JP6734137B2 - インビトロにおいて生成したウイルスの精製方法及びウイルスのクリアランスアッセイ - Google Patents

インビトロにおいて生成したウイルスの精製方法及びウイルスのクリアランスアッセイ Download PDF

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Description

優先権及び関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる2015年7月23日に出願された米国特許仮出願第62/196,004号の優先権の利益を主張する。
配列表の参照
本出願は、電子形式の配列表と共に出願される。配列表は、「DURC6_007AUS_SEQLIST.txt」という表題のファイルで、大きさは1,081バイト、2016年5月31日に作成され、2016年5月31日に最終的に変更された。電子形式の配列表の情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、ウイルス学の分野に、より正確には細胞培養物中で増殖したE型肝炎ウイルス(HEV)、A型肝炎ウイルス(HAV)及びブタパルボウイルス(PPV)などのノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスの精製方法並びにウイルスクリアランス研究において使用するための方法に関する。
全血及び血漿由来生成物の臨床使用は、感染性の血液由来病原体が伝染し得る危険性を孕んでいる。危険性の軽減は、血液及び血漿由来生成物の製造方法において病原体減少工程を実行することによって実現することができる。このような病原体減少工程の有効性を向上させ実証するために、ウイルスクリアランス研究を実施する。これらの研究においては公知の量のウイルスを血液又は血漿生成物中間体にスパイクし、その後スパイクした試料は、病原体減少工程を含むベンチ規模モデル(小規模モデル)の製造方法を使用して処理する。病原体減少工程中のウイルス減少及び/又はクリアランスは、工程前後のウイルスの量を比較することによって決定する。
ウイルスクリアランスデータの妥当性を保証するために、小規模モデルは、大規模な単位操作を正確に表していなければならず、ウイルススパイクは、混入物の可能性を表しているべきである。例えば、インビトロにおけるウイルススパイクの培養には血清が必要であるが、ウイルススパイク中に血清が存在すると血清を含まない生成物中間体を必要とするクリアランス研究に影響を及ぼし得る。外来性宿主細胞膜、タンパク質及び核酸などの非ウイルス性の混入物の存在はまた、おそらく生成物中間体を高度に精製する下流工程中のウイルスクリアランスの正確な評価を妨害し得る。したがって、小規模モデルの性能及び適切性に影響を及ぼし得るウイルススパイク混入物を除去することが重要である。
Larry Schwartzらによる「Introduction to Tangential Flow Filtration for Laboratory and Process Development Applications」(pall.com/main/laboratory/literature-library-details.page?id=34212) Suphachai N、Cliver DO. 2002. J Virol Methods 104:217〜225頁 Schielke Aら、2011. Virol Jol 8:487〜495頁
いくつかの実施形態では、本発明は、ノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスを含む試料を界面活性剤で処理する方法に基づいて、細胞培養物中で増殖したノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスを精製する方法を含む。方法のいくつかの実施形態では、細胞培養物中で増殖したウイルスは、A型肝炎ウイルス(HAV)である。方法のいくつかの実施形態では、細胞培養物中で増殖したウイルスは、ブタパルボウイルス(PPV)である。方法のいくつかの実施形態では、細胞培養物中で増殖したウイルスは、E型肝炎ウイルス(HEV)である。方法のいくつかの実施形態では、ウイルスは、インビトロ細胞培養物中で生成する。方法のいくつかの実施形態では、インビトロ細胞培養物は樹立された細胞株を含む。方法のいくつかの実施形態では、樹立された細胞株は、HepG2(ATCC番号HB-8065)及びHepG2/C3A(ATCC番号CRL-10741)からなる群から選択する。方法のいくつかの実施形態では、界面活性剤は、ドデシル硫酸リチウム、トリトンX-100及びそれらの混合物からなる群から選択される。方法のいくつかの実施形態では、トリトンX-100の濃度は0.5%であり、ドデシル硫酸リチウムの濃度は0.1%である。方法のいくつかの実施形態では、処理する工程は1時間で実施する。方法のいくつかの実施形態では、試料は、清澄化したウイルス感染細胞溶解物懸濁液の超遠心分離から得られた上清である。方法のいくつかの実施形態では、所望により、試料は、清澄化したウイルス感染細胞溶解物懸濁液のトランスフロー濾過に由来する保持液である。
試料中のノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスのレベルを測定する方法であって、a)細胞株及び培養培地を含む混合物に試料を提供する工程;b)試料中に存在する場合は、ノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスを増殖させるためにインキュベートして、インキュベートした部分を得る工程;c)少なくとも1種の界面活性剤で処理して、処理した部分を得る工程;d)処理した部分の一部を収集して、収集した部分を得る工程;並びにe)収集した部分中のノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスのレベルを測定する工程を含む方法。方法のいくつかの実施形態では、試料は哺乳動物から得られる。方法のいくつかの実施形態では、試料は血漿又は血液を含む。方法のいくつかの実施形態では、ノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスはHAVである。方法のいくつかの実施形態では、ノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスはPPVである。方法のいくつかの好ましい実施形態では、ノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスはHEVである。方法のいくつかの実施形態では、ウイルスは、樹立された細胞株を含むインビトロ細胞培養物中で増殖させる。方法のいくつかの実施形態では、細胞株は、HepG2(ATCC番号HB-8065)及びHepG2/C3A(ATCC番号CRL-10741)からなる群から選択する。方法のいくつかの実施形態では、試料は、インキュベートした部分の一部を膜でトランスフロー濾過することによって得られた第1の保持液を含む。いくつかの実施形態では、所望により、試料は、第1の保持液を得るためにインキュベートした部分の一部を膜でトランスフロー濾過し、第1の保持液を遠心分離することによって得られた第1の上清を含む。方法のいくつかの実施形態では、試料は少なくとも1種の界面活性剤又は所望により界面活性剤の混合物で処理して第1の溶液を得、この方法は更に、a)第1の溶液を遠心分離することによって得られた第1のペレットを提供する工程;b)第1のペレットをPBS(リン酸緩衝生理食塩水)に再懸濁することによって得られた第2の溶液を提供する工程;c)第2の溶液を清澄化することによって得られた第3の溶液を提供する工程;d)膜を使用して第3の溶液を濾過することによって得られた第1の濾液を提供する工程;及びe)第1
の濾液を限外濾過することによって得られた第2の保持液を提供する工程であって、第2の保持液が処理した部分を含む工程を含む。方法のいくつかの実施形態では、ノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスのレベルを測定する工程は、生物学的物質を検出する工程を含み、生物学的物質はウイルスのポリヌクレオチド配列及び/又はポリペプチド配列を含み、生物学的物質はHEVリボ核酸である。方法のいくつかの実施形態では、生物学的物質を測定する工程は、a)処理した部分の一部と溶解溶液を混合することによって得られたHEVリボ核酸を含む第1の反応混合物を提供する工程;b)第1の試薬を第1の反応混合物に添加することによって得られた第2の反応混合物を提供する工程であって、第2の反応混合物がHEVリボ核酸と相補的であるデオキシリボ核酸を含む工程;c)第2の反応混合物に、デオキシリボ核酸内の配列に少なくとも部分的に相補的である第2の試薬を添加する工程;d)第2の反応混合物に、デオキシリボ核酸内の配列に少なくとも部分的に相補的である第3の試薬を添加する工程;e)デオキシリボ核酸内の第2及び第3の試薬によって包含される配列を増幅する工程;並びにf)増幅した配列の濃度を測定する工程を含む。方法のいくつかの実施形態では、第2の試薬及び第3の試薬は、
a)5'-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3'(配列番号1)、
b)5'-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3'(配列番号2)、及び
c)5'-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3'(配列番号3)からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、ノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスと共にドデシル硫酸リチウム(LDS)などの少なくとも1種の陰イオン性界面活性剤又はトリトンX-100などの少なくとも1種の非イオン性界面活性剤又は2つの組み合わせを含む試料の処理方法に基づいて、クリアランス研究における挙動が、高度な精製方法の流れにおいて存在し得るものとおそらく同じか又はほとんど同じであるウイルスを得ることを可能にする、細胞培養中で増殖したノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスを精製する方法を含む。いくつかの実施形態では、前述した方法のいくつかの実施形態によって生じたウイルスは、血液及び/又は血漿由来タンパク質の製造方法中の下流工程のウイルス減少及び/又はクリアランス性能を試験するために適切なスパイクとなる。
いくつかの実施形態では、処理方法に基づいて細胞培養物中に生成したウイルスを精製する方法は、ウイルス感染物質を清澄化する工程、混合物の少なくとも一部を膜によってトランスフロー濾過して第1の保持液を得る工程、及び第1の保持液を遠心分離して第1の上清を得る工程を含む。処理方法は、第1の上清を少なくとも1種の界面活性剤で処理して第1の溶液を得る工程を含み、方法は更に、前記処理後、第1の溶液を遠心分離して第1のペレットを得る工程、第1のペレットを再懸濁して第2の溶液を得る工程、第2の溶液を清澄化して第3の溶液を得る工程、膜を使用して第3の溶液を濾過して第1の濾液を得る工程、及び第1の濾液を限外濾過して第2の保持液を得て、収集すべき処理部分の少なくとも一部を提供する工程を含み、前記少なくとも1種の界面活性剤はドデシル硫酸リチウム、トリトンX-100及びそれらの混合物からなる群から選択され、トリトンX-100の濃度は0.5%で、LDSの濃度は0.1%であり、第1の上清の少なくとも1種の界面活性剤による前記処理は1時間で実施する。
いくつかの実施形態では、処理方法に基づいて細胞培養物中に生成したウイルスを精製する方法は、ウイルス感染物質を清澄化する工程、混合物の少なくとも一部を膜によってトランスフロー濾過して第1の保持液を得る工程を含む。処理方法は、第1の保持液を少なくとも1種の界面活性剤で処理して第1の溶液を得る工程を含み、方法は更に、前記処理後、第1の溶液を遠心分離して第1のペレットを得る工程、第1のペレットを再懸濁して第2の溶液を得る工程、第2の溶液を清澄化して第3の溶液を得る工程、膜を使用して第3の溶液を濾過して第1の濾液を得る工程、及び第1の濾液を限外濾過して第2の保持液を得て、収集すべき処理部分の少なくとも一部を提供する工程を含み、前記少なくとも1種の界面活性剤がドデシル硫酸リチウム、トリトンX-100及びそれらの混合物からなる群から選択され、トリトンX-100の濃度は0.5%で、LDSの濃度は0.1%であり、第1の保持液の少なくとも1種の界面活性剤による前記処理は1時間で実施する。
本明細書で開示したいくつかの実施形態によるトランスフロー濾過HEV(TFF HEV)及びTFF上清(Supe)HEVウイルススパイクの調製を示した図である。 本明細書で開示したいくつかの実施形態によって調製したTFF HEV及びTFF Supe HEVウイルススパイクの相対的純度を示した図である。 本明細書で開示したいくつかの実施形態によるTFF HEV、トリトンTFF HEV及びトリトン/LDS TFF HEVウイルススパイクの調製を示した図である。 プライマー及びプローブのヌクレオチド配列を示した図である。
ノンエンベロープウイルスHEVを生成するための効率のよい細胞培養系が近年確立され、そのデータは細胞培養物由来のHEVは血液中に見いだされたHEVと類似していて、いずれも脂質が関連することを示している。したがって、未処理の清澄化した細胞培養物溶解物又は培養上清は、比較的未精製の生成物中間体を含む上流工程のクリアランス研究においてウイルススパイクとして使用することができた。しかし、未処理のウイルススパイクの使用は、処理の流れの純度が比較的高い下流工程におけるHEVクリアランスの評価には適さないことがある。
本発明は、下流製造方法工程のウイルスクリアランス研究での使用に適した比較的高い純度及び高い力価のHEVスパイクの調製方法に関する。
インビトロにおいてHEVを培養することは困難なので、細胞培養物をベースにしたHEV感染性アッセイは今まで容易には利用できなかった。本明細書で開示したいくつかの実施形態では、細胞培養物中の力価の高いHEVの増殖は、ポリブレンを補充した培地を使用することによって可能である。
HEVは技術的にノンエンベロープウイルスと考えられるが、細胞培養中で増殖したHEVは、細胞から放出されるので膜断片/脂質を含むことが多い。これらの膜成分は、液体加熱又は凍結乾燥ケーキの乾燥加熱などのウイルス破壊処理からウイルスを防御することがある。HEVは、ツイーンなどの界面活性剤で処理して膜残渣を除去することができるが、処理されたウイルスは加熱による不活性化に耐性を保持していることが多い。
いくつかの実施形態では、細胞培養HEVに関連した脂質は、トリトンX-100で処理することによって除去することができる。いくつかの実施形態では、細胞培養HEVに関連した脂質は、ドデシル硫酸リチウム(LDS)で処理することによって除去することができる。いくつかの実施形態では、細胞培養物HEVに関連した脂質は、トリトンX-100及びドデシル硫酸リチウム(LDS)の組み合わせで処理することによって除去することができる。いくつかの実施形態では、生じたウイルス調製物はまだ感染性である。いくつかの実施形態では、外来性非ウイルス性混入物の濃度はウイルス調製中に減少する。いくつかの実施形態では、ウイルスはまた、加熱などのウイルス破壊処理によって不活性化されやすい。
HEVは、細胞培養物中で細胞変性効果(CPE)を生じない。したがって、HEV検出は、元々国立衛生研究所(NIH)によって開発されたPCRアッセイに基づく。いくつかの実施形態では、感度を増強するためにPCRアッセイを改変した。いくつかの実施形態では、PCRアッセイで使用したプライマーの1つを変化させた。いくつかの実施形態では、PCRアッセイで使用したリバースプライマーを変化させた。いくつかの実施形態では、PCRアッセイで使用したプローブを再設計した。完全に新しいプローブをPCRアッセイ用に設計した。いくつかの実施形態では、PCRアッセイは、試料におけるウイルス価の決定について陽性又は陰性としてスコア化するために使用した。
いくつかの実施形態では、本発明は、ポリブレンを補充した培地の使用による細胞培養物中の高力価HEVの増殖、膜脂質/残渣を除去するための細胞培養物HEVのトリトンX-100/LDSによる処理及び高感度PCRアッセイによるHEVの検出が関与する方法に関する。
いくつかの実施形態では、この方法はHEVに特異的であってもよい。いくつかの実施形態では、ウイルス増殖及び精製の方法は、その他のノンエンベロープウイルスに適用することができる。いくつかの実施形態では、ウイルス増殖及び精製の方法は、その他のシュードエンベロープウイルスに適用することができる。いくつかの実施形態では、ウイルス増殖及び精製の方法は、HAVに適用することができる。いくつかの実施形態では、ウイルス増殖及び精製の方法は、PPVに適用することができる。いくつかの好ましい実施形態では、ウイルス増殖及び精製の方法は、HEVに適用することができる。
いくつかの実施形態では、本発明は、様々な製造工程及び中間生成物及び最終生成物のHEV除去/不活性化能力を評価する研究を実施するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本発明は、様々な製造工程及び中間生成物及び最終生成物のその他のウイルスの除去/不活性化能力を評価する研究を実施するために使用することができる。いくつかの実施形態では、その他のウイルスはノンエンベロープウイルスである。いくつかの実施形態では、その他のウイルスはシュードエンベロープウイルスである。いくつかの実施形態では、その他のウイルスはHAV及びPPVである。
いくつかの実施形態では、本発明は、血液及び/又は血漿などの様々な医学的又は臨床生成物のHEVに対する安全性を保証することができる。いくつかの実施形態では、本発明は、血液及び/又は血漿などの様々な医学的又は臨床生成物のその他のウイルスに対する安全性を保証することができる。いくつかの実施形態では、その他のウイルスはHAV及びPPVである。
いくつかの実施形態では、本発明は、インビトロにおいて生成したノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスの精製方法に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、インビトロにおいて生成したHEVの精製方法に関する。いくつかの実施形態では、この精製は、少なくとも1種の陰イオン性及び/又は1種の非イオン性界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸リチウム及び/又はトリトンX-100を含む組成物による界面活性剤処理工程を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも1種の界面活性剤を含む組成物中で、界面活性剤は非イオン性界面活性剤であることが企図される。いくつかの実施形態では、界面活性剤の組み合わせを含む組成物中で、1種の界面活性剤は非イオン性で、その他は陰イオン性であることが企図される。いくつかの実施形態では、少なくとも1種の陰イオン性界面活性剤を含む組成物中で、界面活性剤はLDSであることが企図される。いくつかの実施形態では、少なくとも1種の非イオン性界面活性剤を含む組成物中で、界面活性剤はトリトンX-100であることが企図される。好ましい実施形態では、組成物は複数の界面活性剤を含む。好ましい実施形態では、組成物は少なくとも2種の界面活性剤を含む。好ましい実施形態では、組成物は1種の陰イオン性界面活性剤及び1種の非イオン性界面活性剤を含む。好ましい実施形態では、陰イオン性界面活性剤はLDSであり、非イオン性界面活性剤はトリトンX-100である。
いくつかの実施形態では、少なくとも1種の界面活性剤は、本発明の精製方法でその機能を発揮するために適切な濃度で使用する。いくつかの実施形態では、2種の界面活性剤はそれぞれ、本発明の精製方法でその機能を発揮するために適切な濃度で使用する。いくつかの実施形態では、トリトンX-100の濃度は0.1%から2.5%v/vの範囲である。いくつかの好ましい実施形態では、トリトンX-100の濃度は0.5%v/vである。いくつかの実施形態では、LDSの濃度は0.02%から0.5%v/vの範囲である。いくつかの好ましい実施形態では、LDSの濃度は0.1%v/vである。
いくつかの実施形態では、1種又は複数の界面活性剤を含む組成物による処理は、必要な、当業者によって決定された期間で実施する。いくつかの実施形態では、処理は5分間から1日間実施する。いくつかの好ましい実施形態では、処理は10分から3時間実施する。いくつかの好ましい実施形態では、処理は1時間実施する。
最も好ましい実施形態では、トリトンX-100 0.5%及びLDS 0.1%を含む組成物を使用し、組成物による処理工程は1時間実施する。いくつかの実施形態では、インキュベーションは37℃で1時間実施する。
いくつかの実施形態では、本発明の精製方法を実施するための開始材料として、いずれもウイルス感染細胞培養物に由来するウイルス感染細胞培養培地又は清澄化したウイルス感染細胞溶解物懸濁液の超遠心分離から得られた上清を使用する。好ましい実施形態では、清澄化したウイルス感染細胞溶解物懸濁液の超遠心分離から得られた上清を使用する。
いくつかの実施形態では、本発明の精製方法を実施するための開始材料として、いずれもウイルス感染細胞培養物に由来するウイルス感染細胞培養培地又は清澄化したウイルス感染細胞溶解物懸濁液のトランスフロー濾過後に得られた保持液を使用する。好ましい実施形態では、清澄化したウイルス感染細胞溶解物懸濁液のトランスフロー濾過後に得られた保持液を使用する。
第1の実施形態では、精製方法は、以下の工程:
a)開始材料を清澄化する工程;
b)工程a)の溶液を適切な膜でトランスフロー濾過して対応する保持液を得る工程;
c)工程b)の保持液を超遠心分離して対応する上清を得る工程;
d)工程c)の前記上清を1界面活性剤又は界面活性剤の混合物で処理して対応する溶液を得る工程;
e)工程d)の溶液を30%スクロースクッションに載せ、適切な速度及び時間で超遠心分離を実施して対応するペレットを得る工程;
f)工程e)のペレットを適切な体積のPBSに再懸濁して対応する溶液を得る工程;
g)工程f)の溶液を清澄化して対応する溶液を得る工程;
h)工程g)で得られた溶液を適切な膜を使用して限外濾過して対応する保持液を得る工程;並びに
i)工程h)の保持液を濾過する工程
を含むことができる。
好ましい第1の実施形態では、工程a)において、開始材料は孔径0.45μmのフィルターで清澄化する。
好ましい第1の実施形態では、工程b)において、トランスフロー濾過を実施するために使用した膜は300kDa膜である。
好ましい第1の実施形態では、工程c)において、超遠心分離は85,000×gで1.5時間実施する。
好ましい第1の実施形態では、工程d)において、界面活性剤の混合物を使用するとき、界面活性剤の混合物はトリトンX-100 0.5%及びLDS 0.1%を含む。
好ましい第1の実施形態では、工程e)において、超遠心分離は100,000×gで8時間実施する。
好ましい第1の実施形態では、工程f)において、ペレットをPBSに再懸濁することが企図される。
好ましい第1の実施形態では、工程g)において、工程f)の溶液は孔径0.2μmのフィルターで清澄化する。
好ましい第1の実施形態では、工程h)において、限外濾過で使用した膜は100kDa膜である。
好ましい第1の実施形態では、工程i)において、濾過は孔径0.2μmのフィルターで実施する。
第2の実施形態では、精製方法は以下の工程:
a)開始材料を清澄化する工程;
b)工程a)の溶液を適切な膜でトランスフロー濾過して対応する保持液を得る工程;
c)工程b)の前記保持液を1界面活性剤又は界面活性剤の混合物で処理して対応する溶液を得る工程;
d)界面活性剤処理溶液を適切な速度及び適切な時間超遠心分離して対応するペレットを得る工程;
e)工程d)のペレットを適切な体積のPBS中に再懸濁して対応する溶液を得る工程;
f)工程e)の溶液を清澄化して対応する溶液を得る工程;
g)工程f)で得られた溶液を適切な膜で限外濾過して対応する保持液を得る工程;並びに
h)工程g)の保持液を濾過する工程
を含むことができる。
好ましい第2の実施形態では、工程a)において、開始材料は孔径0.45μmのフィルターで清澄化する。
好ましい第2の実施形態では、工程b)において、トランスフロー濾過を実施するために使用した膜は300kDa膜である。
好ましい第2の実施形態では、工程c)において、界面活性剤の混合物を使用するとき、界面活性剤の前記混合物はトリトンX-100 0.5%及びLDS 0.1%を含む。
好ましい第2の実施形態では、工程d)において、超遠心分離は85,000xgで1.5時間実施する。
好ましい第2の実施形態では、工程e)において、ペレットはPBSに再懸濁する。
好ましい第2の実施形態では、工程f)において、工程e)の溶液は孔径0.2μmのフィルターで清澄化する。
好ましい第2の実施形態では、工程g)において、限外濾過で使用した膜は100kDa膜である。
好ましい第2実施形態では、工程h)において、濾過は孔径0.2μmのフィルターで実施する。
本発明は、インビトロで生成したノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスの精製方法におけるLDS及び/又はトリトンX-100の使用に関する。いくつかの実施形態では、ウイルスはノンエンベロープである。いくつかの実施形態では、ウイルスはシュードエンベロープである。
好ましい実施形態では、インビトロにおいて生成したウイルスはHEVである。いくつかの実施形態において、インビトロにおいて生成したウイルスはHEV以外のウイルスである。いくつかの実施形態において、インビトロにおいて生成したウイルスはHAVである。いくつかの実施形態では、インビトロにおいて生成したウイルスはPPVである。最も好ましい実施形態では、インビトロにおいて生成したウイルスはHEVである。
いくつかの実施形態では、前述したインビトロにおける生成は、インビトロ培養において実施する。いくつかの実施形態では、インビトロ培養とは、インビトロ器官、組織又は細胞培養である。好ましい実施形態では、インビトロにおける生成は、インビトロ細胞培養において実施する。
いくつかの実施形態では、初代細胞培養を使用する。いくつかの実施形態では、細胞培養株を使用する。初代細胞及び細胞培養株は任意の生物に由来し得る。例えば、いくつかの実施形態では、昆虫細胞の使用が企図される。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞の使用が企図される。好ましい実施形態では、ヒト細胞培養株を使用する。
好ましい実施形態では、HEV生成及び精製のために肝細胞株を使用する。別の好ましい実施形態では、HEV産生及び精製のために腎臓細胞株を使用する。いくつかの実施形態では、肝細胞株は、健康な又は疾患のある肝臓に由来し得る。いくつかの実施形態では、肝細胞株は、悪性又は良性細胞株であってもよい。いくつかの実施形態では、腎臓細胞株は、健康な又は疾患のある腎臓に由来し得る。いくつかの実施形態では、腎臓細胞株は、悪性又は良性細胞株であってもよい。好ましい実施形態では、樹立された細胞株を使用する。いくつかの実施形態では、細胞はHepG2(ATCC番号HB-8065)である。いくつかの実施形態では、細胞はHepG2/C3A(ATCC番号CRL-10741)である。
いくつかの実施形態では、HEV感染性アッセイを使用する。いくつかの実施形態では、感染価約8log10のウイルススパイクを調製することができる。アッセイは比較的短い期間である(3〜7日間のアッセイ)。PCRバックグラウンドはほとんど又は全く認められず、4log10超の減少を示すことができる。したがって、いくつかの実施形態では、PCRをベースにしたウイルス検出アッセイを使用する。いくつかの実施形態では、PCRをベースにしたHEV検出アッセイを使用する。
更に好ましい実施形態-1
いくつかの実施形態では、細胞培養物中で増殖したノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスを調製する方法であって、ノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスを含む試料を1種又は複数の界面活性剤を含む組成物で処理する工程を含む方法。方法のいくつかの実施形態では、細胞培養物中で増殖したウイルスはHAVである。方法のいくつかの実施形態では、細胞培養物中で増殖したウイルスはPPVである。方法のいくつかの好ましい実施形態では、細胞培養物中で増殖したウイルスはHEVである。方法のいくつかの実施形態では、ウイルスは、インビトロ細胞培養物中で生成する。方法のいくつかの実施形態では、インビトロ細胞培養物は樹立された細胞株を含む。方法のいくつかの実施形態では、樹立された細胞株は、HepG2(ATCC番号HB-8065)及びHepG2/C3A(ATCC番号CRL-10741)からなる群から選択される。方法のいくつかの実施形態では、界面活性剤処理は、ドデシル硫酸リチウム及び/又はトリトンX-100による。方法のいくつかの実施形態では、トリトンX-100の濃度は0.5%であり、LDSの濃度は0.1%である。方法のいくつかの実施形態では、処理する工程は1時間で実施する。方法のいくつかの実施形態では、試料は、清澄化したウイルス感染細胞溶解物懸濁液の超遠心分離から得られた上清である。方法のいくつかの実施形態では、試料は所望により、清澄化したウイルス感染細胞溶解物懸濁液のトランスフロー濾過に由来する保持液である。
更に好ましい実施形態-2
いくつかの実施形態では、試料中のノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスのレベルを測定する方法であって、
a)細胞及び培養培地を含む混合物に試料を提供する工程;
b)試料中に存在する場合は、ノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスを増殖させるためにインキュベートして、インキュベートした部分を得る工程;
c)少なくとも第1の界面活性剤で処理して、処理した部分を得る工程;
d)処理した部分の一部を収集して、収集した部分を得る工程;並びに
e)収集した部分中のノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスのレベルを測定する工程を含む方法。
方法のいくつかの実施形態では、試料は哺乳動物から得られる。方法のいくつかの実施形態では、試料は血漿又は血液を含む。方法のいくつかの実施形態では、ノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスはHAVである。方法のいくつかの実施形態では、ノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスはPPVである。方法のいくつかの好ましい実施形態では、ノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスはHEVである。いくつかの実施形態では、ウイルスは、細胞培養物中で生成する。方法のいくつかの実施形態では、細胞は、HepG2(ATCC番号HB-8065)及びHepG2/C3A(ATCC番号CRL-10741)からなる群から選択する。方法のいくつかの実施形態では、試料は、インキュベートした部分の一部を膜でトランスフロー濾過することによって得られた第1の保持液を含む。方法のいくつかの実施形態では、試料は所望により、第1の保持液を得るためにインキュベートした部分の一部を膜でトランスフロー濾過し、第1の保持液を遠心分離することによって得られた第1の上清を含む。方法のいくつかの実施形態では、試料は少なくとも第1の界面活性剤又は所望により界面活性剤の混合物で処理して第1の溶液を得る。いくつかの実施形態では、この方法は更に、
a)第1の溶液を遠心分離することによって得られた第1のペレットを提供する工程;
b)第1のペレットをPBSに再懸濁することによって得られた第2の溶液を提供する工程;
c)第2の溶液を清澄化することによって得られた第3の溶液を提供する工程;
d)膜を使用して第3の溶液を濾過することによって得られた第1の濾液を提供する工程;及び
e)第1の濾液を限外濾過することによって得られた第2の保持液であって、処理した部分を含む第2の保持液を提供する工程
を含む。
方法のいくつかの実施形態では、ノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスのレベルを測定する工程は、生物学的物質を検出する工程を含む。方法のいくつかの実施形態では、生物学的物質は、ウイルスのポリヌクレオチド配列及び/又はポリペプチド配列を含む。方法のいくつかの実施形態では、生物学的物質は、HEVリボ核酸である。方法のいくつかの実施形態では、生物学的物質を測定する工程は、
a)処理した部分の一部と溶解溶液を混合することによって得られたウイルスリボ核酸を含む第1の反応混合物を提供する工程;
b)第1の試薬を第1の反応混合物に添加することによって得られた第2の反応混合物を提供する工程であって、第2の反応混合物がウイルスRNAに相補的であるデオキシリボ核酸を含む工程;
c)第2の反応混合物に、デオキシリボ核酸内の配列に相補的である第2の試薬を添加する工程;
d)第2の反応混合物に、デオキシリボ核酸内の配列に相補的である第3の試薬を添加する工程;
e)デオキシリボ核酸内の第2及び第3の試薬によって包含される配列を増幅する工程;並びに
f)増幅した配列の濃度を測定する工程
を含む。
方法のいくつかの実施形態では、第2の試薬及び第3の試薬は、
a)5'-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3'(配列番号1)、
b)5'-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3'(配列番号2)、及び
c)5'-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3'(配列番号3)からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む。
更に好ましい実施形態-3
いくつかの実施形態では、ウイルスを清澄化するために、凍結した未精製ウイルスストックを使用する。いくつかの実施形態では、濃縮し精製したノンエンベロープウイルスストックを調製するとき、トリトンX-100 0.5%及びLDS 0.1%を解凍した未精製ウイルスストックに添加し37℃で1時間インキュベートする。
いくつかの実施形態では、解凍した未精製ウイルスストックの清澄化は2℃から8℃で3000から8000×gの速度で15から30分間遠心分離することによって実施する。いくつかの実施形態では、上清を取り出して保持し、ペレットを廃棄する。いくつかの実施形態では、上清は0.45μmフィルターで濾過してから、300kDa膜でトランスフロー濾過してTFF保持液を収集する。
いくつかの実施形態では、超遠心分離については、スインギングバケットローターに入れた超遠心分離チューブ中でTFF保持液を2℃から8℃で約85000×gで1.5時間超遠心分離する。いくつかの実施形態では、超遠心分離の上清を傾瀉し、液体廃棄物として廃棄する。
いくつかの実施形態では、限外濾過については、超遠心分離したペレットをPBSなどの緩衝液5mL以上に再懸濁する。いくつかの実施形態では、ペレット懸濁液は2℃から8℃で3000から4200×gで15分間清澄化する。いくつかの実施形態では、上清を取り出し、濃縮するためにAmicon(登録商標)UFフィルター装置に入れる。いくつかの実施形態では、必要ならば、PBSなどの緩衝液を添加して最終体積を約15mL(フィルター容量は15mLである)にする。
いくつかの実施形態では、保持した試料(濃縮し精製したウイルスストック)最終体積が1mL以下になるまで、フィルター装置を2℃から8℃で約5000×gで遠心分離する。いくつかの実施形態では、およその遠心分離時間は約15分から約60分である。
いくつかの実施形態では、濃縮して精製したウイルスストックを小分けして、-65℃以下で凍結する。
(実施例1)
TFF-HEVスパイクの調製
タンジェンシャルフロー濾過(TFF)は生体分子のよく知られた分離濃縮方法である。TFFに関する更なる情報は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるLarry Schwartzらによる「Introduction to Tangential Flow Filtration for Laboratory and Process Development Applications」(pall.com/main/laboratory/literature-library-details.page?id=34212)において容易に入手可能である。
HEV感染HepG2又はHepG2/C3A細胞を2回凍結解凍し、低速で遠心分離して0.45μmフィルターに通すことによって清澄化した。清澄化した溶液(約1L)は2つの300kDa膜に通すTFFによって10倍に濃縮し、得られたTFF保持液(約100mL)を4℃で約85,000×gで90分間遠心してウイルスをペレットにした。超遠心分離上清(約100mL)を収集し、TFF-Supe HEV(実施例2)で処理するために保存し、一方ペレットはPBSに再懸濁した。再懸濁したペレットは次に0.2μm孔フィルターで濾過し、100kDa膜で限外濾過して最終体積約2mLにした。溶液は0.2μm又は0.1μmフィルターのいずれかで滅菌濾過し、TFF-HEVスパイク調製物として使用する準備ができるまで5℃で保存した。
(実施例2)
TFF上清HEV(TFF-Supe HEV)スパイクの調製
細胞培養物由来のHEVに関連した脂質はウイルスの浮力を増大させ、それによって超遠心分離によるウイルスのペレット化の効率を低下させる。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、トリトンX-100及びドデシル硫酸リチウム(LDS)を含む界面活性剤混合物をHEV含有液に添加して関連した脂質を除去し、ウイルス回収率を増加させる。
実施例1の清澄化したHEV感染細胞溶解物(約1L)のTFF及び超遠心分離から得られた超遠心分離上清約100mLは、37℃でトリトンX-100 0.5%及びLDS 0.1%で30分以上処理してから30%スクロースクッションによって5℃で100,000×gで8時間超遠心分離した。得られたペレットをPBSに再懸濁して、0.2μm孔フィルターで濾過し、100kDa膜で限外濾過して最終体積約1mLにした。次に、溶液は0.2μm又は0.1μmフィルターに通過させ、TFF-Supe HEVスパイク調製物として使用する準備ができるまで5℃で保存した。
(実施例3)
実施例1及び2の方法によって生じたウイルススパイクの純度の比較
実施例1及び2の方法によって生じたウイルススパイクの相対的純度を比較するためにSDS-PAGEを使用した。図2に示したように、以下の試料の一定量をA280及び定量的PCRのために取り出した:最初の未精製HEV、TFF保持液、超遠心分離上清、TFF-HEV及びTFF-Supe HEV。TFF保持液及び超遠心分離上清はA280によって測定すると最初の未精製HEV及びTFF-HEVの10倍、TFF-Supe HEVの40倍のタンパク質を有していた(図2)。タンパク質濃度が異なっていても、全試料中のHEV RNAの濃度は最初の未精製物以外は約9log10コピー/mLであった(図2)。したがって、相対的純度は、ウイルス(HEV RNA)のタンパク質(A280)に対する比によって示したように、TFF-Supe HEV及びTFF-HEVでは超遠心分離上清及びTFF保持液よりもずっと高かった。
試料の相対的純度はSDS-PAGEによって視覚化することができた(図2)。試料は、約4AUまで希釈又は濃縮してから、DTTを含有する試料緩衝液中で加熱し、4〜20%勾配ゲルに添加した。細胞培養培地もバックグラウンド対照として添加した。SDS-PAGE後、ゲルを取り出し、Instant Blueで染色した。結果は、A280及びPCRデータと一致し、TFF保持液及び超遠心分離上清において不純物レベルが最高であることが示された。最も豊富なタンパク質のバンドが約70kDaに認められた。これは細胞培養培地においても存在したので、細胞及びウイルス増殖に必要な培地補充物である牛胎児血清中に最も一般的に見いだされるタンパク質及び下流のクリアランス研究を妨害し得る非ウイルス性混入物である可能性が高い。混入物のほとんどは、実施例1及び2で記載した精製法の間に除去され、その相対的濃度はTFF Supe HEVにおいて最も低く、次いでTFF HEVであった。
(実施例4)
実施例1及び2の方法によって生じたウイルススパイクの熱安定性の比較
実施例1又は2によって調製したTFF-HEV及びTFF-Supe HEVスパイクの熱安定性を比較するために実験を実施した。両方のウイルス調製物をPBS中でスパイクし、5℃、60℃、70℃又は80℃で4時間インキュベートした。各試験溶液から一定量を取り出し、以下のように力価測定した。試料の段階希釈を作製し、HepG2又はHepG2/C3A細胞を接種したウェルに添加した。ウイルスは37℃で1時間以上吸着させ、増殖培地を添加した。プレートは37℃で2日間以上インキュベートしてから、ウェルから培地を吸引し、緩衝液(例えば、PBS)で2回以上細胞を洗浄/吸引した。次にDynabeads(登録商標)mRNA DIRECT(商標)マイクロキット(Life Technologies社)を使用してプレートのウイルスRNAを抽出するか、又は抽出の準備ができるまで-65℃以下で保存した。抽出後、溶出液(ポリA RNA)はすぐにPCR増幅用に処理するか、又は、PCR増幅の準備ができるまで-65℃以下で保存した。
一段階RT-PCRを使用して、前述したように以下のプライマー及びプローブを用いて試料中のHEV RNAを検出した。各反応のアッセイ条件は以下の通りである:
a)試薬; 4×TaqMan(登録商標)Fast Virus 1-Step Master Mix(Life Technologies社)5.0μl、プライマーF+R100mM 0.08μL、プローブ100mM 0.04μL、SUPERase In(Life Technologies社)0.4μL、水4.4μL及び鋳型10μL(全部で20μl)
b)反応:52℃10分、95℃30秒、及び95℃15秒40回、56℃45秒。
PCR及びサイクル閾値(Ct)決定は、AB7500リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems社、Foster City、CA)及び付属のソフトウェアを使用して製造者の指示に従って実施した。過去のデータに基づいて、閾値は標準曲線全ての対数期を通過し、反応当たり1個のRNAコピーの検出が確実な0.1に手動で設定した。HEV RNAの存在を示す陽性のPCRシグナルは、閾値が交差する任意の時間に記録された。
HEV価測定プレートのウェルは全て、陽性PCRシグナルの有無に基づいて陽性又は陰性をスコア化した。次に、適切な統計学的方法: Spearman-Karber、MPN又はポアソンを使用してウイルス価をTCID50/mLとして計算した。
Table1(表1)に示したように、ウイルススパイクを本発明の方法の1実施形態によって調製したとき(実施例2)、ウイルス不活性化は60℃、70℃及び80℃では検出限界であった。他方で、実施例1(従来の方法、界面活性剤処理がない)によって得られたスパイクを使用したとき、ウイルスは70℃又は80℃で4時間加熱した後もまだ存在していた。
公表された報告のデータは、実施例1によって生じたウイルススパイクの熱安定性は天然に見いだされたHEVの挙動とは異なることを示唆している。例えば、知られている最も熱に耐性のあるウイルスのいくつかはヒト腸ウイルスであり、研究によって、PBS中でスパイクされたA型肝炎ウイルス、ポリオウイルス及びネコカリシウイルスは72℃で18.35、5.44及び7.39秒加熱後、90%が不活性化されていることが示された(Suphachai N、Cliver DO. 2002. J Virol Methods 104:217〜225頁)。更に、ヒトHEVの近縁のイノシシHEVを含有する肝臓懸濁液を60℃で1時間加熱すると、4.42log10のウイルス減少が引き起こされた(Schielke Aら、2011. Virol Jol 8:487〜495頁)。したがって、実施例1の方法(従来技術の方法、界面活性剤処理を行わない)によって生じたHEVスパイクは、ウイルスクリアランス研究においてHEVの臨床単離物の減少を正確に評価することができない。
他方、本発明の方法(実施例2)によって生じたウイルススパイクは、天然に見いだされるHEVに認められるのと同様に熱処理によって完全に不活性化された。したがって、本発明の方法によって調製したウイルスは、ウイルスクリアランス研究において使用するためにより適切なスパイクとなり得る。したがって、いくつかの実施形態では、ウイルススパイクは実施例2の方法によって調製する。
(実施例5)
乾燥加熱実験におけるHEV調製方法及びアッセイの適用
原理の証明として、TFF-HEV及びTFF-Supe HEVスパイクを実施例1及び2で記載したように調製し、第VIII因子濃縮製造方法の凍結乾燥/乾燥加熱(FD/DH)工程中のウイルス減少及び/又はクリアランスを評価するための実験で試験した。FD/DH工程は製造方法の最終工程で、下流は溶媒/界面活性剤(S/D)処理工程である。
FD/DH実験では、TFF-HEV又はTFF-Supe HEV調製物のいずれかでスパイクした第VIII因子濃縮物をバイアルに小分けし、製造規模と同じ凍結乾燥サイクルを使用してベンチ規模凍結乾燥機で凍結乾燥した。次に、凍結乾燥バイアルを80℃のオーブンに入れ、最高75時間乾燥加熱した。
力価測定のためのウイルススパイク生成物のバイアルは、凍結乾燥前(最初)及び凍結乾燥後乾燥加熱せずに(FD/DH 0HR)、凍結乾燥後24時間乾燥加熱して(FD/DH 24h)、凍結乾燥後75時間乾燥加熱して(FD/DH 75時間)取り出した。ウイルススパイクFD/DH生成物は高純度水で元の体積に再構成して、段階的に希釈し、96ウェルプレートに播種したHepG2又はHepG2/C3A細胞に接種した。ウイルスが吸着したら最後に培地を添加して覆い、プレートを37℃のインキュベーターに3日間以上入れた。次に、力価測定プレートを取り出し、吸引して、ウイルスRNAを抽出するか、又は抽出の準備ができるまで-80℃で保存した。各ウェルから抽出したRNAは、実施例3に記載したようにHEVについてPCRによって分析した。力価測定ウェルはHEVが陽性か又は陰性かをスコア化し、ウイルス価を決定した。工程中のLog10HEV減少は、最初のバイアル及び最終(FD/DH75時間)バイアルのLog10ウイルス価を比較することによって計算した。
Table2(表2)で示したように、両スパイク調製物の力価は、凍結乾燥前後でほぼ同じで、凍結乾燥による減少はあまりなかった(1log10未満)。対照的に、80℃乾燥加熱処理によるウイルス不活性化は著しく(1log10を上回る)、TFF-Supe HEV(LRV=4.6)ではTFF HEV(LRV=3.4)よりも大きかった。実施例1の方法によって調製したTFF-HEVスパイクにおいて高レベルで存在する可能性がある混入物は、熱による不活性からウイルスを防御するか、又はキャプシド形成したHEV RNAの効率のよい破壊を妨害することがある。
FD/DH処理の最後の工程の開始材料は最後から2番目の工程でS/D処理されるので、第VIII因子濃縮物製造工程の流れの中に存在し得る可能性があるいかなるウイルス混入物も脱脂され、おそらくTFF-HEV(実施例1の方法によって調製)よりもTFF-Supe HEV(実施例2の方法によって調製)に類似している。したがって、TFF-Supe HEVのLRVは、FD/DH処理工程のHEV減少能力のより正確な評価となりやすい。
(実施例6)
界面活性剤処理TFF HEVスパイクの調製
TFF-Supe HEVの調製方法は比較的時間がかかる。したがって、TFF HEVスパイク調製用に更に界面活性剤処理方法を開発した。図3に示したように、TFF-HEVを調製するための同じ方法は、本発明のいくつかの実施形態以外は実施例1に従い、TFF保持液を様々な界面活性剤で処理する工程を85,000×g、1.5時間、5℃での超遠心分離の前に挿入する。トリトンTFF-HEV調製物をトリトンX-100 0.5%と37℃で1.5時間インキュベートし、一方、トリトンX-100 0.5%+LDS 0.1%を使用してトリトン/LDS TFF-HEVスパイクを処理した。超遠心分離後、ペレットのみを更にウイルススパイクに処理した。TFF-HEV及び界面活性剤処理TFF-HEVを調製するための方法は、精製方法から中間体画分を取り出し、先に実施例3で記載したようにウイルスの力価を測定することによって比較した。結果はTable3(表3)に示す。
ウイルス回収率は、TFF-HEV及びトリトン/LDS TFF-HEV方法で同等で、最終スパイク調製物は約8.3log10HEVを含有した。トリトンTFF-HEV方法はウイルスのペレット化の効率が不十分で、投入したウイルスのほとんどが超遠心分離上清画分において失われ、生じたスパイクは7log10HEV未満であった。
(実施例7)
液体加熱実験におけるHEV調製方法及びアッセイの適用
低温殺菌法はアルブミン製造方法の最後の工程であり、高度に精製された生成物のバイアルを60℃で10時間以上加熱することが必要である。ウイルスを実施例6で記載したように調製し、25%アルブミンにスパイクしてから5℃又は60℃で7時間インキュベートした。次にウイルス力価測定のために試料を取り出し、その結果をTable4(表4)に示す。比較として、TFF-Supe HEV(実施例2の方法によって調製した)でスパイクした25%アルブミンの低温殺菌(10時間、60℃)のデータも示す。
TFF-HEVは、最も熱耐性のある試験ウイルスで、熱処理後に示された力価の減少はわずか2.3log10であった。開始力価はTFF-HEVよりも約1log10低かったが、トリトンTFF-HEVのLRVは約1log10高かった。トリトン/LDSで処理したTFF-HEVのLRVは、3つのTFF-HEV調製物の中で最高で、トリトン/LDSでも処理したウイルス調製物であるTFF Supe HEVでスパイクしたアルブミンの低温殺菌後に実現した減少よりもわずかに低かった。
(実施例8)
TFF、超遠心分離及び限外濾過によるウイルス濃縮及び精製
ウイルスを清澄化するために、凍結した未精製ウイルスストックを解凍した。濃縮し精製したノンエンベロープウイルスストックを調製する場合、トリトンX-100 0.5%及びLDS 0.1%を解凍した未精製ウイルスストックに添加し37℃で1時間インキュベートした。清澄化は2℃から8℃で3000から8000×gの速度で15から30分間遠心分離することによって実施した。上清を取り出して保持し、ペレットは廃棄した。上清を0.45μmフィルターで濾過した。
TFFのために、TFFシステムを清掃し、濾過用に準備した。濾過したウイルスストックを清澄化した。
超遠心分離のために、TFF保持液を超遠心分離チューブに入れた。質量が互いに±0.05g以内になるまで、チューブのバランスを取った。チューブをスインギングバケットローターに入れ、2℃から8℃で約85000×gで1.5時間遠心分離した。超遠心分離操作の最後に、遠心分離チューブそれぞれの上清を注意深く傾瀉し、液体廃棄物として廃棄した。チューブを反転させ、室温で吸収性のタオル上で約5分間水分を吸い取らせた。排水後、タオルは除染して処分した。
限外濾過のために、超遠心分離したペレットをPBS5mL以上に再懸濁した。ペレット懸濁液は2℃から8℃で3000から4200×gで15分間清澄化した。上清を取り出し、濃縮するためにAmicon(登録商標)UFフィルター装置に入れた。必要ならば、PBSを添加して最終体積を約15mL(フィルター容量は15mLである)にした。キャップしたフィルター装置を遠心分離ローターに入れ、ローターは分銅でバランスを取った。保持した試料(濃縮し精製したウイルスストック)最終体積が1mL以下になるまで、2℃から8℃で約5000×gで遠心分離を実施した(およその遠心分離時間は15から60分間である)。
定義
HepG2:アメリカ培養細胞系統保存機関から得られた肝細胞がん細胞(ATCC番号HB-8065)
DMEM:ダルベッコ改変イーグル培地
FBS:牛胎児血清
力価:物質(ウイルス)の溶液中の濃度又は力価測定によって決定されたこのような物質の強度
SK:スピアマン-カーバーは、比較的高濃度のウイルスを含む試料におけるウイルス価を計算するための統計学的方法である。この方法は、任意の希釈時の陽性ウェルの割合が>25%のときに使用する(図1)。
MPN:最確数は、比較的低濃度のウイルスを含む試料におけるウイルス価を計算するための統計学的方法である。MPNは、全希釈の陽性ウェルの割合が<25%のときに使用する。
ポアソン:ポアソンは、極めて低濃度のウイルスを含む試料におけるウイルス価を計算するための統計学的方法である。この方法は、陽性ウェルが認められないときに使用する。
ATCC:アメリカ培養細胞系統保存機関
HEV TFF保持液:清澄化したHEV-細胞溶解物を300kD TFF膜を使用して濃縮した後に残存する物質。HEV TFF保持液はTFF HEVスパイクを調製するために使用する。
HEV TFF上清は、HEV TFF保持液を約84780×gで遠心分離した後に残存する流出液である。HEV TFF上清はTFF Supe HEVスパイクを調製するために使用する。
TCID50は、50%組織培養感染量(エンドポイント希釈アッセイ)に対応する。感染した宿主の50%を死滅させる、又は接種した組織培養細胞の50%に細胞変性効果を生じさせるために必要なウイルスの量を定量する感染ウイルス価の測定値である。
A280:タンパク質濃度及び/又は量を示す280nmで測定された吸光度。
AU:吸光度単位
ウイルススパイク:ウイルス含量が公知のウイルス試料
(参考文献)

Claims (22)

  1. 細胞培養物中で増殖したノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスを精製する方法であって、ノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスを含む試料を界面活性剤で処理する工程を含み、界面活性剤が0.5％でのトリトンX-100、及び0.5％でのトリトンX-100と0.1％でのドデシル硫酸リチウムとの混合物からなる群から選択され、試料が清澄化したウイルス感染細胞溶解物懸濁液の超遠心分離から得られた上清である、方法。
  2. 細胞培養物中で増殖したウイルスがE型肝炎ウイルス(HEV)である、請求項1に記載の方法。
  3. 細胞培養物中で増殖したウイルスがA型肝炎ウイルス(HAV)又はブタパルボウイルス(PPV)のいずれかである、請求項1に記載の方法。
  4. ウイルスがインビトロ細胞培養物中で生成する、請求項1に記載の方法。
  5. インビトロ細胞培養物が樹立された細胞株を含む、請求項4に記載の方法。
  6. 樹立された細胞株がHepG2(ATCC番号HB-8065)及びHepG2/C3A(ATCC番号CRL-10741)からなる群から選択される、請求項5に記載の方法。
  7. 処理する工程を1時間で実施する、請求項1に記載の方法。
  8. 試料が清澄化したウイルス感染細胞溶解物懸濁液のトランスフロー濾過に由来する保持液である、請求項1に記載の方法。
  9. 試料中のノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスの量を測定する方法であって、試料が哺乳動物由来の血漿又は血液を含み、かつ試料が清澄化したウイルス感染細胞溶解物懸濁液の超遠心分離から得られた上清であり、
    a)細胞株及び培養培地を含む混合物に試料を提供する工程;
    b)試料中に存在する場合は、ノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスを増殖させるためにインキュベートして、インキュベートした部分を得る工程;
    c)少なくとも1種の界面活性剤で処理して、処理した部分を得る工程であって、界面活性剤が0.5％でのトリトンX-100、及び0.5％でのトリトンX-100と0.1％でのドデシル硫酸リチウムとの混合物からなる群から選択される、工程;
    d)処理した部分の一部を収集して、収集した部分を得る工程;並びに
    e)収集した部分中のノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスの量を測定する工程
    を含む方法。
  10. ノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスがHEVである、請求項9に記載の方法。
  11. ノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスがHAV又はPPVのいずれかである、請求項9に記載の方法。
  12. ウイルスが樹立された細胞株を含むインビトロ細胞培養物中で増殖する、請求項9に記載の方法。
  13. 細胞株がHepG2(ATCC番号HB-8065)及びHepG2/C3A(ATCC番号CRL-10741)からなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
  14. 試料がインキュベートした部分の一部を膜でトランスフロー濾過することによって得られた第1の保持液を含む、請求項9に記載の方法。
  15. 試料が、インキュベートした部分の一部を膜でトランスフロー濾過して得られた第1の保持液を遠心分離することによって得られた第1の上清を含む、請求項9に記載の方法。
  16. 試料を少なくとも1種の界面活性剤又は界面活性剤の混合物で処理して第1の溶液を得る、請求項9に記載の方法。
  17. 更に、
    a)第1の溶液を遠心分離することによって得られた第1のペレットを提供する工程;
    b)第1のペレットをPBSに再懸濁することによって得られた第2の溶液を提供する工程;
    c)第2の溶液を清澄化することによって得られた第3の溶液を提供する工程;
    d)膜を使用して第3の溶液を濾過することによって得られた第1の濾液を提供する工程;及び
    e)第1の濾液を限外濾過することによって得られた第2の保持液を提供する工程であって、第2の保持液が処理した部分を含む工程
    を含む、請求項16に記載の方法。
  18. ノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスの量を測定する工程が生物学的物質を検出する工程を含む、請求項9に記載の方法。
  19. 生物学的物質が、ウイルスのポリヌクレオチド配列及び/又はポリペプチド配列を含む、請求項18に記載の方法。
  20. 生物学的物質がHEVリボ核酸である、請求項19に記載の方法。
  21. 生物学的物質を測定する工程が、
    a)処理した部分の一部と溶解溶液を混合することによって得られたHEVリボ核酸を含む第1の反応混合物を提供する工程;
    b)第1の試薬を第1の反応混合物に添加することによって得られた第2の反応混合物を提供する工程であって、第2の反応混合物がHEVリボ核酸と相補的であるデオキシリボ核酸を含む工程;
    c)第2の反応混合物に、デオキシリボ核酸内の配列に少なくとも部分的に相補的である第2の試薬を添加する工程;
    d)第2の反応混合物に、デオキシリボ核酸内の配列に少なくとも部分的に相補的である第3の試薬を添加する工程;
    e)デオキシリボ核酸内の第2及び第3の試薬によって包含される配列を増幅する工程;並びに
    f)増幅した配列の濃度を測定する工程
    を含む、請求項20に記載の方法。
  22. 第2の試薬及び第3の試薬が、
    a)5'-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3'(配列番号1)、
    b)5'-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3'(配列番号2)、及び
    c)5'-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3'(配列番号3)
    からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項21に記載の方法。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210031000A (ko) * 2018-01-29 2021-03-18 그리폴스 다이어그노스틱 솔루션즈 인크. 임상 시료 내의 파보바이러스 b19를 균질화하기 위한 방법
KR20210079543A (ko) 2019-12-20 2021-06-30 삼성전자주식회사 고대역폭 메모리 및 이를 포함하는 시스템
JP2023141423A (ja) * 2022-03-24 2023-10-05 国立大学法人 東京大学 ウイルスの精製方法
CN115181816B (zh) * 2022-08-10 2023-01-06 杭州纽创生物检测有限公司 一种超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法及其应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4721675A (en) * 1982-02-01 1988-01-26 Abbott Laboratories Production of hepatitis A virus in vitro utilizing a persistently virus infected cell culture system
DZ1706A1 (fr) * 1992-08-07 2002-02-17 Merck & Co Inc Vaccin contre le virus de l'hepatite a.
FR2696748B1 (fr) * 1992-10-14 1994-12-30 Pasteur Merieux Serums Vacc Procédé de préparation d'antigènes et de vaccins de l'hépatite A (HAV).
CN101397335A (zh) * 1998-06-24 2009-04-01 基因创新有限公司 Hcv包膜蛋白颗粒:用于疫苗接种的用途
EP1521849A4 (en) * 2001-10-12 2006-05-17 Chiron Corp HEPATITIS A-VIRUS NUCLEOTIDE SEQUENCES, RECOMBINANT PROTEINS AND THEIR USE
US20090042274A1 (en) 2004-07-27 2009-02-12 Genomidea Inc. Method of Purifying Virus Envelope
US7944468B2 (en) * 2005-07-05 2011-05-17 Northrop Grumman Systems Corporation Automated asymmetric threat detection using backward tracking and behavioral analysis
JP5034040B2 (ja) * 2006-07-13 2012-09-26 国立大学法人鳥取大学 肝炎の診断キット及び診断マーカー
US9682133B2 (en) * 2010-03-17 2017-06-20 Cornell University Disrupted adenovirus-based vaccine against drugs of abuse

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