RU2691026C1 - Способы очистки вируса, продуцированного in vitro, и анализ элиминации вируса - Google Patents
Способы очистки вируса, продуцированного in vitro, и анализ элиминации вируса Download PDFInfo
- Publication number
- RU2691026C1 RU2691026C1 RU2016128956A RU2016128956A RU2691026C1 RU 2691026 C1 RU2691026 C1 RU 2691026C1 RU 2016128956 A RU2016128956 A RU 2016128956A RU 2016128956 A RU2016128956 A RU 2016128956A RU 2691026 C1 RU2691026 C1 RU 2691026C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- virus
- hev
- shell
- pseudo
- sample
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 173
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 134
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 230000008030 elimination Effects 0.000 title abstract description 16
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 title abstract description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title description 7
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims abstract description 64
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 34
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 15
- 241000724675 Hepatitis E virus Species 0.000 claims description 90
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 53
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 52
- YFVGRULMIQXYNE-UHFFFAOYSA-M lithium;dodecyl sulfate Chemical compound [Li+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O YFVGRULMIQXYNE-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 37
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 36
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 36
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 34
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 31
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 31
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 31
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 19
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 19
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 18
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 claims description 15
- 241000702619 Porcine parvovirus Species 0.000 claims description 14
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 14
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 12
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 12
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 11
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 claims description 9
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 8
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 claims description 8
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 8
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 43
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 20
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 40
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 36
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 31
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 29
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 22
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 16
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 15
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 14
- 239000000463 material Substances 0.000 description 14
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 9
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 8
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 8
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 7
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 6
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 6
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 6
- 210000004407 endothelial cell of postcapillary venule of lymph node Anatomy 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 5
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 5
- GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 3-(2-methoxyethoxy)benzohydrazide Chemical compound COCCOC1=CC=CC(C(=O)NN)=C1 GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 4
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 4
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 4
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 4
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 4
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 4
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 4
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 description 3
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000010808 liquid waste Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003253 viricidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 241000714201 Feline calicivirus Species 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241001207270 Human enterovirus Species 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229940105778 coagulation factor viii Drugs 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002941 microtiter virus yield reduction assay Methods 0.000 description 1
- 244000309711 non-enveloped viruses Species 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 238000011165 process development Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/02—Recovery or purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/29—Hepatitis virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D7/00—Compositions of detergents based essentially on non-surface-active compounds
- C11D7/22—Organic compounds
- C11D7/26—Organic compounds containing oxygen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D7/00—Compositions of detergents based essentially on non-surface-active compounds
- C11D7/22—Organic compounds
- C11D7/34—Organic compounds containing sulfur
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
- C12Q1/707—Specific hybridization probes for hepatitis non-A, non-B Hepatitis, excluding hepatitis D
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
- G01N33/5768—Hepatitis A
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D2111/00—Cleaning compositions characterised by the objects to be cleaned; Cleaning compositions characterised by non-standard cleaning or washing processes
- C11D2111/10—Objects to be cleaned
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14051—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14311—Parvovirus, e.g. minute virus of mice
- C12N2750/14351—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/28011—Hepeviridae
- C12N2770/28111—Hepevirus, e.g. hepatitis E virus
- C12N2770/28151—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32411—Hepatovirus, i.e. hepatitis A virus
- C12N2770/32451—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32511—Parechovirus, e.g. human parechovirus
- C12N2770/32551—Methods of production or purification of viral material
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ очистки вируса без оболочки или с псевдооболочкой, продуцированного in vitro, с использованием композиции с по меньшей мере одним детергентом. Также предложены способ очистки, в котором могут быть использованы несколько детергентов, и способ определения присутствия и/или уровня вируса без оболочки или с псевдооболочкой в образце. Изобретение позволяет получить препараты вируса HEV с высокой степенью чистоты и с высоким титром, которые являются подходящими для использования в исследованиях элиминации вируса на последующих стадиях процесса производства. 2 н. и 21 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 табл., 8 пр.
Description
ПРИОРИТЕТ И ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
В данной заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке на патент США 62/196004, поданной 23 июля 2015 года, которая включена в данное описание посредством ссылки во всей ее полноте.
ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Настоящая заявка подается вместе с перечнем последовательностей в машиночитаемом формате. Перечень последовательностей представлен в виде файла DURC6_007AUS_SEQLIST.txt размером 1081 байт, созданного 31 мая 2016 года и окончательно измененного 31 мая 2016 года. Информация в перечне последовательностей в машиночитаемом формате включена в данное описание посредством ссылки во всей ее полноте.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Область техники
Настоящее изобретение относится к области вирусологии, более конкретно к способам очистки вируса без оболочки или с псевдооболочкой, например вируса гепатита Е (HEV), вируса гепатита A (HAV) и свиного парвовируса (PPV), размножившегося в клеточной культуре, и для использования в исследованиях элиминации вируса.
Описание родственного уровня техники
Клиническое применение всех продуктов, имеющих происхождение из крови и плазмы, несет потенциальный риск передачи инфекционных патогенов, передающихся с кровью. Минимизация риска может быть достигнута путем осуществления стадий подавления патогенов в процессах производства продуктов, имеющих происхождение из крови и плазмы. Для разработки и демонстрации эффективности таких стадий подавления патогенов проводят исследования элиминации вируса. Во время этих исследований известное количество вируса преднамеренно вносится в промежуточный продукт крови или плазмы, и затем этот внесенный материал подвергается процессингу с использованием лабораторной модели (модели в уменьшенном масштабе) производственного процесса, включающего стадию подавления патогенов. Снижение вирусной нагрузки и/или элиминацию вируса во время стадии подавления патогенов определяют путем сравнения количества вируса до и после данной стадии.
Для обеспечения достоверности данных по элиминации вируса модель в уменьшенном масштабе должна точно отображать крупномасштабный типовой процесс, и препарат вируса для модельного заражения (virus spike) должен быть репрезентативным в качестве потенциального контаминанта. Например, культивирование вируса для модельного заражения in vitro может потребовать сыворотки, а присутствие сыворотки в препарате вируса для модельного заражения может повлиять на исследования элиминации, которые включают бессывороточные промежуточные продукты. Присутствие невирусных контаминантов, таких как внеклеточные мембраны хозяина, белки и нуклеиновые кислоты, также могут помешать правильной оценке элиминации вируса во время последующей стадии, где промежуточные продукты являются преимущественно высокоочищенными. Таким образом, важно удалить загрязняющие примеси препарата вируса для модельного заражения, которые могут повлиять на выполнимость и уместность моделей в уменьшенном масштабе.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В некоторых воплощениях настоящее изобретение включает способ очистки вируса без оболочки или с псевдооболочкой, размножившегося в клеточной культуре, на основе способа обработки образца, содержащего вирус без оболочки или вирус с псевдооболочкой, детергентом. В некоторых воплощениях указанного способа вирус, размножившийся в клеточной культуре, представляет собой вирус гепатита A (HAV). В некоторых воплощениях указанного способа вирус, размножившийся в клеточной культуре, представляет собой свиной парвовирус (PPV). В некоторых предпочительных воплощениях указанного способа вирус, размножившийся в клеточной культуре, представляет собой вирус гепатита Е (HEV). В некоторых воплощениях указанного способа вирус продуцирован в клеточной культуре in vitro. В некоторых воплощениях указанного способа клеточная культура in vitro включает стабильную клеточную линию. В некоторых воплощениях указанного способа указанная стабильная клеточная линия выбрана из группы, состоящей из HepG2 (номер НВ-8065 в Американской коллекции типовых культур (АТСС)) и HepG2/C3A (номер CRL-10741 в АТСС). В некоторых воплощениях указанного способа детергент выбран из группы, состоящей из додецилсульфата лития, Тритона Х-100 и их смесей. В некоторых воплощениях указанного способа концентрация Тритона Х-100 составляет 0,5%, и концентрация додецилсульфата лития составляет 0,1%. В некоторых воплощениях указанного способа стадию обработки осуществляют в течение 1 часа. В некоторых воплощениях указанного способа образец представляет собой супернатант, полученный в результате ультрацентрифугирования осветленной суспензии лизата клеток, инфицированных вирусом. В некоторых воплощениях указанного способа, возможно, образец представляет собой концентрат, полученный в результате проточной фильтрации осветленной суспензии лизата клеток, инфицированных вирусом.
Способ измерения уровня вируса без оболочки или с псевдооболочкой в образце включает стадии: а) внесения образца в смесь, содержащую клеточную линию и культуральную среду; б) инкубирования для обеспечения размножения вируса без оболочки или с псевдооболочкой, в случае его присутствия в образце, с получением инкубированной порции; в) обработки по меньшей мере одним детергентом с получением обработанной порции; г) сбора части обработанной порции с получением собранной порции; и д) измерения уровня вируса без оболочки или с псевдооболочкой в собранной порции. В некоторых воплощениях указанного способа указанный образец получен из млекопитающего. В некоторых воплощениях указанного способа указанный образец содержит плазму или кровь. В некоторых воплощениях указанного способа вирус без оболочки или с псевдооболочкой представляет собой HAV. В некоторых воплощениях указанного способа вирус без оболочки или с псевдооболочкой представляет собой PPV. В некоторых предпочтительных воплощениях указанного способа вирус без оболочки или с псевдооболочкой представляет собой HEV. В некоторых воплощениях указанного способа вирус размножается в клеточной культуре in vitro, включающей стабильную клеточную линию. В некоторых воплощениях указанного способа клеточная линия выбрана из группы, состоящей из HepG2 (номер НВ-8065 в АТСС) и HepG2/C3A (номер CRL-10741 в АТСС). В некоторых воплощениях указанного способа указанный образец содержит первый концентрат, полученный посредством проточной фильтрации части инкубированной порции через мембрану. В некоторых воплощениях указанного способа, возможно, указанный образец содержит первый супернатант, полученный посредством проточной фильтрации части инкубированной порции через мембрану с получением первого концентрата и центрифугирования указанного первого концентрата. В некоторых воплощениях указанного способа указанный образец обрабатывают по меньшей мере одним детергентом или, возможно, смесью детергентов с получением первого раствора, причем способ дополнительно включает: а) получение первого осадка, получаемого путем центрифугирования первого раствора; б) получение второго раствора, получаемого путем ресуспендирования первого осадка в PBS (фосфатно-буферный раствор); в) получение третьего раствора, получаемого путем осветления второго раствора; г) получение первого фильтрата, получаемого путем фильтрования третьего раствора с использованием мембраны; и д) получение второго концентрата, получаемого путем ультрафильтрования первого фильтрата, где указанный второй концентрат содержит обработанную порцию. В некоторых воплощениях указанного способа измерение уровня вируса без оболочки или с псевдооболочкой включает выявление биологического вещества, где указанное биологическое вещество содержит полинуклеотидную последовательность и/или полипептидную последовательность вируса, и где указанное биологическое вещество представляет собой рибонуклеиновую кислоту HEV. В некоторых воплощениях указанного способа измерение биологического вещества включает: а) получение первой реакционной смеси, содержащей рибонуклеиновую кислоту HEV, получаемой путем смешивания части обработанной порции с раствором для лизиса; б) получение второй реакционной смеси, получаемой путем добавления к первой реакционной смеси первого реагента, где указанная вторая реакционная смесь содержит дезоксирибонуклеиновую кислоту, которая комплементарна указанной рибонуклеиновой кислоте HEV; в) добавление к второй реакционной смеси второго реагента, который по меньшей мере частично комплементарен последовательности, находящейся в пределах указанной дезоксирибонуклеиновой кислоты; г) добавление к второй реакционной смеси третьего реагента, который по меньшей мере частично комплементарен последовательности, находящейся в пределах указанной дезоксирибонуклеиновой кислоты; д) амплификацию последовательности, охватываемой указанными вторым и третьим реагентами в пределах указанной дезоксирибонуклеиновой кислоты; и е) измерение концентрации амплифицированной последовательности. В некоторых воплощениях указанного способа второй реагент и третий реагент содержат олигонуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
а) 5'-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3' (SEQ ID NO: 1);
б) 5'-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3' (SEQ ID NO: 2) и
в) 5'-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3' (SEQ ID NO: 3).
В некоторых воплощениях настоящее изобретение включает способ очистки вируса без оболочки или с псевдооболочкой, размножившегося в клеточной культуре, на основе способа обработки образца, содержащего вирус без оболочки или с псевдооболочкой, по меньшей мере одним анионным детергентом, таким как додецилсульфат лития (LDS), или по меньшей мере одним неионным детергентом, таким как Тритон Х-100, или комбинацией указанных двух агентов, обеспечивая получение вируса, чье поведение в исследованиях элиминации предположительно такое же или близко к такому же, как у тех, которые могли бы потенциально присутствовать в высокоочищенных технологических потоках. В некоторых воплощениях вирус, продуцированный согласно некоторым воплощениям описанного выше способа, представляет собой подходящий вирус для модельного заражения для тестирования эффективности снижения вирусной нагрузки и/или элиминации вируса на последующих стадиях процессов производства белков, имеющих происхождение из крови и/или плазмы.
В некоторых воплощениях способ очистки вируса, продуцированного в клеточной культуре, основан на способе обработки, включающем: осветление инфицированного вирусом материала; проточную фильтрацию по меньшей мере части смеси через мембрану с получением первого концентрата; и центрифугирование указанного первого концентрата с получением первого супернатанта. Данный способ обработки включает: обработку первого супернатанта по меньшей мере одним детергентом с получением первого раствора; где указанный способ дополнительно включает: после указанной обработки, центрифугирование первого раствора с получением первого осадка; ресуспендирование первого осадка с получением второго раствора; осветление второго раствора с получением третьего раствора; фильтрование третьего раствора с использованием мембраны с получением первого фильтрата; и ультрафильтрование первого фильтрата с получением второго концентрата, который дает по меньшей мере часть обработанной порции, подлежащей сбору; где указанный по меньшей мере один детергент выбран из группы, состоящей из додецилсульфата лития, Тритона Х-100 и их смесей; где концентрация Тритона Х-100 составляет 0,5%, и концентрация LDS составляет 0,1%; где указанную обработку первого супернатанта по меньшей мере одним детергентом осуществляют в течение 1 часа.
В некоторых воплощениях способ очистки вируса, продуцированного в клеточной культуре, основан на способе обработки, включающем: осветление инфицированного вирусом материала; проточную фильтрацию по меньшей мере части смеси через мембрану с получением первого концентрата. Данный способ обработки включает: обработку первого концентрата по меньшей мере одним детергентом с получением первого раствора; где указанный способ дополнительно включает: после указанной обработки, центрифугирование первого раствора с получением первого осадка; ресуспендирование первого осадка с получением второго раствора; осветление второго раствора с получением третьего раствора; фильтрование третьего раствора с использованием мембраны с получением первого фильтрата; и ультрафильтрование первого фильтрата с получением второго концентрата, который дает по меньшей мере часть обработанной порции, подлежащей сбору; где указанный по меньшей мере один детергент выбран из группы, состоящей из додецилсульфата лития, Тритона Х-100 и их смесей; где концентрация Тритона Х-100 составляет 0,5%, и концентрация LDS составляет 0,1%; где указанную обработку первого концентрата по меньшей мере одним детергентом осуществляют в течение 1 часа.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На Фиг. 1 показано получение препаратов вируса HEV для модельного заражения в виде препарата после проточной фильтрации (TFF HEV) и TFF-супернатанта (Supe) HEV согласно некоторым раскрытым здесь воплощениям.
На Фиг. 2 показана относительная чистота препаратов вируса для модельного заражения TFF HEV и TFF Supe HEV, которые были получены согласно некоторым раскрытым здесь воплощениям.
На Фиг. 3 показано получение препаратов вируса для модельного заражения TFF HEV, Triton TFF HEV и Triton/LDS TFF HEV согласно некоторым раскрытым здесь воплощениям.
На Фиг. 4 показаны нуклеотидные последовательности праймеров и зондов.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Эффективные системы клеточных культур для продуцирования безоболочечного вируса HEV в настоящее время устанавливаются, и данные показывают, что HEV, получаемый в клеточной культуре, сходен с HEV, обнаруживаемым в крови, в том что они оба ассоциированы с липидами. Как таковые, необработанные осветленные лизаты клеточных культур или супернатанты культур могли бы быть использованы в качестве препаратов вируса для модельного заражения в исследованиях элиминации на первых производственных стадиях с относительно загрязненными промежуточными продуктами. Однако, использование необработанных препаратов вируса для модельного заражения может быть неприемлемым для оценки элиминации HEV во время последующих стадий, где производственные потоки имеют относительно высокую степень чистоты.
Изобретение относится к способу получения препаратов вируса HEV для модельного заражения относительно высокой степени чистоты и с высоким титром, которые являются подходящими для использования в исследованиях элиминации вируса на последующих стадиях процесса производства.
Из-за сложностей культивирования HEV in vitro анализы инфекционной способности HEV на основе клеточной культуры ранее не были легко доступны. В некоторых раскрытых здесь воплощениях размножение HEV с высоким титром в клеточной культуре возможно при использовании сред, обогащенных полибреном.
Хотя HEV технически рассматривается как вирус без оболочки, HEV, размножившийся в клеточной культуре, часто содержит мембранные фрагменты/липиды, поскольку это высвобождается из клеток. Эти мембранные компоненты могут защищать вирус от вирулицидных обработок, таких как жидкостное нагревание или сухое нагревание лиофилизированных осадков. HEV может быть обработан детергентами, такими как Твин, для удаления мембранного дебриса, однако обработанный вирус часто остается устойчивым к инактивации нагреванием.
В некоторых воплощениях липиды, ассоциированные с клеточной культурой HEV, могут быть удалены посредством обработки Тритоном Х-100. В некоторых воплощениях липиды, ассоциированные с клеточной культурой HEV, могут быть удалены посредством обработки додецилсульфатом лития (LDS). В некоторых воплощениях липиды, ассоциированные с клеточной культурой HEV, могут быть удалены посредством обработки комбинацией Тритона Х-100 и додецилсульфата лития (LDS). В некоторых воплощениях полученный вирусный препарат все еще является инфекционным. В некоторых воплощениях концентрации внешних невирусных контаминантов снижены в вирусном препарате. В некоторых воплощениях вирус также более чувствителен к инактивации посредством вирулицидных обработок, таких как нагревание.
HEV не вызывает цитопатических эффектов (СРЕ) в клеточной культуре. Таким образом, выявление HEV основано на ПЦР-анализе, изначально разработанном Национальным Институтом Здоровья (National Institutes of Health, NIH). В некоторых воплощениях ПЦР-анализ был модифицирован для повышения чувствительности. В некоторых воплощениях один из праймеров, используемых в ПЦР-анализе, был изменен. В некоторых воплощениях обратный праймер, используемый в ПЦР-анализе, был изменен. В некоторых воплощениях зонд, используемый в ПЦР-анализе, был сконструирован заново. Полностью новый зонд был разработан для данного ПЦР-анализа. В некоторых воплощениях ПЦР-анализ использовали для оценки образцов как положительных или отрицательных для определения титров вируса.
В некоторых воплощениях изобретение относится к способу, включающему: размножение HEV с высоким титром в клеточной культуре посредством использования среды, обогащенной полибреном; обработку клеточной культуры HEV Тритоном X-100/LDS для удаления мембранных липидов/дебриса; и выявление HEV с использованием чувствительного ПЦР-анализа.
В некоторых воплощениях способ может быть специфичным к HEV. В некоторых воплощениях методики размножения вируса и очистки могут быть применимы к другим безоболочечным вирусам. В некоторых воплощениях методики размножения вируса и очистки могут быть применимы к другим вирусам с псевдооболочкой. В некоторых воплощениях методики размножения вируса и очистки могут быть применимы к HAV. В некоторых воплощениях методики размножения вируса и очистки могут быть применимы к PPV. В некоторых предпочтительных воплощениях методики размножения вируса и очистки могут быть применимы к HEV.
В некоторых воплощениях изобретение может быть использовано для осуществления исследований по оценке эффективности удаления/инактивации HEV на различных стадиях производства и в промежуточных и конечных продуктах. В некоторых воплощениях изобретение может быть использовано для осуществления исследований по оценке эффективности удаления/инактивации других вирусов на различных стадиях производства и в промежуточных и конечных продуктах. В некоторых воплощениях другие вирусы представляют собой вирусы без оболочки. В некоторых воплощениях другие вирусы представляют собой вирусы с псевдооболочкой. В некоторых воплощениях другие вирусы представляют собой HAV и PPV.
В некоторых воплощениях изобретение может обеспечить безопасность различных медицинских или клинических продуктов, таких как кровь и/или плазма, от HEV. В некоторых воплощениях изобретение может обеспечить безопасность различных медицинских или клинических продуктов, таких как кровь и/или плазма, от других вирусов. В некоторых воплощениях другие вирусы представляют собой HAV и PPV.
В некоторых воплощениях настоящее изобретение относится к способу очистки вируса без оболочки или с псевдооболочкой, продуцированному in vitro. В некоторых воплощениях настоящее изобретение относится к способу очистки HEV, продуцированному in vitro. В некоторых воплощениях очистка включает стадию детергентной обработки композицией, содержащей по меньшей мере один анионный и/или один неионный детергент, такой как додецилсульфат лития и/или Тритон Х-100.
В некоторых воплощениях подразумевается, что в композиции, содержащей по меньшей мере один детергент, указанный детергент представляет собой неионный детергент. В некоторых воплощениях подразумевается, что в композиции, содержащей комбинацию детергентов, один детергент является неионным, а другой анионным. В некоторых воплощениях подразумевается, что в композиции, содержащей по меньшей мере один анионный детергент, указанный детергент представляет собой LDS. В некоторых воплощениях подразумевается, что в композиции, содержащей по меньшей мере один неионный детергент, указанный детергент представляет собой Тритон Х-100. В предпочтительном воплощении композиция содержит более одного детергента. В предпочтительном воплощении композиция содержит по меньшей мере два детергента. В предпочтительном воплощении композиция содержит один анионный детергент и один неионный детергент. В предпочтительном воплощении анионный детергент представляет собой LDS, и неионный детергент представляет собой Тритон Х-100.
В некоторых воплощениях по меньшей мере один детергент используют в концентрации, адекватной для осуществления его функции в способе очистки по настоящему изобретению. В некоторых воплощениях каждый из двух детергентов используют в концентрации, адекватной для осуществления его функции в способе очистки по настоящему изобретению. В некоторых воплощениях концентрация Тритона Х-100 находится в диапазоне от 0,1% до 2,5% об./об. В некоторых предпочтительных воплощениях концентрация Тритона Х-100 составляет 0,5% об./об. В некоторых воплощениях концентрация LDS находится в диапазоне от 0,02% до 0,5% об./об. В некоторых предпочтительных воплощениях концентрация LDS составляет 0,1% об./об.
В некоторых воплощениях обработку композицией, содержащей один или более детергентов, осуществляют в течение периода времени, как требуется и определяется специалистом в данной области техники. В некоторых воплощениях указанную обработку осуществляют в течение периода времени от 5 минут до 1 суток. В некоторых предпочтительных воплощениях указанную обработку осуществляют в течение периода времени от 10 минут до 3 часов. В некоторых предпочтительных воплощениях указанную обработку осуществляют в течение 1 часа.
В наиболее предпочтительном воплощении используют композицию, содержащую 0,5% Тритона Х-100 и 0,1% LDS, и стадию обработки указанной композицией осуществляют в течение 1 часа. В некоторых воплощениях инкубацию осуществляют при 37°С в течение 1 часа.
В некоторых воплощениях в качестве исходного материала для осуществления способа очистки по настоящему изобретению используют супернатант, полученный в результате ультрацентрифугирования клеточной культуральной среды, инфицированной вирусом, или осветленной суспензии лизата клеток, инфицированных вирусом, обе из которых имеют происхождение из инфицированных вирусом клеточных культур. В предпочтительном воплощении используют супернатант, полученный в результате ультрацентрифугирования осветленной суспензии лизата клеток, инфицированных вирусом.
В некоторых воплощениях в качестве исходного материала для осуществления способа очистки по настоящему изобретению используют концентрат, полученный после проточной фильтрации инфицированной вирусом клеточной культуральной среды или осветленной суспензии лизата клеток, инфицированных вирусом, обе из которых имеют происхождение из инфицированных вирусом клеточных культур. В предпочтительном воплощении используют концентрат, полученный после проточной фильтрации осветленной суспензии лизата клеток, инфицированных вирусом.
В первом воплощении способ очистки может включать следующие стадии:
а) осветление исходного материала;
б) проточную фильтрацию раствора со стадии а) через подходящую мембрану с получением соответствующего концентрата;
в) ультрацентрифугирование концентрата со стадии б) с получением соответствующего супернатанта;
г) обработку указанного супернатанта со стадии в) детергентом или смесью детергентов с получением соответствующего раствора;
д) помещение раствора со стадии г) на 30%-ную сахарозную подушку и осуществление ультрацентрифугирования при подходящих скорости и периоде времени с получением соответствующего осадка;
е) ресуспендирование осадка со стадии д) в подходящем объеме PBS с получением соответствующего раствора;
ж) осветление раствора со стадии е) с получением соответствующего раствора;
з) ультрафильтрование раствора, полученного на стадии ж), с использованием подходящей мембраны с получением соответствующего концентрата; и
и) фильтрование концентрата со стадии з).
В предпочтительном первом воплощении на стадии а) исходный материал подвергают осветлению через фильтр с размером пор 0,45 мкм.
В предпочтительном первом воплощении на стадии б) мембрана, используемая для осуществления проточной фильтрации, представляет собой мембрану 300 кДа.
В предпочтительном первом воплощении на стадии в) ультрацентрифугирование осуществляют при 85000 × g в течение 1,5 часов.
В предпочтительном первом воплощении на стадии г), если используют смесь детергентов, указанная смесь детергентов содержит 0,5% Тритона Х-100 и 0,1% LDS.
В предпочтительном первом воплощении на стадии д) ультрацентрифугирование осуществляют при 100000 × g в течение 8 часов.
В предпочтительном первом воплощении предусматривается, что на стадии е) осадок ресуспендируют в PBS.
В предпочтительном первом воплощении на стадии ж) раствор со стадии е) подвергают осветлению через фильтр с размером пор 0,2 мкм.
В предпочтительном первом воплощении на стадии з) мембрана, используемая при ультрафильтровании, представляет собой мембрану 100 кДа.
В предпочтительном первом воплощении на стадии и) фильтрование осуществляют через фильтр с размером пор 0,2 мкм.
Во втором воплощении способ очистки может включать следующие стадии:
а) осветление исходного материала;
б) проточную фильтрацию раствора со стадии а) через подходящую мембрану с получением соответствующего концентрата;
в) обработку указанного концентрата со стадии б) детергентом или смесью детергентов с получением соответствующего раствора;
г) ультрацентрифугирование обработанного детергентом раствора при подходящей скорости и в течение подходящего периода времени с получением соответствующего осадка;
д) ресуспендирование осадка со стадии г) в подходящем объеме PBS с получением соответствующего раствора;
е) осветление раствора со стадии д) с получением соответствующего раствора;
ж) ультрафильтрование раствора, полученного на стадии е), с использованием подходящей мембраны с получением соответствующего концентрата; и
з) фильтрование концентрата со стадии ж).
В предпочтительном втором воплощении на стадии а) исходный материал подвергают осветлению через фильтр с размером пор 0,45 мкм.
В предпочтительном втором воплощении на стадии б) мембрана, используемая для осуществления проточной фильтрации, представляет собой мембрану 300 кДа.
В предпочтительном втором воплощении на стадии в), если используют смесь детергентов, указанная смесь детергентов представляет собой 0,5% Тритона Х-100 и 0,1% LDS.
В предпочтительном втором воплощении на стадии г) ультрацентрифугирование осуществляют при 85000 × g в течение 1,5 часов.
В предпочтительном втором воплощении на стадии д) осадок ресуспендируют в PBS.
В предпочтительном втором воплощении на стадии е) раствор со стадии д) подвергают осветлению через фильтр с размером пор 0,2 мкм.
В предпочтительном втором воплощении на стадии ж) мембрана, используемая при ультрафильтровании, представляет собой мембрану 100 кДа.
В предпочтительном втором воплощении на стадии з) фильтрование осуществляют через фильтр с размером пор 0,2 мкм.
Настоящее изобретение относится к применению LDS и/или Тритона X-100 в способе очистки вируса без оболочки или с псевдооболочкой, продуцированного in vitro. В некоторых воплощениях вирус представляет собой вирус без оболочки. В некоторых воплощениях вирус представляет собой вирус с псевдооболочкой.
В предпочтительном воплощении вирус, продуцированный in vitro, представляет собой HEV. В некоторых воплощениях вирус, продуцированный in vitro, может представлять собой вирус, отличный от HEV. В некоторых воплощениях вирус, продуцированный in vitro, представляет собой HAV. В некоторых воплощениях вирус, продуцированный in vitro, представляет собой PPV. В наиболее предпочтительном воплощении вирус, продуцированный in vitro, представляет собой HEV.
В некоторых воплощениях описанное выше продуцирование in vitro осуществляют в культуре in vitro. В некоторых воплощениях культура in vitro представляет собой орган, ткань или клеточную культуру in vitro. В предпочтительном воплощении продуцирование in vitro осуществляют в клеточной культуре in vitro.
В некоторых воплощениях используют первичную клеточную культуру. В некоторых воплощениях используют культуральную линию клеток. Первичные клетки и культуральные линии клеток могут иметь происхождение из любого организма. Например, в некоторых воплощениях подразумевается использование клеток насекомых. В некоторых воплощениях подразумевается использование клеток млекопитающих. В предпочтительном воплощении используют человеческую культуральную линию клеток.
В предпочтительном воплощении используют линию клеток печени для продуцирования и очистки HEV. В другом предпочтительном воплощении используют линию клеток почки для продуцирования и очистки HEV. В некоторых воплощениях линия клеток печени может иметь происхождение от здоровой или пораженной болезнью печени. В некоторых воплощениях линия клеток печени может представлять собой линию клеток злокачественной или доброкачественной опухоли. В некоторых воплощениях линия клеток почки может иметь происхождение от здоровой или пораженной болезнью почки. В некоторых воплощениях линия клеток почки может представлять собой линию клеток злокачественной или доброкачественной опухоли. В предпочтительном воплощении используют стабильную линию клеток. В некоторых воплощениях клетка представляет собой HepG2 (номер НВ-8065 в АТСС). В некоторых воплощениях клетка представляет собой HepG2/C3A (номер CRL-10741 в АТСС).
В некоторых воплощениях используют анализ инфицирующей способности HEV. В некоторых воплощениях могут быть получены препараты вируса для модельного заражения с инфекционными титрами приблизительно 8 log10. Анализ является относительно коротким по продолжительности (3-7-суточный анализ). Наблюдался незначительный или не наблюдалось никакого ПЦР-фона, и может быть продемонстрировано свыше чем 4 log10 снижение вирусной нагрузки. Таким образом, в некоторых воплощениях используют анализ выявления вируса на основе ПЦР. В некоторых воплощениях используют выявление HEV на основе ПЦР.
Дополнительные предпочтительные воплощения - 1
В некоторых воплощениях способ получения вируса без оболочки или с псевдооболочкой, размножившегося в клеточной культуре, включает: стадию обработки образца, содержащего вирус без оболочки или с псевдооболочкой, композицией, содержащей один или более детергентов. В некоторых воплощениях указанного способа вирус, размножившийся в клеточной культуре, представляет собой HAV. В некоторых воплощениях указанного способа вирус, размножившийся в клеточной культуре, представляет собой PPV. В некоторых предпочтительных воплощениях способа вирус, размножившийся в клеточной культуре, представляет собой HEV. В некоторых воплощениях указанного способа вирус продуцирован в клеточной культуре in vitro. В некоторых воплощениях указанного способа клеточная культура in vitro включает стабильную клеточную линию. В некоторых воплощениях указанного способа указанная стабильная клеточная линия выбрана из группы, состоящей из HepG2 (номер НВ-8065 в АТСС) и HepG2/C3A (номер CRL-10741 в АТСС). В некоторых воплощениях указанного способа обработка детергентом представляет собой обработку додецилсульфатом лития и/или Тритоном Х-100. В некоторых воплощениях указанного способа концентрация Тритона Х-100 составляет 0,5%, и концентрация LDS составляет 0,1%. В некоторых воплощениях указанного способа стадию обработки осуществляют в течение 1 часа. В некоторых воплощениях указанного способа образец представляет собой супернатант, полученный в результате ультрацентрифугирования осветленной суспензии лизата клеток, инфицированных вирусом. В некоторых воплощениях указанного способа образец возможно представляет собой концентрат, полученный в результате проточной фильтрации осветленной суспензии лизата клеток, инфицированных вирусом.
Дополнительные предпочтительные воплощения - 2
В некоторых воплощениях способ измерения уровня вируса без оболочки или с псевдооболочкой в образце включает стадии:
а) внесения образца в смесь, содержащую клеточную линию и культуральную среду;
б) инкубирования для обеспечения размножения вируса без оболочки или с псевдооболочкой, в случае его присутствия в образце, с получением инкубированной порции;
в) обработки по меньшей мере одним детергентом с получением обработанной порции;
г) сбора части обработанной порции с получением собранной порции; и
д) измерения уровня вируса без оболочки или с псевдооболочкой в собранной порции.
В некоторых воплощениях указанного способа указанный образец получен из млекопитающего. В некоторых воплощениях указанного способа указанный образец содержит плазму или кровь. В некоторых воплощениях указанного способа вирус без оболочки или с псевдооболочкой представляет собой HAV. В некоторых воплощениях указанного способа вирус без оболочки или с псевдооболочкой представляет собой PPV. В некоторых предпочтительных воплощениях указанного способа вирус без оболочки или с псевдооболочкой представляет собой HEV. В некоторых воплощениях указанного способа вирус продуцирован в клеточной культуре. В некоторых воплощениях указанного способа клетка выбрана из группы, состоящей из HepG2 (номер НВ-8065 в АТСС) и HepG2/C3A (номер CRL-10741 в АТСС). В некоторых воплощениях указанного способа указанный образец содержит первый концентрат, полученный посредством проточной фильтрации части инкубированной порции через мембрану. В некоторых воплощениях указанного способа указанный образец возможно содержит первый супернатант, полученный посредством проточной фильтрации части инкубированной порции через мембрану с получением первого концентрата и центрифугирования указанного первого концентрата. В некоторых воплощениях указанного способа указанный образец обрабатывают по меньшей мере одним детергентом или возможно смесью детергентов с получением первого раствора. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает:
а) получение первого осадка, получаемого путем центрифугирования первого раствора;
б) получение второго раствора, получаемого путем ресуспендирования первого осадка в PBS;
в) получение третьего раствора, получаемого путем осветления второго раствора;
г) получение первого фильтрата, получаемого путем фильтрования третьего раствора с использованием мембраны; и
д) получение второго концентрата, получаемого путем ультрафильтрования первого фильтрата, где указанный второй концентрат содержит обработанную порцию.
В некоторых воплощениях указанного способа измерение уровня вируса без оболочки или с псевдооболочкой включает выявление биологического вещества. В некоторых воплощениях указанного способа указанное биологическое вещество содержит полинуклеотидную последовательность и/или полипептидную последовательность вируса. В некоторых воплощениях указанного способа указанное биологическое вещество представляет собой рибонуклеиновую кислоту HEV. В некоторых воплощениях указанного способа измерение биологического вещества включает:
а) получение первой реакционной смеси, содержащей вирусную рибонуклеиновую кислоту, получаемой путем смешивания части обработанной порции с раствором для лизиса;
б) получение второй реакционной смеси, получаемой путем добавления к первой реакционной смеси первого реагента, где указанная вторая реакционная смесь содержит дезоксирибонуклеиновую кислоту, которая комплементарна указанной вирусной РНК;
в) добавление к второй реакционной смеси второго реагента, который по меньшей мере частично комплементарен последовательности, находящейся в пределах указанной дезоксирибонуклеиновой кислоты;
г) добавление к второй реакционной смеси третьего реагента, который по меньшей мере частично комплементарен последовательности, находящейся в пределах указанной дезоксирибонуклеиновой кислоты;
д) амплификацию последовательности, охватываемой указанными вторым и третьим реагентами в пределах указанной дезоксирибонуклеиновой кислоты; и
е) измерение концентрации амплифицированной последовательности.
В некоторых воплощениях указанного способа второй реагент и третий реагент содержат олигонуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
а) 5'-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3' (SEQ ID NO: 1);
б) 5'-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3' (SEQ ID NO: 2) и
в) 5'-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3' (SEQ ID NO: 3).
Дополнительные предпочтительные воплощения - 3
В некоторых воплощениях для осветления вируса используют замороженный неочищенный вирусный материал. В некоторых воплощениях при приготовлении концентрированного и очищенного концентрата вируса без оболочки 0,5% Тритона Х-100 и 0,1% LDS добавляют к оттаявшему неочищенному вирусному материалу и инкубируют при 37°С в течение 1 часа.
В некоторых воплощениях осветление оттаявшего неочищенного вирусного материала осуществляют путем центрифугирования при скорости от 3000 до 8000 × g в течение 15-30 минут при температуре от 2°С до 8°С. В некоторых воплощениях супернатант извлекают и сохраняют, а осадок отбрасывают. В некоторых воплощениях супернатант фильтруют через фильтр 0,45 мкм, а затем проводят проточную фильтрацию через мембрану 300 кДа и TFF-концентрат собирают.
В некоторых воплощениях, в отношении ультрацентрифугирования, TFF-концентрат подвергают ультрацентрифугированию в ультрацентрифужных пробирках в бакет-роторе при температуре от 2°С до 8°С в течение 1,5 часов при приблизительно 85000 × g. В некоторых воплощениях супернатант от ультрацентрифугирования декантируют и отбрасывают в виде жидких отходов.
В некоторых воплощениях, в отношении ультрафильтрации, ультрацентрифужный осадок ресуспендируют в не менее чем 5 мл буфера, такого как PBS. В некоторых воплощениях суспензию осадка осветляют при 3000-4200 × g в течение 15 минут при температуре от 2°С до 8°С. В некоторых воплощениях супернатант извлекают и помещают в фильтрующее устройство Amicon® UF для концентрирования. В некоторых воплощениях при необходимости добавляют буфер, такой как PBS, для доведения конечного объема до приблизительно 15 мл (фильтрующая способность составляет 15 мл).
В некоторых воплощениях фильтрующее устройство подвергают центрифугированию при приблизительно 5000 × g при температуре от 2°С до 8°С, до тех пор пока конечный объем оставшегося образца (концентрированный и очищенный вирусный материал) не составит не более 1 мл. В некоторых воплощениях приблизительное время центрифугирования составляет от примерно 15 до примерно 60 минут.
В некоторых воплощениях концентрированный и очищенный вирусный материал делят на аликвоты и замораживают при температуре не выше -65°С.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Получение TFF-HEV препаратов вируса для модельного заражения
Тангенциальная проточная фильтрация (TFF) является хорошо известной методикой разделения и концентрирования биомолекул. Дополнительная информация, касающаяся TFF, легко доступна, например, в источнике "Introduction to Tangential Flow Filtration for Laboratory and Process Development Applications" by Larry Schwartz et al. (pall.com/main/laboratory/literature-library-details.page?id=34212), включенном в данное описание посредством ссылки во всей ее полноте.
HEV-инфицированные HepG2 или HepG2/C3A клетки подвергали замораживанию и оттаиванию два раза и осветляли посредством низкоскоростного центрифугирования и пропускания через фильтр 0,45 мкм. Осветленный раствор (примерно 1 л) концентрировали в десять раз посредством TFF через две мембраны 300 кДа и полученный TFF-концентрат (примерно 100 мл) подвергали центрифугированию при приблизительно 85000 × g в течение 90 минут при 4°С с получением осадка вируса. Ультрацентрифужный супернатант (примерно 100 мл) собирали и сохраняли для переработки в TFF-Supe HEV (Пример 2), в то время как осадок ресуспендировали в PBS. Этот ресуспендированный осадок затем отфильтровывали через фильтр с размером пор 0,2 мкм и подвергали ультрафильтрованию через мембрану 100 кДа до конечного объема приблизительно 2 мл. Раствор подвергали стерилизующей фильтрации через фильтр 0,2 мкм или 0,1 мкм и хранили при 5°С до использования в виде TFF-HEV препарата вируса для модельного заражения.
Пример 2. Получение препаратов вируса для модельного заражения в виде TFF-супернатанта HEV (TFF-Supe HEV)
Липиды, ассоциированные с полученным в клеточной культуре HEV, повышают способность вируса держаться на поверхности и тем самым снижают эффективность осаждения вируса при ультрацентрифугировании. Таким образом, в некоторых воплощениях настоящего изобретения смесь детергентов, содержащую Тритон Х-100 и додецилсульфат лития (LDS), добавляют к HEV-содержащим текучим средам для удаления ассоциированных липидов и для увеличения выхода вируса.
Приблизительно 100 мл ультрацентрифужного супернатанта, полученного в результате TFF и ультрацентрифугирования осветленных HEV-инфицированных клеточных лизатов (примерно 1 л) из Примера 1, обрабатывали 0,5% Тритона Х-100 и 0,1% LDS в течение не менее 30 минут при 37°С, а затем подвергали ультрацентрифугированию через 30%-ную сахарозную подушку при 100000 × g в течение 8 часов при 5°С. Полученный осадок ресуспендировали в PBS, фильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм и подвергали ультрацентрифугированию через мембрану 100 кДа до конечного объема приблизительно 1 мл. Этот раствор затем пропускали через фильтр 0,2 мкм или 0,1 мкм и хранили при 5°С до использования в виде TFF-Supe HEV препарата вируса для модельного заражения.
Пример 3. Сравнение чистоты препаратов вируса для модельного заражения, полученных согласно методикам Примеров 1 и 2
SDS-PAGE использовали для сравнения относительной чистоты препаратов вируса для модельного заражения, полученных согласно методикам Примеров 1 и 2. Как показано на Фиг. 2, аликвоты следующих образцов извлекали для измерения А280 и количественной ПЦР: исходный неочищенный HEV, TFF-концентрат, ультрацентрифужный супернатант, TFF-HEV и TFF-Supe HEV. TFF-концентрат и ультрацентрифужный супернатант имели в 10 раз больше белка, как измерено с помощью А280, чем исходный неочищенный HEV и TFF-HEV, и в 40 раз больше, чем TFF-Supe HEV (Фиг. 2). Даже несмотря на то что концентрации белка были разными, концентрации РНК HEV во всех образцах, за исключением исходного неочищенного, составляли приблизительно 9 log10 копий/мл (Фиг. 2). Таким образом, относительная чистота, как указано посредством отношения вируса (РНК HEV) к белку (А280), была намного выше в TFF-Supe HEV и TFF-HEV, чем в ультрацентрифужном супернатанте и TFF-концентрате.
Относительная чистота образцов может быть визуализирована с помощью SDS-PAGE (Фиг. 2). Образцы разбавляли или концентрировали до приблизительно 4 AU, а затем нагревали в образце буфера, содержащем DTT, и загружали на 4-20% градиентные гели. Клеточную культуральную среду также загружали в качестве фонового контроля. После SDS-PAGE эти гели извлекали и окрашивали красителем Instant Blue. Результаты согласовывались с данными А280 и ПЦР по демонстрированию наивысшего уровня загрязняющих примесей в TFF-концентрате и ультрацентрифужном супернатанте. Полосы с избытком белка наблюдались при приблизительно 70 кДа. Поскольку он также присутствовал в клеточной культуральной среде, это наиболее вероятно был белок, обнаруживаемый в фетальной бычьей сыворотке, добавке, необходимой для клетки и размножения вируса, и невирусном контаминанте, который может мешать в последующих исследованиях элиминации. Наибольшую часть контаминанта удалили во время осуществления способа очистки, описанного в Примерах 1 и 2, и его относительные концентрации были наименьшими в TFF Supe HEV вслед за TFF HEV.
Пример 4. Сравнение термической стабильности препаратов вируса для модельного заражения, полученных согласно методикам Примеров 1 и 2
Эксперименты проводили для сравнения термической стабильности TFF-HEV и TFF-Supe HEV препаратов вируса для модельного заражения, которые были получены согласно Примерам 1 или 2. Оба вирусных препарата вносили в PBS и инкубировали в течение 4 часов при 5°С, 60°С, 70°С или 80°С. Аликвоты извлекали из каждого тестируемого раствора и титровали следующим образом. Серийные разведения образца готовили и добавляли в лунки, засеянные HepG2 или HepG2/C3A клетками. Вирусу давали возможность адсорбироваться в течение не менее 1 часа при 37°С и добавляли ростовую среду. Чашки инкубировали при 37°С в течение не менее 2 суток, а затем среду отсасывали из лунок и промывали/отсасывали клетки не менее 2 раз буфером (например PBS). Чашки затем подвергали экстрагированию вирусной РНК, используя набор Dynabeads® mRNA DIRECT™ Micro Kit (Life Technologies), или хранили при температуре не выше -65°С до экстракции. После проведения экстракции элюаты (поли-А РНК) сразу же подвергали ПЦР-амплификации или хранили при температуре не выше -65°С до ПЦР-амплификации.
Одностадийную ОТ-ПЦР использовали для выявления РНК HEV в образцах, используя праймеры и зонды как обсуждалось ранее. Условия для анализа в каждой реакции были следующими:
а) реагенты: 5,0 мкл 4х TaqMan® Fast Virus 1-Step Master Mix (Life Technologies), 0,08 мкл 100 мМ праймера F+R, 0,04 мкл 100 мМ зонда, 0,4 мкл SUPERase In (Life Technologies), 4,4 мкл воды и 10 мкл матрицы (всего 20 мкл),
б) реакция: 52°С 10 минут, 95°С 30 секунд и 40 циклов при 95°С 15 секунд, 56°С 45 секунд,
ПЦР и расчет значений порогового цикла (Ct) осуществляли с использованием системы АВ 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) и сопровождающего программного обеспечения согласно инструкциям производителя. На основании накопленных данных порог был вручную установлен на 0,1, так чтобы он проходил через экспоненциальную фазу всех стандартных кривых и для обеспечения выявления 1 копии РНК на реакцию. Положительный ПЦР-сигнал, указывающий на присутствие РНК HEV, регистрировали в каждый момент времени, когда пересекался данный порог.
Всем лункам планшета для титрования HEV присваивали положительную или отрицательную оценку на основании наличия или отсутствия положительного ПЦР-сигнала. Вирусные титры затем подсчитывали в виде ТСID50/мл с использованием подходящих статистических методов: Spearman-
MPN или Poisson.
Как показано в Таблице 1, инактивация вируса имела место до предела обнаружения при 60°С, 70°С и 80°С, когда препараты вируса были получены согласно воплощению способа по настоящему изобретению (Пример 2). С другой стороны, когда использовали препараты, полученные согласно Примеру 1 (способ из уровня техники, без обработки детергентом), вирус все еще присутствовал после нагревания в течение 4 часов при 70°С или 80°С.
Данные из опубликованных источников подтверждают, что термическая стабильность препаратов вируса, полученных согласно Примеру 1, отличается от поведения HEV, обнаруживаемого в природе. Например, человеческие энтеровирусы представляют собой некоторые из наиболее термоустойчивых вирусов, и исследованиями показана 90%-ная инактивация вируса гепатита А, вируса полиомиелита и кошачьего калицивируса, внесенных в PBS, после нагревания при 72°С в течение 18,35, 5,44, и 7,39 секунд (Suphachai N, Cliver DO. 2002. J Virol Methods 104:217-225). Свыше одночасовое нагревание при 60°С печеночной суспензии, содержащей HEV дикого кабана, который является близкородственным человеческому HEV, приводило в результате к 4,42 log10 снижению вирусной нагрузки (Schielke A, et al. 2011. Virol Jo) 8:487-495). Таким образом, препараты вируса HEV, полученные согласно способу Примера 1 (способ из уровня техники, без обработки детергентом), не могут точно оценить снижение вирусной нагрузки клинических изолятов HEV в исследованиях элиминации вируса.
С другой стороны, препараты вируса, полученные согласно способу по настоящему изобретению (Пример 2), были полностью инактивированы тепловой обработкой, подобно тому, как это наблюдается для HEV, обнаруживаемого в природе. Как таковой, вирус, полученный согласно способу по настоящему изобретению, может представлять собой более приемлемый препарат вируса для модельного заражения для использования в исследованиях элиминации вируса. Таким образом, в некоторых воплощениях препарат вируса получен согласно способу Примера 2.
Пример 5. Применение способов получения и анализа HEV в экспериментах сухого нагревания
В качестве принципиального доказательства, TFF-HEV и TFF-Supe HEV препараты вируса для модельного заражения получали как описано в Примерах 1 и 2 и тестировали в экспериментах по оценке снижения вирусной нагрузки и/или элиминации вируса во время стадии сублимационной сушки/тепловой сушки (FD/DH) процесса производства концентрата Factor VIII (Фактор свертывания крови VIII). Стадия FD/DH является последней стадией производственного процесса и следует за стадией обработки растворителем/детергентом (S/D).
Для FD/DH экспериментов, концентрат Factor VIII с внесенным препаратом TFF-HEV или TFF-Supe HEV распределяли на аликвоты в пробирки и подвергали сублимационной сушке в лабораторном лиофилизаторе с использованием такого же цикла сублимационной сушки, как и при производственном масштабе. Пробирки после сублимационной сушки затем помещали в печь при 80°С и подвергали сухому нагреванию в течение вплоть до 75 часов.
Пробирки продукта с внесенным вирусом для титрования извлекали на анализ до (исходные) и после сублимационной сушки и без сухого нагревания (FD/DH 0 HR), после сублимационной сушки с последующим сухим нагреванием в течение 24 часов (FD/DH 24 ч) и после сублимационной сушки с последующим сухим нагреванием в течение 75 часов (FD/DH 75 часов). FD/DH продукт с внесенным вирусом разбавляли водой высокой степени чистоты до его первоначального объема, подвергали серийному разведению и инокулировали в HepG2 или HepG2/C3A клетках, которыми засевали 96-луночный планшет. Вирус адсорбировали, добавляли конечную покровную питательную среду и планшеты помещали в инкубатор при 37°С в течение не менее 3 суток. Титрационные планшеты затем извлекали, отсасывали материал и экстрагировали вирусную РНК или хранили при -80°С до экстракции. Экстрагированную РНК из каждой лунки анализировали на HEV посредством ПЦР как описано в Примере 3. Титрационным лункам присваивали положительную или отрицательную оценку в отношении HEV и определяли вирусные титры. Log10 снижение вирусной нагрузки HEV во время данной стадии рассчитывали путем сравнения log10 вирусных титров в исходных и конечных (FD/DH 75 часов) пробирках.
Как показано в Таблице 2, титры обоих препаратов вируса для модельного заражения были сходными до и после сублимационной сушки, и снижение вирусной нагрузки при сублимационной сушке было незначительным (менее 1 log10). Напротив, инактивация вируса обработкой сухим нагреванием при 80°С была значительной (более 1 log10) и больше для TFF-Supe HEV (LRV=4,6), чем для TFF HEV (LRV=3,4). Вероятное присутствие высоких уровней контаминантов в TFF-HEV препарате вируса для модельного заражения, полученном согласно способу Примера 1, может защищать вирус от инактивации при нагревании или может затруднять эффективную деструкцию заключенной в капсидную оболочку РНК HEV.
Поскольку исходный материал для последней стадии FD/DH обработки обрабатывается S/D на предпоследней стадии, любой потенциальный вирусный контаминант, который мог бы присутствовать в потоке процесса производства концентрата Factor VIII, будет делипидизирован и предположительно более похож на TFF-Supe HEV (полученный согласно способу Примера 2), чем на TFF-HEV (полученный согласно способу Примера 1). Таким образом, LRV для TFF-Supe HEV наиболее вероятно представляет собой более точную оценку эффективности снижения вирусной нагрузки HEV на стадии FD/DH обработки.
Пример 6. Получение обработанных детергентом TFF HEV препаратов вируса для модельного заражения
Способ получения TFF-Supe HEV требует относительно много времени. Таким образом, дополнительные способы обработки детергентом были разработаны для получения TFF HEV препарата вируса для модельного заражения. Как показано на Фиг. 3, следовали тому же самому процессу получения TFF-HEV как в Примере 1, за исключением того что, согласно некоторым воплощениям настоящего изобретения стадии обработки TFF-концентрата различными детергентами были включены до проведения ультрацентрифугирования при 85000 × g в течение 1,5 часов при 5°С. Препараты Triton TFF-HEV инкубировали с 0,5% Тритона Х-100 в течение 1,5 часов при 37°С, в то время как 0,5% Тритона Х-100 плюс 0,1% LDS использовали для обработки Triton/LDS TFF-HEV препаратов вируса для модельного заражения. После ультрацентрифугирования только осадки подвергали дальнейшей переработке в препараты вируса для модельного заражения. Способы получения TFF-HEV и обработанных детергентом TFF-HEV сравнивали путем извлечения промежуточных фракций из процессов очистки и титрования в отношении вируса как ранее описано в Примере 3. Результаты показаны в Таблице 3.
Выходы вируса были сравнимы для TFF-HEV и Triton/LDS TFF-HEV процессов, причем конечные препараты вируса для модельного заражения содержали приблизительно 8,3 log10 HEV. Triton TFF-HEV процесс был менее эффективным при осаждении вируса, причем наибольшее количество внесенного вируса было потеряно во фракции ультрацентрифужного супернатанта, и получили препарат вируса для модельного заражения с менее чем 7 log10 HEV.
Пример 7. Применение способов и анализов препаратов HEV в экспериментах жидкостного нагревания
Пастеризация представляет собой последнюю стадию в процессе производства альбумина и включает нагревание флаконов высокоочищенного продукта при 60°С в течение не менее 10 часов. Вирус получали как описано в Примере 6 и вносили в 25%-ный альбумин, а затем инкубировали при 5°С или 60°С в течение 7 часов. Образцы затем извлекали для титрования вируса, и результаты показаны в Таблице 4. В качестве сравнения также приведены данные, полученные в результате пастеризации (10 часов, 60°С) 25%-ного альбумина с внесенным TFF-Supe HEV (получен согласно способу Примера 2).
TFF-HEV был наиболее термоустойчивым вирусом и показал лишь 2,3 log10 снижение титра после тепловой обоработки. LRV для Triton TFF-HEV был приблизительно на один log10 выше, даже несмотря на то что его исходный титр был приблизительно на один log10 ниже чем TFF-HEV. LRV для TFF-HEV, обработанного Triton/LDS, был наиболее высоким среди этих трех TFF-HEV препаратов и слегка ниже чем снижение вирусной нагрузки, достигаемое после пастеризации альбумина с внесенным TFF Supe HEV, вирусного препарата, также обработанного Triton/LDS.
Пример 8. Концентрирование и очистка вируса посредством TFF, ультрацентрифугирования и ультрафильтрации
Для осветления вируса замороженные неочищенные вирусные исходные концентраты подвергали оттаиванию. При приготовлении концентрированного и очищенного исходного материала безоболочечного вируса 0,5% Тритон Х-100 и 0,1% LDS добавляли к оттаявшему неочищенному исходному вирусному материалу и инкубировали при 37°С в течение 1 часа. Осветление осуществляли путем центрифугирования при скорости от 3000 до 8000 × g в течение 15-30 минут при температуре от 2°С до 8°С. Супернатант извлекали и сохраняли, а осадок отбрасывали. Супернатант фильтровали через фильтр 0,45 мкм.
Для TFF, систему TFF чистили и готовили для фильтрации. Отфильтрованный исходный вирусный материал был прозрачным.
Для ультрацентрифугирования, TFF-концентрат помещали в ультрацентрифужные пробирки. Эти пробирки уравновешивали до тех пор, пока их массы не стали находиться в пределах ±0,05 г друг от друга. Пробирки загружали в бакет-ротор и центрифугировали при температуре от 2°С до 8°С в течение 1,5 часов при приблизительно 85000 × g. По окончании центрифугирования супернатант от каждой из центрифужных пробирок осторожно декантировали и отбрасывали как жидкие отходы. Пробирки переворачивали и оставляли подсушиваться на абсорбирующем полотенце в течение приблизительно 5 минут при комнатной температуре. По окончании подсушивания полотенце обеззараживали и уничтожали.
Для ультрафильтрации ультрацентрифужный осадок ресуспендировали в не менее чем 5 мл PBS. Суспензию осадка осветляли при 3000-4200 × g в течение 15 минут при температуре от 2°С до 8°С. Супернатант извлекали и помещали в фильтрующее устройство Amicon® UF для концентрирования. При необходимости PBS добавляли для доведения конечного объема до приблизительно 15 мл (пропускная способность фильтра составляет 15 мл). Закрытое фильтровальное устройство помещали в ротор центрифуги, который уравновешивали с противовесом. Центрифугирование осуществляли при приблизительно 5000 × g при температуре от 2°С до 8°С до тех пор, пока конечный объем оставшегося образца (концентрированный и очищенный вирусный материал) не составил не более 1 мл (приблизительное время центрифугирования от 15 до 60 минут).
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
HepG2: Клетки гепатоцеллюлярной карциномы, полученные из Американской коллекции типовых культур (АТСС номер НВ-8065)
DMEM: среда Игла, модифицированная по Дульбекко
FBS: фетальная бычья сыворотка
Титр: концентрация вещества (вируса) в растворе или эффективность такого вещества, определенная титрованием
SK: метод Спермана-Кербера представляет собой статистический метод подсчета вирусных титров в образцах с относительно высокими концентрациями вируса. Данный метод используют, когда доля положительных лунок при любом разведении составляет более 25% (Фиг. 1).
MPN: наиболее вероятное количество представляет собой статистический метод подсчета вирусных титров в образцах с относительно низкими концентрациями вируса. MPN используют, когда доля положительных лунок при всех разведениях составляет менее 25%.
Poisson: пуассоново распределение представляет собой статистический метод подсчета вирусных титров в образцах с экстремально низкими концентрациями вируса. Данный метод используют, когда не наблюдается никаких положительных лунок.
АТСС: Американская коллекция типовых культур
TFF-концентрат HEV: представляет собой материал, остающийся после того как осветленный HEV-клеточный лизат концентрировали с использованием TFF-мембраны 300 кДа. TFF-концентрат HEV используют для получения TFF HEV препаратов вируса для модельного заражения
TFF-супернатант HEV: представляет собой выходящий поток, остающийся после центрифугирования TFF-концентрата HEV при приблизительно 84780 × g. TFF-супернатант HEV используют для получения TFF Supe HEV препаратов вируса для модельного заражения
ТСID50: соответствует 50%-ной инфекционной дозе культуры ткани (конечная точка разведения). Она является мерой инфекционного вирусного титра, которая выражает количество вируса, необходимое для умерщвления 50% инфицированных клеток-хозяев или для продуцирования цитопатического эффекта в 50% инокулированных клеток культуры ткани.
А280: поглощение, измеренное при 280 нм, которое является индикатором концентрации и/или количества белка
AU: Единица поглощения
Препарат вируса для модельного заражения: образец вируса с известным содержанием вируса
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Okamoto Н (2011) Hepatitis Е virus cell culture models. Virus Research 161: 65-77.
2. Shukla P, et al. (2011) Cross-species infections of cultured cells by hepatitis E virus and discovery of an infectious virus-host recombinant. PNAS. 108 (6):2438-2443.
3. Shukla P, et al. (2012) Adaptation of a Genotype 3 Hepatitis E Virus to Efficient Growth in Cell Culture Depends on an Inserted Human Gene Segment Acquired by Recombination. J Virol 86 (10):5697-5707
4. Предварительная заявка на патент США No 61/431377
5. Предварительная заявка на патент США No 61/554323
6. Заявка на патент США No. 13/978839
7. Международная РСТ заявка No. PCT/US2012/020830.
Claims (42)
1. Способ очистки вируса без оболочки или с псевдооболочкой, размножившегося в клеточной культуре, включающий стадию обработки образца, содержащего вирус без оболочки или с псевдооболочкой, детергентом, где детергент выбран из группы, состоящей из Тритона Х-100 в концентрации 0,5% и смеси Тритона Х-100 в концентрации 0,5% и додецилсульфата лития в концентрации 0,1%.
2. Способ по п. 1, где вирус, размножившийся в клеточной культуре, представляет собой вирус гепатита Е (HEV).
3. Способ по п. 1, где вирус, размножившийся в клеточной культуре, представляет собой вирус гепатита A (HAV) или свиной парвовирус (PPV).
4. Способ по п. 1, где вирус продуцирован в клеточной культуре in vitro.
5. Способ по п. 4, где клеточная культура in vitro включает стабильную клеточную линию.
6. Способ по п. 5, где указанная стабильная клеточная линия выбрана из группы, состоящей из HepG2 (номер НВ-8065 в Американской коллекции типовых культур (АТСС)) и HepG2/C3A (номер CRL-10741 в АТСС).
7. Способ по п. 1, где стадию обработки осуществляют в течение 1 часа.
8. Способ по п. 1, где образец представляет собой супернатант, полученный в результате ультрацентрифугирования осветленной суспензии лизата клеток, инфицированных вирусом.
9. Способ по п. 1, где образец представляет собой концентрат, полученный в результате проточной фильтрации осветленной суспензии лизата клеток, инфицированных вирусом.
10. Способ измерения уровня вируса без оболочки или с псевдооболочкой в образце, где образец содержит плазму или кровь млекопитающего, включающий стадии:
а) внесения образца в смесь, содержащую клеточную линию и культуральную среду;
б) инкубирования для обеспечения размножения вируса без оболочки или с псевдооболочкой, в случае его присутствия в образце, с получением инкубированной порции;
в) обработки по меньшей мере одним детергентом с получением обработанной порции; где детергент выбран из группы, состоящей из Тритона Х-100 в концентрации 0,5% и смеси Тритона Х-100 в концентрации 0,5% и додецилсульфата лития в концентрации 0,1%;
г) сбора части обработанной порции с получением собранной порции; и
д) измерения уровня вируса без оболочки или с псевдооболочкой в собранной порции.
11. Способ по п. 10, где вирус без оболочки или с псевдооболочкой представляет собой HEV.
12. Способ по п. 10, где вирус без оболочки или с псевдооболочкой представляет собой HAV или PPV.
13. Способ по п. 10, где вирус размножается в клеточной культуре in vitro, включающей стабильную клеточную линию.
14. Способ по п. 10, где указанная клеточная линия выбрана из группы, состоящей из HepG2 (номер НВ-8065 в АТСС) и HepG2/C3A (номер CRL-10741 в АТСС).
15. Способ по п. 10, где указанный образец содержит первый концентрат, полученный посредством проточной фильтрации части инкубированной порции через мембрану.
16. Способ по п. 10, где указанный образец содержит первый супернатант, полученный посредством проточной фильтрации части инкубированной порции через мембрану с получением первого концентрата и центрифугирования указанного первого концентрата.
17. Способ по п. 10, где указанный образец обрабатывают по меньшей мере одним детергентом или смесью детергентов с получением первого раствора.
18. Способ по п. 17, дополнительно включающий:
а) получение первого осадка, получаемого путем центрифугирования первого раствора;
б) получение второго раствора, получаемого путем ресуспендирования первого осадка в фосфатно-буферном растворе (PBS);
в) получение третьего раствора, получаемого путем осветления второго раствора;
г) получение первого фильтрата, получаемого путем фильтрования третьего раствора с использованием мембраны; и
д) получение второго концентрата, получаемого путем ультрафильтрования первого фильтрата, где указанный второй концентрат содержит обработанную порцию.
19. Способ по п. 10, где измерение уровня вируса без оболочки или с псевдооболочкой включает выявление биологического вещества.
20. Способ по п. 19, где указанное биологическое вещество содержит полинуклеотидную последовательность и/или полипептидную последовательность вируса.
21. Способ по п. 20, где указанное биологическое вещество представляет собой рибонуклеиновую кислоту HEV.
22. Способ по п. 21, где измерение биологического вещества включает:
а) получение первой реакционной смеси, содержащей рибонуклеиновую кислоту HEV, получаемой путем смешивания части обработанной порции раствором для лизиса;
б) получение второй реакционной смеси, получаемой путем добавления первого реагента к первой реакционной смеси, где указанная вторая реакционная смесь содержит дезоксирибонуклеиновую кислоту, которая комплементарна рибонуклеиновой кислоте HEV;
в) добавление к указанной второй реакционной смеси второго реагента, который по меньшей мере частично комплементарен последовательности, находящейся в пределах указанной дезоксирибонуклеиновой кислоты;
г) добавление к указанной второй реакционной смеси третьего реагента, который по меньшей мере частично комплементарен последовательности, находящейся в пределах указанной дезоксирибонуклеиновой кислоты;
д) амплификацию последовательности, охватываемой указанными вторым и третьим реагентами в пределах указанной дезоксирибонуклеиновой кислоты; и
е) измерение концентрации амплифицированной последовательности.
23. Способ по п. 22, где указанный второй реагент и указанный третий реагент содержат олигонуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
а) 5'-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3' (SEQ IDNO: 1);
б) 5'-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3' (SEQ ID NO: 2) и
в) 5'-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3' (SEQ ID NO: 3).
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201562196004P | 2015-07-23 | 2015-07-23 | |
| US62/196,004 | 2015-07-23 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2691026C1 true RU2691026C1 (ru) | 2019-06-07 |
Family
ID=56418394
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016128956A RU2691026C1 (ru) | 2015-07-23 | 2016-07-15 | Способы очистки вируса, продуцированного in vitro, и анализ элиминации вируса |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10336988B2 (ru) |
| EP (1) | EP3121268B1 (ru) |
| JP (1) | JP6734137B2 (ru) |
| KR (1) | KR102205026B1 (ru) |
| CN (1) | CN106367402B (ru) |
| AR (1) | AR105439A1 (ru) |
| AU (1) | AU2016206243B2 (ru) |
| BR (1) | BR102016016678A2 (ru) |
| CA (1) | CA2937089C (ru) |
| ES (1) | ES2712664T3 (ru) |
| IL (1) | IL246769B (ru) |
| MX (1) | MX2016009266A (ru) |
| MY (1) | MY179359A (ru) |
| PL (1) | PL3121268T3 (ru) |
| PT (1) | PT3121268T (ru) |
| RU (1) | RU2691026C1 (ru) |
| SG (1) | SG10201605869QA (ru) |
| TR (1) | TR201902201T4 (ru) |
| TW (1) | TW201704467A (ru) |
| UY (1) | UY36795A (ru) |
| ZA (1) | ZA201604895B (ru) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190092375A (ko) | 2018-01-29 | 2019-08-07 | 그리폴스 다이어그노스틱 솔루션즈 인크. | 임상 시료 내의 파보바이러스 b19를 균질화하기 위한 방법 |
| KR20210079543A (ko) | 2019-12-20 | 2021-06-30 | 삼성전자주식회사 | 고대역폭 메모리 및 이를 포함하는 시스템 |
| JP2023141423A (ja) * | 2022-03-24 | 2023-10-05 | 国立大学法人 東京大学 | ウイルスの精製方法 |
| CN115181816B (zh) * | 2022-08-10 | 2023-01-06 | 杭州纽创生物检测有限公司 | 一种超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5731187A (en) * | 1992-10-14 | 1998-03-24 | Pasteur Merteux Serums Et Vaccins Societe Anonyme | Process for preparing hepatitis A (HAV) antigens and vaccines |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4721675A (en) * | 1982-02-01 | 1988-01-26 | Abbott Laboratories | Production of hepatitis A virus in vitro utilizing a persistently virus infected cell culture system |
| DZ1706A1 (fr) * | 1992-08-07 | 2002-02-17 | Merck & Co Inc | Vaccin contre le virus de l'hepatite a. |
| CN101397335A (zh) * | 1998-06-24 | 2009-04-01 | 基因创新有限公司 | Hcv包膜蛋白颗粒:用于疫苗接种的用途 |
| JP2005528882A (ja) * | 2001-10-12 | 2005-09-29 | カイロン コーポレイション | Ａ型肝炎ウイルスのヌクレオチド配列、組換えタンパク質およびそれらの使用 |
| US20090042274A1 (en) * | 2004-07-27 | 2009-02-12 | Genomidea Inc. | Method of Purifying Virus Envelope |
| US7944468B2 (en) * | 2005-07-05 | 2011-05-17 | Northrop Grumman Systems Corporation | Automated asymmetric threat detection using backward tracking and behavioral analysis |
| JP5034040B2 (ja) * | 2006-07-13 | 2012-09-26 | 国立大学法人鳥取大学 | 肝炎の診断キット及び診断マーカー |
| EP2547362B1 (en) * | 2010-03-17 | 2021-08-25 | Cornell University | Disrupted adenovirus-based vaccine against drugs of abuse |
-
2016
- 2016-07-13 PL PL16179299T patent/PL3121268T3/pl unknown
- 2016-07-13 PT PT16179299T patent/PT3121268T/pt unknown
- 2016-07-13 TR TR2019/02201T patent/TR201902201T4/tr unknown
- 2016-07-13 EP EP16179299.9A patent/EP3121268B1/en active Active
- 2016-07-13 IL IL246769A patent/IL246769B/en active IP Right Grant
- 2016-07-13 ES ES16179299T patent/ES2712664T3/es active Active
- 2016-07-15 UY UY0001036795A patent/UY36795A/es unknown
- 2016-07-15 MX MX2016009266A patent/MX2016009266A/es active IP Right Grant
- 2016-07-15 ZA ZA2016/04895A patent/ZA201604895B/en unknown
- 2016-07-15 RU RU2016128956A patent/RU2691026C1/ru active
- 2016-07-18 SG SG10201605869QA patent/SG10201605869QA/en unknown
- 2016-07-18 MY MYPI2016702601A patent/MY179359A/en unknown
- 2016-07-19 AU AU2016206243A patent/AU2016206243B2/en active Active
- 2016-07-19 US US15/213,740 patent/US10336988B2/en active Active
- 2016-07-19 BR BR102016016678-0A patent/BR102016016678A2/pt active Search and Examination
- 2016-07-20 TW TW105122891A patent/TW201704467A/zh unknown
- 2016-07-20 CN CN201610576006.2A patent/CN106367402B/zh active Active
- 2016-07-22 AR ARP160102226A patent/AR105439A1/es unknown
- 2016-07-22 KR KR1020160093643A patent/KR102205026B1/ko active IP Right Grant
- 2016-07-22 CA CA2937089A patent/CA2937089C/en active Active
- 2016-07-22 JP JP2016144066A patent/JP6734137B2/ja active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5731187A (en) * | 1992-10-14 | 1998-03-24 | Pasteur Merteux Serums Et Vaccins Societe Anonyme | Process for preparing hepatitis A (HAV) antigens and vaccines |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| column 2, line 10 - column 4, line 8, claims 1-9. КОРОЧКИН Р.Б. и др. Культивирование вирусов в культурах клеток, Учебно-методическое пособие для студентов по специальности 1-740302 "Ветеринарная медицина", Витебск, ВГВАМ, 2010. * |
| М.TAKAHASHI et al. Hepatitis E Virus (HEV) strains in Serum Samples Can Replicate Efficiently in Cultured Cells Despite the Coexistence of HEV Antibodies: Characterization of HEV Virions in Blood Circulation, Jjournal of Clinical Microbiology, vol.48, no 4, p.1112-1125. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AR105439A1 (es) | 2017-10-04 |
| TR201902201T4 (tr) | 2019-03-21 |
| CN106367402A (zh) | 2017-02-01 |
| CA2937089A1 (en) | 2017-01-23 |
| MY179359A (en) | 2020-11-05 |
| CN106367402B (zh) | 2022-03-08 |
| US10336988B2 (en) | 2019-07-02 |
| JP6734137B2 (ja) | 2020-08-05 |
| BR102016016678A2 (pt) | 2019-02-12 |
| KR102205026B1 (ko) | 2021-01-19 |
| AU2016206243A1 (en) | 2017-02-09 |
| PT3121268T (pt) | 2019-02-26 |
| ES2712664T3 (es) | 2019-05-14 |
| PL3121268T3 (pl) | 2019-06-28 |
| IL246769A0 (en) | 2016-12-29 |
| IL246769B (en) | 2020-09-30 |
| ZA201604895B (en) | 2021-04-28 |
| EP3121268B1 (en) | 2018-12-26 |
| US20170022480A1 (en) | 2017-01-26 |
| UY36795A (es) | 2016-09-30 |
| KR20170012141A (ko) | 2017-02-02 |
| TW201704467A (zh) | 2017-02-01 |
| CA2937089C (en) | 2024-02-06 |
| JP2017023144A (ja) | 2017-02-02 |
| MX2016009266A (es) | 2017-01-23 |
| SG10201605869QA (en) | 2017-02-27 |
| EP3121268A1 (en) | 2017-01-25 |
| AU2016206243B2 (en) | 2021-04-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sadeghi et al. | Virome of US bovine calf serum | |
| Delwart | Viral metagenomics | |
| RU2691026C1 (ru) | Способы очистки вируса, продуцированного in vitro, и анализ элиминации вируса | |
| AU2014329403B2 (en) | Methods of detection and removal of rhabdoviruses from cell lines | |
| JP5980947B2 (ja) | 高感染価のパルボウイルスの生産方法 | |
| Satoh et al. | Virus concentration using polyethyleneimine-conjugated magnetic beads for improving the sensitivity of nucleic acid amplification tests | |
| MXPA05006158A (es) | Identificacion de oligonucleotidos para la captura, deteccion y cuantificacion del virus del nilo occidental. | |
| Sangar et al. | Examination of poliovirus vaccine preparations for SV40 sequences | |
| Liu | Molecular detection of human viral pathogens | |
| WO2021172573A1 (ja) | ウイルスクリアランス性能の評価方法 | |
| US20100297604A1 (en) | Methods and reagents for virus isolation and detection | |
| Höfner et al. | A hemi-nested PCR assay for the detection and identification of vesicular stomatitis virus nucleic acid | |
| WO2022262206A1 (zh) | Gmp级逆转录病毒载体的纯化方法与应用 | |
| Terry et al. | Rubella virus RNA: effect of high multiplicity passage | |
| RU2691123C1 (ru) | Способ получения материала с высоким титром вируса гепатита Е и анализ титрования вируса гепатита Е | |
| Gracia‐Valenzuela et al. | A simple method for purifying the White Spot Syndrome Virus using ultrafiltration | |
| KR20080109687A (ko) | 감염성 혈액으로부터 바이러스를 순수 분리정제하는 방법 | |
| JP6592100B2 (ja) | 高感染価かつ高純度のパルボウイルスの生産方法 | |
| JPH02500324A (ja) | ヒトｂ親リンパ性ウイルス（ｈｂｌｖ）の単離及び生成物 | |
| Tan et al. | Assessing the efficacy of different bead-based assays in capturing hepatitis E virus | |
| CN116148475A (zh) | 一种狂犬病毒中和抗体的elisa检测方法 | |
| Parker et al. | Next-generation sequencing in clinical virology diagnostics |