데옥시리보핵산 내의 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 제 3 시약을 상기 제 2 반응 혼합물에 첨가하고; e) 상기 데옥시리보핵산 내의 제 2 및 제 3 시약에 둘러싸인 서열을 증폭하고; f) 상기 증폭된 서열의 농도를 측정하는 것을 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 제 2 시약 및 제 3 시약은 하기의 것들로 이루어진 군에서 선택된 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다:
a) 5'-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3'(서열번호 1);
b) 5'-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3'(서열번호 2) 및
c) 5'-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3'(서열번호 3).
몇몇 실시예에서, 본 발명은 비외피형 또는 유사 외피형 바이러스를 포함하는 시료를 도데실 황산 리튬(LDS)과 같은 적어도 한 종의 음이온성 세정제, 또는 Triton X-100과 같은 적어도 한 종의 비이온성 세정제, 또는 상기 두 세정제들의 조합으로 처리하는 방법에 기초하여, 세포 배양물에서 증식된 비외피형 또는 유사 외피형 바이러스를 정제하여, 제거 연구에서의 그의 거동이 고도로 정제된 공정 흐름에 존재할 수 있는 것과 아마도 동일하거나 거의 동일한 바이러스를 얻는 방법을 포함한다. 몇몇 실시예에서, 전술한 방법의 몇몇 실시예들에 의해 생성된 바이러스는 혈액 및/또는 혈장 유래 단백질의 제조 공정에서 하류측 단계의 바이러스 감소 및/또는 제거 능력을 시험하기 위한 적절한 스파이크일 수 있다.
몇몇 실시예에서, 상기 처리 방법에 기초하여 세포 배양물에서 생성된 바이러스를 정제하는 방법은 바이러스 감염 물질을 청정화하고; 상기 혼합물의 적어도 일부를 막을 통해 트랜스 플로우 여과하여 제 1 잔류물을 얻고; 상기 제 1 잔류물을 원심분리하여 제 1 상등액을 얻는 것을 포함한다. 상기 처리 방법은 상기 제 1 상등액을 적어도 한 종의 세정제로 처리하여 제 1 용액을 얻는 것을 포함하고; 상기 방법은 상기 처리 후, 상기 제 1 용액을 원심분리하여 제 1 펠릿을 얻고, 상기 제 1 펠릿을 재현탁하여 제 2 용액을 얻고; 상기 제 2 용액을 청정화하여 제 3 용액을 얻고; 상기 제 3 용액을 막을 이용하여 여과하여 제 1 여과액을 얻고; 상기 제 1 여과액을 한외여과하여, 회수될 처리 부분의 적어도 일부분을 제공하는 제 2 잔류물을 얻는 것을 추가로 포함하고; 상기 적어도 한 종의 세정제는 도데실 황산 리튬, Triton X-100 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되고; Triton X-100의 농도는 0.5% 이고, LDS의 농도는 0.1% 이고; 상기 제 1 상등액을 적어도 한 종의 세정제로서 처리하는 것은 1 시간 동안 수행된다.
몇몇 실시예에서, 상기 처리 방법에 기초하여 세포 배양물에서 생성된 바이러스를 정제하는 방법은 바이러스 감염 물질을 청정화하고, 상기 혼합물의 적어도 일부를 막을 통해 트랜스 플로우 여과하여 제 1 잔류물을 얻는 것을 포함한다. 상기 처리 방법은 상기 제 1 잔류물을 적어도 한 종의 세정제로 처리하여 제 1 용액을 얻는 것을 포함하고; 상기 방법은 상기 처리 후, 상기 제 1 용액을 원심분리하여 제 1 펠릿을 얻고; 상기 제 1 펠릿을 재현탁하여 제 2 용액을 얻고; 상기 제 2 용액을 청정화하여 제 3 용액을 얻고; 상기 제 3 용액을 막을 이용하여 여과하여 제 1 여과액을 얻고; 상기 제 1 여과액을 한외여과하여, 회수될 처리 부분의 적어도 일부분을 제공하는 제 2 잔류물을 얻는 것을 추가로 포함하고; 상기 적어도 한 종의 세정제는 도제실 황산 리튬, Triton X-100 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되고; Triton X-100의 농도는 0.5% 이고, LDS의 농도는 0.1% 이고; 상기 제 1 잔류물을 적어도 한 종의 세정제로 처리하는 것은 1 시간 동안 수행된다.
도 1은 본원에 개시된 몇몇 실시예에 따른 트랜스 플로우 여과 HEV (TFF HEV) 및 TFF 상등액 (Supe) HEV 바이러스 스파이크들의 제조를 도시한다.
도 2는 본원에 개시된 몇몇 실시예에 따라 제조한 TFF HEV 및 TFF Supe HEV 바이러스 스파이크들의 상대 순도를 도시한다.
도 3은 본원에 개시된 몇몇 실시예에 따른 TFF HEV, Triton TFF HEV 및 Triton/LDS TFF HEV 바이러스 스파이크들의 제조를 도시한다.
도 4는 프라이머 및 프로브의 뉴클레오티드 서열을 도시한다.
도 2는 본원에 개시된 몇몇 실시예에 따라 제조한 TFF HEV 및 TFF Supe HEV 바이러스 스파이크들의 상대 순도를 도시한다.
도 3은 본원에 개시된 몇몇 실시예에 따른 TFF HEV, Triton TFF HEV 및 Triton/LDS TFF HEV 바이러스 스파이크들의 제조를 도시한다.
도 4는 프라이머 및 프로브의 뉴클레오티드 서열을 도시한다.
상세한 설명
비외피형 바이러스 HEV를 생성하기 위한 효율적인 세포 배양 시스템이 최근에 확립되었고, 데이터는 세포 배양 유래 HEV는 지질과 관련이 있다는 점에서 혈액에서 확인되는 HEV와 유사하다. 이와 같이, 미처리 청정화 세포 배양 용해물 또는 배양 상등액은 비교적 조제한(crude) 생성물 중간체를 이용한 상류측 단계의 제거 연구에서 바이러스 스파이크로 사용될 수 있었다. 그러나, 미처리 바이러스 스파이크의 사용은 공정 흐름의 순도가 비교적 높은 하류측 단계 동안의 HEV 제거의 평가에는 부적절할 수 있다.
본 발명은 하류측 제조 공정 단계에 대한 바이러스 제거 연구에 사용하기에 적당한 비교적 고순도 및 고역가의 HEV 스파이크를 제조하는 방법에 관한 것이다.
HEV를 시험관내 배양하는데 있어서의 어려움 때문에, 세포 배양에 기반한 HEV 감염성 분석은 예전에는 쉽게 이용될 수 없었다. 본원에 개시된 몇몇 실시예에서, 세포 배양물에서 고역가 HEV의 증식은 폴리브렌(polybrene)이 첨가된 배지를 이용함으로써 가능하게 된다.
기술적으로 HEV는 비외피형 바이러스인 것으로 여겨지고 있지만, 세포 배양물에서 증식된 HEV는 세포로부터 방출되기 때문에 흔히 막 단편/지질을 포함한다. 이러한 막 성분은 동결건조 케이크의 액상 가열 또는 건식 가열과 같은 살바이러스 처리로부터 그 바이러스를 보호한다. HEV는 Tween와 같은 세정제로서 처리되어 막 찌꺼기를 제거할 수 있지만, 그 처리된 바이러스는 흔히 가열 불활성화에 대하여 여전히 저항성이 있다.
몇몇 실시예에서, 세포 배양 HEV와 관련된 지질은 triton X-100을 이용한 처리를 통해 제거될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 세포 배양 HEV와 관련된 지질은 도데실 황산 리튬(LDS)을 이용한 처리를 통해 제거될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 세포 배양 HEV와 관련된 지질은 triton X-100 및 도데실 황산 리튬(LDS)의 조합을 이용한 처리를 통해 제거될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 얻어지는 바이러스 제제는 여전히 감염성이다. 몇몇 실시예에서, 상기 바이러스 제제에서 상기 외래(extraneous) 비바이러스성 성분의 농도가 감소된다. 몇몇 실시예에서, 상기 바이러스는 가열과 같은 살바이러스 처리를 통해 더욱 쉽게 불활성화될 수 있다.
HEV는 세포 배양물에서 세포변성 효과(CPE)를 나타내지 않는다. HEV 검출은 국립 건강 연구원(NIH)에 의해 최초로 개발된 PCR 분석법에 기초한다. 몇몇 실시예에서, PCR 분석법은 감도를 증가시키도록 변경되었다. 몇몇 실시예에서, PCR 분석에서 사용된 프라이머들 중 하나가 변경되었다. 몇몇 실시예에서, PCR 분석에서 사용된 역방향 프라이머가 변경되었다. 몇몇 실시예에서, PCR 분석에서 사용된 프로브가 재설계되었다. 완전히 새로운 프로브가 PCR 분석을 위해 설계되었다. 몇몇 실시예에서, PCR 분석은 바이러스 역가의 측정을 위해 시료를 양성 또는 음성으로 평가하도록 사용되었다.
몇몇 실시예에서, 본 발명은 폴리브렌이 첨가된 배지를 이용하여 세포 배양에서 고역가 HEV를 증식하고, 세포 배양 HEV를 Triton X-100/LDS로 처리하여 막 지질/찌꺼기(debris)를 제거하고, 민감성 PCR 분석을 통해 HEV를 검출하는 것을 포함한다.
몇몇 실시예에서, 상기 방법은 HEV에 대하여 특이적일 수 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 바이러스 증식 및 정제 방법은 다른 비외피형 바이러스에 적용될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 바이러스 증식 및 정제 방법은 다른 유사 외피형 바이러스에 적용될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 바이러스 증식 및 정제 방법은 HAV에 적용될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 바이러스 증식 및 정제 방법은 PPV에 적용될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 바이러스 증식 및 정제 방법은 HEV에 적용될 수 있다.
몇몇 실시예에서, 본 발명은 여러 제조 단계의 HEV 제거/불활성화 능력 및 중간 및 최종 생성물을 평가하기 위한 연구를 수행하기 위해 이용될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 본 발명은 다른 바이러스에 대한 여러 제조 단계의 제거/불활성화 능력 및 중간 및 최종 생성물을 평가하기 위한 연구를 수행하기 위해 이용될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 다른 바이러스는 비외피형 바이러스이다. 몇몇 실시예에서, 상기 다른 바이러스는 유사 외피형 바이러스이다. 몇몇 실시예에서, 상기 다른 바이러스는 HAV 및 PPV 이다.
몇몇 실시예에서, 본 발명은 HEV 유래의 혈액 및/또는 혈장과 같은 여러 의학 또는 임상 생성물의 안전성을 확보할 수 있다. 몇몇 실시예에서, 본 발명은 다른 바이러스 유래의 혈액 및/또는 혈장과 같은 여러 의학 또는 임상 생성물의 안전성을 확보할 수 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 다른 바이러스는 HAV 및 PPV 이다.
몇몇 실시예에서, 본 발명은 시험관 내에서 생성된 비외피형 또는 유사 외피형 바이러스의 정제 방법에 관한 것이다. 몇몇 실시예에서, 본 발명은 시험관 내에서 생성된 HEV의 정제 방법에 관한 것이다. 몇몇 실시예에서, 상기 정제는 도데실 황산 리튬 및/또는 triton X-100과 같은 적어도 한 종의 음이온성 및/또는 적어도 한 종의 비이온성 세정제를 포함하는 조성물을 이용한 세정제 처리 단계를 포함한다.
몇몇 실시예에서, 적어도 한 종의 세정제를 포함하는 조성물 내의 세정제는 비이온성 세정제인 것으로 생각된다. 몇몇 실시예에서, 세정제들의 조합을 포함하는 조성물 내의 한 종의 세정제는 비이온성이고 다른 세정제는 음이온성인 것으로 생각된다. 몇몇 실시예에서, 적어도 한 종의 음이온성 세정제를 포함하는 조성물 내의 세정제는 LDS 인 것으로 생각된다. 몇몇 실시예에서, 적어도 한 종의 비이온성 세정제를 포함하는 조성물 내의 세정제는 Triton X-100 인 것으로 생각된다. 바람직한 실시예에서, 상기 조성물은 한 종 이상의 세정제를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 상기 조성물은 적어도 두 종의 세정제를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 상기 조성물은 한 종의 음이온성 세정제 및 한 종의 비이온성 세정제를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 상기 음이온성 세정제는 LDS 이고, 상기 비이온성 세정제는 Triton X-100 이다.
몇몇 실시예에서, 적어도 한 종의 세정제가 본 발명의 정제 방법에서 그의 기능을 발휘하기에 충분한 농도로 사용된다. 몇몇 실시예에서, 두 종의 세정제가 본 발명의 정제 방법에서 그의 기능을 발휘하기에 충분한 농도로 사용된다. 몇몇 실시예에서, Triton X-100의 농도는 0.1% 내지 2.5% v/v의 범위이다. 바람직한 실시예에서, Triton X-100의 농도는 0.5% v/v 이다. 몇몇 실시예에서, LDS의 농도는 0.02% 내지 0.5% v/v의 범위이다. 바람직한 실시예에서, LDS의 농도는 0.1% v/v 이다.
몇몇 실시예에서, 한 종 이상의 세정제를 포함하는 조성물을 이용한 처리는 당업자에 의해 결정된 필요한 시간 동안 수행된다. 몇몇 실시예에서, 상기 처리;는 5 분 내지 1 일간 수행된다. 몇몇 실시예에서, 상기 처리는 10 분 내지 3 시간 동안 수행된다. 몇몇 실시예에서, 상기 처리는 1 시간 동안 수행된다.
가장 바람직한 실시예에서, 0.5%의 Triton X-100 및 0.1%의 LDS를 포함하는 조성물이 사용되고, 상기 조성물을 이용한 처리 단계는 1 시간 동안 수행된다. 몇몇 실시예에서, 상기 배양은 37℃에서 1 시간 동안 수행된다.
몇몇 실시예에서, 본 발명의 정제 방법을 수행하기 위한 출발 물질로서, 바이러스 감염된 세포 배양물로부터 얻어지는 것으로 청정화된 바이러스 감염 세포 용해물 현탁액 또는 바이러스 감염된 세포 배양 배지의 초원심분리로부터 얻은 상등액이 사용된다. 바람직한 실시예에서, 청정화된 바이러스 감염 세포 용해물 현탁액의 초원심분리로부터 얻은 상등액이 사용된다.
몇몇 실시예에서, 본 발명의 정제 방법을 수행하기 위한 출발 물질로서, 바이러스 감염된 세포 배양물로부터 얻어지는 것으로 청정화된 바이러스 감염 세포 용해물 현탁액 또는 바이러스 감염된 세포 배양 배지의 트랜스 플로우 여과(transflow filtration) 후에 얻은 잔류물이 이용된다. 바람직한 실시예에서, 청정화된 바이러스 감염 세포 용해물 현탁액의 트랜스 플로우 여과 후에 얻은 잔류물이 이용된다.
제 1 실시예에서, 상기 정제 방법은 하기의 단계들을 포함할 수 있다:
a) 출발물질을 청정화하는 단계;
b) 상기 단계 a)의 용액을 적절한 막을 통해 트랜스 플로우 여과하여 해당하는 잔류물을 얻는 단계;
c) 상기 단계 b)의 잔류물을 초원심분리하여 해당하는 상등액을 얻는 단계;
d) 상기 단계 c)의 상등액을 세정제 또는 세정제들의 혼합물로 처리하여 해당하는 용액을 얻는 단계;
e) 상기 단계 d)의 용액을 30% 수크로스 쿠션상에 놓고 적절한 속도로 적절한 시간 동안 초원심분리를 수행하여 해당하는 펠릿을 얻는 단계;
f) 상기 단계 e)의 용액을 적절한 체적의 PBS에 재현탁하여 해당하는 용액을 얻는 단계;
g) 상기 단계 f)의 용액을 청정화하여 해당하는 용액을 얻는 단계;
h) 상기 단계 g)에서 얻은 용액을 적절한 막을 이용하여 한외여과하여 해당하는 잔류물을 얻는 단계; 및
i) 상기 단계 h)의 잔류물을 여과하는 단계.
바람직한 실시예에서, 단계 a)에서, 상기 출발 물질은 0.45 ㎛ 공극 크기를 갖는 필터를 통해 청정화된다.
바람직한 실시예에서, 단계 b)에서, 상기 트랜스 플로우 여과를 수행하기 위해 사용된 막은 300 kDa 막이다.
바람직한 실시예에서, 단계 c)에서, 초원심분리는 85,000 xg에서 1.5 시간 동안 수행된다.
바람직한 실시예에서, 단계 d)에서, 세정제들의 혼합물이 사용되는 경우, 그 세정제들의 혼합물은 0.5% Triton X-100 및 0.1% LDS를 포함한다.
바람직한 실시예에서, 단계 e)에서, 초원심분리는 100,000 xg에서 8 시간 동안 수행된다.
바람직한 실시예에서, 단계 f)에서 펠릿은 PBS 재현탁되는 것으로 생각된다.
바람직한 실시예에서, 단계 g)에서, 단계 f)의 용액은 0.2 ㎛ 공극 크기를 갖는 필터를 통해 청정화된다.
바람직한 실시예에서, 단계 h)에서, 한외여과에 사용된 막은 100 kDa 막이다.
바람직한 실시예에서, 단계 i)에서, 여과는 0.2 ㎛ 공극 크기의 필터를 통해 수행된다.
제 2 실시예에서, 정제 방법은 하기의 단계들을 포함할 수 있다:
a) 출발 물질을 청정화하는 단계;
b) 상기 단계 a)의 용액을 적절한 막을 통해 트랜스 플로우 여과하여 해당하는 잔류물을 얻는 단계;
c) 상기 단계 b)의 잔류물을 세정제 또는 세정제들의 혼합물로 처리하여 해당하는 용액을 얻는 단계;
d) 상기 세정제 처리된 용액을 적절한 속도로 적절한 시간 동안 초원심분리하여 해당하는 펠릿을 얻는 단계;
e) 상기 단계 d)의 펠릿을 적절한 체적의 PBS에 재현탁하여 해당하는 용액을 얻는 단계;
f) 상기 단계 e)의 용액을 청정화하여 해당하는 용액을 얻는 단계;
g) 상기 단계 f)에서 얻은 용액을 적절한 막을 이용하여 한외여과하여 해당하는 잔류물을 얻는 단계; 및
h) 상기 단계 g)의 잔류물을 여과하는 단계.
바람직한 실시예에서, 단계 a)에서, 출발 물질은 0.45 ㎛ 공극 크기의 필터를 통해 청정화된다.
바람직한 실시예에서, 단계 b)에서, 상기 트랜스 플로우 여과를 수행하기 위해 사용된 막은 300 kDa 막이다.
바람직한 실시예에서, 단계 c)에서, 세정제들의 혼합물이 사용되는 경우, 그 세정제들의 혼합물은 0.5% Triton X-100 및 0.1% LDS 이다.
바람직한 실시예에서, 단계 d)에서, 초원심분리는 85,000 xg에서 1.5 시간 동안 수행된다.
바람직한 실시예에서, 단계 e)에서, 상기 펠릿은 PBS에 재현탁된다.
바람직한 실시예에서, 단계 f)에서, 상기 단계 e)의 용액은 0.2 ㎛ 공극 크기의 필터를 통해 청정화된다.
바람직한 실시예에서, 단계 g)에서, 상기 한외여과에서 사용되는 막은 100 kDa 막이다.
바람직한 실시예에서, 단계 h)에서, 여과는 0.2 ㎛ 공극 크기의 필터를 통해 수행된다.
본 발명은 시험관내에서 생성된 비외피형 또는 유사 외피형 바이러스의 정제 방법에서 LDS 및/또는 Triton X-100의 용도에 관한 것이다. 몇몇 실시예에서, 상기 바이러스는 비외피형이다. 몇몇 실시예에서, 상기 바이러스는 유사 외피형이다.
바람직한 실시예에서, 상기 시험관내에서 생성된 바이러스는 HEV. 몇몇 실시예에서, 상기 시험관내에서 생성된 바이러스는 HEV 이외의 바이러스일 수 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 시험관내에서 생성된 바이러스는 HAV 이다. 몇몇 실시예에서, 상기 시험관내에서 생성된 바이러스는 PPV 이다. 가장 바람직한 실시예에서, 상기 시험관내에서 생성된 바이러스는 HEV 이다.
몇몇 실시예에서, 전술한 시험관내 생성은 시험관내 배양물에서 생성된다. 몇몇 실시예에서, 상기 시험관내 배양은 시험관내 장기, 조직 또는 세포 배양물이다. 바람직한 실시예에서, 상기 시험관내 생성은 시험관내 세포 배양물에서 수행된다.
몇몇 실시예에서, 1차 세포 배양물이 사용된다. 몇몇 실시예에서, 세포 배양주가 사용된다. 1차 세포 및 세포 배양주는 임의의 유기물 유래일 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시예에서, 곤충 세포의 사용이 생각된다. 몇몇 실시예에서, 포유동물 세포의 사용이 생각된다. 바람직한 실시예에서, 인간 세포 배양주가 사용된다.
바람직한 실시예에서, 간 세포주가 HEV 생성 및 정제를 위해 사용된다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 신장 세포주가 HEV 생성 및 정제를 위해 사용된다. 몇몇 실시예에서, 상기 간 세포주는 건강하거나 질병이 있는 간에서 유래될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 간 세포주는 악성 또는 양성 세포주일 수 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 신장 세포주는 건강하거나 질병이 있는 신장에서 유래될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 신장 세포주는 악성 또는 양성 세포주일 수 있다. 바람직한 실시예에서, 확립된 세포주가 사용된다. 몇몇 실시예에서, 상기 세포는 HepG2 (ATCC 번호 HB-8065) 이다. 몇몇 실시예에서, 상기 세포는 HepG2/C3A (ATCC 번호 CRL-10741) 이다.
몇몇 실시예에서, HEV 감염 분석(infectivity assay)이 사용된다. 몇몇 실시예에서, ~8 log10 감염 역가를 갖는 바이러스 스파이크가 제조될 수 있다. 상기 분석은 비교적 짧은 시간(3 내지 7일) 동안 수행된다. PCR 배경이 거의 관찰되지 않았고, 4 log10 이상의 감소가 입증될 수 있다. 따라서, 몇몇 실시예에서, PCR-기반 바이러스 검출 분석이 사용된다. 몇몇 실시예에서, PCR-기반 HEV 검출 분석이 사용된다.
추가의 바람직한
실시예
- 1
몇몇 실시예에서, 세포 배양물에서 증식된 비외피형 또는 유사 외피형 바이러스를 제조하는 방법은 상기 비외피형 또는 유사 외피형 바이러스를 포함하는 시료를 한 종 이상의 세정제를 포함하는 조성물로 처리하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 세포 배양물에서 증식된 바이러스는 HAV 이다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 세포 배양물에서 증식된 바이러스는 PPV 이다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 세포 배양물에서 증식된 바이러스는 HEV 이다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 바이러스는 시험관내 세포 배양물에서 생성된다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 시험관내 세포 배양물은 확립된 세포주를 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 확립된 세포주는 HepG2 (ATCC 번호 HB-8065) 및 HepG2/C3A (ATCC 번호 CRL-10741)로 이루어진 군에서 선택된다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 세정제 처리는 도데실 황산 리튬 및/또는 Triton X-100을 이용하여 수행된다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, Triton X-100의 농도는 0.5% 이고, LDS의 농도는 0.1% 이다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 처리 단계는 1 시간 동안 수행된다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 시료는 청정화된 바이러스 감염된 세포 용해물 현탁액의 초원심분리로부터 얻은 상등액이다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 선택적으로 상기 시료는 청정화된 바이러스 감염된 세포 용해물 현탁액의 트랜스 플로우 여과로부터 얻은 잔류물이다.
추가의 바람직한
실시예
- 2
몇몇 실시예에서, 시료내의 비외피형 또는 유사 외피형 바이러스의 수준을 측정하는 방법은 하기의 단계들을 포함한다:
a) 세포 및 배양 배지를 포함하는 혼합물에 상기 시료를 제공하는 단계;
b) 상기 비외피형 또는 유사 외피형 바이러스가 상기 시료내에 존재하는 경우 이를 증식시키도록 배양하여 배양된 부분을 얻는 단계;
c) 적어도 제 1 세정제로 처리하여 처리된 부분을 얻는 단계;
d) 상기 처리된 부분의 일부를 회수하여 회수된 부분을 얻는 단계; 및
e) 상기 회수된 부분내의 상기 비외피형 또는 유사 외피형 바이러스의 수준을 측정하는 단계.
상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 시료는 포유동물로부터 얻어진다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 시료는 혈장 또는 혈액을 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 비외피형 또는 유사 외피형 바이러스는 HAV 이다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 비외피형 또는 유사 외피형 바이러스는 PPV 이다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 비외피형 또는 유사 외피형 바이러스는 HEV 이다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 바이러스는 세포 배양물에서 생성된다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 세포는 HepG2 (ATCC 번호 HB-8065) 및 HepG2/C3A (ATCC 번호 CRL-10741)로 이루어진 군에서 선택된다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 시료는 상기 배양된 부분의 일부를 막을 통해 트랜스 플로우 여과하여 얻은 제 1 잔류물을 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 시료는 상기 배양된 부분의 일부를 막을 통해 트랜스 플로우 여과하여 제 1 잔류물을 얻고 상기 제 1 잔류물을 원심분리하여 얻은 제 1 상등액을 선택적으로 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 시료는 적어도 제 1 세정제 또는 선택적으로 세정제들의 혼합물로 처리되어 제 1 용액을 얻는다. 몇몇 실시예에서, 상기 방법은
a) 상기 제 1 용액을 원심분리하여 얻은 제 1 펠릿을 제공하고;
b) 상기 제 1 펠릿을 PBS에 재현탁하여 얻은 제 2 용액을 제공하고;
c) 상기 제 2 용액을 청정화하여 얻은 제 3 용액을 제공하고;
d) 상기 제 3 용액을 막을 통해 여과하여 얻은 제 1 여과액을 제공하고;
e) 상기 제 1 여과액을 한외여과하여 얻은 제 2 잔류물을 제공하는 것을 추가로 포함하고, 상기 제 2 잔류물은 상기 처리된 부분을 포함한다.
상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 외피형 또는 유사 외피형 바이러스의 수준을 측정하는 것은 생물학적 물질을 검출하는 것을 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 생물학적 물질은 바이러스의 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 생물학적 물질은 HEV 리보핵산이다. 상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 생물학적 물질을 측정하는 것은
a) 상기 처리 부분의 일부를 용해 용액과 혼합하여 얻은 HEV 리보핵산을 포함하는 제 1 반응 혼합물을 제공하고;
b) 상기 제 1 반응 혼합물에 제 1 시약을 첨가하여 얻어지고, HEV 리보핵산에 상보적인 데옥시리보핵산을 포함하는 제 2 반응 혼합물을 제공하고;
c) 상기 데옥시리보핵산 내의 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 제 2 시약을 상기 제 2 반응 혼합물에 첨가하고;
d) 상기 데옥시리보핵산 내의 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 제 3 시약을 상기 제 2 반응 혼합물에 첨가하고;
e) 상기 데옥시리보핵산 내의 제 2 및 제 3 시약에 둘러싸인 서열을 증폭하고;
f) 상기 증폭된 서열의 농도를 측정하는 것을 포함한다.
상기 방법의 몇몇 실시예에서, 상기 제 2 시약 및 제 3 시약은 하기의 것들로 이루어진 군에서 선택된 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다:
a) 5'-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3'(서열번호 1);
b) 5'-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3'(서열번호 2) 및
c) 5'-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3'(서열번호 3).
추가의 바람직한
실시예
- 3
몇몇 실시예에서, 바이러스의 청정화를 위하여, 동결된 조제 바이러스 스톡(frozen crude virus stock)이 사용된다. 몇몇 실시예에서, 농축 및 정제된 비외피형 바이러스 스톡을 제조하는 때, 0.5% Triton X-100 및 0.1% LDS가 해동된 조제 바이러스 스톡에 첨가되고 37℃에서 1 시간 동안 배양된다.
몇몇 실시예에서, 상기 해동된 조제 바이러스 스톡의 청정화는 3000 내지 8000 x g의 속도 및 2℃ 내지 8℃에서 15 내지 30분간의 원심분리를 통해 수행된다. 몇몇 실시예에서, 상기 상등액이 제거 및 유지되고, 펠릿이 버려진다. 몇몇 실시예에서, 상기 상등액은 300k Da 막을 통한 여과 전에 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과되고, TFF 잔류물이 회수된다.
몇몇 실시예에서, 초원심분리(ultracentrifugation)를 위하여, 상기 TFF 잔류물은 약 85000 x g의 속도 및 2℃ 내지 8℃에서 1.5 시간 동안 진동 버킷 로터(swinging bucket rotor) 내의 초원심분리 튜브에서 초원심분리된다. 몇몇 실시예에서, 상기 초원심분리로부터 얻은 상등액은 경사 분리되어 액상 폐기물로서 버려진다.
몇몇 실시예에서, 한외여과를 위하여, 상기 초원심분리 펠릿은 PBS와 같은 5 mL 이상의 완충액에 재현탁된다. 몇몇 실시예에서, 상기 펠릿 현탁액은 3000 내지 4200 x g 및 2℃ 내지 8℃에서 15 분간 청정화된다. 몇몇 실시예에서, 상기 상등액은 제거되고 Amicon® UF 필터 기기에 위치하여 농축된다. 몇몇 실시예에서, 필요한 경우, PBS와 같은 완충액이 최종 부피가 약 15 mL가 되도록 첨가된다(필터 용량은 15 mL 이다).
몇몇 실시예에서, 상기 필터 기기는 잔류한 시료(농축 및 정제된 바이러스 스톡)의 최종 체적이 1 mL 이하가 될 때까지 약 5000 x g 및 2℃ 내지 8℃에서 원심분리된다. 몇몇 실시예에서, 대략적인 원심분리 시간은 약 15 분 내지 약 60분 이다.
몇몇 실시예에서, 상기 농축 및 정제된 바이러스 스톡은 분취되고(aliquoted) -65℃ 이하에서 동결된다.
실시예
실시예
1:
TFF
-
HEV
스파이크의 제조
접선 유동 여과(Tangential flow filtration (TFF))는 생물분자들의 분리 및 농축을 위한 잘 알려진 과정이다. TFF 에 관한 추가의 정보는 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 다음문헌["Introduction to Tangential Flow Filtration for Laboratory and Process Development Applications" by Larry Schwartz et al. (pall.com/main/laboratory/literature-library-details.page?id=34212)]에서 쉽게 이용가능하다.
HEV-감염된 HepG2 또는 HepG2/C3A 세포를 2회 동결 및 해동하고 저속 원심분리 및 0.45 ㎛ 필터를 통한 통과에 의해 청정화했다. 그 청정화된 용액(~1 L)을 두 개의 300 kDa 막을 통한 TFF에 의해 10배 농축하고, 얻어지는 TFF 잔류물(~100 mL)을 약 85,000xg 및 4℃에서 90분간 회전(spin) 시켜서 바이러스를 펠릿화했다. 그 원심분리 상등액(~100 mL)을 회수하고 TFF-Supe HEV(실시예 2)로의 가공을 위해 보관하는 한편, 그 펠릿은 PBS에 재현탁했다. 다음에, 그 재현탁된 펠릿을 0.2 ㎛ 공극 크기 필터를 통해 여과하고 100 kDa 막을 통해 약 2 mL의 최종 체적으로 한외여과했다. 그 용액은 0.2 ㎛ 또는 0.1 ㎛ 필터를 통해 여과 멸균하고, TFF-HEV 스파이크 제제로서 사용시까지 5℃에서 보관했다.
실시예
2:
TFF
-상등액
HEV
(
TFF
-
Supe
HEV
) 스파이크의 제조
세포 배양물 유래의 HEV와 관련된 지질은 바이러스 부력(buoyancy)을 증가시킴으로써 초원심분리를 통한 바이러스 펠릿화 효율을 감소시킨다. 따라서, 본 발명의 몇몇 실시예에서, 관련 지질을 제거하고 바이러스 회수율을 증가시키기 위하여 Triton X-100 및 도데실 황산 리튬을 포함하는 세정제 혼합물이 HEV-함유 유체에 첨가된다.
실시예 1의 TFF 및 청정화 HEV=-감염 세포 용해물(~1 L)의 초원심분리로부터 얻은 약 100 mL의 초원심분리 상등액을, 37℃에서 30분 이상 동안 0.5% Triton X-100 및 0.1% LDS로 처리한 다음, 100,000xg 및 5℃에서 8 시간 동안 30% 수크로스 쿠션을 통해 초원심분리했다. 얻어지는 펠릿을 PBS에 재현탁하고, 0.2 ㎛ 공극 크기 필터를 통해 여과하고, 100 kDa 막을 통해 약 1 mL의 최종 체적으로 한외여과했다. 다음에, 그 용액을 0.2 ㎛ 또는 0.1 ㎛ 필터에 통과시킨 다음 TFF-Supe HEV 스파이크 제제로서 사용시까지 5℃에서 보관했다.
실시예
3:
실시예
1 및 2의 방법에 따라 생성된 바이러스 스파이크들의 순도의 비교
SDS-PAGE를 이용하여, 실시예 1 및 2의 방법에 따라 생성된 바이러스 스파이크들의 상대적 순도를 비교했다. 도 2에서 도시한 바와 같이, 분취량의 하기의 시료들을 A280 및 정량적 PCR을 위해 제거했다: 초기 조제(Crude) HEV, TFF 잔류물, 초원심분리 상등액, TFF-HEV 및 TFF-Supe HEV. TFF 잔류물 및 초원심분리 상등액은 A280에 의해 측정시 초기 조제 HEV 및 TFF-HEV 보다 10배 더 많은 단백질 및 TFF-Supe HEV 보다 40배 더 많은 단백질을 가졌다(도 2). 단백질 농도들이 상이하기 하지만, 초기 조제 시료를 제외한 모든 시료 내의 HEV RNA 의 농도는 약 9 log10 copies/mL (도 2). 따라서, 단백질(A280)에 대한 바이러스(HEV RNA)의 비로 나타낸 상대 순도는 초원심분리 상등액 및 TFF 잔류물의 경우보다는 TFF-Supe HEV 및 TFF-HEV의 경우에 아주 높았다.
시료들의 상대적 순도는 SDS-PAGE에 의해 시각화할 수 있었다(도 2). 시료들을 약 AU까지 희석 또는 농축한 다음, DTT 함유 시료 완충액에서 가열하고 4-20% 구배 겔 상에 로딩했다. 또한, 세포 배양 배지를 배경 대조구(background control)로 로딩했다. SDS-PAGE 후, 그 겔을 제거하고 Instant Blue로 염색했다. 그 결과는 TFF 잔류물 및 초원심분리 상등액에서 최고 불순물 수준을 나타낸다는 점에서 A280 및 PCR 데이터와 일치했다. 가장 풍부한 단백질은 약 70 kDa에서 밴드를 나타냈다. 이는 세포 배양 배지에서도 존재하므로, 이는 아마도 하류측의 제거 연구를 방해할 수 있는 비바이러스성 오염물, 우태혈청에서 확인되는 단백질, 및 세포 및 바이러스 증식을 위해 필요한 배지 첨가물이었다. 그 오염물의 대부분은 실시예 1 및 2에서 기재된 정제 방법 동안에 제거되었고, 그의 상대적 농도는 TFF Supe HEV에서 가장 낮았고 그 다음으로 TFF HEV에서 낮았다.
실시예
4:
실시예
1 및 2의 방법에 따라 생성된 바이러스 스파이크의 열적 안정성의 비교
실시예 1 및 2에 따라 제조된 TFF-HEV 및 TFF-Supe HEV 스파이크의 열적 안정성을 비교하기 위하여 실험을 수행했다. 두 바이러스 제제를 PBS에 스파이크하고 5℃, 60℃, 70℃ 또는 80℃에서 4 시간 동안 배양했다. 각 시험 용액으로부터 분취량을 제거하고 다음과 같이 적정했다. 시료의 계열 희석액을 제조하고 HepG2 또는 HepG2/C3A 세포가 접종된 웰(well)에 첨가했다. 바이러스를 37℃에서 1 시간 이상동안 흡착시키고 성장 배지를 첨가했다. 플레이트를 37℃에서 2일 이상 동안 배양한 다음, 웰로부터 배지를 흡입하고 완충액 (예, PBS)를 이용하여 세포를 2회 이상 세척/흡입하였다. 다음에, 그 플레이트를 Dynabeads® mRNA DIRECTTM Micro Kit (Life Technologies)를 이용하여 바이러스 RNA에 대하여 추출하거나 추출시까지 -65℃ 이하에서 보관했다. 추출 후, 그 삼출물(폴리 A RNA)을 PCR 증폭을 위헤 즉시 처리하거나 PCR 증폭에서 사용시까지 -65℃ 이하에서 보관했다.
전술한 바와 같은 프라이머 및 프로브를 이용한 일-단계 RT-PCR을 이용하여 시료내 HEV RNA를 검출했다. 각각의 반응에 대한 분석 조건은 다음과 같았다:
a) 시약; 5.0 ㎕ 4x TaqMan® Fast Virus 1-Step Master Mix (Life Technologies), 0.08 ㎕ 100 mM 프라이머 F+R, 0.04 ㎕ 100 mM 프로브, 0.4 ㎕ SUPERase In (Life Technologies), 4.4 ㎕ 물 및 10 ㎕ 주형 (전체 20 ㎕).
b) 반응: 52℃에서 10 분, 95℃에서 30 초, 및 95℃에서 15초 및 56℃에서 45초의 40 사이클.
AB 7500 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA) 및 동반 소프트웨어를 이용하여 제조사의 지시에 따라 PCR 및 사이클 문턱(Ct) 값 측정을 수행했다. 과거 데이터에 기반하여, 문턱값을 0.1로 수동으로 설정하여 이를 모든 표준 곡선의 지수 단계에 통과시키고 반응당 1 RNA 카피의 검출을 확보했다. HEV RNA의 존재를 나타내는 양성 PCR 신호를 문턱값이 교차되는 때 기록했다.
HEV 적정 플레이트의 모든 웰들은 양성 PCR 신호의 존재 여부에 따라 양성 또는 음성으로 기록했다. 다음에, 적절한 통계학적 방법인 Spearman-Karber, MPN 또는 Poisson을 이용하여 바이러스 역가를 TCID50/mL로서 계산했다.
| 바이러스 스파이크 | Log10 HEV 역가 | Log10 감소값 | |||||
| 5℃ | 60℃ | 70℃ | 80℃ | 60℃ | 70℃ | 80℃ | |
| TFF HEV | 3.8 | NT | 1.8 | 1.7 | NA | 2.0 | 2.1 |
| TFF Supe HEV | 4.8 | ≤0.8 | =0.8 | ≤0.8 | ≥4.0 | ≥4.0 | ≥4.0 |
* Log 감소값(LRV)은 5℃에서의 log10 HEV 역가로부터 60℃, 70℃ 또는 80℃에서의 log10 HEV 역가를 감하여 계산했다.
NT 시험되지 않음;
NA 적용불가.
표 1에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법의 실시예 (실시예 2)에 따라 바이러스 스파이크가 제조된 때 바이러스 불활성화는 60℃, 70℃ 또는 80℃에서의 검출 한계까지 수행되었다. 다른 한편으로, 실시예 1(현재 기술 상태의 방법, 세정제 처리 없음)에 따라 제조된 스파이크가 사용된 때, 70℃ 또는 80℃에서 4 시간 동안 가열후에도 바이러스가 여전히 존재했다.
공개된 보고의 데이터는 실시예 1에 따라 생성된 바이러스 스파이크의 열적 안정성이 자연계에서 확인되는 HEV의 거동과 상이하다는 것을 암시한다. 예를 들어, 인간 장내 바이러스는 알려진 대부분의 내열성 바이러스의 일부이고, 연구 결과 72℃에서 18.35, 5.44 및 7.39 초 동안의 가열 후 PBS 내로 스파이크된 A형 간염 바이러스, 폴리오바이러스 및 고양이 칼리시바이러스의 90% 불활성화가 확인되었다 (Suphachai N, Cliver DO. 2002. J Virol Methods 104: 217-225). 또한, 인간 HEV와 밀접한 관련이 있는 멧돼지 HEV를 함유하는 간 현탁액의 60℃에서 1 시간 동안의 가열은 4.42 log10 바이러스 감소의 결과를 나타냈다(Schielke A, et al. 2011. Virol Jol 8: 487-495). 따라서, 실시예 1의 방법(현재 기술 상태의 방법, 세정제 처리 없음)에 따라 생성된 HEV 스파이크는 바이러스 제거 연구에서 HEV의 임상 분리물의 감소를 정확히 평가할 수 없다.
다른 한편으로, 본 발명의 방법(실시예 2)에 따라 생성된 바이러스 스파이크는 자연계에서 확인되는 HEV의 경우와 유사하게 열처리에 의해 완전히 불활성화되었다. 이와 같이, 본 발명의 방법에 따라 제조된 바이러스는 바이러스 제거 연구에서 사용하기 위한 더욱 적절한 스파이크일 수 있다. 따라서, 몇몇 실시예에서, 바이러스 스파이크는 실시예 2의 방법에 따라 제조된다.
실시예
5: 건식 가열 실험에서
HEV
제조 방법 및 분석법의 적용
원리를 증명하기 위하여, TFF-HEV 및 TFF-Supe HEV 스파이크를 실시예 1 및 2에 가재된 바와 같이 제조하고, Factor VIII 농축물 제조 방법의 동결 건조/건식 가열 (FD/DH) 단계 동안 바이러스 감소 및/또는 제거를 평가하기 위하여 시험했다. FD/DH 단계는 제조 방법의 마지막 단계로서, 용매/세정제(S/D) 처리 단계의 하류측에 있다.
FD/DH 실험을 위하여, TFF-HEV 또는 TFF-Supe HEV 제제가 스파이크된 Factor VIII 농축물을 바이알에 분주하고 제조 규모에서와 동일한 동결 건조 사이클을 이용하여 벤치(bench) 규모 동결건조기에서 동결 건조했다. 다음에, 동결 건조된 바이알을 80℃ 오븐에 위치시키고 75 시간 이하의 시간 동안 건식 가열했다.
적정을 위한 바이러스 스파이크된 생성물의 바이알을 건식 가열이 없이 동결 건조 전(초기) 및 후 (FD/DH 0 시간), 동결 건조후 24 시간 동안의 건식 가열후(FD/DH 24 시간), 및 자유 건조 후 75 시간의 건식 가열후(FD/DH 75 시간)에 제거했다. 바이러스 스파이크된 FD/DH 생성물을 고순도 물을 이용하여 그의 최초 제적으로 재구성하고, 계열 희석하고, 96-웰 플레이크에 분주된 HepG2 또는 HepG2/C3A 세포에 접종했다. 바이러스를 흡착하고, 최종 오버레이 배지를 첨가하고, 그 플레이트를 37℃ 인큐베이터에서 3일 이하 동안 위치시켰다. 다음에, 적정 플레이트를 제거하고, 흡입하고, 바이러스 RNA에 대하여 추출하거나, 추출을 위해 사용시까지 -80℃에서 보관했다. 각각의 웰의 추출된 바이러스를 실시예 3에서 기재된 바와 같이 PCR을 이용하여 HEV에 대하여 분석했다. 적정 웰들을 HEV에 대하여 양성 또는 음성으로 기록하고, 바이러스 역가를 측정했다. 그 단계 동안 초기 및 최종 (FD/DH 75 시간) 바이알에서의 log10 바이러스 역가를 비교함으로써 Log10 HEV 감소를 계산했다.
| 바이러스 스파이크 | Log10 HEV 역가 | LRV | |||
| 초기 | FD/DH 0 시간 | FD/DH 24 시간 | FD/DH 75 시간 | ||
| TFF-HEV | 5.6 | 4.8 | 2.9 | 2.2 | 3.4 |
| TFF-Supe HEV | 5.2 | 4.7 | 1.4 | 0.6 | 4.6 |
* Log 감소 값(LRV)은 초기 log10 HEV 역가로부터 75 시간 FD/DH 처리 log10 HEV 역가를 감함으로써 계산했다.
상기 표 2에서 나탄낸 바와 같이, 두 스파이크 제제의 역가는 동결 건조 전 및 후에 유사했고 동결 건조에 의한 감소는 유의적이지 않았다(1 log10 미만). 이와 대조로, 80℃ 건식 열처리에 의한 바이러스 불활성화는 유의적이었고(1 log10 초과), TFF HEV (LRV = 3.4)의 경우보다 TFF-Supe HEV (LRV = 4.6)의 경우에 더 컸다. 실시예 1의 방법에 따라 제조한 TFF-HEV 스파이크내의 높은 수준의 오염물의 존재의 가능성은 열에 의한 불활성화로부터 바이러스를 보호할 수 없거나 단백질 막으로 싸여진 HEV RNA의 효율적인 파괴를 저해할 수 있었다.
FD/DH 처리의 마지막 단계를 위한 출발 물질은 두번째 단계에서 처리된 S/D 이므로, Factor VIII 농축물 제조 공정에서 존재할 수 있는 임의의 가능한 바이러스 오염물이 제거될 수 있고 아마도 TFF-HEV (실시예 1의 방법에 따라 제조)보다는 TFF-Supe HEV (실시예 2의 방법에 따라 제조)에 더욱 유사할 수 있다. 따라서, TFF-Supe HEV에 대한 LRV는 아마도 FD/DH 처리 단계의 HEV 감소 능력의 더욱 정확한 평가 기준이다.
실시예
6: 세정제 처리된
TFF
HEV
스파이크의 제조
TFF-Supe HEV를 제조하는 공정은 비교적 시간 소모적이다. 따라서, 세정제 처리를 위한 추가의 방법이 TFF HEV 스파이크 제조를 위해 개발되었다. 도 3에서 도시한 바와 같이, 본 발명의 몇몇 실시예에 따라, TFF 잔류물을 여러 세정제로 처리하는 단계가 85,000xg 및 5℃에서 1.5 시간 동안의 초원심분리 이전에 삽입되었다는 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 과정이 수행되었다. Triton TFF-HEV 제제를 37℃에서 1.5 시간 동안 0.5% Triton X-100과 함께 배양하면서 0.5% Triton X-100 + 0.1% LDS를 이용하여 Triton/LDS TFF-HEV 스파이크를 처리했다. 초원심분리 후, 펠릿 만이 바이러스 스파이크로 추가로 가공되었다. TFF-HEV 및 세정제 처리된 TFF-HEV를 제조하기 위한 방법들은 실시예 3에서 기재된 바와 같이 정제 과정에서 중간체 분획을 제거하고 바이러스에 대하여 적정함으로써 비교되었다. 그 결과들은 하기 표 3에서 보여진다.
| 바이러스 스파이크 | Log10 전체 HEV | |||
| 초기 | TFF 잔류물 | 초원심분리 상등액 | 최종 TFF-HEV 제제 | |
| TFF-HEV | 8.6 | 8.9 | 8.6 | 8.3 |
| Triton TFF-HEV | 8.6 | 8.9 | 9.1 | 6.8 |
| Triton/LDS TFF-HEV | 8.6 | 8.9 | 8.1 | 8.3 |
바이러스 회수율은 TFF-HEV 및 Triton/LDS TFF-HEV 공정들의 경우에 유사했는데, 최종 스파이크 제제는 약 8.3 log10의 HEV을 함유했다. 입력 바이러스의 대부분이 초원심분리 상등액 분획에서 상실되었기 때문에 Triton TFF-HEV 공정은 바이러스를 펠릿화하는데 있어서 덜 효율적이었고, 7 미만의 log10 HEV를 갖는 스파이크를 생성했다.
실시예
7: 액상 가열 실험에서
HEV
제조 방법 및 분석법의 적용
저온살균(pasteurization)은 알부민 제조 공정의 마지막 단계로서, 고도로 정제된 생성물의 바이알을 60℃에서 10 시간 이하 동안 가열하는 것을 포함한다. 바이러스를 실시예 6에서 기재한 바와 같이 제조하고 25% 알부민에 스파이크한 다음 5℃ 또는 60℃에서 7 시간 동안 배양했다. 다음에, 시료를 바이러스 적정을 위해 제거였고, 그 결과는 하기 표 4에서 보여진다. 비교로서, TFF-Supe HEV(실시예 2의 방법에 따라 제조)이 스파이크된 25% 알부민의 저온살균(60℃에서 10 시간)으로부터 얻은 결과도 나타낸다.
| 바이러스 스파이크 | 실험 번호 | Log10 HEV 역가 | LRV | |||
| 7 시간 | 10 시간 | |||||
| 5℃ | 60℃ | 5℃ | 60℃ | |||
| TFF-HEV | VM1910 | 5.6 | 3.3 | ND | ND | 2.3 |
| Triton TFF-HEV | VM1910 | 4.8 | 1.6 | ND | ND | 3.2 |
| Triton/LDS TFF-HEV | VM1910 | 6.1 | 2.3 | ND | ND | 3.8 |
| TFF-Supe HEV | VM1893 | ND | ND | 5.6 | 1.4 | 4.2 |
TFF-HEV는 내열성이 가장 높은 시험 바이러스로서, 열처리 후 단지 2.3의 log10 역가 감소를 나타냈다. Triton TFF-HEV에 대한 LRV는 그의 출발 역가가 TFF-HEV보다 약 1 log10 정도 더 낮긴 하였지만 약 1 log10 정도 더 높았다. Triton/LDS로 처리된 TFF-HEV에 대한 LRV는 세 개의 TFF-HEV 제제들 중에서 가장 높았는데, Triton/LDS로서 또한 처리된 바이러스 제제인 TFF Supe HEV이 스파이크된 알부민의 저온살균후에 달성된 감소보다 약간 더 낮았다.
실시예
8:
TFF
,
초원심분리
및
한외여과에
의한 바이러스의 농축 및 정제
바이러스의 청정화를 위하여, 동결된 조제 바이러스 스톡을 해동했다. 농축 및 정제된 비외피형 바이러스 스톡을 제조할 때, 0.5% Triton X-100 및 0.1% LDS 를 그 해동된 조제 바이러스 스톡에 첨가하고 37℃에서 1 시간 동안 배양했다. 3000 내지 8000 xg의 속도 및 2℃ 내지 8℃에서 15 내지 30분간 원심분리하여 청정화를 수행했다. 그 상등액을 제거 및 유지하고 그 펠릿을 버렸다. 그 상등액을 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과했다.
TFF를 위해, TFF 시스템을 세척하고 여과를 위해 준비했다. 여과된 바이러스 스톡을 청정화했다.
초원심분리를 위하여, TFF 잔류물을 초원심분리 튜브에 위치시켰다. 그, 튜브들을 중량이 서로 ± 0.05 g 이내에 있을 때까지 균형화했다. 그 튜브들을 진동 버킷 로터에 로딩하고 2℃ 내지 8℃ 및 약 85000 x g에서 1.5 시간 동안 원심분리했다. 초원심분리 과정의 종료시, 각각의 원심분리 튜브의 상등액을 조심스럽게 경사분리하고 액상 폐기물로서 버렸다. 그 튜브들을 반전시키고 실온에서 약 5분간 흡수 타올상에 유출시켰다. 유출 후, 그 타올을 오염물 제거하고 처리했다.
한외 여과를 위하여, 초원심분리 펠릿을 5 mL 이하의 PBS에 재현탁했다. 그 펠릿 현탁액을 3000 내지 4200 x g 및 2℃ 내지 8℃에서 15분간 청정화했다. 그 상등액을 제거하여 Amicon® UF 필터 기기에 위치시켜서 농축했다. 필요한 경우, PBS를 첨가하여 최종 체적을 약 15 mL로 조절했다(필터 용량이 15 mL 이다). 그 캐핑된 필터 기기를 원심분리 로터에 위치시키고 그 로터를 평형추로 균형잡았다. 유지된 시료(농축 및 정제된 바이러스 스톡)의 최종 체적이 1 mL가 될 때까지 약 5000 x g 및 2℃ 내지 8℃에서 원심분리를 수행했다(대략적인 원심분리 시간은 약 15 내지 60분이다).
정의
HepG2: 미국 종균협회로부터 얻은 간세포 암종 세포(ATCC 번호 HB-8065).
DMEM:
Dulbecco's Modified Eagle Medium.
FBS: 우태혈청(Fetal Bovine Serum).
역가(Titer): 용액 내 물질(바이러스)의 농도 또는 적정에 의해 측정된 이러한 물질의 강도.
SK: Spearman-Karber는 바이러스의 농도가 비교적 높은 시료내의 바이러스 역가를 계산하기 위한 통계학적 방법이다. 이러한 방법은 임의의 희석시 양성 웰들의 비율이 >25%인 경우에 사용된다(도 1).
MPN: Most Probable Number는 바이러스의 농도가 비교적 낮은 시료내의 바이러스 역가를 계산하기 위한 통계학적 방법이다. MPN은 임의의 희석시 양성 웰들의 비율이 <25%인 경우에 사용된다.
Poisson: Poisson은 바이러스의 농도가 아주 낮은 시료내의 바이러스 역가를 계산하기 위한 통계학적 방법이다. 이러한 방법은 양성 웰이 관찰되지 않는 때 사용된다.
ATCC: 미국 종균협회(American Type Culture Collection).
HEV TFF 잔류물: 이는 청정화된 HEV-세포 용해물이 300 kD TFF 막을 이용하여 농축된 후에 남아있는 물질이다. HEV TFF 잔류물은 TFF HEV 스파이크를 제조하기 위해 사용된다.
HEV TFF 상등액은 HEV TFF 잔류물을 약 84780 xg에서 원심분리한 후에 남아있는 유출물이다. HEV TFF 상등액은 TFF Supe HEV 스파이크를 제조하기 위해 사용된다.
TCID50은 50% 조직 배양 김염 투여량(종말점 희석 분석)에 해당한다. 이는 감염 숙주의 50%를 죽여서 접종 조직 배양 세포의 50%에서 세포병변 효과를 생성하는데 필요한 바이러스의 양을 정량화하는 감염성 바이러스 역가의 척도이다.
A280: 단백질 농도 및/또는 양을 나타내는 280 nm에서 측정한 흡광도.
AU: 흡광도 단위.
바이러스 스파이크: 알려진 바이러스 함량을 갖는 바이러스 시료.
참조문헌
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4. 미합중국 가특허출원 제 61/431,377호.
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6. 미합중국 특허출원 제
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<220>
<221> misc_feature
<222> (26)
<223> n = 3IABkFQ
<400> 3
ntttttacgc naggctgcca aggccn 26
Claims (27)
- 세포 배양물에서 증식된 비외피형 또는 유사 외피형 바이러스를 증식하는 방법으로서, 상기 비외피형 또는 유사 외피형 바이러스를 포함하는 시료를 세정제로 처리하는 단계를 포함하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 세포 배양물에서 증식된 바이러스가 E형 간염 바이러스(hepatitis E virus; HEV)인, 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 세포 배양물에서 증식된 바이러스가 A형 간염 바이러스(hepatitis A virus; HAV) 또는 돼지 파보바이러스(porcine parvovirus; PPV)인, 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 바이러스가 시험관내 세포 배양물에서 생성되는 것인, 방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 시험관내 세포 배양물이 확립된 세포주를 포함하는, 방법.
- 제 5 항에 있어서, 상기 확립된 세포주가 HepG2 (ATCC 번호 HB-8065) 및 HepG2/C3A (ATCC 번호 CRL-10741)로 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 세정제가 도데실 황산 리튬, Triton X-100 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
- 제 7 항에 있어서, Triton X-100의 농도가 0.5%이고, 도데실 황산 리튬의 농도가 0.1%인, 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 처리 단계가 1 시간 동안 수행되는, 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 시료가 청정화된 바이러스 감염된 세포 용해물 현탁액의 초원심분리로부터 얻은 상등액인, 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 시료가 청정화된 바이러스 감염된 세포 용해물 현탁액의 트랜스 플로우 여과로부터 얻은 잔류물인, 방법.
- 시료 내의 비외피형 또는 유사 외피형 바이러스의 수준을 측정하는 방법으로서,
a) 세포주 및 배양 배지를 포함하는 혼합물에 상기 시료를 제공하는 단계;
b) 상기 비외피형 또는 유사 외피형 바이러스가 상기 시료 내에 존재하는 경우 이를 증식시키도록 배양하여 배양된 부분을 얻는 단계;
c) 적어도 한 종의 세정제로서 처리하여 처리된 부분을 얻는 단계;
d) 상기 처리된 부분의 일부를 회수하여 회수된 부분을 얻는 단계;
e) 상기 회수된 부분 내의 비외피형 또는 유사 외피형 바이러스의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 방법. - 제 12 항에 있어서, 상기 시료가 포유동물로부터 얻어지는 것인, 방법.
- 제 13 항에 있어서, 상기 시료가 혈장 또는 혈액을 포함하는, 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 비외피형 또는 유사 외피형 바이러스가 HEV인, 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 비외피형 또는 유사 외피형 바이러스가 HAV 또는 PPV인, 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 바이러스가 확립된 세포주를 포함하는 시험관내 세포 배양물에서 배양되는, 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 세포주가 HepG2 (ATCC 번호 HB-8065) 및 HepG2/C3A (ATCC 번호 CRL-10741)로 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 시료가 상기 배양된 부분의 일부를 막을 통해 트랜스 플로우 여과하여 얻은 제 1 잔류물을 포함하는, 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 시료가 상기 배양된 부분의 일부를 막을 통해 트랜스 플로우 여과하여 제 1 잔류물을 얻고 상기 제 1 잔류물을 원심분리하여 얻은 제 1 상등액을 포함하는, 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 시료가 제 1 용액을 얻기 위하여 적어도 한 종의 세정제 또는 세정제들의 혼합물로 처리되는, 방법.
- 제 21 항에 있어서, 상기 방법은
a) 상기 제 1 용액을 원심분리하여 얻은 제 1 펠릿을 제공하고;
b) 상기 제 1 펠릿을 PBS에 재현탁하여 얻은 제 2 용액을 제공하고;
c) 상기 제 2 용액을 청정화하여 얻은 제 3 용액을 제공하고;
d) 상기 제 3 용액을 막을 이용하여 여과하여 얻은 제 1 여과액을 제공하고;
e) 상기 제 1 여과액을 한외여과하여 얻은 제 2 잔류물을 제공하는 것을 추가로 포함하고, 상기 제 2 잔류물은 상기 처리된 부분을 포함하는, 방법. - 제 12 항에 있어서, 상기 비외피형 또는 유사 외피형 바이러스의 수준을 측정하는 것은 생물학적 물질을 검출하는 것을 포함하는, 방법.
- 제 23 힝에 있어서, 상기 생물학적 물질이 바이러스의 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 폴리펩티드 서열을 포함하는, 방법.
- 제 24 항에 있어서, 상기 생물학적 물질이 HEV 리보핵산인, 방법.
- 제 25 항에 있어서,
상기 생물학적 물질을 측정하는 것은
a) 상기 처리된 부분의 일부를 용해 용액과 혼합하여 얻은 HEV 리보핵산을 포함하는 제 1 반응 혼합물을 제공하고;
b) 상기 제 1 반응 혼합물에 제 1 시약을 첨가하여 얻어지고, HEV 리보핵산에 상보적인 데옥시리보핵산을 포함하는 제 2 반응 혼합물을 제공하고;
c) 상기 데옥시리보핵산 내의 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 제 2 시약을 상기 제 2 반응 혼합물에 첨가하고;
d) 상기 데옥시리보핵산 내의 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 제 3 시약을 상기 제 2 반응 혼합물에 첨가하고;
e) 상기 데옥시리보핵산 내의 제 2 및 제 3 시약에 둘러싸인 서열을 증폭하고;
f) 상기 증폭된 서열의 농도를 측정하는 것을 포함하는, 방법. - 제 26 항에 있어서, 상기 제 2 시약 및 제 3 시약이 하기 a) 내지 c)로 이루어진 군에서 선택된 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법:
a) 5'-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3' (서열번호 1);
b) 5'-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3' (서열번호 2); 및
c) 5'-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3' (서열번호 3).
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