CN112029815B - B群链球菌培养基及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供一种B群链球菌培养基及其制备方法。上述的B群链球菌培养基包括基础液、促生长剂、缓冲剂、杂菌抑制剂和显色干粉，其中，杂菌抑制剂包括多粘菌素、氨曲南、甲硝唑和氟康唑。上述的B群链球菌培养基分析特异性较强。上述的B群链球菌培养基制备方法制备得到的B群链球菌培养基重复性好，并且制备得到的B群链球菌培养基稳定性较高。

Description

B群链球菌培养基及其制备方法
技术领域
本发明涉及B群链球菌检测技术领域，特别是涉及一种B群链球菌培养基及其制备方法。
背景技术
B群链球菌(GroupBStreptococcal，GBS)学名无乳链球菌，为革兰氏阳性球菌，B群链球菌主要寄居于阴道和直肠。临床B群链球菌感染极易引起孕妇感染，同时诱发早产率高达60％，新生儿在母亲B群链球菌检查阳性但没有接受治疗的情况下出生，约有2％最终发展成为侵袭性疾病，早发型感染80％(生后7天以内)主要引起肺炎和败血症，B群链球菌感染是新生儿死亡的主要原因之一。因此，B群链球菌筛查是围产期孕妇的主要指标，可以为临床早期诊断、早期治疗以及疗效观察提供科学的依据。
B群链球菌筛查主要有两种方法，第一种是使用检测试剂盒进行快速诊断，但是通过检测试剂盒进行快速诊断对操作的要求高和成本较高；第二种是目前最常见的方法，是利用培养基对取得的样品进行培养，然后通过直接观察法、革兰氏染色法、触酶试验、协同溶血试验等判断是否感染B群链球菌，但孕妇生殖道和直肠有多种细菌存在，目前的培养基不能有效抑制B群链球菌以外的其他菌的生长，加上B群链球菌营养要求较高以及B群链球菌以外的其他菌生长速度快，常使B群链球菌生长受到抑制，造成B群链球菌漏检。
因此，亟需解决B群链球菌漏检的问题。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足之处，提供一种B群链球菌培养基及其制备方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种B群链球菌培养基，包括基础液、促生长剂、缓冲剂、杂菌抑制剂和显色干粉。
其中，所述杂菌抑制剂包括多粘菌素、氨曲南、甲硝唑和氟康唑。
在其中一个实施例中，每升B群链球菌培养基中包括如下含量的各组分：基础液10ml～22ml、促生长剂50.1ml～110ml、缓冲剂8.5ml～10ml、杂菌抑制剂 5mg～10mg、显色干粉0.1mg～0.5mg和余量纯化水。
在其中一个实施例中，所述促生长剂包括促生长血清和促生长添加剂，所述促生长血清和所述促生长添加剂的体积比为(5～10)：(0.01～1)。
在其中一个实施例中，所述促生长添加剂为葡萄糖、丙酮酸钠、亚硫酸钠、可溶性淀粉、甲氨蝶呤和酵母浸膏中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述促生长血清为马血清和胎牛血清中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述缓冲剂选自磷酸氢二钠缓冲剂、磷酸二氢钾缓冲剂或硫酸镁缓冲剂。
在其中一个实施例中，所述显色干粉选自氯化三苯基四氮唑盐、噻唑蓝、甲氨蝶呤或苯酚红。
一种B群链球菌培养基制备方法，用于制备上述任一实施例所述的B群链球菌培养基，所述B群链球菌培养基制备方法包括如下步骤：
进行工艺制水操作，制得所述纯化水；
向所述基础液中加入所述纯化水进行促溶操作，制得A液；
向所述显色干粉中加入所述纯化水进行第一溶解操作，制得B液；
逐一向所述多粘菌素、所述氨曲南、所述甲硝唑和所述氟康唑加入所述纯化水进行第二溶解操作，制得C液；
将所述A液加入所述B液进行第一混合操作，得到第一混合液；
将所述促生长剂和所述缓冲剂加入所述第一混合液中进行第三溶解操作；
向所述第一混合液中逐一加入所述C液进行第二混合操作，加入所述纯化水进行定容操作，得到B群链球菌培养液；
对B群链球菌培养液进行分装操作，得到B群链球菌培养基。
在其中一个实施例中，在所述第一混合操作之后，且在所述第三溶解操作之前，还包括如下步骤：
在110℃～121℃温度下，对所述B群链球菌培养液进行高压蒸汽灭菌，灭菌处理15min～30min，取出冷却。
在其中一个实施例中，在所述定容操作之后，且在所述分装操作之前，还包括如下步骤：
将所述B群链球菌培养液采用孔径为0.1μm～0.2μm和0.4～0.5μm的滤膜进行过滤除菌。
与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：
1、本发明B群链球菌培养基中运用了多粘菌素、氨曲南、甲硝唑和氟康唑对B群链球菌以外的杂菌进行生长抑制，其中，多粘菌素的作用对象为革兰阴性菌，尤其是大肠埃希菌，大肠埃希菌是孕妇肛门括约肌约2～5cm处取样中的含量较多的B群链球菌以外的杂菌，且生长速度快，容易抑制B群链球菌的生长，采用多粘菌素对大肠埃希菌进行抑制生长作用，有效地避免了B群链球菌生长受到抑制，提高了B群链球菌的分析特异性；氨曲南的作用对象为需氧革兰阴性菌，尤其是肺炎克雷伯菌和伤寒沙门氏菌，与多粘菌素合用可以增强相互之间的抑菌效果，提高了对B群链球菌以外的杂菌的抑制效果；甲硝唑的作用对象为革兰阴性厌氧菌，甲硝唑与氨曲南联合使用增强了相互的抑菌效果，有效地避免了B群链球菌生长受到抑制，提高了B群链球菌的分析特异性；氟康唑的作用对象为真菌，对白色念珠菌和黑曲霉菌具有较好的抑制作用，有效地避免了B群链球菌生长受到抑制，提高了B群链球菌的分析特异性。因此，多粘菌素、氨曲南、甲硝唑和氟康唑较全面地抑制B群链球菌以外的杂菌的生长，且多粘菌素、氨曲南和甲硝唑具有联合作用，增强了多粘菌素、氨曲南和甲硝唑相互之间的作用效果，进一步增强了对B群链球菌以外的杂菌的生长抑制效果，提高了B群链球菌的分析特异性。
2、本发明B群链球菌培养基制备方法中先依次将溶解的基础液、显色干粉、促生长剂和缓冲剂进行混合，再将溶解的杂菌抑制剂逐一进行混合，虽然氨曲南和甲硝唑在体外联合使用有配伍禁忌，但是由于各杂菌抑制剂逐一加入，且杂菌抑制剂的用量小，充分用纯化水进行溶解稀释后再进行混合，不会出现氨曲南和甲硝唑在体外联合使用降低效果的情况，并且本发明的多粘菌素、氨曲南、甲硝唑和氟康唑联合使用，在多粘菌素、氨曲南、甲硝唑和氟康唑的用量均较小的情况下，却能达到更好的抑菌效果。
3、本发明B群链球菌培养基制备方法制备得到的B群链球菌培养基重复性好，并且制备得到的B群链球菌培养基稳定性较高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明一实施方式B群链球菌培养基制备方法的步骤流程图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施方式。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容理解的更加透彻全面。
需要说明的是，当元件被称为“固定于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的，并不表示是唯一的实施方式。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本申请提供一种B群链球菌培养基，包括基础液、促生长剂、缓冲剂、杂菌抑制剂和显色干粉，其中，杂菌抑制剂包括多粘菌素、氨曲南、甲硝唑和氟康唑。
上述的B群链球菌培养基中运用了多粘菌素、氨曲南、甲硝唑和氟康唑对B 群链球菌以外的杂菌进行生长抑制，其中，多粘菌素的作用对象为革兰阴性菌，尤其是大肠埃希菌，大肠埃希菌是孕妇肛门括约肌约2～5cm处取样中的含量较多的B群链球菌以外的杂菌，且生长速度快，容易抑制B群链球菌的生长，采用多粘菌素对大肠埃希菌进行抑制生长作用，有效地避免了B群链球菌生长受到抑制，提高了B群链球菌的分析特异性；氨曲南的作用对象为需氧革兰阴性菌，尤其是肺炎克雷伯菌和伤寒沙门氏菌，与多粘菌素合用可以增强相互之间的抑菌效果，提高了对B群链球菌以外的杂菌的抑制效果；甲硝唑的作用对象为格兰阴性厌氧菌，甲硝唑与氨曲南联合使用增强了相互的抑菌效果，有效地避免了B群链球菌生长受到抑制，提高了B群链球菌的分析特异性；氟康唑的作用对象为真菌，对白色念珠菌和黑曲霉菌具有较好的抑制作用，有效地避免了B群链球菌生长受到抑制，提高了B群链球菌的分析特异性。因此，多粘菌素、氨曲南、甲硝唑和氟康唑较全面地抑制B群链球菌以外的杂菌的生长，且多粘菌素、氨曲南和甲硝唑具有联合作用，增强了多粘菌素、氨曲南和甲硝唑相互之间作用的效果，进一步增强了对B群链球菌以外的杂菌的生长抑制效果，提高了B群链球菌的分析特异性。
需要说明的是，在上述B群链球菌培养基中，基础液的作用是为B群链球菌提供基本营养物质；促生长剂的作用是提高B群链球菌生长速度，进而缩短 B群链球菌的培养时间，提高了B群链球菌培养基的分析灵敏度；缓冲剂的作用是降低B群链球菌培养基中pH的变动幅度，保持B群链球菌培养基中PH值的稳定，提高了B群链球菌培养基缓冲环境的稳定性；杂菌抑制剂的作用为抑制B群链球菌以外的杂菌生长，但对B群链球菌的生长抑制作用小或不影响B 群链球菌的生长；显色干粉的作用为使B群链球菌在生长过程中可显色，用于辅助判断培养基中是否存在B群链球菌。
在其中一个实施例中，每升B群链球菌培养基中包括如下含量的各组分：基础液10ml～22ml、促生长剂50.1ml～110ml、缓冲剂8.5ml～10ml、杂菌抑制剂5mg～10mg、显色干粉0.1mg～0.5mg和余量纯化水。
可以理解的是，在本发明B群链球菌培养基中基础液和促生长剂的含量较大，当每升B群链球菌培养基中基础液为10ml～22ml和促生长剂为50.1ml～110ml 时，可以有效地提高B群链球菌的生长速度，进而缩短B群链球菌的培养时间，提高了B群链球菌培养基的分析灵敏度，若基础液和促生长剂的含量较小，则 B群链球菌需要培养较长的时间，会降低B群链球菌培养基的分析灵敏度，若基础液和促生长剂的含量较大，一方面会增加B群链球菌培养基的成本，另一方面会降低杂菌抑制剂作用，因为B群链球菌培养基的营养含量过剩，B群链球菌以最快速度繁殖的情况下，会对B群链球菌以外的杂菌也起到促进生长的作用，进而会降低杂菌抑制剂对B群链球菌以外的杂菌的抑制生长效果。每升 B群链球菌培养基中缓冲剂的用量为8.5ml～10ml，可以有效保持B群链球菌培养基中PH值的稳定，若缓冲剂的用量较小，则会造成B群链球菌培养基的PH 值的波动较大，不利于B群链球菌的生长，若缓冲剂的用量较大，会造成B群链球菌培养基的电导率过大，不符合培养基的基本要求。在每升B群链球菌培养基中，杂菌抑制剂的用量为5mg～10mg时，即可对B群链球菌以外的杂菌起到较好的抑制作用，由于在B群链球菌培养基中不需要使用大量的杂菌抑制剂，进而也减少了杂菌抑制剂对B群链球菌的抑制效果，进一步降低了杂菌抑制剂对B群链球菌生长的影响。在每升B群链球菌培养基中，显色干粉的含量为 0.1mg～0.5mg时，即可明显使B群链球菌在生长过程中可显色。
在其中一个实施例中，基础液为脑心浸出琼脂培养基、
Figure RE-GDA0002737990300000061
蛋白胨琼脂培养基和葡萄糖蛋白胨琼脂培养基中的至少一种。可以理解的是，脑心浸出琼脂培养基、
Figure RE-GDA0002737990300000062
蛋白胨琼脂培养基和葡萄糖蛋白胨琼脂培养基中含有B群链球菌生长必须的碳源、氮源、水和无机盐类营养物质，为B群链球菌培养提供最基本的营养物质。
在其中一个实施例中，促生长剂包括促生长血清和促生长添加剂，促生长血清和促生长添加剂的体积比为(5～10)：(0.01～1)。可以理解的是，促生长血清为B群链球菌培养提供生长因子类型的营养物质，有利于B群链球菌的快速生长。促生长添加剂以辅助的形式为B群链球菌培养提供补充的最基本营养物质、微量元素或形成有利于B群链球菌生长、显色的环境，以配合促生长血清促进B群链球菌的快速生长。
由于B群链球菌培养鉴定耗时较长，一般培养基至少需要2天，为了减短B 群链球菌培养鉴定的时间，在其中一个实施例中，促生长添加剂为葡萄糖、丙酮酸钠、亚硫酸钠、可溶性淀粉、甲氨蝶呤和酵母浸膏中的至少一种。可以理解的是，葡萄糖、丙酮酸钠的加入为B群链球菌培养提供补充的碳源，有利于 B群链球菌的快速生长。可溶性淀粉可以为B群链球菌培养提供补充的碳源和形成有利于B群链球菌显色的环境，有利于B群链球菌的培养和检测。甲氨蝶呤作为一种叶酸还原酶抑制剂，促使了细胞生长色素合成，有利于B群链球菌的生长。亚硫酸钠提高了B群链球菌培养基的稳定性，为B群链球菌的生长提供了一个稳定的环境，有利于B群链球菌的生长。酵母浸膏的作用是为B群链球菌培养提供补充的氨基酸、维生素、核苷酸类的营养物质及微量元素，有利于B群链球菌的快速生长。
由于B群链球菌培养鉴定耗时较长，一般培养基至少需要2天，为了减短B 群链球菌培养鉴定的时间，在其中一个实施例中，促生长血清为马血清和胎牛血清中的至少一种。可以理解的是，马血清和胎牛血清均为天然培养基，均可以为B群链球菌的生长提高生长因子、维生素和蛋白类物质，将马血清和胎牛血清联合使用于B群链球菌培养基中，由于成分的互相补充，形成更加有利于 B群链球菌生长的环境，进一步提高了B群链球菌的生长速度。
在其中一个实施例中，缓冲剂选自磷酸氢二钠缓冲剂、磷酸二氢钾缓冲剂或硫酸镁缓冲剂。可以理解的是，磷酸氢二钠缓冲剂、磷酸二氢钾缓冲剂或硫酸镁缓冲剂均可以为B群链球菌提供一个PH稳定的生长环境，提高了B群链球菌生长稳定性。
在其中一个实施例中，显色干粉选自氯化三苯基四氮唑盐、噻唑蓝、甲氨蝶呤或苯酚红。上述的氯化三苯基四氮唑盐、噻唑蓝、甲氨蝶呤或苯酚红的显色灵敏且不会发生褪色。当B群链球菌培养基中存在B群链球菌时，其中，氯化三苯基四氮唑盐的颜色变化为无色变为橙红色；噻唑蓝的颜色变化为浅黄色变蓝色；甲氨蝶呤的颜色变化为浅黄色变红色；苯酚红的颜色变化为浅黄色变红色。
一种B群链球菌培养基制备方法，用于制备上述任一实施例的B群链球菌培养基，B群链球菌培养基制备方法包括如下步骤：进行工艺制水操作，制得纯化水；向基础液中加入纯化水进行促溶操作，制得A液；逐一向多粘菌素、氨曲南、甲硝唑和氟康唑加入纯化水进行第二溶解操作，制得C液；将A液加入B液进行第一混合操作，得到第一混合液；将促生长剂和缓冲剂加入第一混合液中进行第三溶解操作；向第一混合液中逐一加入C液进行第二混合操作，加入纯化水进行定容操作，得到B群链球菌培养液；及对B群链球菌培养液进行除菌操作，分装得到B群链球菌培养基。
上述的B群链球菌培养基制备方法中先依次将溶解的基础液、显色干粉、促生长剂和缓冲剂进行混合，再将溶解的杂菌抑制剂逐一进行混合，虽然氨曲南和甲硝唑在体外联合使用有配伍禁忌，但是由于各杂菌抑制剂逐一分开加入，且杂菌抑制剂的用量小，充分用纯化水进行溶解稀释后再进行混合，不会出现氨曲南和甲硝唑在体外联合使用降低效果的情况，并且本发明的多粘菌素、氨曲南、甲硝唑和氟康唑联合使用，在多粘菌素、氨曲南、甲硝唑和氟康唑用量均较小的情况下，却能达到更好的抑菌效果。且上述的B群链球菌培养基制备方法制备得到的B群链球菌培养基重复性好，并且制备得到的B群链球菌培养基稳定性较高。
为了更好地理解本发明B群链球菌培养基制备方法，以下对本发明B群链球菌培养基制备方法作进一步的解释说明，请参阅图1，一实施方式的B群链球菌培养基制备方法包括如下步骤：
S100、进行工艺制水操作，制得纯化水。可以理解的是，进行工艺制水操作之后得到的纯化水，符合电导率≤0.1μS/cm，有利于B群链球菌培养基的PH 的调整。
S200、向基础液中加入纯化水进行促溶操作，制得A液。此步骤需要在十万级以上的洁净区进行。可以理解的是，基础液溶于纯化水的速度较慢，基础液与纯化水形成稳定体系的时间较长，所以需要进行促溶操作，使基础液快速充分溶解于纯化水中形成稳定体系，提高了A液的制备速度。在本实施例中，促溶操作在加热条件下进行，加热至沸腾溶解，有效地加快了A液形成稳定体系的速度。
S300、向显色干粉中加入纯化水进行第一溶解操作，制得B液。此步骤需要在十万级以上的洁净区进行。可以理解的是，显色干粉的润湿性较差，较难与纯化水形成稳定的体系，所以需要进行第一溶解操作，加快显色干粉与纯化水形成稳定体系的速度，提高了B液的制备速度。在本实施例中，第一溶解操作在超声波振荡条件下进行，利用超声波振荡溶解显色干粉，有效地加快了显色干粉与纯化水形成稳定体系的速度。
S400、逐一向杂菌抑制剂中加入纯化水进行第二溶解操作，制得C逐一向多粘菌素、氨曲南、甲硝唑和氟康唑加入纯化水进行第二溶解操作，制得C液。此步骤需要在十万级以上的洁净区进行。逐一向杂菌抑制剂中加入纯化水进行第二溶解操作，使多粘菌素、氨曲南、甲硝唑和氟康唑逐一与纯化水形成稳定体系，可以理解的是，杂菌抑制剂的润湿性较差，较难与纯化水形成稳定的体系，所以需要进行第二溶解操作，加快杂菌抑制剂与纯化水形成稳定体系的速度。在本实施例中，第二溶解操作在超声波振荡条件下进行，利用超声波振荡溶解杂菌抑制剂，有效地加快了杂菌抑制剂与纯化水形成稳定体系的速度。
S500、将A液加入B液进行第一混合操作，得到第一混合液。此步骤需要在十万级以上的洁净区进行。可以理解的是，A液与B液的均为稳定体系，将 A液与B液混合较容易混合均匀，且混合后基础液和显色干粉的浓度均减小，纯化水的比例增加，有利于促生长剂和缓冲剂的溶解。
S600、将促生长剂和缓冲剂加入第一混合液中进行第三溶解操作。此步骤需要在十万级以上的洁净区进行。可以理解的是，基础液与促生长剂均为B群链球菌生长提供营养物质，若将基础液和促生长剂一同进行促溶操作，由于促生长剂在未与基础液混合前，促生长剂的有效成分在加热条件下容易被破坏，而基础液的加热温度太低则使基础液溶解不充分，不能与纯化水或促生长剂形成稳定的体系，所以需要先将基础液形成稳定体系后加入促生长剂再进行溶解，提高了B群链球菌培养基的制备速度和B群链球菌培养基的稳定性。在此步骤加入缓冲剂可以稳定第一混合液的PH，维持第一混合液为中性，避免了促生长剂中的有效成分失去活性。
S700、向第一混合液中逐一加入C液进行第二混合操作，加入纯化水进行定容操作，得到B群链球菌培养液。此步骤需要在十万级以上的洁净区进行。可以理解的是，C液包括未混合的多粘菌素、氨曲南、甲硝唑和氟康唑四种液体，在此步骤将C液逐一加入第一混合液，此时的纯化水含量大，加入第一混合液后的多粘菌素、氨曲南、甲硝唑和氟康唑的浓度均很小，所以氨曲南和甲硝唑并不会出现配伍禁忌，效果降低的情况，反而氨曲南和甲硝唑在B群链球菌培养基中联合使用，促进了抑制B群链球菌以外的杂菌的生长。虽然杂菌抑制剂的用量较小，但能较好的、较全面的抑制B群链球菌以外的杂菌的生长，提高了B群链球菌的分析特异性。
S800、对B群链球菌培养液进行除菌操作，分装得到B群链球菌培养基。此步骤需要在百万级以上的洁净区进行。可以理解的是，制备得到B群链球菌培养液后还需要进行除菌操作，避免前期制作过程中B群链球菌培养液被污染，最重要的是，在分装过程中选择分配型蠕动泵进行分装，提高了B群链球菌培养基的生产速度。
上述的B群链球菌培养基制备方法中先依次将溶解的基础液、显色干粉、促生长剂和缓冲剂进行混合，再将杂菌抑制剂逐一溶解进行混合，虽然氨曲南和甲硝唑在体外联合使用有配伍禁忌，但是由于各杂菌抑制剂逐一分开加入，且杂菌抑制剂的用量小，充分用纯化水进行溶解稀释后再进行混合，所以不会出现联合使用降低效果的情况；并且虽然杂菌抑制剂的用量小，但是能达到更好的抑菌效果。B群链球菌培养基制备方法制备得到的B群链球菌培养基重复性好，并且制备得到的B群链球菌培养基稳定性较高。
其中一个实施例中，在所述第一混合操作之后，且在所述第三溶解操作之前，还包括如下步骤：在110℃～121℃温度下，对所述B群链球菌培养液进行高压蒸汽灭菌，灭菌处理15min～30min，取出冷却。可以理解的是，基础液和显色干粉的耐高温性能较高，采用高压蒸汽灭菌先对其进行灭菌，可以达到更好地灭菌效果。
在其中一个实施例中，在所述定容操作之后，且在所述分装操作之前，还包括如下步骤：将所述B群链球菌培养液采用孔径为0.1μm～0.2μm和0.4～0.5μm 的滤膜进行过滤除菌。可以理解的是，生长促进剂中的有效物质具有活性，在高温下容易失活，故采用过滤的方式除菌，在前序采用高压蒸汽灭菌之后，再进一步对B群链球菌培养液进行过滤除菌，两者根据B群链球菌培养基中添加物质的性能采用分别采用高压蒸汽灭菌和过滤除菌，相互配合，更好地达到了除菌效果。
在其中一个实施例中，工艺制水操作包括如下步骤：
采聚丙烯熔喷滤芯过滤，能有效去除原水中的各种颗粒杂质。
采用颗粒活性炭过滤，可以理解的是，颗粒活性炭过滤滤芯采用天然果壳活性炭、椰壳活性炭或高质量媒质活性炭制作形成。采用颗粒活性炭过滤可有效去除原水中的杀虫剂、农药残余物、有机溶剂及其他因工业造成的化学污染物质，并具有对水进行脱色、去除异味的效果。
采用连续电除盐技术过滤除去原水中的余氯、钙离子和镁离子。
采用RO膜过滤，可以进一步过滤除去原水中的无机盐、重金属离子、有机物、胶体、细菌和病毒。
采用超滤芯过滤，使得到的纯化水符合电导率≤0.1μS/cm，有利于B群链球菌培养基的PH的调整。
上述的工艺制水操作较全面地过滤除去了原水中的颗粒物质、无机盐、重金属离子、有机物、胶体、细菌和病毒，使得到的纯化水符合电导率≤0.1μS/cm，有利于B群链球菌培养基的PH的调整。
在其中一个实施例中，向第一混合液中加入C液进行第二混合操作具体包括如下步骤：
将C液中的多粘菌素溶液和C液中的氟康唑溶液加入第一混合液中进行混合。先将多粘菌素溶液和氟康唑溶液加入第一混合液中进行混合，可以提高第一混合液中纯化水的含量，使甲硝唑溶液加入后可以快速分散均匀，且使甲硝唑的浓度较低，不会与氨曲南发生相互反应。在此步骤中，由于缓冲剂的存在，所以经过混合后的第一混合液的PH较稳定，使混合后的第一混合液中的各有效物质形成稳定体系。
将C液中的氨曲南溶液加入第一混合液中进行混合，可以理解的是，先将氨曲南溶液加入第一混合液中进行混合，可以进一步提高第一混合液中纯化水的含量，使甲硝唑溶液加入后可以快速分散均匀，且使甲硝唑的浓度较低，不会与氨曲南发生相互反应。在此步骤中，由于缓冲剂的存在，所以经过混合后的第一混合液的PH较稳定，使混合后的第一混合液中的各有效物质形成稳定体系。
将C液中的甲硝唑溶液加入第一混合液中进行混合。可以理解的是，经过前面的各步骤操作，在此步骤中的第一混合液中的纯化水含量较大，当甲硝唑溶液加入第一混合液中进行混合时，甲硝唑溶液加入后可以快速分散均匀，且使甲硝唑的浓度较低，不会与氨曲南发生相互反应。在此步骤中，由于缓冲剂的存在，所以经过混合后的第一混合液的PH较稳定，使混合后的第一混合液中的各有效物质形成稳定体系。
上述的向第一混合液中加入C液进行第二混合操作，避免了甲硝唑与氨曲南发生反应，进而降低了抑菌效果的情况，甲硝唑与氨曲南的联合用药，有效地使B群链球菌以外的杂菌的生长受到抑制，并且甲硝唑、氨曲南、多粘菌素和氟康唑联合使用，降低了杂菌抑制剂的整体使用量，且较全面、较有效地使B 群链球菌以外的杂菌的生长受到抑制。
需要说明的是，B群链球菌培养基在25℃时的pH值应为7.2±0.4。
在其中一个实施例中，多粘菌素、氨曲南、甲硝唑和氟康唑的体积比为 (0.4～1):(1～1.6)：(0.4～1):(1～1.6)。以上述的体积比混合使用，更好地避免了氨曲南和甲硝唑发生反应，并且更好地使B群链球菌以外的杂菌的生长受到抑制。
需要说明的是，本发明B群链球菌培养基制备方法制备得到的B群链球菌培养基的成份中不含生物危险性材料、放射性材料及人源性生物材料，主要的生物材料均已按要求灭活，为无生物活性物质，所以在制造和使用过程中不会对制造者和使用者引起热原、免疫学或毒理的反应。
以下列举一些具体实施例，若提到％，均表示按重量百分比计。需注意的是，下列实施例并没有穷举所有可能的情况，并且下述实施例中所用的材料如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
将10L葡萄糖蛋白胨琼脂培养基加入100L纯化水进行加热溶解，得到A液；
将0.1g氯化三苯基四氮唑盐加入100L纯化水中进行超声波振荡溶解，得到 B液；
将2g多粘菌素、3g氨曲南、2g甲硝唑和3g氟康唑分别超声波振荡溶解于 100L纯化水中；
将A液加入B液进行混合，得到第一混合溶液，对第一混合溶液进行高压蒸汽灭菌；
将50L马血清和0.1L磷酸氢二钠缓冲剂加入第一混合液中进行溶解混合；
继续向第一混合液中分别加入粘菌素溶液、氟康唑溶液、氨曲南溶液和甲硝唑溶液混合均匀，加入纯化水进行定容操作，得到B群链球菌培养液；
对B群链球菌培养液采用孔径为0.1μm和0.45μm的滤膜进行过滤除菌；
采用分配型蠕动泵分装得到B群链球菌培养基。
实施例2
将10L
Figure RE-GDA0002737990300000131
蛋白胨琼脂培养基加入100L纯化水进行加热溶解，得到A液；
将0.1g噻唑蓝加入100L纯化水中进行超声波振荡溶解，得到B液；
将1.3g多粘菌素、1.6g氨曲南、0.9g甲硝唑和2.2g氟康唑分别超声波振荡溶解于100L纯化水中；
将A液加入B液进行混合，得到第一混合溶液，对第一混合溶液进行高压蒸汽灭菌；
将50L胎牛血清和0.1L磷酸二氢钾缓冲剂加入第一混合液中进行溶解混合；
继续向第一混合液中分别加入粘菌素溶液、氟康唑溶液、氨曲南溶液和甲硝唑溶液混合均匀，加入纯化水进行定容操作，得到B群链球菌培养液；
对B群链球菌培养液采用孔径为0.1μm和0.45μm的滤膜进行过滤除菌；
采用分配型蠕动泵分装得到B群链球菌培养基。
实施例3
将10L脑心浸出琼脂培养基加入100L纯化水进行加热溶解，得到A液；
将0.1g苯酚红加入100L纯化水中进行超声波振荡溶解，得到B液；
将3.2g多粘菌素、1.6g氨曲南、0.4g甲硝唑和2.8g氟康唑分别超声波振荡溶解于100L纯化水中；
将A液加入B液进行混合，得到第一混合溶液，对第一混合溶液进行高压蒸汽灭菌；
将20L牛血清、30L胎牛血清和0.1L硫酸镁缓冲剂加入第一混合液中进行溶解混合；
继续向第一混合液中分别加入粘菌素溶液、氟康唑溶液、氨曲南溶液和甲硝唑溶液混合均匀，加入纯化水进行定容操作，得到B群链球菌培养液；
对B群链球菌培养液采用孔径为0.1μm和0.45μm的滤膜进行过滤除菌；
采用分配型蠕动泵分装得到B群链球菌培养基。
以下对利用本发明B群链球菌培养基制备方法制备得到的实施例1～3的B 群链球菌培养基进行各项性能检测。
一、对分析灵敏度、分析特异性和重复性的性能检测
确定依据及性能指标：
1、确定依据
参考依据《SN/T1538.2～2016培养基制备指南第2部分：培养基性能测试实用指南》：
(1)指南中，固体培养基的目标菌生长率标准和测试方法，引用为本产品阳性符合率及分析灵敏度的参考依据；
(2)指南中，固体培养基的非目标菌选择性标准及测试方法，引用为本产品阴性符合率的参考依据；
(3)指南中，固体培养基对混合菌(少量目标菌+大量非目标菌)的标准及测试方法，引用为本产品分析特异性的参考依据，测试方法中先做液体培养再做非选择性固体菌落计数改为液体培养后，分别接种入各自选择培养基培养观察生长情况；
(4)批内重复性及批间重复性参照《体外诊断试剂分析性能评估系列指导原则～精密度》的要求设置，根据本产品属定性试剂的特点，将结果的RSD计算改为重复率计算；
2、分析性能指标
本产品的分析性能指标如表1所示。
Figure RE-GDA0002737990300000151
表1：性能指标
试验方法
1、测试准备
(1)参比试剂准备：珠海贝索生物技术有限公司生产的产品《B群链球菌液体显色培养基》(注册证编号：粤械注准20192400162)；
制备工作菌株：按《SN/T1538.2～2016培养基制备指南第2部分：培养基性能测试实用指南》5.2.2的方法制备B群链球菌、大肠埃希菌工作菌株。
(2)测试试剂准备
管装固体型批号为：实施例1、实施例2、实施例3、(50人份/盒)
(3)测试步骤(1人份/管，重复100次，取平均值)
①生长率试验：
用于评价B群链球菌培养基对目标菌的促生长性能。用B群链球菌菌株试验，分三组，接种量分别为：100CFU/管、500CFU/管、1000CFU/管，按接种量的分组组数，各相应设一组参比培养基对照；
按以上要求接种B群链球菌株，35℃～37℃恒温培养12h～20h，逐日观察；
比较测试B群链球菌培养基和参比培养基出现明显颜色变化的最高稀释度，计算生长率(PR)。
②选择性试验：
用于评价试剂对非目标菌的选择性。用大场埃希菌株试验，分三组，接种量分别为103CFU/管、104CFU/管、105CFU/管，按接种量的分组组数，各相应设一组参比培养基对照；
按以上要求接种大肠埃希菌工作菌株，35℃～37℃恒温培养12h～20h；
比较B群链球菌培养基间出现颜色变化的最高稀释度，计算抑制因子(SF)。
③分析特异性试验：
用于综合评价B群链球菌培养基的对混合菌中目标菌的生长效果和非目标菌的选择效果；
用B群链球菌混合大肠埃希菌试验，分三组，B群链球菌菌株接种量分别为10CFU/管、50CFU/管、100CFU/管，大肠埃希菌菌株分别为103CFU/管、 104CFU/管、105CFU/管，比较选择培养后各工作菌株的CFU。
④批内重复性及批间重复性试验：
生长重复性试验：步骤与生长率试验相似，但不设参比培养基对照；
选择重复性试验：步骤与选择性试验相似，但不设参比培养基对照。
结果判读
(1)生长率计算
PR＝Ns/No式中，PR表示生长率，Ns表示从多个实施例1～3的B群链球菌培养基中得到的CFU的平均值，No表示从相应各组参比培养基中得到的CFU 的平均值，PR应≥0.7。
(2)选择因子计算
SF＝Do～Ds。式中，SF、Do、Ds用log10表示，SF表示选择因子，Do表示相应各组参比培养基上的CFU的平均值，Ds表示多个实施例1～3的B群链球菌培养基上得到的CFU的平均值，SF应≥2。
(3)分析特异性计算
生长选择特异性：生长选择符合率＝生长选择符合数(Nc)/生长选择试验数(Nt)。
生长选择符合率应≥95％。
(4)批内重复性计算
生长重复性：生长重复率＝生长可重复数(Nr)/生长试验数(Nt)，生长批内重复率应≥95％；
选择重复性：选择重复率＝选择可重复数(Nr)/选择试验数(Nt)，选择批内重复率应≥95％。
(5)批间重复性计算
生长重复性：生长重复率＝生长可重复数(Nr)/生长试验数(Nt)，生长批间重复率应≥95％；
选择重复性：选择重复率＝选择可重复数(Nr)/选择试验数(Nt)，选择批间重复率应≥95％。
试验结果
1、生长率
B群链球菌菌株的分析灵敏度～阳性符合率测试结果如表2所示；
Figure RE-GDA0002737990300000171
表2：分析灵敏度-阳性符合率
2、选择性
大肠埃希菌菌株的阴性符合率测试结果如表3所示：
Figure RE-GDA0002737990300000172
表3：阴性符合率
3、分析特异性
B群链球菌菌株～大肠埃希菌菌株混合菌株的生长选择性测试结果如表4所示：
Figure RE-GDA0002737990300000181
表4：混合菌生长选择性
4、批内重复性及批间重复性
(1)B群链球菌菌株的生长批内重复性及批间重复性如表5所示：
Figure RE-GDA0002737990300000182
表5：生长批内重复性及批间重复性测试结果
(2)大肠埃希菌菌株的选择批内重复性及批间重复性如表6所示：
Figure RE-GDA0002737990300000183
表6：选择批内重复性及批间重复性测试结果
分析讨论
1.实施例1～3的B群链球菌培养基属定性试剂，《体外诊断试剂分析性能评估系列指导原则》主要以定量试剂盒为对象，缺乏对定性试剂盒的具体规定，无法直接引用。《SN/T15108.2-2016培养基制备指南第2部分：培养基性能测试实用指南》较切合本产品实际；
2、实施例1～3的B群链球菌培养基中含有葡萄糖、马血清、显色剂和抑制剂等物质，能为B群链球菌的生长提供丰富的营养成分和创造一个良好的生长环境；B群链球菌在本发明的B群链球菌培养基中能快速生长并显色，从而达到鉴别目的；
3、实施例1～3的B群链球菌培养基分析灵敏度高，生长率优于一般培养基；
4、实施例1～3的B群链球菌培养基分析特异性强，可抑制临床标本中可能出现的以大肠杆菌为主的多种杂菌；
5、实施例1～3的B群链球菌培养基重复性好，B群链球菌培养基的制备方法工艺成熟。
二、CBS培养基稳定性的检测，检测试验按照《体外诊断试剂分析性能评估指导原则～稳定性》的原则要求进行。
试验方法
1、长期稳定性试验
测试批次产品：实施例1～3(于2℃～8℃储存处取出进行试验)；
分别在储存期为3个月、6个月、9个月、12个月时，按产品技术要求的性能指标进行性能检测；
以产品性能指标作为参照，判断测试储存时长的各批次产品的性能结果。
2、开封稳定性试验
测试批次产品：实施例1～3(于2℃～8℃储存处取出进行试验)；
分别将实施例1～3的B群链球菌培养基开盖后室温放置，每隔1h观察外观变化并测试pH值1次，直至pH值恒定不变，以不开盖的B群链球菌培养基为对照，计算pH变化值；
3、模拟运输稳定性试验
①运输温度对试剂影响试验
测试批次产品：实施例1～3(于2℃～8℃储存处取出进行试验)；
储存于28℃下；
分别在储存期为5、10、15天时，对不同温度段储存的每批次产品按产品技术要求的性能指标进行性能检测；
将试验完后各批次试剂剩余产品转存于2～8℃条件下，分别在储存期为3 个月、6个月、9个月、12个月时，每批次产品按产品技术要求的性能指标进行性能检测；
以产品性能指标作为参照，判断不同运输温度的各批次产品的性能结果。
②运输过程对试剂影响试验
测试批次产品：实施例1～3(于2℃～8℃储存处取出进行试验)；
按实际可能使用的运输方式将B群链球菌培养基邮寄至本企业合作的医疗器械经营单位，B群链球菌培养基的运输详情如表7所示：
Figure RE-GDA0002737990300000201
表7：实施例1～3的B群链球菌培养基运输详情
本企业合作的医疗器械经营单位收到B群链球菌培养基后，再以相同的运输方式邮寄回本企业；
4、加速稳定性试验
测试批次产品：实施例1～3(于2℃～8℃储存处取出进行试验)；
储存于37℃(恒温培养箱)条件下；
分别在储存期为6、9、12、30天时，每批次产品按产品技术要求的性能指标进行性能检测；
以产品性能指标作为参照，判断测试储存时长的各批次产品的性能结果。
研究结果
1、长期稳定性试验
①2℃～8℃储存3个月，B群链球菌培养基性能试验结果如表8所示：
Figure RE-GDA0002737990300000211
表8：2℃～8℃储存3个月的B群链球菌培养基性能试验结果
②2℃～8℃储存6个月，B群链球菌培养基性能试验结果如表9所示：
Figure RE-GDA0002737990300000212
表9：2℃～8℃储存6个月的B群链球菌培养基性能试验结果
③2℃～8℃储存9个月，B群链球菌培养基性能试验结果如表10所示：
Figure RE-GDA0002737990300000221
表10：2℃～8℃储存9个月的B群链球菌培养基性能试验结果
④2℃～8℃储存12个月，B群链球菌培养基性能试验结果如表11所示：
Figure RE-GDA0002737990300000222
表11：2℃～8℃储存12个月的B群链球菌培养基性能试验结果
2、开封稳定性试验结果如表12所示：
Figure RE-GDA0002737990300000231
表12：B群链球菌培养基开盖试验结果
3、模拟运输试验结果
①28℃放置5天，B群链球菌培养基性能试验结果如表13所示：
Figure RE-GDA0002737990300000241
表13：28℃放置5天B群链球菌培养基性能试验结果
②28℃放置10天，B群链球菌培养基性能试验结果如表14所示：
Figure RE-GDA0002737990300000242
表14：28℃放置10天B群链球菌培养基性能试验结果
③28℃放置15天，B群链球菌培养基性能试验结果如表15所示：
Figure RE-GDA0002737990300000243
表15：28℃放置15天B群链球菌培养基性能试验结果
④28℃放置15天后，转运至2～8℃储存3个月的性能试验结果如表16所示：
Figure RE-GDA0002737990300000251
表16：28℃放置15天后，转运至2～8℃储存3个月的性能试验结果
⑤28℃放置15天后，转运至2～8℃储存6个月的性能试验结果如表17所示：
Figure RE-GDA0002737990300000252
表17：28℃放置15天后，转运至2～8℃储存6个月的性能试验结果
⑤28℃放置15天后，转运至2～8℃储存9个月的性能试验结果如表18所示：
Figure RE-GDA0002737990300000253
表18：28℃放置15天后，转运至2～8℃储存9个月的性能试验结果
⑤28℃放置15天后，转运至2～8℃储存12个月的性能试验结果如表19所示：
Figure RE-GDA0002737990300000261
表19：28℃放置15天后，转运至2～8℃储存12个月的性能试验结果
4、运输过程对培养基的影响
①经过空运、铁路、汽运的运输方式发出及寄回后的B群链球菌培养基情况如表20所示：
Figure RE-GDA0002737990300000262
表20：B群链球菌培养基在实际运输过程的外观和结构影响的结果
5、加速稳定性试验结果
①37℃储存6天后，B群链球菌培养基性能试验结果如表21所示：
Figure RE-GDA0002737990300000271
表21：37℃储存6天后，B群链球菌培养基的性能试验结果
②37℃储存9天后，B群链球菌培养基性能试验结果如表22所示：
Figure RE-GDA0002737990300000272
表22：37℃储存9天后，B群链球菌培养基的性能试验结果
③37℃储存12天后，B群链球菌培养基性能试验结果如表23所示：
Figure RE-GDA0002737990300000273
表23：37℃储存12天后，B群链球菌培养基的性能试验结果
④37℃储存30天后，B群链球菌培养基性能试验结果如表24所示：
Figure RE-GDA0002737990300000281
表24：37℃储存30天后，B群链球菌培养基的性能试验结果
分析讨论
(1)B群链球菌培养基在2℃～8℃储存温度下放置12个月，仍符合产品技术要求，稳定性较高；
(2)B群链球菌培养基中的血清、营养物质可提供B群链球菌生长环境，持续开盖8h内，B群链球菌培养基pH基本不变化，稳定性较高；
(3)模拟运输环境(28℃)在企业的研发室进行；运输过程中，试剂盒周边有冰皇，外部有泡沫箱及纸箱包装，除了起到隔热作用，使试剂盒在运输过程中温度始终保持在28℃；且避免了以冷链的方式进行运输，减小了企业产品的运输成本；
(4)B群链球菌培养基置于37℃(相关技术标准认为：37℃下储存1日相当于2℃～8℃下储存1个月)30天，试验性能仍符合性能要求，说明热不稳定因子对B群链球菌培养基在30天内无影响。
由上可见，B群链球菌培养基在2℃～8℃储存温度放置12个月、在28℃温度下运输15天或B群链球菌培养基连续开盖8h，其性能均符合产品技术要求。
结论
(1)产品在≤28℃温度下运输15天，不影响产品的性能和效期；
(2)空运、铁路货运或汽运对产品完整性无影响；
(3)产品在2～8℃条件下储存，有效期大于12个月；
(4)B群链球菌培养基启封后8h内B群链球菌培养基性能符合检测要求。
由上可见，从CBS培养基稳定性的检测结果可得出本发明B群链球菌培养基制备方法得到的B群链球菌培养基的稳定性较高。
三、CBS中杂菌抑菌剂的分级抑菌浓度指数测定
杂菌抑菌剂的分级抑菌浓度指数测定结果如表25所示：
多粘菌素 甲硝唑 氟康唑 氨曲南 多粘+氨曲南+甲硝锉+氟康唑
大肠埃希菌 0.5 ˉ ˉ 0.12 0.37
肺炎克雷伯菌 1 ˉ ˉ 0.5 0.25
沙门氏菌 0.25 ˉ ˉ 0.12 0.25
白色念珠菌 ˉ ˉ 0.25 ˉ 0.5
乳杆菌 ˉ 0.5 ˉ 1 0.5
表25：分级抑菌浓度指数测定结果
其中，单个药物为最低抑菌浓度(MIC)，联合用药时计算部分抑菌浓度指数(FIC)，FIC＝A药联合时的MIC/A药单测时MIC+B药联合时的MIC/B药单测时MIC+……，当FIC指数＜0.5为协同作用；0.5～1为相加作用；1～2 为无关作用；＞2为拮抗作用。
上述结果可以得出，多粘菌素、氨曲南、甲硝唑和氟康唑联用，对革兰阴性杆菌FIC指数小于0.5，表示有协同作用，对白色念珠菌和乳杆菌FIC为0.5，表示相加作用。因此四药联合应用对革兰阴性杆菌、真菌类及厌氧菌均有抑菌作用，且对革兰阴性杆菌的抑菌作用有加强协同作用，能有效地抑制B群链球菌以外的杂菌生长。
以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种B群链球菌培养基，其特征在于，每升B群链球菌培养基中包括如下含量的各组分：基础液10ml~22ml、促生长剂50.1ml~110ml、缓冲剂8.5ml~10ml、杂菌抑制剂5mg~10mg、显色干粉0.1mg~0.5mg和余量纯化水，其中，所述杂菌抑制剂由多粘菌素、氨曲南、甲硝唑和氟康唑组成。
2.根据权利要求1所述的B群链球菌培养基，其特征在于，所述促生长剂包括促生长血清和促生长添加剂，所述促生长血清和所述促生长添加剂的体积比为（5~10）：（0.01~1）。
3.根据权利要求2所述的B群链球菌培养基，其特征在于，所述促生长添加剂为葡萄糖、丙酮酸钠、亚硫酸钠、可溶性淀粉、甲氨蝶呤和酵母浸膏中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的B群链球菌培养基，其特征在于，所述促生长血清为马血清和胎牛血清中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的B群链球菌培养基，其特征在于，所述缓冲剂选自磷酸氢二钠缓冲剂、磷酸二氢钾缓冲剂或硫酸镁缓冲剂。
6.根据权利要求1所述的B群链球菌培养基，其特征在于，所述显色干粉选自氯化三苯基四氮唑盐、噻唑蓝、甲氨蝶呤或苯酚红。
7.一种B群链球菌培养基制备方法，用于制备权利要求1~6中任一项所述的B群链球菌培养基，其特征在于，所述B群链球菌培养基制备方法包括如下步骤：
进行工艺制水操作，制得所述纯化水；
向所述基础液中加入所述纯化水进行促溶操作，制得A液；
向所述显色干粉中加入所述纯化水进行第一溶解操作，制得B液；
逐一向所述多粘菌素、所述氨曲南、所述甲硝唑和所述氟康唑加入所述纯化水进行第二溶解操作，制得C液；
将所述A液加入所述B液进行第一混合操作，得到第一混合液；
将所述促生长剂和所述缓冲剂加入所述第一混合液中进行第三溶解操作；
向所述第一混合液中逐一加入所述C液进行第二混合操作，加入所述纯化水进行定容操作，得到B群链球菌培养液；
对B群链球菌培养液进行分装操作，得到B群链球菌培养基。
8.根据权利要求7所述的B群链球菌培养基制备方法，其特征在于，在所述定容操作之后，且在所述分装操作之前，还包括如下步骤：
将所述B群链球菌培养液采用孔径为0.1μm~0.2μm和0.4~0.5μm的滤膜进行过滤除菌。
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