CN115181816B - 一种超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法及其应用 - Google Patents

一种超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115181816B
CN115181816B CN202211100443.9A CN202211100443A CN115181816B CN 115181816 B CN115181816 B CN 115181816B CN 202211100443 A CN202211100443 A CN 202211100443A CN 115181816 B CN115181816 B CN 115181816B
Authority
CN
China
Prior art keywords
detection
filtrate
titer
equal
virus titer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202211100443.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115181816A (zh
Inventor
贾建东
邵丹丹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Xinchuang Biological Detection Co ltd
Original Assignee
Hangzhou Xinchuang Biological Detection Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hangzhou Xinchuang Biological Detection Co ltd filed Critical Hangzhou Xinchuang Biological Detection Co ltd
Publication of CN115181816A publication Critical patent/CN115181816A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115181816B publication Critical patent/CN115181816B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/24—Methods of sampling, or inoculating or spreading a sample; Methods of physically isolating an intact microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/38—Pseudomonas
    • C12R2001/385—Pseudomonas aeruginosa
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/21—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Pseudomonadaceae (F)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本申请涉及一种超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法及其应用，采用双层平板法检测滤液中PP7的滴度，含有PP7的滤液样品的总检测量由下式计算得到：
Figure 100004_DEST_PATH_IMAGE002
；上式中，V检为含有PP7的滤液样品的总检测量，单位为mL；V总为滤液的体积总量，400≥V总≥80；k为取样系数，0.5≥k≥0.075；b为取样修正系数，当V总＜180时，0≥b≥‑1；当250＞V总≥180时，2≥b≥0；当V总≥250时，3≥b≥0。本申请进一步公开了上述检测方法应用于除病毒过滤器、过滤膜病毒截留能力检测。本申请中的检测方法针对超低病毒滴度体系的总检测量难确定、检测结果偏差大的问题，通过确定体系的总量定量和体系所需的总检测量之间的关系，使得检测人员能够快速确定总检测量，不但大大提高检测结果的准确性，还能提高检测效率。

Description

一种超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法及其应用
技术领域
本申请涉及膜过滤的领域，尤其是涉及一种超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法及其应用。
背景技术
生物制剂往往采用人畜来源的原料制备，如亲本细胞、转化细胞、转基因动物产生的奶类、天然提取物和人畜来源的血浆等。这些产品一般属于蛋白质类，需要经过复杂的工序加工得到，在这些复杂的加工工序中，病毒污染是严重影响其安全性的因素，而如何提高生物制剂的安全性是各类生物、医药企业始终关注的问题。
2020年版《中国药典》和指导文件“ICH Q5A”对于生物制剂的病毒安全性有明确要求，生物制剂的病毒去除步骤已经必不可少。例如，在进行药品申报时，需要将病毒安全性评估测试结果形成报告附于申请文件中，以供审查。生产工艺中清除感染性病毒的能力，也就成为重要的评价标准。一般来说，生产过程中需要进行病毒灭活和/或病毒清除工序，目前较为常用的病毒清除方法是膜过滤除病毒，过滤器（过滤膜）的除病毒能力直接决定了生物制剂的病毒安全性。
膜分离技术是以膜为分离介质，当膜两侧存在某种推动力时（可以是压差、浓差等），原料侧组分选择性透过膜，从而达到分离、提纯和浓缩的目的。膜分离技术由于操作条件较为温和，不易引起生物制剂活性的改变；病毒分离效果好；能够直接放大应用于规模化的分离工程等原因，特别适合生物制剂的病毒清除步骤，因而广泛应用于生物、医药领域。
其中，除菌级过滤器的挑战测试方法可以参照ASTM F838-20中的相关规定。而除病毒级过滤器目前并无明确的工业标准，不同企业的病毒挑战测试条件也存在一定的区别。针对上述问题，美国注射剂协会PDA(Parenteral Drug Association)就生物制剂的病毒过滤测试方法和除病毒验证发布了一份指南性文件“Virus Filtration, TechnicalReport No. 41(Revised 2008)”，简称TR41。
TR41文件中规定了，截留病毒为噬菌体PR772或PP7（PR772为大病毒，PP7为小病毒，可按需选择），物料流为免疫球蛋白IVIG（或牛血清蛋白BSA）。更进一步的，TR41的附录III中明确记载了小型病毒-截留过滤器-测试协议，其以PP7作为标称用的挑战病毒模型，蛋白透过率评估采用人免疫球蛋白（IVIG），为了计算病毒的截留率，需要对挑战液和滤液的PP7滴度分别进行检测。TR41中明确记载了PP7滴度的检测方法，其使用双层平板计数法对样品进行培养计数，检测体系的具体配方为1mL特定浓度的含有PP7的滤液样品和2mL宿主细胞（铜绿假单胞杆菌），以及9mL温热的琼脂；或含有PP7的滤液样品约0.1mL，宿主菌为1mL，琼脂液为4.5mL。
本申请的发明人们发现，检测挑战液中PP7的滴度时，直接参照TR41的方法即可，这是由于挑战液中PP7的滴度较高，通过控制合适的稀释度，平板上的可视菌斑数往往能够较好的控制在10~300pfu，根据稀释度、样品量以及噬菌斑数量即可计算挑战液中的PP7浓度（pfu/mL），检测结果的准确性高、平板上噬菌斑易于计数。
但是滤液中的PP7滴度较低（目前实际滴度比TR41中预期的要低），这是由于，TR41中规定，预过滤后挑战液中PP7的浓度106~107pfu/ml，并且要求过滤器（过滤膜）能够达到LRV4；然而，目前的过滤器（过滤膜）已经能够达到LRV＞5甚至LRV＞6，因此，最终得到的滤液的滴度比TR41中预估的低至少1~2个数量级。例如，若预过滤后的挑战液中PP7的滴度为106pfu/ml，当LRV=4时，滤液的滴度能够达到102pfu/ml，滴度较高；而当LRV=5时，滤液的滴度仅能达到101pfu/ml，有数量级的降低。在本申请中，当LRV＞5时，我们认为滤液中PP7的滴度超低（TR41要求计数10~300个噬菌斑的平板，而LRV＞5时已经有可能无法达到此要求，故认为滴度超低），很可能无法达到TR41中检测方法的检测限。
对于LRV4级别的滤膜而言，滤液中PP7滴度检测的方法可直接参考TR41，并不需要过多考虑滤液的检测量问题，这是由于滤液中的PP7滴度较高（甚至可能高达103以上），只需以不同的稀释度对滤液进行稀释，即可得到符合TR41中检测方法检测限的合适稀释度的滤液。而对于LRV5甚至LRV6以上滤膜的滤液而言，即使不进行任何稀释，滤液中PP7的滴度也可能无法达到TR41中检测方法的检测限，若仍然按照TR41中的规定的检测量（约0.1mL或1mL的检测量）进行取样，由于无法达到检测限，检测结果往往与真实值之间存在较大的偏差，准确性较低。
实际上，对于超低病毒滴度的滤液，TR41中的相关检测方法已经无法满足需求，需要对检测方法进行调整，其中，如何定量确定滤液的总检测量，确保检测结果与真实值之间偏差较小，检测结果准确性较高，是目前亟待解决的问题。
发明内容
为了改善目前PDA发布的指导性文件TR41中病毒滴度的检测方法不适用超低病毒滴度滤液滴度检测的问题，本申请提供一种超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法及其应用，该检测方法通过限定PP7滤液样品的总检测量和滤液总量之间的关系，能够根据滤液总量定量的确定滤液的总检测量，以确保超低病毒滴度滤液的滴度检测结果具有较高的准确性，对于超低病毒滴度滤液滴度检测具有重要的指导意义。
本申请提供的一种超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法及其应用采用如下的技术方案：
第一方面，本申请提供一种超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法，采用如下的技术方案：
一种超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法，采用双层平板法，检测滤液中PP7的滴度，其中，含有PP7的滤液样品的总检测量由下式计算得到：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
；
上式中，
V检为样品滴度检测时，含有PP7的滤液样品的总检测量，单位为mL；
V总为滤液的体积总量，400≥V总≥80；
k为取样系数，0.5≥k≥0.075；
b为取样修正系数，当V总＜180时，0≥b≥-1；当250＞V总≥180时，2≥b≥0；当V总≥250时，3≥b≥0。
优选的，k≥0.1。更优选的，k≥0.15。
通过采用上述技术方案，需要明确的是，对于本申请而言，滤液中PP7滴度的真实值，是指以总检测量为V检+5时测得的滴度，且测得的滴度与总检测量为V检时测得的滴度的偏差应当在30%以内，若两者偏差高于30%，则认为总检测量V检不合理。对于超低滴度的滤液而言，即使是完全相同的检测方法，测得的结果也存在一定偏差，且随着滴度的降低，这种偏差有增大的趋势，因此，在认定检测结果的准确性时，需要给定较宽的浮动范围。当然，即使给定了较宽的浮动范围，仍能够明显的体现检测结果准确性的变化趋势。
由于TR41中并未给出超低病毒滴度下滤液滴度的检测方法，而按照TR41中规定的低总检测量进行检测时，不同平行组平板之间的数据往往波动很大，滴度计算精确度较低。
目前并无成熟的理论能够帮助检测人员确定超低病毒滴度下滤液滴度检测时，合适的总检测量；并且，确定滤液的总检测量时，需要考虑样品总量、滤液的滴度、可操作性、结果稳定性和精确度等众多因素，因此，需要定量确定滤液的总检测量并不容易。例如，即使滤液的滴度相同，当滤液总量为1000mL时，1mL总检测量很可能无法精确表征滤液中PP7的滴度；当滤液总量为10mL时，1mL总检测量测得的结果与真实值之间的偏差可能较小。同样的，即使滤液总量相同，当滤液滴度不同时，相同的总检测量测得的结果与真实值之间的偏差大小也完全不同。因此，确定滤液的总检测量时，需要考虑滤液滴度和样品总量等影响因素。
本申请的发明人们致力于将超低病毒滴度滤液的总检测量定量表示，从而确保在对滤膜为LRV5甚至LRV6以上的滤液的滴度进行检测时，能够快速确定不同滤液的总检测量，并且确保以此总检测量对超低病毒滴度滤液的滴度进行检测时，检测结果的准确性较高（偏差小于30%，对于优选结果，偏差甚至小于10%）。
在确定总检测量时，必须明确所需的检测限，这对于检测方法而言是相当重要的限定。例如，当以较大的总检测量对滤液中病毒的滴度进行检测，结果仍为未检出，那么，报告中写明的检测限就变成了重要的参考依据（毕竟滤液中病毒滴度为0的结果显然是有误的，检测方法的检测限就成为重要依据）。
对于下游生物医药企业而言，病毒挑战报告是其判定滤膜性能的主要手段之一，也是判定滤液病毒安全性合格与否的重要依据，若报告中标明的检测方法的检测限较高，下游厂商有理由怀疑超低病毒滴度的滤液是因为无法达到检测方法的检测限而导致未检出的结果，从而不认可该检测方法和检测结果。对于LRV5甚至LRV6以上的滤膜而言，本申请的发明人们认为，检测限应当不高于40pfu；进一步优选的，检测限不高于20pfu。需要注意，该检测限并非是滴度，单位并非是pfu/mL，而是指经过过滤后，滤液中通过过滤器（过滤膜）的病毒总量，即检测限应当理解为不高于20pfu/V总。
在明确所需的检测限后，需要在确保检测结果的准确性的基础上，将检测限转化为取样系数k，从而以滤液的体积总量V总作为基数，定量表征滤液的总检测量。在将检测限转化为k时，需要充分考虑滤液的体积总量范围、滤液的滴度等，确保总检测量的检测限低于滤液中PP7的量，从而确保检测结果的准确性。在此基础上，本申请的发明人们发现，以5%非可信区间为判定依据，取其自然对数-ln（5%）作为分子，并以检测限作为分母，以此作为取样系数k。以前述方法将检测限转化为取样系数k充分考虑了检测限、滤液的滴度、检测结果的可信度等，对于超低病毒滴度的滤液而言，需要k≥0.075。且随着滤膜LRV的变化，取样系数k也需要相应调整，从而确保总检测量对应的检测限低于滤液中PP7的量，提高检测结果的准确性。此外，对着取样系数k的不断提高，存在边际递减效应，例如，当k=0.5时测得的数据和k=0.7时测得的结果可能偏差较小，但是k=0.7时的工作量明显提高，因此，限定k不大于0.5。能够在确保检测结果准确性的基础上，提高工作效率。
双层平板计数法的机理为，为了对滤液中PP7的数量进行计数，需要含有PP7的滤液样品中的每一个PP7都能够感染一个宿主菌，以确保每个PP7都能够产生一个可计数的噬菌斑。上述机理决定了，一切影响PP7感染宿主菌的因素，都会对检测结果产生影响，而环境的变化、操作的误差、复配的检测体系等，都会对PP7感染宿主菌的过程产生影响，因此，需要对实际操作过程中产生的误差进行修正。
因此，在以滤液的体积总量V总作为基数，以取样系数k初步确定滤液所需的总检测量后，需要对总检测量进行进一步的修正。b为修正系数，用于对检测总量进行适当调整，本申请的发明人们发现，修正系数b与滤液的体积总量V总之间具有较大的关系。这可能是由于，当滤液的体积总量较小时（如小于180mL），以较小的总检测量就能够获得准确性较高的检测结果，并且较低的总检测量可以减少操作次数（例如，若总检测量为30mL时，不可能通过一次双层平板法测得30mL滤液中的PP7的量，必须分成多次进行），从而降低操作误差，在此基础上将总检测量适当下调不但可以降低工作量，还能够保证结果准确性。而当滤液的体积总量较大时（如在180~250mL），即使总检测量已经较大，因为多次操作导致的操作误差等原因，最终检测结果与真实值之间的偏差会变大，适当上调总检测量修正操作误差，从而获得更准确的检测结果。当滤液的体积总量更大时（如不小于250mL），适当上调总检测量能够对操作误差进行修正，提高检测结果的准确性。因此，在初步确定滤液所需的总检测量之后，进一步根据不同的工况，对总检测量进行修正，从而确保检测结果的准确性。对于检测人员而言，该检测总量的确定方法能够显著提高工作效率，具有十分重要的指导意义。
基于下述原因，本申请的技术方案是非显而易见的。本申请通过将超低病毒滴度滤液的总检测量定量表示，给超低病毒滴度滤液滴度检测方法提供了重要的理论指导，这不但是一种全新的技术方案，还极有可能是未来超低病毒滴度体系确定检测总量的重要依据，具有重要的指导意义。
可选的，检测滤液中PP7的滴度时，以双层平板法检测取得的含有PP7的滤液样品的滴度，含有PP7的滤液样品的单次检测量V单满足下式：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
；
上式中，
S板为培养皿的底面积；
h为检测体系在培养皿中的高度，h≤23mm；
P为体积系数，4≥P≥2。
通过采用上述技术方案，不论是TR41中，还是目前常规认知，一般采用双层平板法检测噬菌体的滴度。其中，TR41中记载了，以双层平板法检测含有PP7的滤液样品的滴度时，含有PP7的滤液样品的单次检测量约为0.1mL或1mL，对于高滴度的滤液而言，这样的单次检测量并无问题，只需控制合适的稀释度即可获得10~300个可计数的噬菌斑并以此计算滤液中PP7的滴度即可。
然而，超低病毒滴度的滤液的总检测量较高（例如可能高达30mL以上），若仍按照TR41中的检测方法进行滴度检测，即使不考虑复测等额外的工作量，也需要至少制作30个培养皿。而每一批次的滤膜都应当进行病毒挑战测试，如此庞大的工作量和器材占用量，将给检测验证部门带来极大的压力。因此，在明确了超低病毒滴度滤液的总检测量的基础上，需要对单次检测量进行放大。例如，若能够将含有PP7的滤液样品的单次检测量从1mL放大为10mL，并且确保检测结果的准确性，在检测总量保持不变的前提下，工作量和器材占用量能够下降约10倍，这是工作效率的极大提升，具有十分重要的意义。
一般认为，为了提高工作效率，含有PP7的滤液样品的单次检测量越大越好，例如，若能够将单次检测量放大为30mL，则只需一次试验即可准确的检测滤液中PP7的滴度。然而，本申请的发明人们发现，在对含有PP7的滤液样品的单次检测量进行放大时，并不是越大越好。
这是由于，根据TR41的规定，检测体系中应当包含含有PP7的滤液样品、宿主菌液和琼脂液，含有PP7的滤液样品的单次检测量放大意味着整个检测体系的体积量较大。检测体系体积量变大后，PP7和宿主菌所处环境与TR41中已经不同（如不同厚度位置的溶氧量、物料沉积等不同），将影响检测结果；且双层平板法要求倒置培养过夜，过大体积量的检测体系很可能在倒置培养时掉落，不具有可操作性；更进一步的，单次检测量放大将导致PP7在厚度方向上产生投影重合的可能性大大提高，从而产生无法计数或计数不准确的噬菌斑，影响检测结果。因此，含有PP7的滤液样品的单次检测量并非越大越好，而是需要在保证检测结果偏差较小、具有可操作性的基础上，对含有PP7的滤液样品的单次检测量进行适当放大。
本申请的发明人们致力于将含有PP7的滤液样品的单次检测量的定量表征，并且意外发现，当前式中体积系数满足4≥P≥2时，能够确保最终检测结果具有相对较小的偏差，并且可操作性强，工作效率高。对于单次检测量的定量表征确保了检测验证人员能够根据实际情况快速确定合适的单次检测量，从而在确保检测结果的准确性和可操作性高的基础上，大幅降低工作量。同样的，该定量确定单次检测量的技术方案是全新的构思，并且极有可能是未来确定单次检测量的重要参考，具有重要的指导意义，因此，该技术方案是非显而易见的。
当然，含有PP7的滤液样品的总检测量V检往往无法被单次检测量V单整除，则余下的检测量按照单次检测量1mL进行检测或仍以确定的单次检测量V单进行检测。当单次检测量为1mL时，检测方法参考TR41中的相关规定，检测体系中各物料的配比为，含有PP7的滤液样品1mL、宿主菌液2mL、琼脂液9mL，琼脂液的浓度为0.7%。例如，若计算得到总检测量需不小于32mL，而单次检测量为5mL，除了进行6次5mL单次检测量的实验外，还需要进行2次1mL单次检测量的实验；或者，可直接进行7次5mL单次检测量的实验。上述两种方案可根据实际需求进行选择。
可选的，检测滤液中PP7的滴度时，检测体系包括含有PP7的滤液样品、宿主菌液和琼脂液，且各组分的体积份数如下：
含有PP7的滤液样品 5~10mL；
宿主菌液 2~8mL；
琼脂液 4~17mL；
所述检测体系凝固后的强度为（30~150）g/cm2。
通过采用上述技术方案，为了进一步降低单次检测量放大后带来的检测偏差，并且充分考虑大检测总量带来的工作量的提升，本申请的发明人们发现，当含有PP7的滤液样品的单次检测量为5~10mL时，检测偏差较小、而工作效率大幅提升。
此外，需要注意的是，可预期的是，含有PP7的滤液样品的单次检测量放大后，其余物料的添加量等比放大即可，检测体系的各物料配比应当保持不变。然而，本申请的发明人们意外发现，当含有PP7的滤液样品的单次检测量放大后，若其余物料仅等比放大，不论是可操作性还是最终检测结果的偏差量等往往较差。
例如，若宿主菌液和含有PP7的滤液样品的配比仍保持不变，由于宿主菌在三维空间上是均匀分布的（水平方向和竖直方向都是均布的），对于同一水平面上均匀分布的宿主菌而言，由于产生的噬菌斑呈现在水平面上是分散平铺的，能够精确计数；而对于在竖直方向上的分布为投影重合的宿主菌而言，一旦产生的噬菌斑在水平面上的投影是重合的，就会产生噬菌斑难以计数的问题；重合的、难以计数的噬菌斑将导致检测结果的较大偏差。因此，本申请中将含有PP7的滤液样品的单次检测量放大后，还将宿主菌液的添加比例有所下调，从而降低噬菌斑重合的可能，但是宿主菌液的添加比例又不能过低，否则容易产生PP7无宿主菌可感染的可能，同样会导致检测结果的偏差变大。
此外，本申请的发明人们意外发现，琼脂液的添加量满足检测体系凝固后的强度符合（30~150）g/cm2时，不论是可操作性还是检测结果的偏差等都意外的十分良好。
这可能是由于，当检测体系凝固后的强度过低时，倒置培养时检测体系容易脱落，操作性较差。此外，检测体系凝固后的强度过低时，菌斑重合的概率也明显上升，这可能是由于，随着检测体系凝固后强度的降低，检测体系中琼脂形成的网络节点越来越少，对于PP7和宿主菌的运动限制就越低。一旦被PP7感染的宿主菌能够运动到相近的位置，就会产生重合、难以计数的噬菌斑。而若检测体系凝固后的强度过高时，产生的噬菌斑数量又有十分明显的降低，这可能是由于，随着检测体系凝固后强度的提高，检测体系中琼脂形成的网络节点越来越多，对于PP7和宿主菌的运动限制增强。一旦对于PP7的运动限制使得PP7不能很好的移动时，大量PP7无法运动感染宿主菌，导致形成的噬菌斑数量明显降低。只有当检测体系凝固后的强度为（30~150）g/cm2时，才能够保证检测体系倒置培养时不脱落，在此强度下，PP7具有良好的运动能力，而宿主菌的运动能力被明显限制，因而能够产生大量不重合噬菌斑，以获得更准确的检测结果。
因此，与预期的不同，本申请中检测体系各组分的配比，并非是TR41中检测体系的等比放大，从而确保检测结果的准确性和可操作性，这同样是一种全新的技术构思，是非显而易见的。
容易理解的是，为了便于操作以及减少操作引起的误差，本申请在取样时，各物料的量均为整数，但是并不意味各物料的用量必须为整数。
可选的，所述检测体系凝固后所受掉落力为（0.05~0.25）g/cm2，所述检测体系凝固后的强度为掉落力的（200~1300）倍。
通过采用上述技术方案，双层平板法要求倒置培养过夜，检测体系的总量过大或检测体系的配方不合理时，都容易导致凝固后的检测体系在倒置培养时脱落，检测过程无法进行，可操作性低。
本申请的发明人们意外发现，检测体系凝固后的强度为掉落力的200~1300倍时，就能够大大降低检测体系倒置培养时脱落的可能。因此，只需培养皿的尺寸确定、检测体系的配比确定，即可通过计算得到检测体系凝固后所受掉落力，通过检测得到检测体系凝固后的强度，通过对比这两个数据，即可确定可操作性。这给检测体系配方的调整、培养皿尺寸的选定等理论依据。很大程度上解决了当下培养皿尺寸、检测体系配方选定后，必须观察倒置培养结果后，才能确定检测体系配方、培养皿尺寸的合理性的问题，这无疑大大提高了效率。
可选的，所述宿主菌液的OD550与所述检测体系的OD550之比为2.0~2.5。
通过采用上述技术方案，本申请的发明人们意外发现，当宿主菌液的OD550与检测体系的OD550之比为2.0~2.5时，噬菌斑重合、无法计数的概率明显降低，并且最终的检测结果准确性也较高。
这可能是由于，正如前述提到的，将含有PP7的滤液样品的单次检测量放大后，需要将宿主菌液的添加比例适当下调，控制在合理范围，以降低噬菌斑重合的概率或PP7无菌可感染的概率。但是宿主菌的合理添加量受到含有PP7的滤液样品的添加量、琼脂液的添加量、琼脂液中琼脂的含量、检测体系总量等的影响，宿主菌液的添加量是否合理较难确定。而本申请的发明人们发现，当宿主菌液的OD550和检测体系的OD550符合两者的之比为2.0~2.5时，在本申请特定的检测体系中，宿主菌的浓度既能够保证PP7有宿主菌可感染，还能够保证噬菌斑重合的概率较低，因此最终的检测结果准确性较高。
可选的，所述检测体系的粘度为（2.5~7.0）cp@45℃。
通过采用上述技术方案，由于检测体系的粘度随温度变化而变化，并且，为了保持检测体系的流动性，降低宿主菌和噬菌体失活的可能，可将检测体系水浴保温于约45~50℃，并在此条件下进行粘度的检测。检测体系粘度为（2.5~7.0）cp@45℃的意思是，检测体系在45℃的温度下，粘度为（2.5~7.0）cp。
本申请的发明人们意外发现，当检测体系的粘度为（2.5~7.0）cp@45℃时，能够保证检测体系凝固后倒置不掉落，并且噬菌斑重合、检测结果明显偏低等现象有所减少。这可能是由于，根据TR41的规定，在配制检测体系时，需要用移液枪来回混匀两次，从而确保各物料的均匀混合，特别需要保证PP7和宿主菌液的分散均匀性。若检测体系的粘度过高，混匀的难度提高，对于操作的要求将明显提高，略有不当的操作就很可能导致PP7的分布均匀性较差，产生的噬菌斑也集中于一处，难以计数。若检测体系的粘度过低，凝固后的检测体系很可能强度不够，倒置培养时容易脱落。即使未脱落，强度过低的检测体系也更容易产生重合、难以计数的噬菌斑。
本申请的发明人们还发现，一般认为，检测体系的粘度随着体系中琼脂浓度的提高而提高，然而，实际检测结果并没有体现这种正相关，甚至有琼脂浓度更高而粘度更低的现象。也就是说，检测体系的流变性能是十分复杂的体系，其受到许多因素的影响，并不仅仅是琼脂浓度所决定的。
可选的，PP7分散于酸性缓冲液，所述酸性缓冲液的pH为4~6；所述琼脂液配制完成后调节pH至7.4~8.0。
优选的，所述酸性缓冲液为醋酸缓冲液或柠檬酸缓冲液。
通过采用上述技术方案，根据TR41中的相关规定，以PP7作为模式病毒时，整个实验阶段所用缓冲液为PBS（pH7.4），但是很多生物制剂的生产过程中需要使用酸性缓冲液，如柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液等，而不同缓冲体系对于滤除病毒阶段蛋白透过率、病毒截留率等可能存在影响，为了尽量贴近实际生产工况，需要将PBS缓冲体系更换为酸性缓冲体系。
将TR41中规定的缓冲体系更换为酸性缓冲体系，能够以更贴近实际生产的条件评估过滤器（过滤膜）在特定工况下的过滤性能。然而，本申请的发明人们发现，在验证滤液中PP7的滴度时，酸性缓冲体系下平板上噬菌斑的量明显下降，并且随着单次取样量的提高，这种下降趋势更明显。
这可能是由于，根据TR41的规定，模式病毒选用PP7、宿主菌选用铜绿假单胞杆菌是确定的，但是TR41仅考虑以pH为7.4的PBS缓冲体系进行滴度检测的情况，实际上，当缓冲体系为酸性缓冲体系时，配制得到的检测体系也必然是酸性的，而铜绿假单胞杆菌在酸性条件下生长受抑制。生长活性受抑制的宿主菌受病毒感染的概率大幅下降，这就使得检测结果产生明显的下降。通过将琼脂液的pH调节至弱碱性，在复配检测体系时，能够对检测体系的pH进行调节，中和酸性缓冲液对于检测结果的影响。
需要注意，琼脂液的pH不宜调节过高，这是由于，琼脂属于酸性多糖，在碱性条件下容易发生水解，甚至产生无法凝固的现象。
可选的，检测体系包括以下体积份数的原料：
含有PP7的滤液样品 5~7mL；
宿主菌液 2~5mL；
琼脂液 4~13mL。
可选的，检测体系包括以下体积份数的原料：
含有PP7的滤液样品 5mL；
宿主菌液 2~4mL；
琼脂液 4~6mL。
可选的，检测体系包括以下体积份数的原料：
含有PP7的滤液样品 6mL；
宿主菌液 2~4mL；
琼脂液 5~7mL。
可选的，检测体系包括以下体积份数的原料：
含有PP7的滤液样品 7mL；
宿主菌液 3~5mL；
琼脂液 9~13mL。
通过采用上述技术方案，本申请的发明人们意外发现，检测体系中含有PP7的滤液样品的单次检测量优选控制在5~7mL时，能够在保证效率的基础上，显著提高实验的稳定性，降低操作误差，检测结果的偏差也明显更小。这可能是由于，当含有PP7的滤液样品的单次检测量为8~10mL时，随着单次检测量的提高，检测体系的总量越大，倒置时越容易脱落，为了保证检测体系不脱落，需要提高检测体系凝固后的强度。这就使得检测体系的粘度变高，混匀难度加大，PP7和宿主菌的分散均匀度下降，检测结果的稳定性下降，操作引起误差的可能性提高。且随着检测体系凝固后强度的提高，PP7的运动受抑制的程度不断提高，这大大降低了PP7感染宿主菌的可能性，使得检测结果产生明显的下降。
可选的，检测体系包括以下体积份数的原料：
含有PP7的滤液样品 8mL；
宿主菌液 4~6mL；
琼脂液 11~14mL。
可选的，检测体系包括以下体积份数的原料：
含有PP7的滤液样品 9mL；
宿主菌液 5~7mL；
琼脂液 11~15mL。
可选的，检测体系包括以下体积份数的原料：
含有PP7的滤液样品 10mL；
宿主菌液 6~8mL；
琼脂液 12~17mL。
第二方面，本申请提供一种超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法，采用如下的技术方案：
可选的，前述检测方法包括以下工艺步骤：
A1、检测体系复配，按照前述配比，将含有PP7的滤液样品、宿主菌液和琼脂液复配混合，得到检测体系；
A2、培养计数，将检测体系放到带有下层琼脂的平板上，待培养液凝固后倒置培养过夜，对平板上的噬菌斑进行计数，计算得到滤液中PP7的滴度；
A3、重复步骤A1和步骤A2，至含有PP7滤液样品的总检测量达到V检。
通过采用上述技术方案，在对超低病毒滴度体系中病毒的滴度进行检测时，除需要对总检测量和单次检测量等进行调整外，整体检测方法可继续沿用相关规定中的方法，并不需要对工艺步骤进行过多的调整，适用性较好。
第二方面，本申请进一步公开了前述检测方法在除病毒过滤器、过滤膜病毒截留能力检测中的应用。
通过采用上述技术方案，前述超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法特别适合应用于除病毒过滤器、过滤膜病毒截留能力检测时，滤液中病毒滴度的检测。即使随着膜分离技术的发展，滤膜对于生物制品中的病毒截留率进一步提高，本申请中的病毒滴度检测方法仍然具有重要的借鉴意义。
综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：
1.随着膜分离技术的发展，目前的滤膜性能往往能够达到LRV5甚至LRV6以上，相较于TR41规定的LRV4高至少1~2个数量级，这就使得当前的滤液滴度远低于TR41中预估的滴度，即使不对滤液进行任何稀释操作，按照TR41中的操作步骤可能也无法得到具有合适数量噬菌斑的平板；在此基础上，本申请通过将滤液总量和总检测量定量表征，能够在保证检测结果准确性的基础上快速确定总检测量，这种全新的技术构思具有重要的指导意义。
2.滤液中PP7的滴度降低后，需要提高总检测量，若仍按照TR41的规定，以单次检测量为1mL或0.1mL进行滴度检测，将导致工作量的成倍提升；一般认为，为了提高效率，单次检测量越大越好；然而，单次检测量的确定需要考虑检测结果的准确性、可操作性等，并非越大越好；本申请通过对单次检测量进行定量表征，使得操作人员能够快速确定单次检测量，从而在保证检测结果准确性的基础上，大大提高效率。
3.通过定量表征含有PP7的滤液样品的单次检测量，能够快速确定检测体系中含有PP7的滤液样品的量，一般认为，含有PP7的滤液样品量放大后，宿主菌液和琼脂液等比放大即可；然而，直接等比放大得到的检测体系往往不具有可操作性，或者检测结果较差；本申请的发明人们发现，通过对检测体系各物料的配比进行调整，并使其凝固后的强度符合（30~150）g/cm2时，不论是可操作性还是检测结果的准确性等都意外的十分良好。
4.本申请的发明人们意外发现，当检测体系凝固后的强度为掉落力的200~1300倍、宿主菌液的OD550与检测体系的OD550之比为2.0~2.5时，能够大大降低检测体系倒置培养时脱落的风险以及检测结果偏差较大的风险，这给检测体系的配方确定提供了重要的指导，配方确定效率大大提高。
5.本申请的发明人们意外发现，相较于含有PP7的滤液样品的单次取样量为8~10mL，当含有PP7的滤液样品的单次取样量控制为5~7mL时，能够在保证效率的基础上，显著提高实验的稳定性、降低操作误差、提高检测结果的准确性。
具体实施方式
如未特殊说明，在下述各实施例中，所用的物料及设备均可通过商业途径购得。此外，由于部分原料、设备、操作步骤等均详细记载于TR41中，故未展开说明，各物料来源、配制方式等记录如下：
菌种信息
宿主菌：铜绿假单胞菌，Pseudomonas aeruginosa 编号：ATCC15692。
噬菌体：PP7 编号：ATCC 15692-B4。
各培养基、试剂的准备
BSA：牛血清蛋白（模型蛋白），纯度不低于 95%，颜色为米黄色至纯白色，市售。
营养肉汤（NB, BD Order NO.: 234000或其他等效）：取8.0 g粉末溶解于1 L的纯化水中，充分溶解后于121℃高压灭菌20 min。
营养琼脂（NA, BD Order NO.: 213000或其他等效）：取琼脂糖粉末溶解于纯水中，使琼脂糖的浓度为1.5%，琼脂糖充分溶解后于121℃高压灭菌20 min。
上层软琼脂：在营养肉汤中添加0.7%或1%的电泳级琼脂糖，充分溶解后于121℃高压灭菌20 min。
温热的软琼脂：将上层软琼脂在45-50℃水浴中保持融化的状态，即为温热的软琼脂。
PBS 缓冲液：pH=7.4，市售为20倍浓缩液，使用时用去离子水稀释20倍，于121℃高压灭菌30 min。
醋酸缓冲液：pH=5.1，市售。
含有PP7的滤液样品：为了降低不同批次滤膜得到的滤液PP7滴度不稳定等对试验结果引起误差，以PP7滴度为40pfu/200mL的测试液模拟含有PP7的滤液样品。由于所有测试液均为统一配制，因此，能够降低滤液对于检测结果的影响。PP7滴度为40pfu/200mL的测试液的配制方法为：提前一天采用双层琼脂覆盖法对PP7进行培养，以双层平板法进行计数后，将培养液稀释为PP7滴度为约40pfu/200mL的测试液。为了更贴近实际滤液的成分，测试液中需添加0.1g/L的BSA（模型蛋白也可根据需要选择IVIG）。
宿主菌液：取低于-70℃冰箱中保存的P.aeruginosa（ATCC 15692）种子液，于37℃复苏；随后以~1/100th体积比接种于营养肉汤中，置于摇床中培养过夜，得到宿主菌悬液，宿主菌悬液应当是绿色的，制得的宿主菌悬液可储存于2~8℃的无菌环境中备用。再进行宿主菌扩培，在进行PP7计数分析前几个小时，取过夜培养的宿主菌悬液，以~1/100th体积比加入到营养肉汤中，于37℃振荡培养约2~2.5h，直至宿主菌处于对数生长中期，即得宿主菌液。宿主菌扩培完成后，需观察其生长情况，处于对数生长中期的宿主菌液应当具有明显的混浊现象且OD550为0.3~0.6，若振荡培养2~2.5h后，宿主菌液仍是澄清的，应继续培养0.5~1h后再观察，若仍然是澄清状态，则该宿主菌液视为不可用，需查找原因。
实施例1
本申请实施例首先公开一种超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法，包括以下工艺步骤：
A1、检测体系复配，检测体系按照1mL含有PP7的滤液样品、2mL宿主菌液、9mL琼脂液的配比进行复配（琼脂液的浓度为0.7%），将含有PP7的滤液样品、宿主菌液混合并室温放置5min后，将温热的软琼脂加入，以无菌滴管吹打混合两次，即得检测体系。
A2、培养计数，将检测体系加入150mm营养琼脂固体平板表面，旋转平板确保其混合均匀并完全覆盖在下层琼脂固体平板上。随后将平板室温放置至完全凝固（放置时间不小于10min），将平板转移至37℃培养箱中倒置培养过夜。培养结束后，以每块平板上的噬菌斑个数进行分析，可采用灯箱辅助观察，根据计数值计算测试样品中的噬菌体浓度pfu/mL，记录。
A3、重复步骤A1和A2，至含有PP7滤液样品的总检测量达到V检。
需要注意的是，前述各步骤中，所用缓冲液均为PBS缓冲液，步骤A1和A2需要进行多次，以使多个检测体系中含有PP7的滤液样品的单次检测量V单之和，大于等于所需的含有PP7的滤液样品的总检测量V检。即，
本实施例中，滤液的总检测量通过下式计算得到，本申请实施例中V总为200mL：
Figure 557667DEST_PATH_IMAGE002
；
上式中，
V检为样品滴度检测时，含有PP7的滤液样品的总检测量，单位为mL；
V总为滤液的体积总量，滤液的总体积可直接测得，单位为mL；
k为取样系数，为了获得更准确的检测结果，本实施例中取k=0.15；
b为取样修正系数，当V总＜180时，b=0；当250＞V总≥180时，b=0；当V总≥250时，b=0，即本申请实施例的总检测量通过下式计算得到：
V 检=0.15V 总。
根据上式计算，滤液的总检测量为30mL，因此，需要重复步骤A1和步骤A2，使多个检测体系中含有PP7的滤液样品的单次检测量V单之和，大于等于30mL，本实施例中，重复步骤A1和A2，至总检测量为30mL即可。
本实施例中，为了验证检测结果的准确性，分别以总检测量为V检和V检+5检测滤液的滴度，分别记为D0和D1，检测结果的偏差计算公式为：
偏差=（D0-D1）/D0*100%。
本申请实施例进一步公开了一种除病毒过滤器、过滤膜病毒截留能力的检测方法，通过分别检测滤液中PP7的滴度和挑战前样品PP7的滴度，并将数据进行对照，计算得到除病毒过滤器、过滤膜的病毒截留能力。其中，滤液中PP7的滴度参照前述记载的方法，挑战前样品PP7滴度检测按照TR41中的相关规定进行，并且安排在最后进行，以防止对滤液滴度检测结果造成干扰。挑战前样品PP7滴度检测方法大致记录如下：
取若干无菌试管（如10 mL），向其中加入1 mL扩培好的宿主菌P.aeruginosa（ATCC15692），取0.1mL挑战前样品（稀释度为10-4、10-5）加入该管中（每个稀释梯度进行两次平行检测），室温孵育5 min。将4.5 mL温热的软琼脂加入该噬菌体-细菌混合物。吹打混合一两次。倒入90 mm琼脂平板表面。轻轻旋转平板以确保覆盖整个表面。待平板凝固后（室温10min），37°C下倒置培养过夜。以每块平板上的噬菌斑个数进行分析，可采用灯箱辅助观察，根据稀释度和计数值计算测试样品中的噬菌体浓度pfu/mL，记录。
实施例2
实施例2与实施例1的不同之处主要在于，在确定滤液的总检测量时，取样修正系数b取值不同。本实施例中取V总=200mL，即属于250＞V总≥180，此时，取b=2，因此，本实施例的含有PP7的滤液样品的总检测量由下式计算得到：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
。
根据上式计算，本实施例滤液的总检测量为32mL，因此，需要重复步骤A1和步骤A2，使多个检测体系中含有PP7的滤液样品的单次检测量V单之和，大于等于32mL，本实施例中，重复步骤A1和A2，至总检测量为30mL即可。
含有PP7的滤液样品的单次检测量以及检测体系中各物料的配比与实施例1相同，不赘述。
实施例3
实施例3与实施例1的不同之处在于，本实施例中取V总=160mL，即V总＜180，此时，取b=-1，因此，本实施例含有PP7的滤液样品的总检测量由下式计算得到：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
。
根据上式计算，本实施例滤液的总检测量为23mL，因此，需要重复步骤A1和步骤A2，使多个检测体系中含有PP7的滤液样品的单次检测量V单之和，大于等于23mL，本实施例中，重复步骤A1和A2，至总检测量为23mL即可。
含有PP7的滤液样品的单次检测量以及检测体系中各物料的配比与实施例1相同，不赘述。
实施例4
实施例4与实施例1的不同之处在于，本实施例中取V总=300mL，即属于V总≥250，此时，取b=3，因此，本实施例含有PP7的滤液样品的总检测量由下式计算得到：
Figure DEST_PATH_IMAGE010
。
根据上式计算，本实施例滤液的总检测量为48mL，因此，需要重复步骤A1和步骤A2，使多个检测体系中含有PP7的滤液样品的单次检测量V单之和，大于等于48mL，本实施例中，重复步骤A1和A2，至总检测量为48mL即可。
含有PP7的滤液样品的单次检测量以及检测体系中各物料的配比与实施例1相同，不赘述。
实施例5
实施例5与实施例4的不同之处在于，在V总=300mL时，取b=0，其余与实施例4相同，不赘述。
实施例6-17
实施例6-17中超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法相同，均包括以下工艺步骤：
A1、检测体系复配，检测体系按照下表中的配比进行复配，将含有PP7的滤液样品、宿主菌液混合并室温放置5min后，将温热的软琼脂加入，以无菌滴管吹打混合两次，即得检测体系。
A2、培养计数，将检测体系加入150mm营养琼脂固体平板表面，旋转平板确保其混合均匀并完全覆盖在下层琼脂固体平板上。随后将平板室温放置至完全凝固（放置时间不小于10min），将平板转移至37℃培养箱中倒置培养过夜。培养结束后，以每块平板上的噬菌斑个数进行分析，可采用灯箱辅助观察，根据计数值计算测试样品中的噬菌体浓度pfu/mL，记录。
A3、重复步骤A1和A2共三次。
前述各步骤中，所用缓冲液均为PBS缓冲液。
需要注意的是，由于含有PP7的滤液样品中PP7的滴度越低，操作误差等对于结果的影响就越大，为了适当减小操作误差带来的影响，在实施例6-17中，以PP7滴度为10pfu/mL（即2000pfu/200mL，将单次检测量扩大至5~10mL后，重复三次A1和A2的检测方法的检测限必然低于2000pfu/200mL）的测试液模拟含有PP7的滤液样品（仍属于超低滴度的滤液）。由于所有测试液均为统一配制，因此，能够降低滤液对于检测结果的影响。PP7滴度为10pfu/mL的测试液的配制方法为：提前一天采用双层琼脂覆盖法对PP7进行培养，以双层平板法进行计数后，将培养液稀释为PP7滴度为约10pfu/mL的测试液。为了更贴近实际滤液的成分，测试液中需添加0.1g/L的BSA（模型蛋白也可根据需要选择IVIG）。
除此之外，实施例6-17中除病毒过滤器、过滤膜病毒截留能力的检测方法与实施例1相同，不赘述。
实施例6-17中，为了验证检测结果的准确性，在总检测量保持相同的前提下，参照TR41中的检测方法，对滤液的滴度进行检测。即，检测体系按照1mL含有PP7的滤液样品、2mL宿主菌液、9mL琼脂液的配比进行复配（琼脂液的浓度为0.7%）。例如，由于实施例5重复进行三次试验后，总检测量为15mL，故需要按照TR41的方法进行15次单次检测量为1mL的试验。其中，当单次检测量为5-10mL时测得的滤液滴度记为D2，单次检测量为1mL时测得的滤液滴度记为D3，检测结果的偏差计算公式为：
偏差=（D2-D3）/D2*100%。
实施例6-17中各物料的组成记为下表：
Figure DEST_PATH_IMAGE011
需要注意的是，由于实施例16中配制得到的检测体系总体积量过大，在倒置培养时脱落，故不再进行进一步的实验。
实施例17为按照TR41文件中检测体系的等比放大，即从TR41规定的含有PP7的滤液样品1mL、宿主菌液2mL、琼脂液9mL；在将含有PP7的滤液样品放大为5mL后，将宿主菌液等比例放大为10mL，将琼脂液等比例放大为45mL。由于检测体系的总量过大，已经超出150mm培养皿的容量，无法进行进一步的实验。进一步尝试在240mm的方形培养皿中进行培养计数，倒置培养时掉落，无法进一步实验。
实施例18
实施例18与实施例1的不同之处在于，缓冲液为醋酸缓冲液，而非PBS缓冲液。在此基础上，琼脂液以氢氧化钠调节pH为7.6。需要注意的是，本实施例计算检测结果的偏差时，以实施例1中测得的V检+5时的滴度数据为基准。即，本实施例测得的滴度数据记为D4，实施例1中以V检+5检测滤液的滴度记为D1，检测结果的偏差计算公式为：
偏差=（D4-D1）/D4*100%。
实施例19
实施例19与实施例18的不同之处在于，缓冲液为醋酸缓冲液，而非PBS缓冲液，而琼脂液仍为温热的软琼脂，并未调节其pH值。
对比例1
对比例1和实施例1所使用的滤液相同，对比例1与实施例1的不同之处在于，含有PP7的滤液样品的总检测量通过下式计算得到：
Figure 779832DEST_PATH_IMAGE002
；
上式中，k为取样系数，k=0.03；
V总为滤液的体积总量；
b为取样修正系数，b=0。
由于V总为200mL，根据上式，滤液的总检测量为6mL。
对比例2
对比例2与实施例1的不同之处在于，含有PP7的滤液样品的总检测量V检为1mL。
性能检测
一、检测体系的粘度、密度
以各实施例或对比例中的检测体系作为检测对象，采用BrookField DV2T粘度计检测其粘度和密度，记录读数。
二、检测体系凝固后的强度
以各实施例或对比例中的检测体系作为检测对象，采用TA-XT plus质构仪，采用P/0.5探头，测试前下压速度为1mm/s，测试过程中下压速度为0.5mm/s，形变65%、停留时间2s、触发力5g，记录读数。
三、检测体系和宿主菌液的吸光度
以各实施例或对比例中的检测体系以及振荡培养后得到的宿主菌液作为检测对象，通过Cary 3500紫外可见分光光度计分别测定其在550nm处的吸光度，计算两者的比值，记录为吸光度之比。需要注意的是，由于宿主菌液为统一配制得到，故各实施例、对比例中所使用的宿主菌相同。
检测结果记为下表：
粘度（cp） 掉落力（g/cm<sup>2</sup>） 强度（g/cm<sup>2</sup>） 强度/掉落力 吸光度之比 偏差（%）
实施例1 / / / / / 6.3
实施例2 / / / / / 6.8
实施例3 / / / / / 4.4
实施例4 / / / / / 4.7
实施例5 / / / / / 9.6
实施例6 5.4 0.07 40.3 547 2.3037 20.86
实施例7 5.8 0.07 92.5 1257 2.3011 5.04
实施例8 8.2 0.12 164.3 1382 2.1112 -73.4
实施例9 4.8 0.08 40.7 479 2.3389 14.62
实施例10 5.2 0.08 98.2 1156 2.3104 1.17
实施例11 3 0.12 61.1 514 2.1729 7.42
实施例12 3.7 0.12 131.2 1103 2.2254 -23.58
实施例13 6.0 0.13 61.3 471 2.2112 -20.0
实施例14 4.8 0.16 62.2 379 2.1227 -27.0
实施例15 4.2 0.19 62.4 334 2.1592 -29.8
实施例16 / / / / / /
实施例17 / / / / / /
实施例18 / / / / / -25.6
实施例19 / / / / / -52.1
对比例1 / / / / / -65.7
对比例2 / / / / / -90
结论
通过比较实施例1-5和对比例1-2的技术方案和上表中的数据，不难看出，对于超低病毒滴度的滤液而言，进行滴度检测时的总检测量对于最终结果的准确性影响巨大。以本申请中特定公式确定的滤液总检测量能够确保获得的检测结果具有较高的准确性。进一步的，通过比较实施例1-3的方案和数据，不难发现，以滤液样品的体积总量为基础，综合取样系数，已经能够获得准确度较高的检测结果。在此基础上，以修正系数对总检测量进行调整，当滤液的体积总量较低时，修正系数能够降低工作量；当滤液样品的体积总量较大时，通过修正系数b对总检测量进行适当上调，能够明显提高检测结果的准确性。
通过比较实施例6-15的技术方案和上表中的数据，不难看出，相较于TR41中规定的单次检测量为1mL，当单次检测量为5-10mL时，只需检测体系的组成配比是合理的，获得的检测结果准确性较高。优选的，单次检测量为5-7mL时的检测结果准确性更高。
进一步的，通过比较实施例6-8的技术方案和上表中的数据，不难看出，即使确定了合理的单次检测检测量，检测体系中各物料的组成配比对于最终的检测结果同样有十分明显的影响。实施例8中由于添加了过量的琼脂，最终检测结果的偏差相较于实施例6-7就产生了十分明显的差异。
通过比较实施例6-8与实施例17的技术方案和上表中的数据，不难看出，虽然一般的想法是，单次取样量放大后，检测体系中其余组成物的用量也等比放大即可。然而，若直接将其余物料等比放大，根本不具有可操作性，检测结果的准确性更无从保证。
通过比较实施例1和实施例18-19的技术方案和上表中的数据，不难看出，为了更贴近实际生产环境，选用醋酸缓冲液。但是在使用醋酸缓冲液后，最终测得的滴度有十分明显的降低，考虑到实施例1和实施例18-19的测试液为统一配置，滴度应当相同，这一结果说明实施例18-19的滴度检测结果偏低。并且，通过氢氧化钠将琼脂液的pH调整为弱碱性后，检测结果的偏差明显降低。这可能是由于醋酸缓冲液导致检测体系的pH过低，对于宿主菌生长产生了抑制作用，导致检测结果明显偏低。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (9)

1.一种超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法，其特征在于：采用双层平板法，检测滤液中PP7的滴度，包括以下工艺步骤：
A1、检测体系复配，将含有PP7的滤液样品、宿主菌液和琼脂液复配混合，得到检测体系；
A2、培养计数，将检测体系放到带有下层琼脂的平板上，待培养液凝固后倒置培养过夜，对平板上的噬菌斑进行计数，计算得到滤液中PP7的滴度；
A3、重复步骤A1和步骤A2，至含有PP7滤液样品的总检测量达到V检；
其中，含有PP7的滤液样品的总检测量由下式计算得到：
Figure 956411DEST_PATH_IMAGE001
；
上式中，
V检为样品滴度检测时，含有PP7的滤液样品的总检测量，单位为mL；
V总为滤液的体积总量，400≥V总≥80；
k为取样系数，0.5≥k≥0.075；
b为取样修正系数，当V总＜180时，0≥b≥-1；当250＞V总≥180时，2≥b≥0；当V总≥250时，3≥b≥0；
所述超低病毒滴度体系是指，采用LRV＞5的滤膜获得的滤液；且该检测方法的检测限不高于40pfu。
2.根据权利要求1所述的超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法，其特征在于：检测滤液中PP7的滴度时，以双层平板法检测取得的含有PP7的滤液样品的滴度，含有PP7的滤液样品的单次检测量V单满足下式：
Figure 820462DEST_PATH_IMAGE002
；
上式中，
S板为培养皿的底面积；
h为检测体系在培养皿中的高度，h≤23mm；
P为体积系数，4≥P≥2。
3.根据权利要求1或2所述的超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法，其特征在于：检测滤液中PP7的滴度时，检测体系包括含有PP7的滤液样品、宿主菌液和琼脂液，且各组分的体积份数如下：
含有PP7的滤液样品 5~10mL；
宿主菌液 2~8mL；
琼脂液 4~17mL；
所述检测体系凝固后的强度为（30~150）g/cm2。
4.根据权利要求3所述的超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法，其特征在于：所述检测体系凝固后所受掉落力为（0.05~0.25）g/cm2，所述检测体系凝固后的强度为掉落力的（200~1300）倍。
5.根据权利要求3所述的超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法，其特征在于：所述宿主菌液的OD550与所述检测体系的OD550之比为2.0~2.5。
6.根据权利要求3所述的超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法，其特征在于：所述检测体系的粘度为（2.5~7.0）cp@45℃。
7.根据权利要求3所述的超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法，其特征在于：PP7分散于酸性缓冲液，所述酸性缓冲液的pH为4~6；所述琼脂液配制完成后调节pH至7.4~8.0。
8.根据权利要求3所述的超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法，其特征在于：所述检测体系包括以下体积份数的原料：
含有PP7的滤液样品 5~7mL；
宿主菌液 2~5mL；
琼脂液 4~13mL。
9.权利要求1~8任一项所述的超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法在除病毒过滤器、过滤膜病毒截留能力检测中的应用。
CN202211100443.9A 2022-08-10 2022-09-09 一种超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法及其应用 Active CN115181816B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2022109575117 2022-08-10
CN202210957511 2022-08-10

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115181816A CN115181816A (zh) 2022-10-14
CN115181816B true CN115181816B (zh) 2023-01-06

Family

ID=83524450

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211100443.9A Active CN115181816B (zh) 2022-08-10 2022-09-09 一种超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115181816B (zh)

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1687460A (zh) * 2005-03-14 2005-10-26 浙江大学 评价膜法过滤空气和水环境中病毒效果的检测方法
EP2725033A1 (en) * 2011-06-24 2014-04-30 Asahi Kasei Kuraray Medical Co., Ltd. Method for producing protein preparation
CN104313182A (zh) * 2014-10-23 2015-01-28 山东京青农业科技有限公司 一种噬菌体的检测方法
CN104531895A (zh) * 2014-11-25 2015-04-22 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 一种测定病毒滴度的方法
AU2016206243A1 (en) * 2015-07-23 2017-02-09 Grifols, S.A. Methods for purification of a virus produced in vitro and clearance assay for the virus
CN108342368A (zh) * 2018-01-25 2018-07-31 武汉珈创生物技术股份有限公司 一种低pH孵育病毒灭活的验证方法
CN110904276A (zh) * 2019-12-23 2020-03-24 苏州良辰生物医药科技有限公司 噬菌体在生物制品病毒清除工艺验证中的应用
CN114592033A (zh) * 2022-01-28 2022-06-07 上海铣利商务咨询中心 一种适用于生物大分子药物的病毒过滤验证方法及应用
CN114653221A (zh) * 2022-04-27 2022-06-24 杭州科百特过滤器材有限公司 一种低非特异性吸附的除病毒多孔膜及其制备方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111235309B (zh) * 2020-01-20 2022-09-30 湖南农业大学 一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量pcr方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1687460A (zh) * 2005-03-14 2005-10-26 浙江大学 评价膜法过滤空气和水环境中病毒效果的检测方法
EP2725033A1 (en) * 2011-06-24 2014-04-30 Asahi Kasei Kuraray Medical Co., Ltd. Method for producing protein preparation
CN104313182A (zh) * 2014-10-23 2015-01-28 山东京青农业科技有限公司 一种噬菌体的检测方法
CN104531895A (zh) * 2014-11-25 2015-04-22 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 一种测定病毒滴度的方法
AU2016206243A1 (en) * 2015-07-23 2017-02-09 Grifols, S.A. Methods for purification of a virus produced in vitro and clearance assay for the virus
CN108342368A (zh) * 2018-01-25 2018-07-31 武汉珈创生物技术股份有限公司 一种低pH孵育病毒灭活的验证方法
CN110904276A (zh) * 2019-12-23 2020-03-24 苏州良辰生物医药科技有限公司 噬菌体在生物制品病毒清除工艺验证中的应用
CN114592033A (zh) * 2022-01-28 2022-06-07 上海铣利商务咨询中心 一种适用于生物大分子药物的病毒过滤验证方法及应用
CN114653221A (zh) * 2022-04-27 2022-06-24 杭州科百特过滤器材有限公司 一种低非特异性吸附的除病毒多孔膜及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A Consensus Rating Method for Small Virus-Retentive Filters.I.Method Development;Scott Lute et al.;《PDA J Pharm Sci and Tech 》;20081031;第62卷(第5期);第318-333页 *
痘苗病毒滴度测定用国家标准品的制备;黄维金 等;《中国生物制品学杂志》;20120930;第25卷(第9期);第1099-1101页、1105页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN115181816A (zh) 2022-10-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2661764C2 (ru) Композиции и способы на основе dac hyp
Lubiniecki et al. Process validation for cell culture-derived pharmaceutical proteins
Fischer Growth of fibroblasts and hydrogen ion concentration of the medium
CN115181816B (zh) 一种超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法及其应用
CN112359139A (zh) 利用组织半数感染法染色测定异嗜性鼠白血病病毒滴度的方法
Tsao et al. Development and improvement of a serum-free suspension process for the production of recombinant adenoviral vectors using HEK293 cells
Slesinski et al. Mutagenicity evaluation of glutaraldehyde in a battery of in vitro bacterial and mammalian test systems
Häge et al. The complex regulatory role of cytomegalovirus nuclear egress protein pUL50 in the production of infectious virus
RU2657808C1 (ru) Способ определения продукции интерферонов как параметров врожденного иммунитета
CN111850086A (zh) 注射用伏立康唑的无菌检测方法
CN111020060A (zh) 一种利用空斑染色测定异嗜性鼠白血病病毒滴度的方法
CN103554252B (zh) 一种巨细胞人免疫球蛋白及其制备方法
Thorén et al. Heat conduction microcalorimetry of overall metabolism in rabbit alveolar macrophages in monolayers and in suspensions
Finter [2] Standardization of assay of interferons
RU2463610C1 (ru) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ПАНЕЛИ СЫВОРОТОК С HBsAg AD- И AY-СУБТИПОВ ДЛЯ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ДИАГНОСТИКИ ГЕПАТИТА В
CN1664584A (zh) 一种抗原抗体稀释液及其形成的质控品
Wilson et al. Death and division of lymphocytes: neglected factors in assessment of PHA-induced transformation
CN109055309A (zh) 一种无血清细胞培养基及其用途
CN112029815B (zh) B群链球菌培养基及其制备方法
JP7135096B2 (ja) ポロキサマー組成物ならびにその製造方法およびその使用
CN111138523A (zh) 一种从重组鸡干扰素α复性液中纯化制备重组鸡干扰素α的方法
CN110964695B (zh) 一种细胞株及其增殖检测rhIL-12体外活性的方法
Pérez et al. Validation of model virus removal and inactivation capacity of an erythropoietin purification process
CN111172326A (zh) 一种体外检测rhTSG-6抗病毒活性的方法及rhTSG-6在抗病毒药物中的应用
EP3805375A1 (en) Method for in vitro reprogramming of fibroblasts into sertoli cells and application thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant