JP6734137B2 - インビトロにおいて生成したウイルスの精製方法及びウイルスのクリアランスアッセイ - Google Patents
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Description
本出願は、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる2015年7月23日に出願された米国特許仮出願第62/196,004号の優先権の利益を主張する。
本出願は、電子形式の配列表と共に出願される。配列表は、「DURC6_007AUS_SEQLIST.txt」という表題のファイルで、大きさは1,081バイト、2016年5月31日に作成され、2016年5月31日に最終的に変更された。電子形式の配列表の情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
の濾液を限外濾過することによって得られた第2の保持液を提供する工程であって、第2の保持液が処理した部分を含む工程を含む。方法のいくつかの実施形態では、ノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスのレベルを測定する工程は、生物学的物質を検出する工程を含み、生物学的物質はウイルスのポリヌクレオチド配列及び/又はポリペプチド配列を含み、生物学的物質はHEVリボ核酸である。方法のいくつかの実施形態では、生物学的物質を測定する工程は、a)処理した部分の一部と溶解溶液を混合することによって得られたHEVリボ核酸を含む第1の反応混合物を提供する工程;b)第1の試薬を第1の反応混合物に添加することによって得られた第2の反応混合物を提供する工程であって、第2の反応混合物がHEVリボ核酸と相補的であるデオキシリボ核酸を含む工程;c)第2の反応混合物に、デオキシリボ核酸内の配列に少なくとも部分的に相補的である第2の試薬を添加する工程;d)第2の反応混合物に、デオキシリボ核酸内の配列に少なくとも部分的に相補的である第3の試薬を添加する工程;e)デオキシリボ核酸内の第2及び第3の試薬によって包含される配列を増幅する工程;並びにf)増幅した配列の濃度を測定する工程を含む。方法のいくつかの実施形態では、第2の試薬及び第3の試薬は、
a)5'-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3'(配列番号1)、
b)5'-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3'(配列番号2)、及び
c)5'-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3'(配列番号3)からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む。
a)開始材料を清澄化する工程;
b)工程a)の溶液を適切な膜でトランスフロー濾過して対応する保持液を得る工程;
c)工程b)の保持液を超遠心分離して対応する上清を得る工程;
d)工程c)の前記上清を1界面活性剤又は界面活性剤の混合物で処理して対応する溶液を得る工程;
e)工程d)の溶液を30%スクロースクッションに載せ、適切な速度及び時間で超遠心分離を実施して対応するペレットを得る工程;
f)工程e)のペレットを適切な体積のPBSに再懸濁して対応する溶液を得る工程;
g)工程f)の溶液を清澄化して対応する溶液を得る工程;
h)工程g)で得られた溶液を適切な膜を使用して限外濾過して対応する保持液を得る工程;並びに
i)工程h)の保持液を濾過する工程
を含むことができる。
a)開始材料を清澄化する工程;
b)工程a)の溶液を適切な膜でトランスフロー濾過して対応する保持液を得る工程;
c)工程b)の前記保持液を1界面活性剤又は界面活性剤の混合物で処理して対応する溶液を得る工程;
d)界面活性剤処理溶液を適切な速度及び適切な時間超遠心分離して対応するペレットを得る工程;
e)工程d)のペレットを適切な体積のPBS中に再懸濁して対応する溶液を得る工程;
f)工程e)の溶液を清澄化して対応する溶液を得る工程;
g)工程f)で得られた溶液を適切な膜で限外濾過して対応する保持液を得る工程;並びに
h)工程g)の保持液を濾過する工程
を含むことができる。
いくつかの実施形態では、細胞培養物中で増殖したノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスを調製する方法であって、ノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスを含む試料を1種又は複数の界面活性剤を含む組成物で処理する工程を含む方法。方法のいくつかの実施形態では、細胞培養物中で増殖したウイルスはHAVである。方法のいくつかの実施形態では、細胞培養物中で増殖したウイルスはPPVである。方法のいくつかの好ましい実施形態では、細胞培養物中で増殖したウイルスはHEVである。方法のいくつかの実施形態では、ウイルスは、インビトロ細胞培養物中で生成する。方法のいくつかの実施形態では、インビトロ細胞培養物は樹立された細胞株を含む。方法のいくつかの実施形態では、樹立された細胞株は、HepG2(ATCC番号HB-8065)及びHepG2/C3A(ATCC番号CRL-10741)からなる群から選択される。方法のいくつかの実施形態では、界面活性剤処理は、ドデシル硫酸リチウム及び/又はトリトンX-100による。方法のいくつかの実施形態では、トリトンX-100の濃度は0.5%であり、LDSの濃度は0.1%である。方法のいくつかの実施形態では、処理する工程は1時間で実施する。方法のいくつかの実施形態では、試料は、清澄化したウイルス感染細胞溶解物懸濁液の超遠心分離から得られた上清である。方法のいくつかの実施形態では、試料は所望により、清澄化したウイルス感染細胞溶解物懸濁液のトランスフロー濾過に由来する保持液である。
いくつかの実施形態では、試料中のノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスのレベルを測定する方法であって、
a)細胞及び培養培地を含む混合物に試料を提供する工程;
b)試料中に存在する場合は、ノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスを増殖させるためにインキュベートして、インキュベートした部分を得る工程;
c)少なくとも第1の界面活性剤で処理して、処理した部分を得る工程;
d)処理した部分の一部を収集して、収集した部分を得る工程;並びに
e)収集した部分中のノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスのレベルを測定する工程を含む方法。
a)第1の溶液を遠心分離することによって得られた第1のペレットを提供する工程;
b)第1のペレットをPBSに再懸濁することによって得られた第2の溶液を提供する工程;
c)第2の溶液を清澄化することによって得られた第3の溶液を提供する工程;
d)膜を使用して第3の溶液を濾過することによって得られた第1の濾液を提供する工程;及び
e)第1の濾液を限外濾過することによって得られた第2の保持液であって、処理した部分を含む第2の保持液を提供する工程
を含む。
a)処理した部分の一部と溶解溶液を混合することによって得られたウイルスリボ核酸を含む第1の反応混合物を提供する工程;
b)第1の試薬を第1の反応混合物に添加することによって得られた第2の反応混合物を提供する工程であって、第2の反応混合物がウイルスRNAに相補的であるデオキシリボ核酸を含む工程;
c)第2の反応混合物に、デオキシリボ核酸内の配列に相補的である第2の試薬を添加する工程;
d)第2の反応混合物に、デオキシリボ核酸内の配列に相補的である第3の試薬を添加する工程;
e)デオキシリボ核酸内の第2及び第3の試薬によって包含される配列を増幅する工程;並びに
f)増幅した配列の濃度を測定する工程
を含む。
a)5'-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3'(配列番号1)、
b)5'-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3'(配列番号2)、及び
c)5'-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3'(配列番号3)からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルスを清澄化するために、凍結した未精製ウイルスストックを使用する。いくつかの実施形態では、濃縮し精製したノンエンベロープウイルスストックを調製するとき、トリトンX-100 0.5%及びLDS 0.1%を解凍した未精製ウイルスストックに添加し37℃で1時間インキュベートする。
TFF-HEVスパイクの調製
タンジェンシャルフロー濾過(TFF)は生体分子のよく知られた分離濃縮方法である。TFFに関する更なる情報は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるLarry Schwartzらによる「Introduction to Tangential Flow Filtration for Laboratory and Process Development Applications」(pall.com/main/laboratory/literature-library-details.page?id=34212)において容易に入手可能である。
TFF上清HEV(TFF-Supe HEV)スパイクの調製
細胞培養物由来のHEVに関連した脂質はウイルスの浮力を増大させ、それによって超遠心分離によるウイルスのペレット化の効率を低下させる。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、トリトンX-100及びドデシル硫酸リチウム(LDS)を含む界面活性剤混合物をHEV含有液に添加して関連した脂質を除去し、ウイルス回収率を増加させる。
実施例1及び2の方法によって生じたウイルススパイクの純度の比較
実施例1及び2の方法によって生じたウイルススパイクの相対的純度を比較するためにSDS-PAGEを使用した。図2に示したように、以下の試料の一定量をA280及び定量的PCRのために取り出した:最初の未精製HEV、TFF保持液、超遠心分離上清、TFF-HEV及びTFF-Supe HEV。TFF保持液及び超遠心分離上清はA280によって測定すると最初の未精製HEV及びTFF-HEVの10倍、TFF-Supe HEVの40倍のタンパク質を有していた(図2)。タンパク質濃度が異なっていても、全試料中のHEV RNAの濃度は最初の未精製物以外は約9log10コピー/mLであった(図2)。したがって、相対的純度は、ウイルス(HEV RNA)のタンパク質(A280)に対する比によって示したように、TFF-Supe HEV及びTFF-HEVでは超遠心分離上清及びTFF保持液よりもずっと高かった。
実施例1及び2の方法によって生じたウイルススパイクの熱安定性の比較
実施例1又は2によって調製したTFF-HEV及びTFF-Supe HEVスパイクの熱安定性を比較するために実験を実施した。両方のウイルス調製物をPBS中でスパイクし、5℃、60℃、70℃又は80℃で4時間インキュベートした。各試験溶液から一定量を取り出し、以下のように力価測定した。試料の段階希釈を作製し、HepG2又はHepG2/C3A細胞を接種したウェルに添加した。ウイルスは37℃で1時間以上吸着させ、増殖培地を添加した。プレートは37℃で2日間以上インキュベートしてから、ウェルから培地を吸引し、緩衝液(例えば、PBS)で2回以上細胞を洗浄/吸引した。次にDynabeads(登録商標)mRNA DIRECT(商標)マイクロキット(Life Technologies社)を使用してプレートのウイルスRNAを抽出するか、又は抽出の準備ができるまで-65℃以下で保存した。抽出後、溶出液(ポリA RNA)はすぐにPCR増幅用に処理するか、又は、PCR増幅の準備ができるまで-65℃以下で保存した。
a)試薬; 4×TaqMan(登録商標)Fast Virus 1-Step Master Mix(Life Technologies社)5.0μl、プライマーF+R100mM 0.08μL、プローブ100mM 0.04μL、SUPERase In(Life Technologies社)0.4μL、水4.4μL及び鋳型10μL(全部で20μl)
b)反応:52℃10分、95℃30秒、及び95℃15秒40回、56℃45秒。
乾燥加熱実験におけるHEV調製方法及びアッセイの適用
原理の証明として、TFF-HEV及びTFF-Supe HEVスパイクを実施例1及び2で記載したように調製し、第VIII因子濃縮製造方法の凍結乾燥/乾燥加熱(FD/DH)工程中のウイルス減少及び/又はクリアランスを評価するための実験で試験した。FD/DH工程は製造方法の最終工程で、下流は溶媒/界面活性剤(S/D)処理工程である。
界面活性剤処理TFF HEVスパイクの調製
TFF-Supe HEVの調製方法は比較的時間がかかる。したがって、TFF HEVスパイク調製用に更に界面活性剤処理方法を開発した。図3に示したように、TFF-HEVを調製するための同じ方法は、本発明のいくつかの実施形態以外は実施例1に従い、TFF保持液を様々な界面活性剤で処理する工程を85,000×g、1.5時間、5℃での超遠心分離の前に挿入する。トリトンTFF-HEV調製物をトリトンX-100 0.5%と37℃で1.5時間インキュベートし、一方、トリトンX-100 0.5%+LDS 0.1%を使用してトリトン/LDS TFF-HEVスパイクを処理した。超遠心分離後、ペレットのみを更にウイルススパイクに処理した。TFF-HEV及び界面活性剤処理TFF-HEVを調製するための方法は、精製方法から中間体画分を取り出し、先に実施例3で記載したようにウイルスの力価を測定することによって比較した。結果はTable3(表3)に示す。
液体加熱実験におけるHEV調製方法及びアッセイの適用
低温殺菌法はアルブミン製造方法の最後の工程であり、高度に精製された生成物のバイアルを60℃で10時間以上加熱することが必要である。ウイルスを実施例6で記載したように調製し、25%アルブミンにスパイクしてから5℃又は60℃で7時間インキュベートした。次にウイルス力価測定のために試料を取り出し、その結果をTable4(表4)に示す。比較として、TFF-Supe HEV(実施例2の方法によって調製した)でスパイクした25%アルブミンの低温殺菌(10時間、60℃)のデータも示す。
TFF、超遠心分離及び限外濾過によるウイルス濃縮及び精製
ウイルスを清澄化するために、凍結した未精製ウイルスストックを解凍した。濃縮し精製したノンエンベロープウイルスストックを調製する場合、トリトンX-100 0.5%及びLDS 0.1%を解凍した未精製ウイルスストックに添加し37℃で1時間インキュベートした。清澄化は2℃から8℃で3000から8000×gの速度で15から30分間遠心分離することによって実施した。上清を取り出して保持し、ペレットは廃棄した。上清を0.45μmフィルターで濾過した。
HepG2:アメリカ培養細胞系統保存機関から得られた肝細胞がん細胞(ATCC番号HB-8065)
DMEM:ダルベッコ改変イーグル培地
FBS:牛胎児血清
力価:物質(ウイルス)の溶液中の濃度又は力価測定によって決定されたこのような物質の強度
SK:スピアマン-カーバーは、比較的高濃度のウイルスを含む試料におけるウイルス価を計算するための統計学的方法である。この方法は、任意の希釈時の陽性ウェルの割合が>25%のときに使用する(図1)。
MPN:最確数は、比較的低濃度のウイルスを含む試料におけるウイルス価を計算するための統計学的方法である。MPNは、全希釈の陽性ウェルの割合が<25%のときに使用する。
ポアソン:ポアソンは、極めて低濃度のウイルスを含む試料におけるウイルス価を計算するための統計学的方法である。この方法は、陽性ウェルが認められないときに使用する。
ATCC:アメリカ培養細胞系統保存機関
HEV TFF保持液:清澄化したHEV-細胞溶解物を300kD TFF膜を使用して濃縮した後に残存する物質。HEV TFF保持液はTFF HEVスパイクを調製するために使用する。
HEV TFF上清は、HEV TFF保持液を約84780×gで遠心分離した後に残存する流出液である。HEV TFF上清はTFF Supe HEVスパイクを調製するために使用する。
TCID50は、50%組織培養感染量(エンドポイント希釈アッセイ)に対応する。感染した宿主の50%を死滅させる、又は接種した組織培養細胞の50%に細胞変性効果を生じさせるために必要なウイルスの量を定量する感染ウイルス価の測定値である。
A280:タンパク質濃度及び/又は量を示す280nmで測定された吸光度。
AU:吸光度単位
ウイルススパイク:ウイルス含量が公知のウイルス試料
Claims (22)
- 細胞培養物中で増殖したノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスを精製する方法であって、ノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスを含む試料を界面活性剤で処理する工程を含み、界面活性剤が0.5%でのトリトンX-100、及び0.5%でのトリトンX-100と0.1%でのドデシル硫酸リチウムとの混合物からなる群から選択され、試料が清澄化したウイルス感染細胞溶解物懸濁液の超遠心分離から得られた上清である、方法。
- 細胞培養物中で増殖したウイルスがE型肝炎ウイルス(HEV)である、請求項1に記載の方法。
- 細胞培養物中で増殖したウイルスがA型肝炎ウイルス(HAV)又はブタパルボウイルス(PPV)のいずれかである、請求項1に記載の方法。
- ウイルスがインビトロ細胞培養物中で生成する、請求項1に記載の方法。
- インビトロ細胞培養物が樹立された細胞株を含む、請求項4に記載の方法。
- 樹立された細胞株がHepG2(ATCC番号HB-8065)及びHepG2/C3A(ATCC番号CRL-10741)からなる群から選択される、請求項5に記載の方法。
- 処理する工程を1時間で実施する、請求項1に記載の方法。
- 試料が清澄化したウイルス感染細胞溶解物懸濁液のトランスフロー濾過に由来する保持液である、請求項1に記載の方法。
- 試料中のノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスの量を測定する方法であって、試料が哺乳動物由来の血漿又は血液を含み、かつ試料が清澄化したウイルス感染細胞溶解物懸濁液の超遠心分離から得られた上清であり、
a)細胞株及び培養培地を含む混合物に試料を提供する工程;
b)試料中に存在する場合は、ノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスを増殖させるためにインキュベートして、インキュベートした部分を得る工程;
c)少なくとも1種の界面活性剤で処理して、処理した部分を得る工程であって、界面活性剤が0.5%でのトリトンX-100、及び0.5%でのトリトンX-100と0.1%でのドデシル硫酸リチウムとの混合物からなる群から選択される、工程;
d)処理した部分の一部を収集して、収集した部分を得る工程;並びに
e)収集した部分中のノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスの量を測定する工程
を含む方法。 - ノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスがHEVである、請求項9に記載の方法。
- ノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスがHAV又はPPVのいずれかである、請求項9に記載の方法。
- ウイルスが樹立された細胞株を含むインビトロ細胞培養物中で増殖する、請求項9に記載の方法。
- 細胞株がHepG2(ATCC番号HB-8065)及びHepG2/C3A(ATCC番号CRL-10741)からなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
- 試料がインキュベートした部分の一部を膜でトランスフロー濾過することによって得られた第1の保持液を含む、請求項9に記載の方法。
- 試料が、インキュベートした部分の一部を膜でトランスフロー濾過して得られた第1の保持液を遠心分離することによって得られた第1の上清を含む、請求項9に記載の方法。
- 試料を少なくとも1種の界面活性剤又は界面活性剤の混合物で処理して第1の溶液を得る、請求項9に記載の方法。
- 更に、
a)第1の溶液を遠心分離することによって得られた第1のペレットを提供する工程;
b)第1のペレットをPBSに再懸濁することによって得られた第2の溶液を提供する工程;
c)第2の溶液を清澄化することによって得られた第3の溶液を提供する工程;
d)膜を使用して第3の溶液を濾過することによって得られた第1の濾液を提供する工程;及び
e)第1の濾液を限外濾過することによって得られた第2の保持液を提供する工程であって、第2の保持液が処理した部分を含む工程
を含む、請求項16に記載の方法。 - ノンエンベロープ又はシュードエンベロープウイルスの量を測定する工程が生物学的物質を検出する工程を含む、請求項9に記載の方法。
- 生物学的物質が、ウイルスのポリヌクレオチド配列及び/又はポリペプチド配列を含む、請求項18に記載の方法。
- 生物学的物質がHEVリボ核酸である、請求項19に記載の方法。
- 生物学的物質を測定する工程が、
a)処理した部分の一部と溶解溶液を混合することによって得られたHEVリボ核酸を含む第1の反応混合物を提供する工程;
b)第1の試薬を第1の反応混合物に添加することによって得られた第2の反応混合物を提供する工程であって、第2の反応混合物がHEVリボ核酸と相補的であるデオキシリボ核酸を含む工程;
c)第2の反応混合物に、デオキシリボ核酸内の配列に少なくとも部分的に相補的である第2の試薬を添加する工程;
d)第2の反応混合物に、デオキシリボ核酸内の配列に少なくとも部分的に相補的である第3の試薬を添加する工程;
e)デオキシリボ核酸内の第2及び第3の試薬によって包含される配列を増幅する工程;並びに
f)増幅した配列の濃度を測定する工程
を含む、請求項20に記載の方法。 - 第2の試薬及び第3の試薬が、
a)5'-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3'(配列番号1)、
b)5'-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3'(配列番号2)、及び
c)5'-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3'(配列番号3)
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項21に記載の方法。
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