MXPA05006158A

MXPA05006158A - Identificacion de oligonucleotidos para la captura, deteccion y cuantificacion del virus del nilo occidental.

Info

Publication number: MXPA05006158A
Application number: MXPA05006158A
Authority: MX
Inventors: Shyamala Venkatakrishna
Original assignee: Chiron Corp
Priority date: 2002-12-12
Filing date: 2003-12-05
Publication date: 2005-08-26
Also published as: US20070238086A1; US20070128637A1; CA2509520A1; US7807813B2; WO2004055159A2; CA2509520C; AU2003297996A1; US20050032729A1; US20070128638A1; US20120015345A1; US7132233B2; US7927839B2; US8551706B2

Abstract

Se describen oligonucleotidos de captura, cebadores y sondas del virus del Nilo Occidental derivados de regiones conservadas del genoma del virus del Nilo Occidental. Tambien se describen ensayos basados en acido nucleico que utilizan los oligonucleotidos de captura, los cebadores y las sondas.

Description

IDENTIFICACION DE OLIGONUCLEOTIDOS PARA LA CAPTURA, DETECCION Y CÜANTIFICACION DEL VIRUS DEL NILO OCCIDENTAL Campo de la Invención La presente invención pertenece en general a diagnósticos virales. En particular, la invención se refiere a ensayos basados en ácido nucleico para diagnosticar de manera precisa la infección por el virus del Nilo Occidental y para detectar la presencia del virus del Nilo Occidental en una muestra biológica. Antecedentes de la Invención El virus del Nilo Occidental (WNV, por sus siglas en inglés) es un flavivirus transportado por mosquitos que infecta a humanos, caballos y aves. El virus es transmitido a humanos y varias especies de animales a través de mosquitos que adquieren el virus al alimentarse en aves infectadas. El virus es nativo de África, Asia, Europa y Australia, y ha causado recientemente grandes epidemias en el Hemisferio Occidental, inclusive en Europa y los Estados Unidos. El WNV se detectó primero en América del Norte en 1999 durante una epidemia de meningoencefalitis en la ciudad de Nueva York. Los estudios de seroprevalencia del WNV en Queens, Nueva York mostraron evidencia de una infección anterior en 2.6% de la población, de 5 años de edad o mayores. Durante 1999-2002, el virus extendió su rango en la mayor parte del Este de los R F: 164597 Estados Unidos. Se espera que el rango de infecciones por WNV dentro del Hemisferio Occidental continúe expandiéndose. Las infecciones en humanos por WNV son frecuentemente subclinicas pero las infecciones clínicas pueden variar en gravedad de una fiebre no complicada a una meningoencefalitis fatal. La incidencia de la enfermedad neuroinvasiva, severa y la muerte incrementa con la edad. La epidemia de encefalitis y meningitis por WNV hace que surja la inquietud que la transmisión del WNV puede ocurrir a través de donaciones voluntarias de sangre. Como con otros flavi irus, el WNV posee un genoma de ARN de sentido positivo de cadena individual de aproximadamente 11,000 nucleótidos. El genoma consiste de un marco de lectura abierto, individual (ORF, por sus siglas en inglés) de aproximadamente 10,300 nucleótidos que codifica una poliproteína que es procesada de manera proteolítica en 10 proteínas viral, maduras, en el orden de NH2-C-prM-E-NSl-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-COOH . Las tres proteínas estructurales, cápside (C) , membrana (prM) y envoltura (E) , son codificadas dentro de la porción 5' del ORF, mientras que las siete proteínas no estructurales NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5 , son codificadas dentro de la porción 3' . Los límites de estas proteínas, numeradas con relación a la secuencia de nucleótidos del WNV, cepa EG101, son como sigue: C, 97-465; pr, 466-741; M, 742-986; E, 987-2469; NS1, 2470-3525; NS2A, 3526-4218; NS2B, 4219-4611; NS3, 4612-6458; NS4A, 6459-6915; NS4B, 6916-7680; NS5 , 7681-10395. Para una revisión del WNV- y su estructura molecular, véase Brinton, M. A., Ann. Rev. Micorbiol. (2002) 56:371-402; y Lanciotti y colaboradores, Science (1999) 286:2333-2337. A la fecha, no existe una prevención o un tratamiento efectivo de la infección por WNV. Actualmente, entonces, la educación pública y los programas para la disminución del mosquito se utilizan para contener la transmisión del virus. Sin embargo, la intervención rápida es critica a fin de reducir el riesgo a humanos. Tradicionalmente, la detección del virus se ha realizado al someter a prueba mosquitos y aves muertas por la presencia de virus utilizando métodos de cultivo de células y técnicas de inmunoensayo . Sin embargo, estos métodos son extremadamente consumidores de tiempo y pueden tomar una semana o más para completarse . La diagnosis de la infección por WNV en humanos se puede establecer por la presencia del anticuerpo IgM del WNV en el suero o fluido cerebroespinal (CSF, por sus siglas en inglés) , los incrementos en el anticuerpo del WNV detectado por ELISA o el anticuerpo neutralizador del WNV. Sin embargo, la confirmación del tipo de virus infeccioso es posible únicamente mediante la detección de una elevación de cuatro veces o mayor en los títulos de anticuerpo neutralizador específico para el virus en ya sea el CSF o el suero al realizar los ensayos de neutralización de reducción de placas con varios flavivirus. El aislamiento del virus en un cultivo de células de CSF y suero generalmente no ha sido exitoso, probablemente debido a la viremia de bajo nivel y con un periodo de vida corto asociada con la infección. Adicionalmente, las pruebas inmunológicas son indirectas y pueden ocurrir reacciones no especificas de antigenos-anticuerpos y pueden dar por resultado falsas determinaciones positivas. Por lo tanto, las pruebas inmunológicas tienen serias desventajas, una utilidad limitada y proporcionan solo un índice indirecto de infectividad viral, potencial. Recientemente, los ensayos TaqManMR se han utilizado para detectar el WNV en especímenes de CSF. Briese y colaboradores, The Lancet (2000) 355 : 1614-1615; Lanciotti y colaboradores, J. Clin. Microbiol. (2000) 38:4066-4071. Lanciotti y colaboradores, J. Clin. Microbiol . (2001) 39:4506-4513 describen el uso de la amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA, por sus siglas en inglés) para detectar el WNV. Esta técnica de amplificación emplea tres enzimas, transcriptasa inversa, ARN polimerasa T7 y RNAsa H y el producto de amplificación final es un ARN de cadena individual con una polaridad opuesta al objetivo. El producto de ARN amplificado se puede detectar utilizando una sonda de captura específica para el objetivo unida a un substrato, en combinación con una sonda detectora, etiquetada. Alternativamente, el ARN amplificado puede detectarse específicamente en tiempo real utilizando sondas guía, moleculares en la reacción de amplificación. No obstante, aún permanece la necesidad por el desarrollo de métodos confiables y eficientes para detectar el WNV en muestras de humanos y animales, a fin de contener la transmisión del virus. Breve Descripción de la Invención La presente invención se basa en el desarrollo de una prueba de diagnóstico basada en ácido nucleico, confiable, sensible para la detección del WNV en muestras biológicas, particularmente muestras de sangre, de sujetos potencialmente infectados. Las técnicas descritas en este texto utilizan el ácido nucleico muestra, extraído como una plantilla para la amplificación de regiones genómicas, conservadas de la secuencia del WNV utilizando una amplificación mediada por la transcripción (TMA, por sus siglas en inglés) , así como también en un ensayo de nucleasa 5' , tal como la técnica TaqManMR. Los métodos permiten la detección de una cantidad tan pequeña como 10 copias de la secuencia del WNV objetivo en muestras virémicas . Además, los métodos descritos en este texto proporcionan un análisis de un crisol en donde los ácidos nucleicos muestra, capturados se pueden sujetar a la amplificación y la detección en el mismo recipiente. Utilizando los métodos de la invención, las muestras infectadas se pueden identificar y excluir del suministro de sangre para la transfusión, asi como también para la preparación de derivados de sangre. Por consiguiente, en una modalidad, la invención se dirige a un oligonucleótido aislado con una longitud no mayor de 60 nucleótidos, que comprende: (a) una secuencia de nucleótidos de al menos 10 nucleótidos contiguos, preferiblemente al menos 15 nucleótidos contiguos, más preferiblemente al menos 20 nucleótidos contiguos o cualquier número de nucleótidos contiguos entre 10 y 60, de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 1-16, 34-39, 42-46, 49 y 50; (b) una secuencia de nucleótidos que tiene 90% de identidad de secuencias con una secuencia de nucleótidos de ( a) ; o (c) complementos de (a) y (b) . En las modalidades adicionales, el oligonucleótido se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 52, 53, 54 y 55 y comprende una etiqueta detectable. En ciertas modalidades, la etiqueta detectable está en el extremo 5' y/o en el extremo 3' . En ciertas modalidades, la etiqueta detectable es una etiqueta fluorescente seleccionada del grupo que consiste de 6-carboxifluoresceina (6-FAM), tetrametilrrodamina (TA RA) , y 2' , 4' , 5' , 7'-tetracloro-4-7-diclorofluoresceína (???) . En todavía las modalidades adicionales, el oligonucleótido se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 36, 39, 44 y 45. En todavía otra modalidad, la invención se dirige a un método para detectar la presencia del virus del Nilo Occidental (WNV) en una muestra biológica, el método comprende los pasos que consisten en: aislar los ácidos nucleicos de una muestra biológica que se sospecha que contiene el WNV; amplificar los ácidos nucleicos utilizando un cebador de sentido y un cebador antisentido, en donde cada uno de los cebadores tiene una longitud no mayor que aproximadamente 60 nucleótidos y es suficientemente complementario para una porción de las cadenas de sentido y antisentido, respectivamente, del ácido nucleico aislado para hibridizarse con las mismas, y (a) el cebador de sentido comprende la SEC ID NO: 34 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencias con la misma, o la SEC ID NO: 37 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencias con la misma, o la SEC ID NO: 42 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencias con la misma; (b) el cebador antisentido comprende la SEC ID NO: 35 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencias con la misma cuando el cebador de sentido es la SEC ID NO: 34, o el cebador antisentido comprende la SEC ID NO: 38 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencias con la misma cuando el cebador de sentido es la SEC ID NO: 37 o el cebador antisentido comprende la SEC ID NO: 43 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencias con la misma cuando el cebador de sentido es la .SEC ID NO: 42; y detectar la presencia de los ácidos nucleicos amplificados como una indicación de la presencia del WNV en la muestra. En las modalidades adicionales, los ácidos nucleicos son aislados de la muestra biológica por medio de un método que comprende los pasos que consisten en: (a) poner en contacto un soporte sólido que comprende ácidos nucleicos de captura asociados con el mismo con una muestra biológica bajo condiciones de hibridización en donde las cadenas de ácido nucleico del WNV, si están presentes en la muestra biológica, se hibridizan con los ácidos nucleicos de captura; y (b) separar el soporte sólido de la muestra. En ciertas modalidades, el soporte sólido comprende perlas, tales como perlas magnéticas.

En las modalidades adicionales, el aislamiento, amplificación y detección se realizan en un recipiente individual . En las modalidades todavía adicionales, los ácidos nucleicos de captura comprenden uno o más oligonucleótidos , en donde cada uno de los oligonucleótidos tiene una longitud no mayor que aproximadamente 60 nucleótidos y comprende al menos 10 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 1-16, 45, 46 y 50. En las modalidades adicionales, los ácidos nucleicos de captura comprenden además una cadena de homopolímero de aproximadamente 10-25 nucleótidos de longitud, seleccionada del grupo que consiste de poliA, poliT, poliG, poliC y poliü. En ciertas modalidades, la amplificación comprende la RT-PCR, amplificación mediada por la transcripción (TMA) o TaqManMR, o una combinación de las mismas. En las modalidades adicionales, la amplificación comprende Taq anMR utilizando el cebador de sentido y el cebador antisentido y la detección se hace utilizando al menos una sonda que comprende una etiqueta detectable. En las modalidades adicionales, al menos una sonda tiene una longitud no mayor que 60 nucleótidos y comprende (a) la secuencia de la SEC ID NO: 52 o la secuencia de la SEC ID NO: 53 cuando el cebador de sentido comprende la secuencia de la SEC ID NO: 34 o (b) la secuencia de la SEC ID NO: 54 cuando el cebador de sentido comprende la secuencia de la SEC ID NO: 37 o (c) la secuencia de la SEC ID NO: 55 cuando el cebador de sentido comprende la secuencia de la SEC ID NO: 42. En las modalidades adicionales, el método comprende utilizar una sonda que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 52 y una sonda que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 53 cuando el cebador de sentido comprende la secuencia de la SEC ID NO: 34. La sonda puede comprender además etiquetas detectables en el extremo 5' y en el extremo 3' . En ciertas modalidades, la etiqueta detectable es una etiqueta fluorescente seleccionada del grupo que consiste de 6-carboxifluoresceina (6-E¾M) , tetrametilrrodamina (TAMRA) , y 2' , 4' , 5' , 7' ,-tetracloro-4-7-diclorofluoresceina (TET) . En las modalidades adicionales, está presente una secuencia de control interno. La secuencia de control interno puede comprender la secuencia de nucleótidos de la figura 2 (SEC ID NO: 17) . El método puede comprender además una secuencia de sonda etiquetada de manera detectable para la secuencia de control interno. En ciertas modalidades, la secuencia de la sonda etiquetada de manera detectable para la secuencia de control interno comprende la secuencia de la SEC ID NO: 40 o la SEC ID NO: 41. En las modalidades adicionales, la invención se dirige a un equipo para detectar la presencia del virus del Nilo Occidental ( NV) en una muestra biológica, el equipo comprende : ácidos nucleicos de captura que comprenden uno o más oligonucleótidos, en donde cada uno de los oligonucleótidos tiene una longitud no mayor que aproximadamente 60 nucleótidos y comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 10 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 1-16, 45 y 46; oligonucleótidos cebadores en donde los oligonucleótidos cebadores tienen una longitud no mayor que aproximadamente 60 nucleótidos y comprenden una secuencia de nucleótidos de al menos 10 nucleótidos contiguos de las SEC ID NOS: 34 y 35 o las SEC ID NOS: 37 y 38 o las SEC ID NOS: 42 y 43; y instrucciones escritas para identificar la presencia del WNV. En las modalidades adicionales, el equipo además comprende una polimerasa y amortiguadores. En ciertas modalidades, el equipo además comprende al menos un oligonucleótido de sonda con una longitud no mayor que aproximadamente 60 nucleótidos y al menos 10 nucleótidos contiguos, en donde al menos un oligonucleótido de sonda' comprende (a) la secuencia de la SEC ID NO: 52 o la secuencia de la SEC ID NO: 53 cuando los oligonucleótidos cebadores comprenden al menos 10 nucleotidos contiguos de la SEC ID NO: 34 y la SEC ID NO: 35; o (b) la secuencia de la SEC ID NO: 54 cuando los oligonucleótidos cebadores comprenden al menos 10 nucleotidos contiguos de la SEC ID NO: 37 y la SEC ID NO: 38; o (c) la secuencia de la SEC ID NO: 55 cuando los oligonucleótidos cebadores comprenden al menos 10 nucleotidos contiguos de la SEC ID NO: 42 y la SEC ID NO: 43. En ciertas modalidades, la sonda además comprende etiquetas detectables en el extremo 5' y el extremo 3' . La etiqueta detectable puede ser una etiqueta fluorescente selecciona del grupo que consiste de 6-carboxifluoresceina (6-FAM), tetrametilrrodamina (TAMRA) , y 2' , 4 ' , 5' , 7 ' , -tetracloro-4-7-diclorofluoresceina (TET) . En modalidades todavia adicionales, el equipo comprende una sonda que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 36 y una sonda que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 49 cuando el cebador de sentido comprende la secuencia de la SEC ID NO: 34. En las modalidades adicionales, el equipo además comprende un control interno que comprende la secuencia de nucleotidos de la figura 2 (SEC ID NO: 17) . En las modalidades adicionales, la invención se dirige a un par de cebadores de amplificación para detectar el WNV que comprende un par de oligonucleótidos seleccionados del grupo que consiste del par de la SEC ID NO: 34/SEC ID NO: 35, el par de la SEC ID NO: 37/SEC ID NO: 38 y el par de la SEC ID NO: 42/SEC ID NO: 43. En las modalidades adicionales, la invención se dirige a un conjunto de oligonucleótidos para capturar específicamente el ácido nucleico del WNV que comprende un oligonucleótido con una longitud no mayor que 60 nucleótidos y que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 8, un oligonucleótido con una longitud no mayor que 60 nucleótidos y que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 12, un oligonucleótido con una longitud no mayor que 60 nucleótidos y que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 45 y un oligonucleótido con una longitud no mayor que 60 nucleótidos y que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 46. En otra modalidad, la invención se dirige a un método para preparar un suministro de sangre que comprende sangre completa, plasma o suero, sustancialmente libres del WNV. El método comprende: (a) examinar alícuotas de sangre completa, plasma o suero de muestras de sangre colectadas por cualquiera de los métodos de detección descritos anteriormente; (b) eliminar las muestras cuando se detecta el WNV; y (c) combinar las muestras donde el WNV no es detectado para proporcionar un suministro de sangre sustancialmente libre del WNV. Estos y otros aspectos de la presente invención llegaran a ser evidentes con referencia a la siguiente descripción detalla y los dibujos anexos. Además, en la presente se exponen varias referencias que describen con mayor detalle ciertos procedimientos o composiciones. Breve Descripción de las Figuras Las figuras 1A-1S (SEC ID NOS: 1-16, 45, 46 y 50, respectivamente) representan los oligonucleótidos de captura ejemplares (V NVC1-VWNVC16 , VWNVC45, VWNVC46 y VWNVC18) para el aislamiento del ARN del WNV de una muestra biológica. La figura 2 (SEC ID NO: 17) representa una secuencia de control interno, ejemplar para el uso como un control para la captura y amplificación de objetivos. Las letras mayúsculas en negritas representan la secuencia en el IC que reemplaza la secuencia en el objetivo. Las figuras 3A-3D (SEC ID NOS: 52-55, respectivamente) muestran oligonucleótidos de sonda, representativos para el uso con los métodos principales . Descripción Detallada de la Invención La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra manera, métodos convencionales de técnicas químicas, bioquímicas, de ADN recombinante y virología, dentro de la experiencia en el campo. Estas técnicas son explicadas completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Fundamental Virology, 2- edición, volumen I & II (B. N. Fields y D. M. Knipe, eds . ) ; A. L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., adición en curso); Sambrook, y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edición, 1989); -Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan eds . , Academic Press, Inc.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (1984) . Se debe observar que, como se utiliza en esta especificación y las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen referencias plurales a menos que el contenido dicte claramente lo contrario. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "un oligonucleótido" incluye una mezcla de dos o más oligonucleótidos y similares. Las siguientes abreviaciones de aminoácidos se utilizan por todo el texto: Alanina: Ala (A) Arginina : Arg(R) Asparagina : Asn(N] Acido aspártico: Asp(D) Cisteina: Cys (C) Glutamina: Gln(Q) Acido glutámico: Glu(E) Glicina: Gly(G) Histidina: His(H) Isoleucina: lie (I) Leucina: Leu(L) Lisina: Lys (K) etionina: Met (M) Fenilalanina : Phe(F) Prolina: Pro(P) Serina: Ser(S) Treonina: Thr(T) Triptófano: Trp( ) Tirosina: Tyr(Y) Valina: Val (V) I. Definiciones En la descripción de la presente invención, se emplearán los siguientes términos y se propone que sean definidos' como se indica a continuación. Los términos "polipéptido" y "proteína" se refieren a un polímero de residuos de aminoácidos y no están limitados a una longitud mínima del producto. De esta manera, los péptidos, oligopéptidos, dímeros, multímeros y similares están incluidos dentro de la definición. Tanto las proteínas de longitud completa como los fragmentos de las mismas están incluidos por la definición. Los términos también incluyen las modificaciones pos-expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilación, acetilación, fosforilación y similares. Además, para propósitos de la presente invención, un "polipéptido" se refiere a una proteína que incluye modificaciones, tales como supresiones, adiciones y sustituciones (generalmente de naturaleza conservadora), a la secuencia nativa, siempre y cuando la proteína mantenga la actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de la mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tal como a través de mutaciones de hospedantes que producen las proteínas o errores debido a la amplificación de PCR. Por "aislado" se propone, cuando se refiere a un polipéptido, que la molécula indicada es separada y discreta del organismo completo con el cual se encuentra la molécula en la naturaleza o está presente en ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas del mismo tipo. El término "aislado" con respecto a un polinucleótido es una molécula de ácido nucleico exenta de, completamente o en parte, secuencias asociadas normalmente con ésta en la naturaleza; o una secuencia, como existe en la naturaleza, pero que tiene secuencias heterólogas en asociación con la misma; o una molécula disasociada del cromosoma. Los términos "polinucleótido", "oligonucleótido" , "ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico" se utilizan este texto para incluir una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos . Este término se refiere únicamente a la estructura primaria de la molécula. De esta manera, el término incluye ADN de cadena triple, doble e individual, asi como también ARN de cadena triple, doble e individual. También incluye modificaciones, tales como mediante la metilación y/o mediante la colocación de un casquete y formas no modificadas del polinucleótido. Más particularmente, los términos "polinucleótido", "oligonucleótido", "ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico" incluyen polidesoxirribonucleótidos (que contienen 2-desoxi-D-ribosa) , polirribonucleótidos (que contienen D-ribosa) , cualquier otro tipo de polinucleótido el cual es un N- o C-glicósido de una base de purina o pirimidina, y otros polímeros que contienen estructuras principales -no nucleotídicas , por ejemplo, poliamida (por ejemplo, ácidos nucleicos de péptidos (PNAs, por sus siglas en inglés) y polimorfolino (comercialmente disponible de Anti-Virals, Inc., Corvallis, Oregon, como Neugene) polímeros y otros polímeros de ácido nucleico específicos para la secuencia sintética con la condición que los polímeros contengan nucleobases en una configuración que permita el apareo de bases y la acumulación de bases, tal como se encuentra en el ADN y ARN. No existe una distinción propuesta en longitud entre los términos "polinucleótido", "oligonucleótido", "ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico" y estos términos se utilizarán intercambiablemente. Estos términos se refieren únicamente a la estructura primaria de la molécula. De esta manera, estos términos incluyen, por ejemplo, 3' -desoxi-2' , 5' -ADN, N3' P5' fosforamidatos de oligodesoxirribonucleótidos, ARN sustituido por 2 ' -O-alquilo, ADN de cadena doble e individual, así como también ARN de cadena doble e individual, híbridos de AD :ARN e híbridos entre PNAs y ADN o ARN, y también incluyen tipos conocidos de modificaciones, por ejemplo, etiquetas que son conocidas en el campo, metilación, "casquetes", sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo, modificaciones internucleótidos tales como, por ejemplo, aquellas con enlaces no cambiados (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos , etcétera), con enlaces cargados negativamente (por ejemplo, fosforotioatos , fosforoditioatos , etcétera) y con enlaces cargados positivamente (por ejemplo, aminoalguilfosforamidatos, aminoalquilfosfotriésteres) , aquellos que contienen porciones pendientes, tales como, por ejemplo, proteínas (inclusive nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señales, poli-L-lisina, etcétera) , aquellos con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoralen, etcétera) , aquellos que contienen formadores de quelatos (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidantes, etcétera) , aquellos que contienen alquiladores, aquellos con enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa-anoméricos , etcétera), así como también formas no modificadas del polinucleótido u oligonucleótido . En particular, el ADN es ácido desoxirribonucleico . Un polinucleótido "derivado de" o "específico para" una secuencia designada se refiere a una secuencia de polinucleótido que comprende una secuencia contigua de aproximadamente al menos aproximadamente 6 nucleótidos, preferiblemente al menos aproximadamente 8 nucleótidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 10-12 nucleótidos y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 15-20 nucleótidos que corresponden, es decir, son idénticos o complementarios para, una región de la ¦ secuencia de nucleótidos designada. El- polinucleótido derivado no será necesariamente derivado físicamente de la secuencia de nucleótidos de interés, sino que se puede generar de cualquier manera, inclusive, pero no limitado a, la síntesis química, replicación, transcripción inversa o transcripción, lo cual se basa en la información proporcionada por la secuencia de bases en la(s) región (es) de la cual se deriva el polinucleótido. Como tal, puede representar ya sea una orientación de sentido o antisentido del polinucleótido original . "Homología" se refiere al porcentaje de similitud entre dos secuencias de polinucleótido o dos porciones de polipéptido. Dos secuencias de polinucleótido o dos secuencias de polipéptido son "sustancialmente homologas" entre sí cuando las secuencias exhiben al menos aproximadamente 50%, preferiblemente al menos aproximadamente 75%, más preferiblemente al menos aproximadamente 80%-85%, preferiblemente al menos aproximadamente 90% y mucho más preferiblemente al menos aproximadamente 95%-98% de similitud de secuencias sobre una longitud definida de las moléculas. Como se utiliza en este texto, sustancialmente homólogo también se refiere a secuencias que muestran una identidad completa con la secuencia especificada de polinucleótido o polipéptido .

En general, "identidad" se refiere a una correspondencia exacta de nucleótido con nucleótido o aminoácido con aminoácido de dos secuencias de polinucleótido o polipéptido, respectivamente. El porcentaje de identidad se puede determinar por una comparación directa de la información de secuencia entre dos moléculas al alinear las secuencias, contar el número exacto de coincidencias entre las dos secuencias alineadas, dividir por la longitud de la secuencia más corta y multiplicar el resultado por 100. Los programas de computadora fácilmente disponibles se pueden utilizar para ayudar en el análisis de la homología y la identidad, tales como ALIGN, Dayhoff, M. O. en Atlas of Protein Sequence and Structure M. O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3_: 353-358, National biomedical Research Foundation, Washington, DC, el cual adapta el algoritmo de homología local de Smith y Waterman Advances in Appl . Math. 2_: 482-489, 1981 para el análisis de péptidos . Los programas para determinar la homología de secuencias de nucleótidos son disponibles en Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 (disponible de Genetics Computer Group, Madison, WI) por ejemplo, los programas BESTFIT, FASTA y GAP, los cuales también dependen del algoritmo Smith y " Waterman. Estos programas son utilizados fácilmente con los parámetros por omisión recomendados por el fabricante y descritos en el paquete de análisis de secuencias Wisconsin, referido anteriormente. Por ejemplo, el porcentaje de homología de una secuencia de nucleótidos -particular con una secuencia de referencia se puede determinar utilizando el algoritmo de homología de Smith y Waterman con una tabla de registro por omisión y una penalidad por espacio de seis posiciones de nucleótidos . Otro método para establecer el porcentaje de homología en el contexto de la presente invención es utilizar el paquete MPSRCH de programas registrados por la Universidad de Edimburgo, desarrollados por John F. Collins y Shane S. Sturrok y distribuido por IntelliGenetics , Inc. (Mountain View, CA) . De este juego de paquetes, el algoritmo Smith-Waterman se puede emplear donde se utilizan los parámetros por omisión para la tabla de registro (por ejemplo, penalidad por espacio abierto de 12, penalidad por extensión de espacio de uno y un espacio de seis) . A partir de los datos generados, el valor de "coincidencia" refleja la "homología de secuencias". Otros programas adecuados para calcular el porcentaje de identidad o similitud entre secuencias son generalmente conocidos en el campo, por ejemplo, otro programa de alineamiento es BLAST, utilizado con parámetros por omisión. Por ejemplo, BLASTN y BLASTP se pueden utilizar con los siguientes parámetros por omisión: código genético = estándar; filtro = ninguno; cadena = ambas; corte = 60; esperado = 10; Matriz = BLOSUM62; Descripciones = 50 secuencias; clasificado por = HIGH SCORE; Bases de datos = no redundantes, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss protein + Spupdate + PIR. Los detalles de estos programas se pueden encontrar en la siguiente dirección de Internet: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST. Alternativamente, la homología se puede determinar mediante la hibridización de polinucleótidos bajo condiciones que forman duplos estables entre regiones homologas, seguido por la digestión con nucleasa(s) específica (s) de cadena individual y la determinación del tamaño de los fragmentos digeridos . Las secuencias de ADN que son sustancialmente homologas se pueden identificar en el experimento de hibridización Southern bajo, por ejemplo, condiciones rigurosas, como se define para ese sistema particular. La definición de las condiciones de hibridización apropiadas está dentro de la experiencia en el campo. Véase, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, supra; ADN Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra. "Recombinante", utilizado en este texto para describir una molécula de ácido nucleico, significa un polinucleótido de origen genómico, de ADNc, viral, semisintético o sintético, el cual, en virtud de su origen o manipulación, no está asociado con la totalidad o una porción del polinucleótido con el cual está asociado en la naturaleza. El término "recombinante", utilizado con respecto a una proteina o un polipéptido, significa un polipéptido producido mediante la -expresión de un polinucleótido recombinante . En general, el gen de interés" es clonado y luego expresado en organismos transformados, como se describe adicionalmente más adelante. El organismo hospedante expresa el gel extraño para producir la proteina bajo condiciones de expresión . Una "ADN polimerasa dependiente del ADN" es una enzima que sintetiza una copia de ADN complementario de una plantilla de ADN. Los ejemplos son ADN polimerasa I de E. coli y ADN polimerasa del bacteriófago T7. Todas las ADN polimerasas dependientes del ADN conocidas requieren un cebador complementario para iniciar la síntesis. Bajo condiciones adecuadas, una ADN polimerasa dependiente del ADN puede sintetizar una copia de ADN complementario de una plantilla de ADN. Una "ARN polimerasa dependiente del ADN" o una "transcriptasa" es una enzima que sintetiza múltiples copias de ARN de una molécula de ADN de cadena doble o de cadena parcialmente doble que tiene una secuencia promotora (usualmente de doble cadena) . Las moléculas de ARN ("transcripciones") son sintetizadas en la dirección 5' a 3' comenzando una posición especifica justo corriente abajo del promotor. Los ejemplos de transcriptasas son la ARN polimerasa dependiente del ADN de E. coli y los bacteriófagos T7, ?3 y SP6. Una "ADN polimerasa dependiente del ARN" o una "transcriptasa inversa" es una enzima que sintetiza una copia de ADN complementario de una plantilla de ARN. Todas las transcriptasas inversas conocidas también tienen la capacidad de hacer una copia de ADN complementario a partir de una plantilla de ADN; de esta manera, son ADN polimerasas dependientes tanto de ARN como ADN. Se requiere un cebador para iniciar la sintesis con las plantillas tanto de ARN como de ADN. La "RNAsa R" es una enzima que degrada la porción de ARN de un duplo de ARN: ADN. Estas enzimas pueden ser endonucleasas o exonucleasas . La mayoría de enzimas transcriptasa inversa contienen normalmente una actividad de RNAsa H además de su actividad de polimerasa. Sin embargo, otras fuentes de RNAsa H son disponibles sin una actividad de polimerasa asociada. La degradación puede dar por resultado la separación del ARN de un complejo de ARN:ADN. Alternativamente, la RNAsa H puede cortar simplemente el ARN en varias ubicaciones, de tal manera que las porciones del ARN se funden, o permiten que las enzimas desenrollen porciones del ARN. Como se utiliza en este texto, el término "región de ácido nucleico objetivo" o "ácido nucleico objetivo" representa una molécula de ácido nucleico con una "secuencia objetivo" que es amplificada. El ácido nucleico objetivo puede ser ya sea de cadena individual o de cadena doble y puede incluir otras secuencias además de la secuencia objetivo, las cuales pueden no ser amplificadas. El término "secuencia objetivo" se refiere a la secuencia de nucleótidos particular del ácido nucleico objetivo que debe ser amplificada. La secuencia objetivo puede incluir una región de hibridización de sondas contenida dentro de la molécula objetivo con la cual una sonda formará un híbrido estable bajo condiciones deseadas. La "secuencia objetivo" también puede incluir las secuencias formadoras de complejos con las cuales los cebadores de oligonucleótidos forman complejos y se pueden extender utilizando la secuencia objetivo como plantilla. Donde el ácido nucleico objetivo es originalmente de cadena individual, el término "secuencia objetivo" también se refiere a la secuencia complementaria para la "secuencia objetivo" ya que está presente en el ácido nucleico objetivo. Si el "ácido nucleico objetivo" es originalmente de cadena doble, el término "secuencia objetivo" se refiere a las cadenas tanto más (+) como menos (-) . El término "cebador" o "cebador de oligonucleótido" como se utiliza en este texto, se refiere a un oligonucleótido que actúa para iniciar la síntesis de una cadena de ácido nucleico complementaria cuando se coloca bajo condiciones en las cuales es inducida la síntesis de un 7 producto de extensión de cebador, es decir, en presencia de nucleótidos y un agente inductor de la polimerización, tal como una ADN o ARN polimerasa y a una temperatura, pH, concentración de metal y concentración de sales, adecuadas. El cebador es preferiblemente de cadena individual para una máxima eficacia en la amplificación, pero puede ser alternativamente de cadena doble. Si' es de cadena doble, el cebador puede ser tratado primero para separar sus cadenas antes de utilizarse para preparar productos de extensión. Este paso de desnaturalización es efectuado típicamente por el calor, pero se puede llevar a cabo alternativamente utilizando álcali, seguido por la neutralización. De esta manera, un "cebador" es complementario para una plantilla y los complejos mediante la unión de hidrógeno o la hibridización con la plantilla para proporcionar un complejo de cebador/plantilla para la iniciación de la síntesis por una polimerasa, que se extiende por la adición de bases unidas covalentemente enlazadas en su extremo 3' complementarias para la plantilla en el proceso de síntesis de ADN o ARN. Como se utiliza en este texto, el término "sonda" o "sonda de oligonucleótido" se refiera a una estructura comprendida de un polinucleótido, como . se definiera anteriormente, que contiene una secuencia de ácido nucleico complementaria para una secuencia de ácido nucleico presente en el analito de ácido nucleico objetivo. Las regiones de polinucleótidos de las sondas pueden estar comprendidas de ADN y/o ARN, y/o análogos de nucleótidos sintéticos. Cuando una "sonda de oligonucleótido" debe utilizarse en un ensayo de nucleasa 5', tal como la técnica TaqManMR, la sonda contendrá al menos una sustancia fluorescente y al menos un apagador, el cual es digerido por la actividad de endonucleasa 5' de una polimerasa utilizada en la reacción a fin de detectar cualquier secuencia de oligonucleótidos objetivo, amplificada. En este contexto, la sonda de oligonucleótido tendrá un número suficiente de enlaces de fosfodiéster adyacentes a su extremo 5' de manera que la actividad de nucleasa 5' a 3' empleada puede degradar eficientemente la sonda unida para separar las sustancias fluorescentes y los apagadores. Cuando se utiliza una sonda de oligonucleótido en la técnica de ???, será etiquetada adecuadamente, como se describe posteriormente. Se apreciará que las secuencias de hibridización no necesitan tener una complementariedad perfecta para proporcionar híbridos estables. En muchas situaciones, los híbridos estables se formarán donde menos de aproximadamente 10% de las bases son desajustes, ignorando los circuitos de cuatro o más nucleótidos. Por consiguiente, como se utiliza en este texto, el término "complementariedad" se refiere a un oligonucleótido que forma un duplo estable con su "complemento" bajo condiciones de ensayo, generalmente donde existe aproximadamente 90% -de homología o más. Los términos "hibridizar" e "hibridización" se refieren a la formación de complejos entre secuencias de nucleótidos las cuales son suficientemente complementarias para formar complejos por vía del apareamiento de bases Watson-Crick. Donde un cebador "se hibridiza" con el objetivo (plantilla) , estos complejos (o híbridos) son suficientemente estables para servir en la función de cebado requerida por, por ejemplo, la ADN polimerasa para iniciar la síntesis de ADN. Como se utiliza en este texto, el término "par de unión" se refiere a una primera molécula y una segunda molécula que se unen específicamente entre sí, tal como pares de polinucleótidos complementarios capaces de formar duplos de ácido nucleico. La "unión específica" del primer miembro del par de unión con el segundo miembro del par de unión en una muestra es evidenciada por la unión del primer miembro con el segundo miembro, o viceversa, con una afinidad y especificidad mayores que con otros componentes en la muestra. La unión entre los miembros del primer par de unión es típicamente no covalente. A menos que el contexto indique claramente lo contrario, los términos "molécula de afinidad" y "analito objetivo" se utilizan en este texto para referirse a un primer miembro y un segundo miembro de un par de unión, respectivamente . Los términos "molécula de unión especifica" y "molécula de afinidad" se utilizan intercambiablemente en este texto y se refieren a una molécula que se unirá selectivamente, a través de medios químicos o físicos, a una sustancia detectable que esté presente en una muestra. Por "unir selectivamente" se propone que la molécula se une preferiblemente al objetivo de interés o se une con mayor afinidad al objetivo que a otras moléculas. Por ejemplo, una molécula de ADN se unirá a una secuencia sustancialmente complementaria y no a secuencias no relacionadas. La "temperatura de fusión" o "Tm" (por sus siglas en inglés del ADN de cadena doble se define como la temperatura a la cual se pierde la mitad de la estructura hélica del ADN debido al calentamiento u otra disociación de la unión de hidrógeno entre pares de bases, por ejemplo, por el tratamiento con ácido o álcali o similares. La Tm de una molécula de ADN depende de su longitud y de su composición de bases. Las moléculas de ADN con alto contenido de pares de bases GC tienen una Tm superior que aquellas que tienen una abundancia de pares de bases AT. Las cadenas complementarias, separadas de ADN se reasocian espontáneamente o se hibridizan para formar ADN duplo cuando la temperatura se hace descender abajo de la Tm. La velocidad más alta de hibridización de ácido nucleico ocurre aproximadamente 25°C abajo de la Tm. La Tm puede calcularse utilizando la siguiente relación: Tm = 69.3 + 0.41 (GC)% ( armur y colaboradores, (1962) J. Mol. Biol 5:109-118) . Como se utiliza en este texto, los términos "etiqueta" y "etiqueta detectable" se refieren a una molécula con capacidad de detección que incluye, pero no está limitada a, isótopos radioactivos, sustancias fluorescentes, sustancias quimioluminiscentes , cromóforos, enzimas, substratos enzimáticos, cofactores enzimáticos, inhibidores enzimáticos, cromóforos, tintes, iones de metal, coloides líquidos de metal, nanocristales semiconductores, ligandos (por ejemplo, biotina, avidina, estrepavidina o haptenos) y similares. El término "sustancia fluorescente" se refiere a una sustancia o una porción de la misma que es capaz de exhibir fluorescencia en el rango detectable. Como se utiliza en este texto, un "soporte sólido" se refiere a una superficie sólida, tal como una perla magnética, perla de látex, pocilio de placa de microtítulo, placa de vidrio, nilón, agarosa, acrilamida y similares. Como se utiliza en este texto, una "muestra biológica" se refiere a una muestra de tejido o fluido aislada de un sujeto, tal como, pero no limitada a, sangre, plasma, suero, materia fecal, orina, médula ósea, bilis, fluido espinal, fluido linfático, muestras de la piel, secreciones de la piel, tracto respiratorio, intestinal y genitourinario, lagrimas, saliva, leche, células sanguíneas, órganos, biopsias y también muestras de constituyentes de cultivo de células in vitro que incluyen, pero no están limitados a, medios acondicionados que resultan del crecimiento de células y tejidos en un medio de cultivo, por ejemplo, células recombinantes y componentes de células. Las muestras detalladas anteriormente no necesitan estar necesariamente en la forma obtenida directamente de la fuente. Por ejemplo, la muestra puede ser tratada antes del uso, tal como, por ejemplo, mediante el calentamiento, centrifugación, etcétera antes del análisis. Por "sujeto vertebrado" se propone cualquier miembro del subfilo cordata que es susceptible a la infección por WNV, inclusive, sin limitación, mamíferos tales como caballos y humanos, y especies aviarias. El término no representa una edad particular. De esta manera, se propone que sean cubiertos los animales tanto adultos como recién nacidos, así como también fetos. II. Modos para Llevar a Cabo la Invención Antes de describir la presente invención en detalle, se debe entender que esta invención no está limitada a formulaciones o parámetros de proceso particulares ya que, por supuesto, éstos pueden variar. También se debe entender que la terminología utilizada en este texto únicamente tiene el propósito de describir modalidades particulares de la invención únicamente y no se propone que sea limitante. Aunque una vari-edad de composiciones y métodos similares o equivalentes a aquellos descritos en este texto se pueden utilizar en la práctica de la presente invención, los materiales y métodos preferidos se describen en la presente . Como se observa anteriormente, la presente invención se basa en el descubrimiento de nuevos métodos de diagnóstico para detectar de manera precisa la presencia del virus del Nilo Occidental (WNV) en una muestra biológica. Los métodos se pueden utilizar para detectar el WNV en una muestra biológica de cualquier especie de vertebrados susceptible al virus . Los métodos dependen de técnicas de detección sensibles basadas en ácido nucleico que permiten la identificación de secuencias de ácido nucleico objetivo del WNV en muestras que contienen pequeñas cantidades del virus. Los métodos son particularmente útiles para detectar el WNV en muestras de sangre, inclusive, sin limitación, en sangre completa, suero y plasma. Los métodos se pueden utilizar para diagnosticar la infección por WNV en un sujeto, asi como también para detectar la contaminación por WNV en muestras de sangre donada. De esta manera, las alícuotas de muestras donadas o muestras reunidas, individuales se pueden examinar por la presencia del WNV y aquellas muestras o muestras reunidas que están contaminadas con el WNV se pueden eliminar antes de que sean combinadas. De esta manera, se puede proporcionar un suministro- de sangre sustancialmente libre de contaminación por WNV. Por "sustancialmente libre del WNV" se propone que la presencia del WNV no es detectada utilizando los ensayos descritos en este texto, preferiblemente utilizando los ensayos TaqManMR descritos en los ejemplos. Normalmente, entonces, una muestra será considerada como "sustancialmente libre del WNV" cuando están presentes menos de 5 copias /WNV de ácido nucleico objetivo del WNV, preferiblemente menos de 3 copias/mi y aún más preferiblemente menos de 1 copia/ml. En la estrategia de la presente invención, los ácidos nucleicos objetivo son separados de los ácidos nucleicos no homólogos utilizando oligonucleótidos de captura inmovilizados en un soporte sólido. Los oligonucleótidos de captura se derivan de regiones conservadas del genoma del WNV y son específicos para el WNV. Se ha descubierto por los inventores en este texto que los oligonucleótidos de captura derivados de regiones conservadas de la cápside, las regiones prM y 3'UTR del genoma del WNV, son particularmente útiles en los presentes métodos de diagnóstico. Se conocen las secuencias para el genoma del WNV, inclusive esas regiones, en una variedad de aislados del WNV. Véase, por ejemplo, los números de acceso de NCBI NC001563; AF404757; AF404756; AF404755; AF404754; AF404753; AF481864; M12294; AF196835; AF260969; AF260968; AF260967; AF206518; AF202541; AF196835; Briton, M. A., Ann. Rev. Micorbiol . (2002) 56:371-402; Lanciotti y colaboradores, Science (1999) 286:2333-2337; y la solicitud de patente norteamericana No. 2002/0164349. Mediante la comparación de las secuencias de diversos aislados del WNV, se pueden identificar fácilmente estas y otras regiones conservadas para el uso con la presente invención . Por conveniencia, los diversos nucleótidos para el uso con la presente invención han sido numerados en este texto con relación a la cepa del WNV, WN-NY99 (véase, Lanciotti y colaboradores, Science (1999) 286:2333-2337 y el número de acceso de NCBI AF196835, para la secuencia genómica de WN-NY99) . ^ Los ácidos nucleicos objetivo, separados entonces se pueden detectar mediante el uso de sondas de oligonucleótidos, también derivadas de regiones conservadas del genoma del WNV. Por lo tanto, estas sondas se pueden derivar de, por ejemplo, regiones conservadas de la cápside, regiones pr y 3'UTR, y se pueden etiquetar con grupos reporteros o se pueden amplificar. A fin de proporcionar mejores capacidades de detección, se puede utilizar más de una sonda para dar cuenta de la variación de la cepa. De esta manera, por ejemplo, múltiples sondas derivadas de diferentes cepas principales del WNV se pueden utilizar en combinación.

Después de la detección, se puede realizar un ensayo adicional para determinar- que cepa del WNV ha causado la infección. Adicionalmente, diversas sondas se pueden etiquetar con etiquetas distinguibles para detectar simultáneamente variantes del virus en un modo múltiple. Los oligonucleótidos de captura particularmente útiles comprenden las secuencias de nucleótidos de los diversos oligonucleótidos representados en las figuras 1A-1R (SEC ID NOS: 1-16, 45, 46 y 50, respectivamente), o secuencias que exhiben al menos aproximadamente 80-90% o más de identidad de secuencias con las mismas, incluyendo cualquier porcentaje de identidad dentro de estos rangos, tal como 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% de identidad de secuencias con las mismas. Como se explica anteriormente, las regiones de la cuales se derivan los oligonucleótidos de captura son conservadas entre aislados virales. Sin embargo, los oligonucleótidos de captura se pueden derivar utilizando métodos bien conocidos en el campo a fin de mejorar la afinidad de unión con el ácido nucleico objetivo. Los cebadores de amplificación particularmente útiles y las sondas para el uso en los ácidos nucleicos, objetivo, separados comprenden secuencias de nucleótidos derivadas de la cápside, regiones E, NS1, NS2 y 3'UTR, tales como las secuencias de nucleótidos de las SEC ID NOS: 34, 35, 37, 38, 7 42, 43 y 52-55 o secuencias que exhiben al menos aproximadamente 80-90% o más de identidad de secuencias con las mismas, incluyendo cualquier porcentaje de identidad dentro de estos rangos. En una modalidad de la presente invención, la muestra biológica que lleva potencialmente el ácido nucleico objetivo se pone en contacto con un soporte sólido en asociación con oligonucleótidos de captura. Los oligonucleótidos de captura, los cuales se pueden utilizar por separado o preferiblemente en combinación, pueden ser asociados con el soporte sólido, por ejemplo, mediante la unión covalente de la porción de captura con el soporte sólido, mediante la asociación de afinidad, unión de hidrógeno o asociación no especifica. Los oligonucleótidos de captura pueden incluir de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 nucleótidos de la región conservada, particular, preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nucleótidos, o más preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 nucleótidos de la región conservada o cualquier número entero dentro de estos rangos, tal como una secuencia que incluye 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26...35...40, etcétera, nucleótidos de la región conservada de interés. El oligonucleótido de captura puede ser unido al soporte sólido en una variedad de maneras. Por ejemplo, el oligonucleótido puede ser unido al soporte sólido por la unión del nucleótido terminal 3' o 5' de la sonda con el soporte sólido. Más preferiblemente, el oligonucleótido de captura es unido al soporte sólido por un ligante que sirve para separar la sonda del soporte sólido. El ligante tiene usualmente una longitud de al menos 10-50 átomos, más preferiblemente una longitud de al menos 15-30 átomos. La longitud requerida del ligante dependerá del soporte sólido, particular que se utiliza. Por ejemplo, un ligante de seis átomos es generalmente suficiente cuando se utiliza un poliestireno reticulado, superior como el soporte sólido. En el campo se conoce una amplia variedad de ligantes, los cuales se pueden utilizar para unir la sonda de oligonucleótido con el soporte sólido. El ligante se puede formar de cualquier compuesto que no interfiera significantemente con la hibridización de la secuencia objetivo con la sonda unida al soporte sólido. El ligante se puede formar de un oligonucleótido homopolimérico, el cual se puede adicionar fácilmente al ligante mediante la síntesis automatizada. La secuencia homopolimérica puede estar ya sea en 5' o 3' con respecto a la secuencia específica del virus. En un aspecto de la invención, los oligonucleótidos de captura incluyen una cadena de homopolímero, tal como, por ejemplo, poli A, poli T, poli G, poli C, poli U, poli dA, poli dT, poli dG, poli dC o poli dü a fin de facilitar la unión a un soporte sólido. La cadena de homopolimero puede tener una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 nucleótidos o preferiblemente una longitud de aproximadamente 12 a aproximadamente 25 nucleótidos, o cualquier número entero dentro de estos rangos, tal como, por ejemplo, 10...12...16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 nucleótidos. El homopolimero, si está presente, se puede adicionar a la terminación 3' o 5' de los oligonucleótidos de captura por medio de métodos enzimáticos o químicos. Esta adición se puede hacer mediante la adición gradual de nucleótidos o mediante la ligadura de un homopolimero formado previamente. Los oligonucleótidos de captura particulares que incluyen cadenas de poli A se muestran en los ejemplos y son representados por las SEC ID NOS: 18-33, 47, 48 y 51. Los oligonucleótidos de captura preferidos son representados por las SEC ID NOS: 8, 12, 45, 46 y 50 (SEC ID NOS: 25, 29, 47, 48 y 51, respectivamente, con la cola de poli A) . Alternativamente, los polímeros tales como polietilenglicol funcionalizado se pueden utilizar como el ligante. Estos polímeros no interfieren significantemente con la hibridización de la sonda con el oligonucleótido objetivo. Los ejemplos de enlaces incluyen enlaces de polietilenglicol, carbamato y amida. Los enlaces entre el soporte sólido, el ligante y la sonda no son escindidos preferiblemente durante la remoción de los grupos protectores de bases bajo condiciones básicas a altas temperaturas. El oligonucleóti-do de captura también puede ser fosforilado en el extremo 3' a fin de impedir la extensión del oligonucleótido de captura. El soporte sólido puede tomar muchas formas que incluyen, por ejemplo, nitrocelulosa reducida a una forma particulada y recuperable con el paso del medio de la muestra que contiene el soporte a través de un tamiz; nitrocelulosa o los materiales impregnados con partículas magnéticas o similares, que permite que la nitrocelulosa migre dentro del medio de la muestra con la aplicación de un campo magnético; perlas o partículas que se pueden filtrar o pueden exhibir propiedades electromagnéticas; y perlas de poliestireno que dividen a la superficie de un medio acuoso. Los ejemplos de tipos preferidos de soportes sólidos para la inmovilización de la sonda de oligonucleótido incluyen un vidrio de poros controlados, placas de vidrio, poliestireno, perlas de poliestireno revestidas con avidina, celulosa, nilón, gel de acrilamida y dextrano activado. Una modalidad preferida de la presente invención incluye un soporte sólido que comprende perlas magnéticas. Preferiblemente, las perlas magnéticas contienen grupos funcionales de amina primaria, los cuales facilitan la unión covalente o asociación de los oligonucleotidos de captura con las partículas de soporte magnéticas. Alternativamente, las perlas magnéticas tienen inmovilizados en las mismas homopolimeros, tales como las secuencias poli T o poli A. Los homopolímeros en el soporte sólido serán generalmente complementarios para cualquier homopolimero en el oligonucleótido de captura para permitir la unión del oligonucleótido de captura al soporte sólido mediante la hibridización . El uso de un soporte sólido con perlas magnéticas permite un método de aislamiento, amplificación y detección de un crisol ya que el soporte sólido puede separarse de la muestra biológica por las perlas magnéticas. Las perlas o partículas magnéticas se pueden producir utilizando técnicas estándar o se pueden obtener de fuentes comerciales. En general, las partículas o perlas pueden estar comprendidas de partículas magnéticas, aunque también pueden incluir otro metal magnético u óxidos de metal, ya sea en forma impura, de aleación o compuesta, ya que tienen una superficie reactiva y exhiben una capacidad para reaccionar con un campo magnético. Otros materiales que se pueden utilizar individualmente o en combinación con el hierro incluyen, pero no están limitados a, cobalto, níquel y silicio. Una perla magnética adecuada para el uso con la presente invención incluye perlas magnéticas que contienen los grupos poli dT comercializados bajo el nombre comercial perlas magnéticas de oligonucleótidos Sera-MagMR por Seradyn, Indianápolis, IN.

Después, la asociación de los oligonucleótidos de captura con el soporte sólido es iniciada por el contacto del soporte sólido con el medio que contiene los oligonucleótidos de captura. En la modalidad preferida, las perlas magnéticas que contienen los grupos poli dT son hibridizadas con los oligonucleótidos de captura que comprenden el grupo poli dA contiguo con la secuencia de captura (es decir, la secuencia sustancialmente complementaria para una secuencia de ácido nucleico del WNV) seleccionada de la región de cadena individual, conservada del genoma del WNV. El poli dA en el oligonucleotido de captura y el poli dT en el soporte sólido se hibridizan para inmovilizar o asociar con lo cual los oligonucleótidos de captura con el soporte sólido. El soporte sólido con oligonucleótidos de captura asociados se pone en contacto con la muestra biológica bajo condiciones de hibridización . Los oligonucleótidos de captura se hibridizan con las cadenas objetivo presentes en la muestra biológica. Típicamente, la hibridización de los oligonucleótidos de captura con los objetivos se puede realizar en aproximadamente 15 minutos, pero puede tomar tanto como 3 a 48 horas. El soporte sólido entonces se separa de la muestra biológica, por ejemplo, mediante la filtración, el paso a través de una columna o por las perlas magnéticas. Como será apreciado por una persona experta en el campo, el método de separación dependerá del tipo de soporte sólido que se selecciona. Puesto que los- objetivos son hibridizados con los oligonucleótidos de captura inmovilizados en el soporte sólido, las cadenas objetivo son separadas con lo cual de las impurezas en la muestra. En algunos casos, los ácidos nucleicos, proteínas, carbohidratos, lipidos, desechos celulares y otras impurezas extraños aún se pueden unir al soporte, aunque en concentraciones muy inferiores que las encontradas inicialmente en la muestra biológica. Aquellas personas expertas en el campo reconocerán que algunos materiales indeseables se pueden remover al lavar el soporte con un medio de lavado. La separación del soporte sólido de la muestra biológica remueve preferiblemente al menos aproximadamente 70%, más preferiblemente al menos aproximadamente 90% y, mucho más preferiblemente, al menos aproximadamente 95% o más de los ácido nucleicos no objetivos que están presentes en la muestra. Los métodos de la presente invención también pueden incluir la amplificación del ácido nucleico del WNV objetivo, capturado para producir ácidos nucleicos amplificados. La amplificación de un ácido nucleico objetivo utiliza típicamente una polimerasa de ácido nucleico para producir múltiples copias del ácido nucleico objetivo o fragmentos del mismo. Las técnicas de amplificación adecuadas son bien conocidas en el campo, tales como, por ejemplo, la amplificación medida por la transcripción, reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) , amplificación mediada por replicasa y reacción en cadena de ligasa (LCR, por sus siglas en inglés) . Los oligonucleótidos de captura, cebadores y sondas para el uso en los ensayos son sintetizados fácilmente por medio de técnicas estándar, por ejemplo, la síntesis de fase sólida por vía de la química de fosforamidita, como se describe en las patentes norteamericanas Nos. 4,458,066 y 4,415,732; Beaucage y colaboradores, (1992) Tetrahedron £8:2223-2311; y Applied Biosystems User Bulletin No. 13 (1 de Abril de 1987) . Otros métodos de síntesis química incluyen, por ejemplo, el método de fosfotriéster descrito por Narang y colaboradores, Meth. Enzymol. (1979) _68:90 y el método de fosfodiéster descrito por Brown y colaboradores, Meth. Enzymol. (1979) 68_: 109. Poli A o poli C, u otras extensiones de nucleótidos no complementarias, se pueden incorporar en las sondas utilizando los mismos métodos. Las extensiones de óxido de hexaetileno se pueden acoplar a sondas por métodos conocidos en el campo. Cload y colaboradores, (1S91) J. Mi. Chem. Soc. 113 : 6324-6326; patente norteamericana No. , 91 ,210 to Levenson y colaboradores, Durand y colaboradores (1990) Nucleic Acids Res. 18: 6353-6359; y Horn y colaboradores, (1986) Tet. Lett. 27:4705-4708. Además, los cebadores y las sondas se pueden acoplar a las etiquetas para la detección. Existen varios medios conocidos para · derivar oligonucleótidos con funcionalidades reactivas que permitan la adición de una etiqueta. Por ejemplo, varios planteamientos son disponibles para biotinilar sondas de manera que las etiquetas radioactivas, fluorescentes, quimioluminescentes , enzimáticas o de densidad electrónica se pueden unir por via de avidina. Véase, por ejemplo, Broken y colaboradores, Nucí. Acids Res. (1978) _5:363-384 que describe el uso de etiquetas de ferritina-avidina-biotina; y Chollet y colaboradores, Nucí. Acids Res. (1985) 13: 1529-1541 que describe la biotinilación de las terminaciones 5' de los oligonucleótidos por via de un brazo ligante de aminoalquilfosforamida . Varios métodos también son disponibles para sintetizar oligonucleótidos derivatizados de amino que son etiquetados fácilmente por tipos fluorescentes u otros tipos de compuestos derivados por grupos reactivos amino, tales como isotiocianato, N-hidroxisuccinimida o similares, véase, por ejemplo, Connolly (1987) Nucí. Acids Res. 15:3131-3139, Gibson y colaboradores, (1987) Nucí. Acids Res. 15:6455-6467 y la patente norteamericana No. 4,605,735 expedida a Miyoshi y colaboradores . También están disponibles métodos para sintetizar los oligonucleótidos derivados de sulfhidrilo los cuales se pueden hacer reaccionar con etiquetas especificas de tiol, véase, por ejemplo, patente norteamericana No. 4,757,141 expedida a Fung y colaboradores, Connolly y colaboradores, (1985) Nucí ¡ Acids Res. 13:4485-4502 y Spoat y colaboradores, (1987) Nucí . Acids Res. 15:4837-4848. Una revisión comprensiva de las metodologías para etiquetar fragmentos de ADN se proporciona en Matthews y colaboradores, Anal. Biochem. (1988) 169:1-25. Por ejemplo, los cebadores y las sondas se pueden etiquetar de manera fluorescente mediante la unión de una molécula fluorescente a la terminación no ligadora de la sonda. La guia para seleccionar las etiquetas fluorescentes, apropiadas se puede encontrar en Smith y colaboradores, Meth. Enzymol. (1987) 155 : 260-301; Karger y colaboradores, Nucí. Acids Res. (1991) 19:4955-4962; Haugland (1989) Handbook of Fluorescent Pzobes and Research Chemicals (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) . Las etiquetas fluorescentes, preferidas incluyen fluoresceína y derivados de la misma, tal como se describe en la patente norteamericana No. 4,318,846 y Lee y colaboradores, Cytometry (1989) 10:151-164, y 6-FA , JOE, TAMRA, ROX, HEX-1, HEX-2, ZOE, TET-1 o NAN-2 y similares. Adicionalmente, los cebadores y las sondas se pueden etiquetar con un éster de acridinio (AE) utilizando las técnicas descritas a continuación. Las tecnologías actuales permiten que la etiqueta de AE sea colocada en cualquier ubicación dentro de la sonda. Véase, por ejemplo, Nelson y colaboradores (1995) "Detection of Acrxdinium Esters by Chemiluminescence" en Nonisotopic Probing, Blotting and Sequencing, Kricka L. J. (ed) Academic Press, San Diego, CA; Nelson y colaboradores, (1994) "Application of the Hybridization Protection Assay (HPA) to PCR" en The Polymerase Chain Reaction, Mullis y colaboradores, (eds.) Birkhauser, Boston, MA; Weeks y colaboradores, Clin. Chem. (1983) 29:1474-1479; Berry y colaboradores, Clin. Chem. (1988) 3_4: 2087-2090. Una molécula de AE se puede unir directamente a la sonda utilizando la química de brazo ligante no basada en nucleótidos que permite la colocación de la etiqueta en cualquier ubicación dentro de la sonda. Véase, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 5,585,481 y 5, 185, 39. En ciertas modalidades, un control interno (IC, por sus siglas en inglés) o un estándar interno se adiciona para servir como control para la captura y amplificación de objetivos. Preferiblemente, el IC incluye una secuencia que difiere de las secuencias objetivo, es capaz de hibridizarse con los oligonucleótidos de captura utilizados para separar los ácidos nucleicos específicos para el organismo de la muestra y es capaz de la amplificación por los cebadores utilizados para amplificar los ácidos nucleicos del WNV objetivo. El uso del control interno permite el control del proceso de separación, el proceso de amplificación y el sistema de detección y permite la supervisión del desempeño del ensayo y la cuantificación para la(s) muestra(s). El control de amplificación -se puede distinguir del objetivo amplificado (en este caso WNV) en el paso de detección. Se pueden utilizar diferentes sondas para la detección del control y el objetivo. El IC se puede incluir en cualquier punto adecuado, por ejemplo, en el amortiguador de lisis. En una modalidad, el IC comprende ARN que contiene una parte de la secuencia de nucleótidos de W V y una secuencia única que se hibridiza con la sonda. De esta manera, en ciertas modalidades, el IC incluye una porción del genoma del WNV con una secuencia modificada con 5-30, tal como 6...9...12...15...20 y asi sucesivamente, o más bases sustituidas por otras bases. Las bases sustitutas se pueden localizar sobre la longitud completa de la secuencia objetivo de tal manera que solo 2 o 3 secuencias consecutivas son reemplazadas. Un IC representativo para el WNV se muestra en la figura 2 (SEC ID NO: 17) y comprende 967 pares de bases derivados de la región de codificación 5'UTR y 5' del genoma del WNV. Las bases en letras mayúsculas, negritas en la figura 2 representan las bases sustituidas que han sido sustituidas por bases que se encuentran en la secuencia de tipo natural del WNV en cuestión. El ensayo puede incluir adicionalmente sondas especificas para el estándar interno (sondas de IC) . Las sondas representativas para la secuencia de IC son detalladas en los ejemplos como la SEC ID NO: 40 y la SEC ID NO: 41. La sonda de IC- puede acoplarse opcionalmente con una etiqueta detectable que sea diferente de la etiqueta detectable para la secuencia objetivo. En las modalidades donde la etiqueta detectable es un fluoróforo, el IC se puede cuantificar espectrofotométricamente y mediante el limite de los estudios de detección. Una sonda de IC ejemplar para la unión al soporte sólido es representada por la secuencia xCAGTGACATGCAGGTCTAGCTz (SEC ID NO: 40), donde x = TET y z = ligante + TAMRA. Otra sonda de IC ejemplar para la unión al soporte sólido es representada por la secuencia xCCCAGTGACATGCAGGTCTAGCTz (SEC ID NO: 41), donde x = TET y z = ligante + TAMRA. Típicamente, el número de copias de IC que no interfiere con la detección del objetivo se determina al titular el IC con una IU fij a/copias/PFU del objetivo, preferiblemente en el extremo inferior y una curva estándar se genera al diluir una muestra del estándar internacxonalmente aceptado. En otra modalidad, un IC que comprende ARN, como se describiera en este texto, se combina con ácido nucleico aislado de la muestra de acuerdo con técnicas estándar conocidas para aquellas personas expertas en el campo. El ARN entonces es transcrito de manera inversa utilizando una transcriptasa inversa para proporcionar el ADNc. Las secuencias de ADNc se pueden amplificar opcionalmente (por ejemplo, mediante la PCR) - utilizando cebadores etiquetados. Los productos de la amplificación se separan, típicamente mediante la electroforesis, y se determina la cantidad de etiqueta incorporada (proporcional a la cantidad del producto amplificado) . La cantidad de ARN en la muestra entonces se calcula mediante la comparación con la señal producida por los estándares conocidos. Los cebadores y las sondas descritos anteriormente se pueden utilizar en las técnicas basadas en la reacción en cadena de polimerasa (PCR) , tales como RT-PCR, para detectar l presencia del WNV en muestras biológicas . La PCR es una técnica para amplificar una secuencia de ácido nucleico objetivo, deseada que está contenida en una molécula de ácido nucleico o una mezcla de moléculas. En la PCR, un par de cebadores se emplea en exceso para hibridizarse con las cadenas complementarias del ácido nucleico objetivo. Los cebadores son extendidos cada uno por una polimerasa utilizando el ácido nucleico objetivo como plantilla. Los productos de la extensión se vuelven secuencias objetivo por si mismas después de la disociación de la cadena objetivo, original. Los nuevos cebadores entonces son hibridizados y extendidos por una polimerasa y el ciclo se repite para incrementar geométricamente el número de moléculas de secuencia objetivo. El método de PCR para amplificar las secuencias de ácido nucleico objetivo en una muestra es bien conocido en el campo y se -ha descrito en, por ejemplo, Innis y colaboradores, (eds.) PCR Protocols (Academic Press, NY '19.90); Taylor (1991) Polymerase chain reaction: basic principies y automation, in PCR: A Practical Approacht, McPherson y colaboradores, (eds.) IRL Press, Oxford; Saiki y colaboradores, (1986) Nature 32 : 163 ; asi como también las patentes norteamericanas Nos. 4,683,195, 4,683,202 y 4,889,818. En particular, la PCR utiliza cebadores de oligonucleótidos relativamente cortos que flanquean la secuencia de nucleótidos objetivo que es amplificada, orientados de tal manera que sus extremos 3' se enfrenten entre si, cada cebador que se extiende hacia el otro. La muestra de polinucleótidos se extrae y se desnaturaliza, preferiblemente por el calor y se hibridiza con el primer cebador y el segundo cebador que están presentes en un exceso molar. La polimerización es catalizada en presencia de los cuatro trifosfatos de desoxirribonucleotidos (dNTPs — dATP, dGTP, dCTP y dTTP) utilizando un cebador - y una plantilla - dependiendo del agente de polimerización de polinucleótidos, tal como cualquier enzima capaz de dar por resultado productos de extensión del cebador, por ejemplo, ADN polimerasa de E. coli I, fragmento Klenow de ADN polimerasa I, ADN polimerasa T , ADN polimerasas termoestables aisladas de Thermus aquaticus (Taq) , disponibles de una variedad de fuentes (por ejemplo, Perkin Elmer) , Thermus thermophilus (United States Biochemicals ) , Bacillus stereotlaermophilus (Bio-Rad) o Thermococcus litoralis ("Vent" polymerase, New England Biolabs) . Esto da por resultado dos "productos largos", los cuales contienen los cebadores respectivos en sus extremos 5' enlazados covalentemente a los complementos recientemente sintetizados de las cadenas originales. La mezcla de reacción entonces se regresa a las condiciones de polimerización, por ejemplo, al disminuir la temperatura, inactivar un agente de desnaturalización o adicionar más polimerasa y se inicia un segundo ciclo. El segundo ciclo proporciona las dos cadenas originales, los dos productos largos del primer ciclo, dos nuevos productos largos replicados de las cadenas originales y dos "productos cortos" replicados de los productos largos. Los productos cortos tienen la secuencia de la secuencia objetivo con un cebador en cada extremo. En cada ciclo adicional, se producen dos productos largos, adicionales y una variedad de productos cortos iguales al número de productos largos y cortos que permanecen en el extremo del ciclo previo. De esta manera, el número de productos cortos que contienen la secuencia objetivo crece exponencialmente con cada ciclo. Preferiblemente, la PCR se lleva a cabo con un ciclador térmico comercialmente disponible, por ejemplo, Perkin Elmer.

Los ARNs pueden ser amplificados mediante la transcripción inversa del ARNm en ADNc y luego al realizar la PCR (RT-PCR) , como se describiera anteriormente. Alternativamente, se puede utilizar una enzima individual para ambos pasos como se describe en la patente norteamericana No. 5,322,770. El ARNm también puede ser transcrito de manera inversa en el ADNc, seguido por la reacción en cadena de ligasa de espacio asimétrico (RT-AGLCR, por sus siglas en inglés) como se describe por Marshall y colaboradores, (1994) PCR Meth. App. 4: 80-84. El ensayo de nucleasa 5' fluorogénica, conocido como el ensayo Taq anMR (véase, por ejemplo, Holland y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1991) 88:7276-7280), es un sistema de detección basado en PCR poderoso y versátil para los objetivos de ácido nucleico. Por lo tanto, los cebadores y las sondas derivados de regiones conservadas del genoma del WNV descritas en este texto se pueden utilizar en los nuevos análisis TaqManMR para detectar la presencia del WNV en una muestra biológica. El análisis se realiza en conjunto con la ciclación térmica al supervisar la generación de señales fluorescentes. El sistema de ensayo elimina la necesidad del análisis electroforético en gel y tiene la capacidad de generar datos cuantitativos que permiten la determinación de números de copias objetivo. Por ejemplo, se pueden producir curvas estándar utilizando diluciones en serie de suspensiones virales previamente cuantificadas del WNV. Se puede producir una gráfica estándar con números de copias de cada miembro del panel contra los cuales se pueden comparar las muestras desconocidas. El ensayo de nucleasa 5' fluorogénica se realiza convenientemente utilizando, por ejemplo, la ADN polimerasa AmpliTaq GoldMR, la cual tiene actividad de nucleasa 5' endógena, para digerir una sonda de oligonucleótido interna etiquetada con tanto un tinte reportero, fluorescente como un apagador (véase, Holland y colaboradores, Froc. Nati, Acad. Sel. EUA3 (1991) 8_8: 7276-7280; y Lee y colaboradores, Nucí. Acids Res. (1993) 2_1 : 3761-3766) . Los resultados del ensayo se detectan al medir los cambios en la fluorescencia que ocurren durante el ciclo de amplificación a medida que la sonda fluorescente es digerida, desacoplar las etiquetas de tinte y apagador y causar un incremento en la señal fluorescente que es proporcional a la amplificación del ácido nucleico obj etivo . Los productos de amplificación se pueden detectar en solución o utilizando soportes sólidos. En este método, la sonda TaqManMR está diseñada para hibridizarse con una secuencia objetivo dentro del producto de PCR deseado. El extremo 5' de la sonda TaqManMR contiene un tinte reportero, indicador fluorescente. El extremo 3' de la sonda es bloqueado para impedir la extensión de la sonda y contiene un tinte que apagará la fluorescencia del fluoroforo 5' . Durante la amplificación subsecuente, la etiqueta fluorescente 5' es escindida si está presente en la reacción una polimerasa con actividad de exonucleasa 5' . La escisión del fluoroforo 5' da por resultado un incremento en la fluorescencia que se puede detectar. Las sondas etiquetadas, representativas incluyen las sondas de las SEC ID NOS: 36, 39, 44 y 49. Para una descripción detallada del ensayo TaqManMR, los reactivos y las condiciones para el uso en el mismo, véase, por ejemplo, Holland y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci, E.Ü.A. (1991) 8¡3_: 7276-7280; las patentes norteamericanas Nos. 5,538,848, 5,723,591 y 5,876,930. Por consiguiente, la presente invención se refiere a métodos para amplificar una secuencia de nucleótidos del WNV objetivo utilizando una polimerasa de ácido nucleico que tiene actividad de nucleasa 5' a 3' , uno o más cebadores capaces de hibridizarse con la secuencia objetivo del WNV y una sonda de oligonucleótido capaz de hibridizarse con la secuencia objetivo del WNV 3' con relación al cebador. Durante la amplificación, la polimerasa digiere la sonda de oligonucleótido cuando es hibridizada con la secuencia objetivo, para separar con lo cual la molécula reportera de la molécula del apagador. A medida que se conduce la amplificación, la fluorescencia de la molécula reportera se supervisa, con la fluorescencia que corresponde a la ocurrencia de la amplificación de ácido nucleico. La molécula informadora es preferiblemente un tinte de fluoresceína y la molécula del apagador es preferiblemente un tinte de rodamina . Mientras que la longitud de los cebadores y las sondas puede variar, las secuencias de las sondas se seleccionan de tal manera que tengan una temperatura de fusión más alta que las secuencias de los cebadores. Preferiblemente, las secuencias de las sondas pueden tener una temperatura de fusión estimada que sea aproximadamente 10°C superior a aquella de la temperatura de fusión para las secuencias de cebadores de amplificación. Por lo tanto, las secuencias de cebadores son generalmente más cortas que las secuencias de las sondas. Típicamente, las secuencias de cebadores están en el rango de entre 10-75 nucleótidos de largo, más típicamente en el rango de 20-45. La sonda típica está en el rango de entre 10-50 nucleótidos de largo, más típicamente de 15-40 nucleótidos de longitud. Las secuencias del WNV descritas en este texto también se pueden utilizar como una base para los ensayos de amplificación mediada por la transcripción (TMA) . La TMA proporciona un método para identificar las secuencias de ácido nucleico objetivo que están presentes en cantidades muy pequeñas en una muestra biológica. Estas secuencias pueden ser difíciles o imposibles para detectarse utilizando métodos de ensayo directos. En particular, la TMA es un sistema de amplificación de objetivos- de ácido nucleico autocatalitico, isotérmico que puede proporcionar más de mil millones de copias de ARN de una secuencia objetivo. El ensayo se puede hacer cualitativamente, para detectar de manera precisa la presencia o ausencia de la secuencia objetivo en una muestra biológica. El ensayo también puede proporcionar una medida cuantitativa de la cantidad de secuencia objetivo sobre un rango de concentración de varios órdenes de magnitud. La TMA proporciona un método para sintetizar de manera autocatalitica múltiples copias de una secuencia de ácido nucleico objetivo sin la manipulación repetitiva de las condiciones de reacción, tales como la temperatura, intensidad iónica y pH. Generalmente, la TMA incluye los siguientes pasos: (a) aislar el ácido nucleico, inclusive el ARN, de la muestra biológica de interés que se sospecha que está infectada con el NV; y (b) combinar en una mezcla de reacción (i) el ácido nucleico aislado, (ii) el primero y el segundo cebadores de oligonucleótidos, el primer cebador que tiene una secuencia formadora de complejos suficientemente complementaria para la porción terminal 3' de una secuencia objetivo de ARN, si está presente (por ejemplo la cadena (+) ) , para formar complejos con la misma y el segundo cebador que tiene una secuencia formadora de complejos suficientemente complementaria para la porción terminal 3' de la secuencia objetivo de su complemento (por ejemplo, la cadena (-) ) para formar complejos con la misma, en donde el primer oligonucleótido comprende además una secuencia 5' con respecto a la secuencia formadora de complejos que incluye un promotor, (iii) una transcriptasa inversa o ADN polimerasas dependientes del ARN y ADN, (iv) una actividad enzimática que degrada selectivamente la cadena de ARN de un complejo de ARN-ADN (tal como una ARNsa H) y (v) una ARN polimerasa que reconoce al promotor. Los componentes de la mezcla de reacción se pueden combinar gradualmente o la vez . La mezcla de reacción se incuba bajo condiciones mediante las cuales se forma una secuencia de oligonucleótido/obj etivo, que incluyen las condiciones de cebado de ADN síntesis y la de ácido nucleico (que incluyen trifosfatos de ribonucleótidos y trifosfatos de desoxirribonucleótidos) durante un periodo de tiempo suficiente para proporcionar múltiples copias de la secuencia objetivo. La reacción toma lugar de manera ventajosa bajo condiciones adecuadas para mantener la estabilidad de los componentes de reacción, tal como las enzimas componentes y sin requerir la modificación o manipulación de las condiciones de reacción durante el curso de la reacción de amplificación. Por consiguiente, la reacción puede tomar lugar bajo condiciones que son sustancialmente isotérmicas e incluyen una intensidad iónica y pH sustancialmente constantes. La reacción no requiere convenientemente un paso de desnaturalización para separar el complejo de ARN-ADN producido por la primera reacción de extensión de ADN. Las ADN polimerasas adecuadas incluyen las transcriptasas inversas, tales como la transcriptasa inversa del virus de mieloblastosis aviaria (A V) (disponible de, por ejemplo, Seikagaku America, Inc.) y transcriptasa inversa del virus de leucemia de murino Moloney (MMLV) (disponible de, por ejemplo, Bethesda Research Laboratories). Los promotores o secuencias promotoras adecuados para la incorporación en los cebadores son secuencias de ácido nucleico (ya sea de origen natural, producidas sintéticamente o un producto de una digestión de restricción) que son reconocidas específicamente por una ARN polimerasa que reconoce y se une a esa secuencia e inicia el proceso de transcripción medite el cual se producen transcripciones ARN. La secuencia puede incluir opcionalmente bases de nucleótidos que se extienden más allá del sitio de reconocimiento real de la ARN polimerasa que puede proporcionar una estabilidad o susceptibilidad adicionada a los procesos de degradación o una eficacia de transcripción incrementada. Los ejemplos de promotores útiles incluyen aquellos que son reconocidos por ciertas polimerasas de bacteriófagos, tales como aquellas del bacteriófago T3, T7 o SP6 o un promotor de E. coli. Estas ARN polimerasas son fácilmente disponibles de fuentes comerciales, tales como New England Biolabs and Epicentre. Algunas de las transcriptasas inversas adecuadas para el uso en los métodos descritos en este texto tienen actividad de RNAsa H, tal como la transcriptasa inversa del A V. Sin embargo, puede ser preferible adicionar RNAsa H exógena, tal como RNAsa H de E. coli, aún cuando se utiliza la transcriptasa inversa del AMV. La RNAsa H es fácilmente disponible de, por ejemplo, Bethesda Research Laboratories. Las transcripciones de ARN producidas por estos métodos pueden servir como plantillas para producir copias adicionales de la secuencia objetivo a través de los mecanismos descritos anteriormente. El sistema es autocatalitico y la amplificación ocurre de manera autocatalitica sin la necesidad de modificar o cambiar repetidamente las condiciones de reacción, tales como la temperatura, pH, intensidad iónica o similares. La detección se puede hacer utilizando una amplia variedad de métodos, que incluyen la secuenciación directa, hibridización con oligómeros específicos para la secuencia, electroforesis de gel y espectrometría de masas. Estos métodos pueden utilizar formatos heterogéneos u homogéneos, etiquetas isotópicas y no isotópicas, así como también pueden no utilizar etiquetas en absoluto. ün método preferible de detección es el uso de sondas de oligonucleótidos especificas para la secuencia objetivo que se describen anteriormente. Las sondas se pueden utilizar en los ensayos de protección de hibridizacion (HPA, por sus siglas en inglés) . En esta modalidad, las sondas son etiquetadas convenientemente con éster de acridinio (AE) , una molécula altamente quimioluminescente . Véase, por ejemplo, Nelson y colaboradores, (1995) "Detection of Acridinium Esters by Chemiluminescence" en Nonisotopic Prohing, Blotting and Sequencing, Kricka L. J. (ed) Academic Press, San Diego, CA; Nelson y colaboradores, (1994) "Application of the Hybridization Protection Assay (HPA) to PCR" en The Polynzerase Chain Reaction, Mullís y colaboradores, (eds.) Birkhauser, Boston, MA; Weeks y colaboradores, Clin. Chem. (1983) 29:1474-1479; Berry y colaboradores, Clin. Chem. (1988) 3_4 :2087-2090. Una molécula de AE se une directamente a la sonda utilizando una química de brazo ligante no basados en nucleótidos que permite la colocación de la etiqueta en cualquier ubicación dentro de la sonda. Véase, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 5,585,481 y 5,185,439. La quimioluminiscencia es desencadena por la reacción con peróxido de hidrógeno alcalino, el cual produce una N-metil-acridona excitada que colapsa subsecuentemente al estado fundamental con la emisión de un fotón. Cuando la molécula de AE se une covalentemente a una sonda de ácido nucleico, la hidrólisis es rápida bajo condiciones ligeramente alcalinas. Cuando la sonda etiquetada con AE es exactamente complementaria al ácido nucleico objetivo, la velocidad de la hidrólisis de AE se reduce grandemente. De esta manera, la sonda etiquetada con AE hibridizada y no hibridizada se puede detectar directamente en solución, sin la necesidad de una separación física. El HPA consiste generalmente de los siguientes pasos: (a) la sonda etiquetada con AE es hibridizada con el ácido nucleico objetivo en solución durante aproximadamente 15 a aproximadamente 30 minutos. Entonces se adiciona una solución ligeramente alcalina y el AE acoplado a la sonda no hibridizada se hidroliza. Esta reacción toma aproximadamente 5 a 10 minutos. El AE asociado con el híbrido restante se detecta como una medida de la cantidad de objetivo presente. Este paso toma aproximadamente 2 a 5 segundos. Preferiblemente, el paso de hidrólisis diferencial se conduce a la misma temperatura como el paso de hibridización, típicamente de 50 a 70 °C. Alternativamente, un segundo paso de hidrólisis diferencial se puede conducir a temperatura ambiente. Esto permite que se utilicen pH elevados, por ejemplo en el rango de 10-11, lo cual produce diferencias más grandes en la velocidad de hidrólisis entre la sonda etiquetada con AE hibridizada y no hibridizada. El HPA se describe en detalle en, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 6,004,745; 5,948,899; y 5,283,174.

El ??? se describe en detalle en, por ejemplo, la patente norteamericana No-. 5,399,491. En un ejemplo de un ensayo típico, una muestra de ácido nucleico aislada, que se sospecha que contiene una secuencia objetivo del NV, se mezcla con un concentrado de amortiguador que contiene el amortiguador, sales, magnesio, trifosfatos de nucleótidos, cebadores, ditiotreitol y espermidina. La reacción se incuba opcionalmente a aproximadamente 100°C durante aproximadamente dos minutos para desnaturalizar cualquier estructura secundaria. Después del enfriamiento a temperatura ambiente, se adiciona la transcriptasa inversa, la ARN polimerasa y la RNAsa H y la mezcla se incuba durante dos a cuatro horas a 37 °C. La reacción entonces se puede someter a ensayo mediante la desnaturalización del producto, la adición de una solución de sonda, la incubación durante 20 minutos a 60°C, la adición de una solución para hidrolizar de manera selectiva la sonda no hibridizada, la incubación de la reacción durante seis minutos a 60 °C y la medición de la quimioluminiscencia restante en un luminímetro. En otro aspecto de la invención, se realizan dos o más de las pruebas descritas anteriormente para confirmar la presencia del organismo. Por ejemplo, si la primera prueba utilizó la amplificación mediada por la transcripción ( A, por sus siglas en inglés) para amplificar los ácidos nucleicos para la detección, entonces se realiza un ensayo de prueba de ácido nucleico alternativo (NAT, por sus siglas en inglés) , por ejemplo, mediante el uso de la amplificación de PCR, RT PCR y similares, como se describe en este texto. De esta manera, el NV se puede detectar especifica y selectivamente aún cuando la mezcla contiene otros organismos, tal como HIV y parvovirus B19, por ejemplo. Como es fácilmente aparente, el diseño de los ensayos descritos en este texto está sujeto a una gran cantidad de variación y se conocen muchos formatos en el campo. Las descripciones anteriores se proporcionan únicamente como una guia y una persona experta en el campo pueden modificar fácilmente los protocolos descritos, utilizando técnicas bien conocidas en el campo. Los reactivos de ensayo descritos anteriormente, inclusive los cebadores, sondas, soporte sólido con sondas unidas, asi como también otros reactivos de detección, se pueden proporcionar en equipos, con instrucciones adecuadas y otros reactivos necesarios, a fin de conducir los ensayos como se describiera anteriormente. El equipo contendrá normalmente en recipientes separados, la combinación de cebadores y sondas (ya sea, ya unidos a una matriz sólida o separados con reactivos para unirlos a la matriz) , formulaciones control (positivas y/o negativas), reactivos etiquetados cuando el formato del ensayo requiere reactivos iguales y generadores de señales (por ejemplo, substrato de enzima) si la etiqueta no genera directamente una señal. Las instrucciones (por ejemplo, escritas, en cinta magnética, VCR, CD-ROM, etcétera) para llevar a cabo el ensayo serán incluidas usualmente en el equipo. El equipo también puede contener, dependiendo del ensayo particular que se utiliza, otros reactivos y materiales empacados (es decir, amortiguadores de lavado y similares) . Los ensayos estándar, tales como aquellos descritos anteriormente, se pueden conducir utilizando estos equipos.

III . Experimental A continuación se encuentran ejemplos de modalidades especificas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen para propósitos ilustrativos únicamente y no se proponen para limitar de ninguna manera el alcance de la presente invención. Se han hechos esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etcétera) , pero, por supuesto, se debe permitir algún error experimental y desviación. En los siguientes ejemplos, las enzimas se adquirieron de fuentes comerciales y se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los filtros de nitrocelulosa y similares también se adquirieron de fuentes comerciales .

En el aislamiento de los fragmentos de ADN, excepto donde se observa, todas las manipulaciones de ADN se hicieron de acuerdo con procedimientos estándar. Véase, Sambrook y colaboradores, supra. Las enzimas de restricción ADN ligasa T4, ADN polimerasa I de E. coli, fragmento Klenow y otros reactivos biológicos, se pueden adquirir de proveedores comerciales y se utilizan de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los fragmentos de ADN de doble cadena se separaron en geles de agarosa. Ejemplo 1 Extracción del ARN del WNV de la Muestra Biológica El cultivo de tejido positivo en el ácido nucleico del WNV se adquirió de Boston Biomedica, Inc. Se utilizaron dos planteamientos para aislar el ácido nucleico de 0.5 mi de muestra. En particular, el ARN se extrajo mediante (a) la unión a sílice; y (b) la hibridización a oligonucleótidos específicos para el objetivo. (a) Aislamiento del ácido nucleico mediante la unión a sílice. En general, se siguió el método descrito por Boom y colaboradores, (1990) J. Clin. Miczobiol. 28: 495-503. En presencia de altas concentraciones de sal caotrópica, tal como isotiocianato de guanidinio, los ácidos nucleicos se unen al sílice. Los ácidos nucleicos de tamaño pequeño se unen más eficientemente al sílice bajo condiciones de pH ácido. Los ácidos nucleicos unidos son eluidos eficientemente en una sal baja, amortiguador de pH alcalino a temperaturas altas. La sustitución del sílice magnetizado por sílice regular facilita grandemente los pasos de lavado y elusión del aislamiento de ácido nucleico. De esta manera, se utilizó una base magnética para capturar las partículas de sílice unidas al ácido nucleico, eliminando de esta manera las centrifugaciones requeridas para sedimentar las partículas de sílice regulares. El amortiguador de lisis utilizado fue de Organon-Teknika (Durham, NC) . Este amortiguador de lisis contuvo isotiocianato de guanidinio para solubilizar las proteínas e inactivar las RNasas y DNasas y el Tritón X-100. El detergente Tritón X-100 facilitó adicionalmente el proceso de solubilización y desintegración de la estructura celular y las proteínas nucleares, liberando de esta manera el ácido nucleico. En particular, el WNV cultivado se diluyó en serie utilizando suero de Seracure (Ocean Side, CA) . Previo a las alícuotas, se utilizaron 9.0 mi del reactivo de lisis para extraer el ARN de 0.5 mi del suero positivo en WNV (105/ml) . El sílice magnetizado (MagPrep particles, Novagen, -Vil) se sustituyó por sílice regular y se utilizó una base magnética para capturar las partículas de sílice unidas al ácido nucleico, eliminando de esta manera las centrifugaciones requeridas para sedimentar las partículas de sílice regular.

Los ácidos nucleicos unidos se eluyeron en 50 µ? de Tris 10 niM, pH 8.0, que contiene EDTA 1 mM. Después del aislamiento del ácido nucleico, se determinó la presencia del WNV al realizar la RT-PCR TaqManMR, como se describe posteriormente. (b) Aislamiento de ácido nucleico mediante la hibridización con los oligonucleótidos específicos para el objetivo Aunque el uso de sílice magnetizado facilita grandemente la manipulación rápida y fácil durante los pasos de lavado y elusión, el aislamiento del ácido nucleico es aún laborioso y consumidor de tiempo. Por lo tanto, se utilizó la captura de un paso del objetivo de ácido nucleico específico del plasma o suero utilizando perlas magnéticas. A fin de hacer esto aplicable para una amplia variedad de pruebas de captura de ácido nucleico viral, se utilizaron perlas magnéticas, genéricas acopladas con el oligo dT . Las perlas de oligo (dT) magnéticas Sera-Mag (Seradyn, Indianápolis, IN) con una longitud de oligo dT de aproximadamente 14 pares de bases, se utilizaron en combinación con los oligonucleótidos de captura que contenían de 21-24 poli A' s en el extremo 3' contiguo a la secuencia específica del WNV utilizada (designada en el extremo de la secuencia específica posteriormente) . Las perlas magnéticas se suspendieron en 0.4 mi de amortiguador de lisis, el cual contuvo 200 µ? de amortiguador de lisis Organon-Teknika (Durham, NC) (véase, ejemplo 1(a)) y 200 µ? de amortiguador de -lisis 2X que contenia EDTA 10 mM, Tritón X-102 al 2%, Hepes 100 mM, pH 7.5, LiCl2 2.0 M. Un amortiguador de lisis alternativo incluyó un amortiguador de lisis que contuvo 200 µ? de amortiguador de lisis Promega (Madison, WI) y 200 µ? de amortiguador de lisis 2X que contenia EDTA 10 mM, Tritón X-102 al 2%, Hepes 100 mM pH 7.5, LiCl2 2.0 M. Otro amortiguador de lisis incluyó 400 µ? de EDTA 5 mM, Tritón X-102 al 1%, Hepes 50 mM, pH 7.5, LiCl2 2.0 M y tiocianato de guanidinio 5.0 M. Los cebadores de captura se sometieron a prueba individualmente o en combinación, para capturar 100 copias/ml de ARN del WNV. Después de la captura, las perlas se lavaron tres veces con un amortiguador de lavado de Hepes 10 mM (pH 7.5), NP-40 al 0.5% que contenia NaCl 0.3 M. Las perlas con el ácido nucleico capturado se suspendieron en 100 µ? de reactivo de RT-PCR de un paso TaqManMT y se transfirieron a una placa de microtitulo de RT-PCR TaqManMR para la detección mediante la PCR TaqManMR como se describe posteriormente. Varias combinaciones de oligonucleótidos fueron eficientes en la captura del WNV como se detectó por el ensayo TaqManMR. Los oligonucleótidos de captura utilizados fueron como sigue (la numeración indicada al final de la secuencia corresponde a la posición dentro del genoma del WNV, con relación al número de acceso de NCBI AF196835) : V VCl-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagcacatgiatcccacatccattg (nt578-600) (SEC ID NO:18) VWNVC2-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaactctgacaatgcataggttcttt (nt 555-577) (SEC ID NO:19) VW VC3-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaccagcagctgttggaatcgtg (nt 534-554) (SEC ID NO:20) VW VC4-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaatgacatctgtgacgtcagtagc (nt 511-532) (SEC ID NO:21) VWNVC5-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaatttaccgtcatcatcaccttccc (nt 487-509) (SEC ID NO:22) VWNVC6-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaattggaagttagagagggtaactg (nt 464-486) (SEC ID NO:23) VWNVC7-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaactcctacgctggcgatcaggcc (nt 442-463) (SEC ID NO:24) VWNVC8-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaatcatgactgcaattccggtcttt (nt 421-441) (SEC ID NO:25) V NVC9-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagagctccgccgattgatagca (nt 375-395) (SEC ID NO:26) VWNVClO-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaactggtcaaggtccctagttcc (nt 354-374) (SEC ID NO:27) VWNVCll-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaattcttaaaactcagaaggtKtttca (nt 329-353) (SEC ID NO:28) VW VC12-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaatogctgtttgtttgttcacacctc (nt 305-328) (SEC ID NO:29) VWNVC13-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaatccatcgatccagcactgctcgggtc (nt 279-304) (SEC ID NO:30) V NVC14-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaggagcaattgctgtgaacctgaa (nt 256-278) (SEC ID NO:31) VWNVC15-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagaacgccaagagagccaacac (nt 235-255) (SEC ID NO:32) VWNVC16-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaatcgtattggccccttgccgtcg (nt 210-234) (SEC ID NO:33) VWNVC45- gtccacctcttgcgaaggacaaaaaaaaaaaa (SEC ID NO:47) (nt 3592-3612) VWNVC46- otgtgccgtgtggctggttgtaaaaaaaaaaaa (SEC ID NO:48) (nt 10,967-10,988) VWNVC18- cctagtctatcccaggtgtcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa (SEC ID NO:51) (nt 10,931-10,950) Ejemplo 2 Detección y Cuantificación de Acido Nucleico del WNV Mediante TaqManMR La tecnología TaqManMR se utilizó para amplificar el objetivo capturado como ADN. Para esta amplificación, se derivaron tres conjuntos de oligonucleótidos de regiones conservadas dentro del la cápside (VWNVA1-VWNVA3 ) , 3'UTR (VWNVA4-VWNVA6) y la región NS1/NS2 (VWNVA7-VWNVA9 ) del genoma del WNV. Los conjuntos de cebadores y sondas fueron como sigue (la numeración indicada al final de la secuencia corresponde a la posición dentro del genoma del WNV, con relación al número de acceso de NCBI AF196835) : VWNVAl-CCGGGCTGTCAATATGCTAAA (Cebador de sentido-ntl29-149) (SEC ID NO: 34) VWNVA2-AGCCCTCTTCAGTCCAATCAAG (Cebador antisentido-ntl74-195 ) (SEC ID NO:35) VWNVA3-xCGGAATGCCCCGCGTGTTGz ( Sonda-ntl53-171 ) (SEC ID NO:36) Una segunda sonda también se puede utilizar en combinación con 'la primera sonda a fin de compensar la variación de cepas y proporcionar capacidades de detección mayores . Una segunda sonda representativa tiene la siguiente secuencia : x-CGGTATGCCCCGCGGATTG-z (Sonda-nt 153-171) (SEC ID NO: 9) V NVA4-CAGACCACGCTACGGCG (Cebador de sentido-ntl0668-10684) (SEC ID NO:37) VWNVA5-CTAGGGCCGCGTGGG (Cebador antisentido-ntl0756- 10770) (SEC ID NO:38) VWNVA6-xTCTGCGGAGAGTGCAGTCTGCGATz (Sonda-ntl0691-10714) (SEC ID NO:39) VNVA7-TCTGCTCTTCCTCTCCGTGAA (Cebador de sentido-nt2 39-2460) (SEC ID NO:42) VWNVA8-CTCTTGCCGGCTGATGCTAT (cebador antisentido-nt2485-2506) (SEC ID NO:43) VWNVA9-xTGCACGCTGACACTGGGTGTGCz (Sonda-nt2462-2484) (SEC ID NO: 44) En las secuencias anteriores, x = 6-FA y z = ligante más TAMRA. Los reactivos par-a el análisis TaqManMR se obtuvieron de Applied Biosystems, Foster Citv, CA. El ácido nucleico del ejemplo 1(a) en un volumen de 47 µ? se utilizó en el ensayo TaqMan^ en un volumen total de 100 µ? mediante la adición de reactivo de mezcla maestra de la RT-PCR de un paso 2X que contenia 0.4 pmol de la sonda. Alternativamente, 100 µ? del reactivo de mezcla maestra de la RT-PCR de un paso IX que contenia 1 pmol de cada uno de los cebadores de amplificación y 0.4 pmol de la sonda, se adicionó a un objetivo capturado en las perlas magnéticas y la suspensión se transfirió a una placa de microtitulo TaqMan^. Las condiciones de reacción fueron 48 °C durante 30 minutos para la reacción RT, 10 minutos a 95 °C para activar la enzima seguido por 50 ciclos de 30 segundos a 95°C, alternando con 1 minuto a 60°C en un detector de secuencias ABI 7900. Se utilizaron los dos conjuntos de oligonucleótidos descritos anteriormente. Utilizando el protocolo del objetivo con los cebadores de captura y la tecnología de RT-PCR TaqManMR, se pudo detectar una cantidad tan pequeña como 10 copias del obj etivo . Se preparó una transcripción de control interno de 967 pares de bases, figure 2 (SEC ID NO: 17), la cual se puede capturar mediante los oligonucleótidos de captura y se puede amplificar por VWNAV1 y VWNAV2 pero con una secuencia de unión de sondas alterada. El control interno se utiliza para determinar los negativos falsos. Las letras en negrita en la secuencia representada en la figura 2 representan la secuencia en el IC que reemplaza la secuencia en el objetivo. La secuencia de la sonda para el IC es xCAGTGACATGCAGGTCTAGCTz (SEC ID NO: 40) o xCCCAGTGACATGCAGGTCTAGC z (SEC ID NO: 41) donde x = TET y z = ligante + TAMRA. Ejemplo 3 Prueba de Eficacia de Amplificación El ARN del WNV aislado mediante la unión a sílice se amplificó en el ensayo TaqManMR y se detecto utilizando los métodos, cebadores y sondas descritos anteriormente. Típicamente, las señales de las muestras realizadas <45 ciclos en un umbral de <0.2 se consideraron positivas. La tabla 1 detalla los resultados. Tabla 1 Región Ct Ct Cápside 32.43 Promedio=32.56 32.63 Desv. Est.=0.11 32.61 % de CV=0.34 NS1/NS2 33.90 Promedio=33.31 32.93 Desv. Est.=0.52 33.10 % de CV=1.56 3'UTR 32.97 Promedio=33.43 33.76 Desv. Est.=0.41 33.56 % de CV=1.22 De las tres regiones, la amplificación de la cápside se detectó primero y, por lo tanto, fue la más robusta . En experimentos adicionales, se utilizaron los reactivos de Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA) . En particular, estos experimentos utilizaron el sistema de RT-PCR cuantitativa de un paso Invitrogen Superscript III Platinum. El ácido nucleico del ejemplo 1(a) se suspendió en 100 µ? de una mezcla de reacción que contenia 2 µ? de la mezcla Superscript IIIRT/Platinum Taq, 50 µ? de la mezcla de reacción 2X, MgS04 4 m , 2 µ? de ROX, 1 pmol de cebadores de amplificación y 0.25 pmol de las sondas. Las perlas suspendidas se transfirieron a una placa de microtitulo TaqManMR. Las condiciones de reacción fueron 50°C durante 15 minutos para la reacción RT, seguido por 95°C durante 2 minutos para desnaturalizar el anticuerpo de polimerasa Taq, seguido por 50 ciclos de incubaciones alternantes a 95 °C durante 15 segundos y 60 °C durante 1 minuto. Utilizando el protocolo de los cebadores de captura objetivo y la tecnología de RT-PCR TaqManMR-superscript, se observó 100% de detección de 7.5 copias/ml (Cps/ml) de ARN del WNV (véase, tabla 2) . · Tabla 2 N = 12; Un miembro del panel de calificación de ARN del WNV de BBI , QWN702 (comercialmente disponible de BBI Diagnostics, Boston, MA, véase posteriormente) se diluyó en suero humano deslipidado, de fibrinado, a la dilución requerida. Ejemplo 4 Sensibilidad del Ensayo de Dos Sondas La sensibilidad del ensayo de dos sondas que utiliza los pares de cebadores VWNVA1 (SEC ID NO: 34) y VWNVA2 (SEC ID NO: 35) y la sondas de la SEC ID NO: 36 y la SEC ID NO: 49, se sometió a prueba. La sonda de la SEC ID NO: 36 se dirige contra la cepa principal del WNV norteamericano y la sonda de la SEC ID NO: 49 se dirige contra la cepa principal de Uganda. El ARN de control interno de la SEC ID NO: 17 (figure 2) y la sonda de IC (SEC ID NO: 41) también se incluyeron, ün miembro del panel de BBI de 10,000 Gps/ml (comercialmente disponible de BBI Diagnostics, Boston, MA) se diluyó en serie para la prueba por triplicado como se describiera anteriormente para establecer la sensibilidad analítica del ensayo. En este ensayo, una lectura de >45 Ct se consideró negativa. Los resultados se muestran en la tabla 3. Tabla 3 Objetivo Linaje BBI 702 1-EUA Linaje BBI 701 2-üganda Hubo 100% de positividad en 39 cps/ml para ambos linajes. El ensayo fue altamente sensible y fue capaz de detectar 30 cps/ml. Ejemplo 5 Métodos para Cultivar e Inactivar el WNV Se desarrollaron métodos mejorados para preparar el WNV en un cultivo celular y procedimientos para la inactivación térmica. El virus inactivado se puede utilizar como un control en los ensayos de diagnóstico y detección. Por ejemplo, el ARN viral en virus cultivados se puede cuantificar utilizando estándares estabilizados y se puede utilizar a fin de preparar curvas estándar para ensayos cuantitativos. A. Infección de células Vero con WNV: Las células Vero (ATCC CCL-81) se desarrollaron en Medio Esencial Mínimo de Eagle (EMEM) , 100 U de Penicilina/ml, 100 µg/ml de Estreptomicina, 10 µ9/p?1 de Fungizona, complementado con suero bovino fetal al 10% (FBS, por sus siglas en inglés) en C02 al 5%, a 37 °C. Una monocapa de células Vero subconfluentes se infectó con la cepa de virus del Nilo Occidental 385-99 en un matraz T75. Las células se incubaron durante 1 hora a 37 °C, en una mezcla de aire humidificado de C02 al 5% y el matraz se agitó cada 15 minutos. Entonces, el medio de mantenimiento (FBS al 2%, EMEM, Penicilina/Estreptomicina/Anfotericina) se adicionó y las células se incubaron adicionalmente . Tres días después de la infección, fue evidente un fuerte efecto citopático por el redondeo de las células y la muerte de las células. El sobrenadante de cultivo de células se colectó, se centrifugo durante 15 minutos a 900 x g a RT para remover los restos de células y la suspensión del WNV se congeló a -70 °C. B. Inactivación del WNV: La suspensión del WNV se trató con calor durante 30 minutos a 56°C o 65 minutos a 62.5-65 °C, se enfrió rápidamente durante 15 minutos en un baño de agua helada, se centrifugó durante 15 minutos a 900 x g a 4°C y se almacenó a -70°C. La inactivación del WNV se controló y no se observó la formación adicional de placas en un ensayo de formación de placas, asi como también no se observó infectividad de la suspensión del WNV en una monocapa de células Vero. C. Cuantificación del WNV Cultivado en Células Vero Un panel de siete miembros se preparó mediante la dilución en serie de la suspensión viral del WNV propagado en células Vero como se describiera anteriormente. El número de copias de cada uno de estos miembros del panel se estabilizó utilizando el panel de cuantificación del ARN del WNV, QWN702, comercialmente disponible de BBI Diagnostics, Boston, MA. El panel consiste de 15 miembros que varían de 10,000-30 copias/mi del WNV cultivado en células Vero. Los miembros del panel se sometieron a ensayo por triplicado para obtener una gráfica estándar. Las muestras vivas, así como también las muestras inactivadas como se describiera anteriormente, se sometieron a prueba por triplicado y los resultados se muestran en la tabla 4. El rango representa los resultados de dos versiones de la gráfica estándar obtenidos con los miembros del panel de BBI. Los resultados también se expresan como copias/pfu en base a la determinación de pfu, la cual fue 7.07 x 107 pfu/ml (1 pfu= -1000 copias) .

Tabla 4 WNV Vivo WNV Inactivado con Calor Por consiguiente, se han descrito secuencias novedosas del WNV y ensayos de detección que utilizan estas secuencias. ? partir de lo anterior, se apreciará que, aunque las modalidades especificas de la invención se han descrito en este texto para propósitos de ilustración, se pueden hacer varias modificaciones sin desviarse del espíritu y alcance de la misma. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un oligonucleótido aislado con una longitud no mayor que 60 nucleótidos, caracterizado, porque comprende: (a) una secuencia de nucleótidos de al menos 10 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 1-16, 34, 35, 37, 42, 43, 45, 46, 50 y 52-55; (b) una secuencia de nucleótidos que tiene 90% de identidad de secuencias con una secuencia de nucleótidos de (a) ; o (c) complemento de (a) y (b) .

2. El oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el oligonucleótido es una secuencia de nucleótidos de al menos 10 nucleótidos contiguos de una secuencia selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 1-16, 34, 35, 37, 42, 43, 45, 46, 50 y 52-55.

3. El oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 1-16, 45, 46 y 50.

4. El oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 1-16, 45, 46 y 50.

5. El oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 34, 35, 37, 38, 42 y 43.

6. El oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 34, 35, 37, 38, 42 y 43.

7. Un oligonucleótido etiquetado con una longitud no mayor que 60 nucleótidos, caracterizado porque comprende: (a) una secuencia de nucleótidos de al menos 10 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 52, 53, 54 y 55; (b) una secuencia de nucleótidos que tiene 90% de identidad de secuencias con una secuencia de nucleótidos de (a) ; o (c) complementos de (a) y (b) .

8. El oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el oligonucleótido es una secuencia de nucleótidos de al menos 10 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 52, 53, 54 y 55.

9. El ol igonucleót ido de conformidad con cualquiera de las - reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque además comprende una etiqueta detectable en el extremo 5' y/o el extremo 3' .

10. El oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la etiqueta detectable es una etiqueta fluorescente seleccionada del grupo que consiste de 6-carboxifluor es ceina (6-FAM) , tetrametilrrodamina (TAMRA) y 2', 4', 5', 7'-tetracloro-4-7-diclorofluoresceina (TET) .

11. El oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el oligonucleótido se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 36, 39, 44 y 45.

12. ün método para detectar la presencia del virus del Nilo Occidental (WNV) en una muestra biológica, el método está caracterizado porque comprende los pasos que consisten en: aislar ácidos nucleicos de una muestra biológica que se sospecha que contiene el WNV; amplificar los ácidos nucleicos utilizando un cebador de sentido o antisentido en donde cada uno de los cebadores tiene una longitud no mayor que aproximadamente 60 nucleótidos y es suficientemente complementario para una porción de las cadenas de sentido y antisentido, respectivamente, del ácido nucleico aislado para hibridizarse con las mismas, y (a) el cebador de sentido comprende la SEC ID NO: 34 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencias con la misma, o la SEC ID NO: 37 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencias con la misma, o la SEC ID NO: 42 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencias con la misma; (b) el cebador antisentido comprende la SEC ID NO: 35 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencias con la misma cuando el cebador de sentido es la SEC ID NO: 34, o el cebador antisentido comprende la SEC ID NO: 38 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencias con la misma cuando el cebador de sentido es la SEC ID NO: 37 o el cebador antisentido comprende la SEC ID NO: 43 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencias con la misma cuando el cebador de sentido es la SEC ID NO: 42; y detectar la presencia de ácidos nucleicos amplificados como una indicación de la presencia del NV en la muestra.

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque los ácidos nucleicos se aislan de la muestra biológica por medio de un método que comprende los pasos que consisten en : (a) poner en contacto un soporte sólido que comprende ácidos nucleicos de captura asociados con el mismo con una muestra biológica bajo condiciones de hibridización, en donde las cadenas de ácido nucleico del WNV, si están presentes en la muestra biológica, se hibridizan con los ácidos nucleicos de captura; y (b) separar el soporte sólido de la muestra.

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el soporte sólido comprende perlas.

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque las perlas son perlas magnéticas.

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el aislamiento, la amplificación y la detección se realizan en un recipiente individual.

17. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque los ácidos nucleicos de captura comprenden uno o más oligonucleót idos , en - donde cada uno de los oligonucleótidos tiene una longitud no mayor que aproximadamente 60 nucleótidos y comprende al menos 10 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 1-16, 45, 46 y 50.

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque los ácidos nucleicos de captura además comprenden una cadena de homopolímero de aproximadamente 10-25 nucleótidos de longitud, seleccionada del grupo que consiste de poliA, poliT, poliG, poliC y poliü.

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la cadena de homopolímero es una cadena de poli A.

20. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la amplificación comprende la RT-PCR, amplificación mediada por la transcripción (TMA) o TaqManMR, o una combinación de los mismos.

21. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la amplificación comprende TaqManMR utilizando el cebador de sentido y el cebador antisentido y la detección se hace utilizando al menos una sonda que comprende una etiqueta detectable.

22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque al menos una sonda tiene una longitud no mayor que 60 nucleótidos y comprende (a) la secuencia de la SEC ID NO: 52 o la secuencia de la SEC ID NO: 53 cuando el cebador de sentido comprende la secuencia de la SEC ID NO: 34 o (b) la secuencia de la SEC ID NO: 54 cuando el cebador de sentido comprende la secuencia de la SEC ID NO: 37 o (c) la secuencia de la SEC ID NO: 55 cuando el cebador de sentido comprende la secuencia de la SEC ID NO: 42.

23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el método comprende utilizar una sonda que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 52 y una sonda que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 53 cuando el cebador de sentido comprende la secuencia de la SEC ID NO : 34.

24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22 o 23, caracterizado porque la sonda además comprende etiquetas detectables en el extremo 5' y en el extremo 3' .

25. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la etiqueta detectable es una etiqueta fluorescente seleccionada del grupo que consiste de 6-carboxifluoresceína (6-FAM) , tetrametilrrodamina (TAMRA), y 2 ' , 4 ' , 5 ' , 7 ' -t e tracloro- - 7 -diclorofluo es ceina (TET) .

26. El método de conformidad con la reivindicación 12, ca acterizado porque está presente una secuencia de control interno.

27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la secuencia de control interno comprende la secuencia de nucleótidos de la figura 2 (SEC ID NO: 17) .

28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque además comprende una secuencia de sonda etiquetada de manera detectable para la secuencia de control interno.

29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la secuencia de sonda etiquetada de manera detectable para la secuencia de control interno comprende la secuencia de la SEC ID NO: 40 o SEC ID NO: 41.

30. Un equipo para detectar la presencia del virus del Nilo Occidental (WNV) en una muestra biológica, el equipo está caracterizado porque comprende: ácidos nucleicos de captura que comprenden uno o más oligonucleót idos , en donde cada uno de los oligonucleót idos tiene una longitud no mayor que aproximadamente 60 nucleótidos y comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 10 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 1-16, 45, 46 y 50; oligonucleót idos cebadores en donde los oligonucleót idos cebadores tienen una longitud no mayor que aproximadamente 60 nucleótidos y comprenden una secuencia de nucleótidos de al menos 10 nucleótidos contiguos de las SEC ID NOS: 34 y 35 o las SEC ID NOS: 37 y 38 o las SEC ID NOS: 42 y 43; e instrucciones escritas para identificar la presencia del WNV.

31. El equipo de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque además comprende una polimerasa y amortiguadores.

32. El equipo de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque además comprende al menos un oligonucleótido de sonda con una longitud no mayor que aproximadamente 60 nucleótidos y al menos 10 nucleótidos contiguos, en donde al menos un oligonucleótido de sonda comprende (a) la secuencia de la SEC ID NO: 52 o la secuencia de la SEC ID NO: 53 cuando los oligonucleótidos cebadores comprenden · al menos 10 nucleótidos contiguos de la SEC ID NO: 34 y la SEC ID NO: 35; o (b) la secuencia de la SEC ID NO: 54 cuando los oligonucleótidos cebadores comprenden al menos 10 nucleótidos contiguos de la SEC ID NO: 37 y la SEC ID NO: 38; o (c) la secuencia de la SEC ID NO: 55 cuando los oligonucleótidos cebadores comprenden al menos 10 nucleótidos contiguos de la SEC ID NO: 42 y SEC ID NO: 43.

33. El equipo de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la sonda además comprende etiquetas detectables en el extremo 5' y el extremo 3' .

34. El equipo de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la etiqueta detectable es una etiqueta fluorescente seleccionada del grupo que consiste de 6-carboxifluoresceina (6-FA ) , tetrametilrrodamina (TA RA), y 2',4',5',7'-tetracloro-4-7-diclorofluoresceina (TET) .

35. El equipo de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el equipo comprende una sonda que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 36 y una sonda que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 49 cuando el cebador de sentido comprende la secuencia de la SEC ID NO: 34.

36. El equipo de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque además comprende un control interno que comprende la secuencia de nucleótidos de la figura 2 (SEC ID NO: 17 ) .

37. Un par de cebadores de amplificación para detectar el WNV, caracterizado porque comprende un par de oligonucleótidos seleccionados del grupo que consiste del par de la SEC ID NO: 34/SEC ID NO: 35, el par de la SEC ID NO: 37/SEC ID NO: 38 y el par de la SEC ID NO: 42/SEC ID NO: 43.

38. Un conjunto de oligonucleótidos para capturar específicamente el ácido nucleico del WNV, caracterizado porque comprende un oligonucleótido con una longitud no mayor que 60 nucleótidos y que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 8, un oligonucleótido con una longitud no mayor que 60 nucleótidos y que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 12, un oligonucleótido con una longitud no mayor que 60 nucleótidos y que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 45 y un oligonucleótido con una longitud no mayor que 60 nucleótidos y que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 46.

39. El conjunto de oligonucleótidos de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque además comprende un oligonucleótido con una longitud no mayor que 60 nucleótidos y que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 50.

40. Un método para preparar un suministro de sangre que comprende sangre completa, plasma o suero, sustancialmente libres del virus del Nilo Occidental (WNV) , caracterizado porque comprende los pasos que consisten en: (a) examinar alícuotas de sangre completa, plasma o suero de muestras de sangre colectadas por medio del método de conformidad con la reivindicación 12; (b) eliminar las muestras donde se detecta el WNV; y (c) combinar las muestras donde no se detecta el WNV para proporcionar un suministro de sangre sustancialmente libre del WNV.