CN107287275B - 培养基、包含其的试剂盒、及其应用 - Google Patents
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Abstract
本揭露提供一种用于检测B群链球菌(Group B Streptococcus(GBS))的培养基,其包含:富集调合物(enrichment formulation);多糖类;以及微生物筛选剂。本揭露亦提供一种用于检测B群链球菌的试剂盒,其包含如前述的培养基,及一或多种容器,其用于容置如前述的培养基,该一或多种容器独立选自由采样管、试管及培养皿所组成的群组。本揭露的培养基在鉴别GBS具有成本低、储存简便、检测时间较短、但同时具有灵敏度及准确度的优点。
Description
技术领域
本揭露关于用于培养微生物的培养基。更具体而言,本揭露关于用于检测B群链球菌(Group B Streptococcus,简称为GBS,即无乳链球菌(Streptococcus agalactiae),又名乙型链球菌)的培养基。本揭露亦同时提供该培养基的用途。
背景技术
B群链球菌(Group B Streptococcus,简称为GBS,即无乳链球菌(Streptococcusagalactiae),又名乙型链球菌),为一种革兰氏阳性球菌,常栖息于人体肠道及泌尿生殖道,研究显示,中国台湾约有18~20%的孕妇生殖道有GBS菌落聚集(colonization),不过带菌孕妇通常不会出现临床症状,但由于新生儿抵抗力较低,容易于生产过程中,受到母亲的垂直感染。GBS对新生儿的健康是一个相当大的威胁,因此,若在产前检查时先行诊断出GBS,将能有效地预防新生儿感染。
目前根据文献的建议拟定的侦测GBS的标准作业流程为:将阴道-肛门拭子接种于血琼脂平板(blood agar plate,简称BAP),再将棉拭放入对GBS具有选择增菌性的产胡萝卜色培养液(carrot broth)或Lim氏培养液(Lim broth,或简称为LIM)中;BAP及增菌培养基置于35℃培养;若隔天BAP没有长出疑似GBS的菌落,再将Lim氏培养液次培养到BAP,培养后再观察。若有疑似菌落,则可挑取纯菌进行后续的鉴定试验(如CAMP试验(CAMP test))及/或药敏试验。若使用产胡萝卜色培养液增菌培养基,则可根据培养后的显色(介于淡橘至红色之间,例如胡萝卜色)直接报告为GBS阳性。
近年来,为了达到更快速筛检与更容易鉴别GBS的目的,已有厂商开发不同的培养基,以便快速鉴别出GBS。例如,Hardy Diagnostics的StrepB carrot brothTM试剂盒是一种可用于选择区分性液体培养基配方,除了可以选择性地增菌GBS外,也可因呈现出特殊颜色外观(橘至红色,即胡萝卜色)而能快速鉴别出GBS。Hardy Diagnostics的StrepB carrotbrothTM试剂盒分成二部分:StrepB carrot brothTM,其是Granada氏培养基为基础的改良培养基,包含蛋白胨(peptone)、水溶性淀粉、筛选剂、MOPS、磷酸氢二钠、右旋糖、丙酮酸钠、及硫酸镁;以及StrepB carrot brothTM片,其是一产色纸条,该产色纸条含有生长因子及色素促进因子。该产品对温度敏感,必须储存于2至8℃。于使用时,需要使用嗜氧运送管运送检体,而这类嗜氧运送管并不含营养成分,仅能保存检体中病原菌并维持原来的生态。且在接种时,另需将StrepB carrot brothTM片加入StrepB carrot brothTM中,且不能过早将StrepB carrot brothTM片加入,以避免影响检验结果。这在检体量大时,会增加人力负担。综上所述,可知现有的培养基仍有检验室的人事成本高、耗材成本高、以及检测时间较长的问题。
有鉴于此,需要成本低、储存简便、检测时间较短、操作亲民及快速,但同时具有灵敏度及准确度的鉴别GBS的培养基。
发明内容
为解决前述的问题,本揭露提供一种用于检测B群链球菌(Group BStreptococcus(GBS))的培养基,其包含:富集调合物(enrichment formulation),其包含心浸出物(heart infusion)、经酶消化的蛋白质(enzyme-digested protein)、右旋糖(dextrose)、及盐类;多糖类,其可例如为以六碳糖为单体所组成的聚合物,例如淀粉,该多糖类含量是每1升培养基为10至25克;以及微生物筛选剂。
本揭露的培养基的富集调合物中所含的心浸出物是一种生长培养基,能供给更多的维生素、矿物质及氨基酸,其通常藉由烹煮动物心脏,使营养素或因子溶出,再制成粉末状以利调制,该动物心脏可选自猪、牛、马、或羊的心脏,只要该来源取得不会带有不利于GBS生长的因素即可。心浸出物亦可市售购得。
本揭露的培养基的富集调合物中所含的经酶消化的蛋白质是例如动物或植物来源的蛋白质(例如牛肉、明胶、酪蛋白、大豆等等)经过诸如木瓜酶或胰蛋白酶等酶消化水解的产物。经酶消化的蛋白质亦可市售购得,例如BD公司的Neopeptone。
本揭露的培养基的富集调合物中所含的盐类可包含碳酸钠、磷酸氢二钠、及氯化钠。
本揭露的培养基的富集调合物亦可市售购得,例如Todd-Hewitt氏培养基。当选择商业所购得的富集调合物时,可依需求另加入右旋糖(dextrose)。该富集调合物含量是每1升培养基为15至30克。
在另一实施方式中,本揭露的培养基可依需求另包含盐类,例如丙酮酸钠及硫酸镁。在另一实施方式中,本揭露的培养基可依需求另包含缓冲剂,例如吗福林丙磺酸(MOPS)及磷酸氢二钠(Na2HPO4)。在另一实施方式中,本揭露的培养基可依需求另包含氨基酸或其盐类,例如L-半胱氨酸盐酸盐。
本揭露的培养基的富集调合物中所含的微生物筛选剂用以抑制非所欲的杂菌的生长,可包含硫酸黏菌素(colistin sulfate)、硫酸庆大霉素(gentamicin sulfate)、萘啶酮酸(nalidixic acid)、或它们的二者或多者的组合。
本揭露的培养基可依检验的需求添加适量的琼脂。在一个实施方式中,该琼脂含量是每1升培养基为4至6克。在另一实施方式中,该琼脂含量是每1升培养基为15克。
本揭露亦提供一种用于检测B群链球菌的试剂盒,其包含如前述的培养基,及一或多种容器,其用于容置适量的如前述的培养基,该一或多种容器独立选自由采样管、试管及培养皿所组成的群组。针对采样管、试管及培养皿的尺寸、材质等等,所属技术领域中具有通常知识者可依需求或各国检验标准而替换,例如采样管可为嗜氧检体运送管,或者,当选用培养皿作为容置培养基的容器时,除了一般容置单一培养基的培养皿之外,若欲搭配其他种类的培养基,亦可使用例如2分格培养皿(bi-plate)、3分格(tri-plate)、或4分格(quad-plate)的培养皿。举例而言,当欲将本揭露的培养基与能同时侦测β及γ溶血型B群链球菌(Group B Streptococcus(GBS))的培养基搭配以供进一步确认检体中是否有GBS存在时,可使用2分格培养皿,并分别将两种不同培养基容置于不同格中。在另一实施方式中,该试剂盒可包含用于取得样品的工具,例如无菌棉棒。
本揭露同时提供一种用于检测样品中GBS的存在的方法,该方法包含:将样品培养于如前述的培养基;及约18至约24小时后(随菌量的多寡而不同),若培养基有淡橘至红色的色素产生,则判读为阳性。
本揭露的培养基可搭配例如能同时侦测β及γ溶血型B群链球菌(Group BStreptococcus(GBS))的培养基(在后文中称此类培养基为β/γGBS detection agar),以提高检验灵敏度及缩短报告时间。举例而言,首先,可用无菌棉棒拭子自阴道及/或直肠口采检后,放入一般嗜氧检体运送管运送到检验室,检验室收到后,立即取出棉棒拭子划种一个滋养培养基(如BAP),然后插入一管产胡萝卜色培养液(GBS carrot broth)(即,不必再加一张产色纸条),将GBS carrot broth及滋养培养基过夜培养,若显色即可报告检体含有GBS;若无显色,则取培养液移种GBS产胡萝卜色培养基平板(GBS carrot agar)(并插种)及同时侦测β及γ溶血型GBS的培养基上,经划种或接种的GBS产胡萝卜色培养基、同时侦测β及γ溶血型GBS的培养基及产胡萝卜色培养液置于35℃的厌氧箱或CO2培养箱培养,并于18至24小时后判读,若产胡萝卜色培养液出现胡萝卜色及/或于同时侦测β及γ溶血型GBS的培养基观察到疑似GBS的β溶血菌落,且GBS产胡萝卜色培养基平板上也出现胡萝卜色菌落,则亦可直接发出GBS阳性报告;若无怀疑菌落,则继续培养18-24小时,于培养后做同样观察。若需操作药敏试验,则可直接挑取培养基上经确认为B群链球菌的生长菌落进行测试。若GBS产胡萝卜色培养基平板未产生胡萝卜色,应注意观察同时侦测β及γ溶血型GBS的培养基上是否有β溶血的疑似GBS菌落,必要时,可选取此疑似的菌落进行GBS的鉴定流程,若经鉴定为GBS,再进行药物感受性试验。
本揭露的培养基,可有效减少成本且同时储存简便、检测时间较短、操作亲民及快速,但同时具有灵敏度及准确度的鉴别GBS的培养基。
附图说明
图1a、b、及c分别显示实施例1A、实施例1B、及实施例1C在接种β溶血型GBS及其他菌的显色情形。如图所示,β溶血型GBS可产生淡橘至红色的色素,其他菌则不会呈现淡橘至红色的色素。
图2显示B群链球菌与其他测试菌在实施例1B平板培养基与CHROMagar StrepB培养基的显色。图2a显示B群链球菌在实施例1B平板培养基的生长菌落呈深胡萝卜色(左),而其他菌(以GAS为范例)则无颜色变化(右);图2b显示B群链球菌在CHROMagar StrepB的生长菌落呈紫色,而其他菌为蓝色(粪肠球菌E.faecalis为范例)或无颜色变化。
图3显示B群链球菌在实施例1B平板培养基及CHROMagar StrepB上的生长受到不同浓度的其他菌干扰情形。以103CFU/mL B群链球菌分别与102~106CFU/mL(左至右)的E.faecalis进行混菌,图3a为实施例1B平板培养基的测试结果,显示B群链球菌呈胡萝卜色,而E.faecalis呈白色;图3b为CHROMagar StrepB的测试结果,显示B群链球菌菌落呈紫色,而E.faecalis呈蓝色。两种培养基当与106CFU/mL E.faecalis混菌时(菌量比1:1,000),B群链球菌的生长均受到抑制(图3a及图3b最右)。
图4显示实施例1C培养基的变色反应:图右为阳性反应(产生胡萝卜色),而图左为阴性对照(未变色)。
图5显示采集孕妇生殖道/直肠检体与一般常规操作流程比较。图5a为一般检验流程,图5b为使用含实施例1A培养基、实施例1B培养基及β/γGBS侦测琼脂平板的试剂盒的检验流程。
图6显示采集孕妇生殖道/直肠检体利用含有实施例1C培养基的GBS增菌输送管的操作流程。培养后依检验室的耗材种类有三种操作选择,选择1为接种Lim氏培养液,选择2为接种滋养培养基BAP,选择3为使用含实施例1B培养基及β/γGBS侦测琼脂平板的试剂盒的检验流程。
图7显示各培养基对GBS增菌效能。实施例1C培养基、实施例1A培养基与LIM氏培养液在增菌的效果上并无显著差异(P<0.05),以棉棒中104CFU的菌量在24hr皆即可达到增菌的上限。
图8显示孕妇乙型链球菌检验鉴定建议流程图。
具体实施方式
以下配合图式而说明本发明的实施例以详细说明本发明,唯其并不意味本发明仅局限于此等实施例所揭示的内容。
实施例1:培养基的制备
下列提供根据本揭露的培养基的配方例示性实施方式,并说明每1升所包括的各成分的含量,其中,实施例1A是B群链球菌产胡萝卜色培养液,在后文中称其为实施例1A液体培养基或实施例1A培养基;实施例1B是B群链球菌产胡萝卜色平板培养基,在后文中称其为实施例1B平板培养基或实施例1B培养基;实施例1C是用于B群链球菌输送培养装置中的检体输送/富集/鉴别试剂盒用培养基,在后文中称其为实施例1C培养基。
制备实施例1A液体培养基时,上述成分分为两部分制备后,再将两部分混合均匀后分装,细节如下:
第一部分:首先依上述所列的量分别称取Todd-Hewitt培养基(BD公司制造)、淀粉、MOPS、及Na2HPO4,溶于950mL纯水,加热至沸腾5至7分钟后,接着放入恒温水箱冷却至47至50℃。
第二部分:另依上述所列的量分别称取右旋糖、丙酮酸钠、MgSO4·7H2O、L-半胱氨酸盐酸盐,溶于40mL的无菌水,再加入10mL的微生物筛选剂(黏菌素、庆大霉素、及
萘啶酮酸溶于10mL无菌水),混合均匀后,以0.22μm滤膜过滤。
混合第一部分及第二部分,即获得液体培养基。依需求,将适量的液体培养基分装至选定的容器中。例如在本实施例中,可将约3.0至5.0mL的实施例1A液体培养基分装于直径约15毫米、长度103毫米的无菌聚碳酸酯(PC)试管中。
制备实施例1B平板培养基时,步骤与制备实施例1A液体培养基步骤类似,但在第一部分中另加入15g的琼脂粉,且分装时是将20mL尚呈液态的平板培养基分装于直径9公分的无菌塑料培养皿中,并静置使之凝固。
制备实施例1C检体输送/富集/鉴别试剂盒用培养基时,步骤与制备实施例1A液体培养基步骤类似,但在第一部分中另加入4至6g的琼脂粉,且分装时是将4.8mL尚呈液态的培养基分装至无菌采样管中,并以γ射线灭菌。
图1a、b、及c分别显示实施例1A、实施例1B、及实施例1C培养基在接种β溶血型GBS及其他菌的显色情形。如图所示,β溶血型GBS可产生淡橘至红色的色素,其他菌则不会呈现淡橘至红色的色素。
实施例2:评估实施例1B平板培养基鉴别GBS的效能
为了探讨本揭露的平板培养基的临床应用性,本研究以160株测试菌(包括120株B群链球菌的临床分离株,8株非B群的链球菌及32株其他各种非链球菌菌种)进行效能评估,项目包括在不同的培养环境、接种方式及培养时间所呈现的特异性、灵敏度、阳性预测值、阴性预测值与效率(efficiency)。为了了解本揭露的平板培养基与市售CHROMagar StrepB(CHROMagar公司,法国)效能的异同,除了以同样测试菌评估CHROMagar StrepB的灵敏度与特异性外,吾等更进一步以模拟临床检体混菌的状况接种此两种培养基以了解B群链球菌生长可能受干扰的情形,期能确认本揭露的平板培养基及CHROMagar StrepB实用性的异同。
材料与方法
试验菌种来源
本研究试验菌中的B群链球菌、A群链球菌(GAS)、G群链球菌(GGS),除了ATCC标准菌株外,临床测试菌种皆来自台美医事检验所(新北市,中国台湾)。临床菌株是从中国大台北地区各医院产前检查检体中分离,而各种标准菌株则购自美国菌种保存中心(ATCC)的授权公司MicroBioLogicals公司(MBL,加拿大)。这些菌种/菌株保存于-70℃冷冻柜中的GermBank菌种保存装置(启新公司,中国台湾),共计160株试验菌(表1)。
表1.评估本揭露之平板培养基效能所使用的测试菌种/菌株
试验菌种的移种培养
进行试验前,从Germbank装置分别取出临床分离株移种于BAP,将BAP培养于35℃的5%CO2培养箱,18至24小时后,再以三区划线法移种半片的BAP以获得单一菌落,共移种3次。
菌种的确认
将测试菌株移种两次BAP或巧克力色滋养培养基后,观察菌落生长及革兰氏染色抹片的显微镜下镜检特征,其中B群链球菌再配合链球菌分群试剂盒(Streptococcalgrouping kit,目录号DR0585A,Oxoid公司,英国)的快速乳胶凝集试验(latexagglutination test)结果,确认其为B群链球菌。若需要,再搭配CAMP试验与马尿酸水解试验(即hippurate hydrolysis试验)阳性以及接种含有或不含抗生素的实施例1A培养基作为菌种二次确认而纳入研究对象。至于GAS与GGS亦以快速乳胶凝集试验进行群别确认,而其他测试菌则依传统方法进行鉴定。
培养基与试剂
实施例1B平板培养基外,所使用的培养基包括BAP与各种鉴定用培养基/试剂皆购自启新生物科技有限公司。CHROMagar StrepB则由CHROMagar公司生产的粉末以厂家的配制说明进行配制。
实施例1B平板培养基接种后于不同培养环境及培养天数的特异性及灵敏度
将160株测试菌(表1)以接种环沾菌,直线画法接种于实施例1B平板培养基,分别置于35℃的厌氧箱、5%~10%CO2培养箱及蜡烛缸(放一般培养箱),18~24小时后观察实施例1B平板培养基变色情形;若无显色则于36~48小时后再观察一次。
实施例1B平板培养基于不同接种方式下的特异性及灵敏度
将160株测试菌种(表1),分别以接种环沾菌直接划种及穿刺实施例1B平板培养基底部的方式接种(图3),穿刺的目的为制造隔绝空气的无氧环境,并分别培养于35℃的5%~10%CO2培养箱与蜡烛缸,18~24小时后观察其显色情形。
CHROMagar StrepB的特异性及灵敏度
依照CHROMagar公司的使用说明,以一般划种方式分别接种160株测试菌于CHROMagar StrepB,然后置于35℃的5%~10%CO2培养箱,18~24小时后观察各种测试菌在此培养基上的生长及显色情形。
混菌情形对B群链球菌在实施例1B平板培养基及CHROMagar StrepB生长的干扰性
为了评估B群链球菌在混菌的情况下在实施例1B平板培养基或CHROMagar StrepB所受到的干扰性,利用B群链球菌(约103CFU/mL)分别混合同属于链球菌科的Enterococcusfaecalis、GAS、GGS及S.pneumoniae,混合菌量分别为102~106CFU/mL。操作时,以上述四种新鲜生长菌分别调至相当于McFarland no.0.5的浓度(约1.5×108CFU/mL),再以TSB进行系列稀释,分别得到B群链球菌约103CFU/mL以及四种测试菌的各种浓度(菌量约102~106CFU/mL)(表2),B群链球菌与另一测试菌的各种稀释液各取1mL至无菌试管中,以1:1的比例混合,得到的混菌比例分别为1:0.1、1:1、1:10、1:100及1:1,000。利用吸管吸取100μL到实施例1B平板培养基或CHROMagar StrepB平板上,然后以四区划线法分别划种,接种后的平板置于35℃的5%~10%CO2培养箱,18~24小时后,观察B群链球菌在实施例1B平板培养基及CHROMagar StrepB的显色情形。
结果
实施例1B平板培养基种菌后培养在不同环境与不同培养时间鉴别B群链球菌的特异性(specificity)及灵敏度(sensitivity)
以一般接种法分别接种160株测试菌于实施例1B平板培养基,共3组,分别置于35℃的厌氧箱,5%~10%CO2培养箱及厌氧缸中培养,18~24小时后观察菌落显色情形,结果发现三种培养环境的40株非B群链球菌生长菌落皆不出现胡萝卜色(橘~红)而呈无色(图1b右),因此其特异性为100%(表2)。
表2.以B群链球菌接种实施例1B平板培养基在不同培养环境、培养时间及接种方法的特异性及灵敏度总表
120株B群链球菌在实施例1B平板培养基的显色情形,区分为阳性反应(+)、弱阳性反应(w+)与阴性反应(-)(图1)。结果发现接种的实施例1B平板培养基培养在厌氧箱、CO2培养箱及蜡烛缸中,培养18~24小时的鉴别B群链球菌灵敏度分别为99.1%(119/120)(表2及表3)、94.1%(113/120)与94.1%(113/120),而培养36~48小时,其灵敏度分别为99.1%(119/120)、96.6%(116/120)与96.6%(116/120)(表2)。B群链球菌菌落在无氧环境呈现的橘红色,比其他培养环境者更为鲜艳(图1b左)。
表3.接种B群链球菌于实施例1B平板培养基,然后培养于厌氧箱18~24小时的效能
*实施例1B平板培养基侦测B群链球菌的灵敏度为99.1%(119/120),特异性100%(40/40);119个阳性结果中有6个呈弱阳性反应。阳性预测值(PPV)100%(119/119),阴性预测值(NPV)97.5%(40/41),效能(Efficiency)99.3%(159/160)。
以划种及穿刺方式接种实施例1B平板培养基对鉴别B群链球菌的特异度及灵敏度
以划种及穿刺方式接种160株测试菌于实施例1B平板培养基,共2组,分别培养在35℃的5%~10%CO2培养箱与蜡烛缸中,结果显示鉴别B群链球菌的特异性为100%(40/40),而培养于CO2培养箱与蜡烛缸的灵敏度分别为98.3%(118/120)(表2及表3)与96.6%(116/120)(表2)。
本研究利用几种临床常见的分离菌(表1)进行实施例1B平板培养基的效能评估,结果发现40株的非B群链球菌均不会显现胡萝卜色,特异性为100%,但由于测试120株B群链球菌培养在不同环境18~24小时后的显色灵敏度不同,以培养在厌氧箱的灵敏度最高(99.1%,119/120)(表3),其次为划种穿刺法培养于CO2环境,灵敏度为98.3%(118/120)(表4),较差者为培养在CO2培养箱或蜡烛缸(94.1%,113/120)。因此,若检验室使用实施例1B平板培养基协助B群链球菌侦测时,可根据硬设备决定培养环境及接种方式。
表4.以划种及穿刺法接种B群链球菌于实施例1B平板培养基,然后培养于35℃的CO2培养箱18~24小时的效能
*实施例1B平板培养基侦测B群链球菌的灵敏度为98.3%(118/120),特异性100%(40/40);118个阳性结果中有17个呈弱阳性反应。阳性预测值(PPV)100%(118/118),阴性预测值(NPV)95.2%(40/42),效能(Efficiency)98.7%(158/160)。
CHROMagar StrepB鉴别B群链球菌的效能
将CHROMagar StrepB分别接种160株测试菌种(表1),结果显示在CHROMagarStrepB的生长菌落中,S.pneumoniae、GAS、GGS、Staphylococcus aureus(ATCC 25923)、S.epidermidis(ATCC 12228)与Stenotrophomonas maltophilia也呈现与B群链球菌相同的紫色菌落形态(图2b),因此无法从菌落外观上区分,其特异性仅为70%(28/40),而灵敏度则为100%(120/120)(表5)。
表5.以一般方式接种B群链球菌于CHROMagar StrepB培养于35℃的5~10%CO2培养箱18~24小时的鉴定效能
*B群链球菌在CHROMagar StrepB的灵敏度为100%(120/120)、特异性70%(28/40)、阳性预测值(PPV),90.9%(120/132)、阴性预测值(NPV),100%(28/28);效能(efficiency),92.5%(148/160)
其他菌种的存在下(不同比例混菌)对B群链球菌在实施例1B平板培养基及CHROMagar StrepB生长的干扰性
为了探讨当临床检体如果有其他同属于链球菌类别的高或低菌量存在下B群链球菌的生长是否会受到不同程度的影响,吾等以B群链球菌(103CFU/mL)分别与GAS及S.pneumoniae(约102~106CFU/mL)进行混菌试验,结果指出此两菌的各种混菌比例皆不影响B群链球菌在实施例1B平板培养基上的显色;但与106CFU/mL(约B群链球菌的1,000倍菌量)的E.faecalis及与105CFU/mL GGS(约B群链球菌的100倍菌量)进行混菌时,其生长受到干扰(图3a及表6)。B群链球菌与S.pneumoniae、GAS及GGS的各种浓度混菌接种CHROMagarStrepB时,因为这些菌种的生长菌落显色皆相同,而无法彼此区分,而与106CFU/mLE.faecalis的混菌试验,同样地会干扰B群链球菌的生长(图3b及表6)。
表6.B群链球菌混合不同浓度的其它革兰氏阳性菌接种实施例1B平板培养基培养后对生长显现的干扰情形
a实施例1B,GBS carrot agar;Chrom,CHROMagarStrepB。
b B群链球菌菌量皆为103CFU/mL,混合它菌的菌量分别为102~106CFU/mL。
c括号数字代表B群链球菌:它菌的菌量比。
d B群链球菌的胡萝卜色生长菌落:+,有;-,无。
实施例3:评估实施例1C检体输送/富集/鉴别试剂盒用培养基(后文简称为实施例1C培养基)的效能
材料与方法
供试的检体采检及输送装置
含实施例1C培养基的试剂盒(图4)为针对孕妇产前检查B型链球菌检体的采检及输送装置,包括1支无菌棉棒及1支内含实施例1C培养基的塑料采样管。
测试实施例1C培养基效能的菌株
为了探讨孕妇生殖道检体常见的栖息菌及一般产色素菌对实施例1C培养基效能的影响,本研究选用的测试菌株包括8株ATCC标准菌种:Streptococcus agalactiae(ATCC12386)、Enterococcus faecalis(ATCC 29212)、Escherichia coli(ATCC 8739)、Candidaalbicans(ATCC 10231)、Staphylococcus aureus(ATCC 25923)、Serratia marcescens(ATCC 43861及8100)与Rhodococcus equi(ATCC 25729),以及由孕妇产道分离的菌种Escherichia coli、Staphylococcus aureus与Enterococcus faecalis各一株(表7)。这些菌种/菌株保存于GermBank装置,存放于-70℃冰箱。
表7.以多种生殖道常见及产色素菌株评估实施例1C检体培养基之特异性
a试验菌株接种菌量为106CFU,阴性对照组则接种无菌蒸馏水
b表中“+”表示出现胡萝卜色之变化,“-”表示无产生颜色变化。
培养基及稀释液
接种菌种/菌株的培养基为滋养性BAP,而稀释液则使用无菌蒸馏水,GBS增菌培养液使用Lim氏培养液,库存及品保菌株保存于Germ-Bank后置放于-70℃;以上BAP、Lim氏培养液及GermBank均购自启新生物科技有限公司,中国台湾。
试验菌的移种培养
试验前,从GermBank装置分别取出各种不同库存试验菌株及品保菌种移种于BAP,将BAP培养于35℃,5%CO2培养箱,18~24小时后再挑取单一菌落移种两次备用。
实施例1C培养基的特异性(specificity)
为了了解实施例1C培养基是否具有只对S.agalactiae产生胡萝卜颜色变化(图4)的特异性,将测试的11株菌种(表7)经过三次活化后得到新鲜生长的试验菌,以无菌蒸馏水配制成相当于McFarland No.0.5(约含1.5x108CFU/mL)的悬浮菌液,再稀释十倍后取100μL稀释菌液沾附于棉棒上,使棉棒上约含106CFU的菌量,然后插入含实施例1C培养基的试剂盒后,置入35℃的一般培养箱,18~24小时后观察实施例1C培养基变色情形。
实施例1C培养基的干扰性
为了了解实施例1C培养基的效能是否会受到孕妇生殖道中常见栖息菌的影响,本实验将S.agalactiae(约102CFU)混合两种菌量(约102及105CFU)的5株阴道常见菌(表8),得到10种组合方式的混合菌液后接种于个别棉棒上,然后插入含实施例1C培养基的试剂盒中,于室温下放置隔夜(模拟输送时间)后,取出棉棒以四区划线法接种BAP,再将棉棒折断浸泡于Lim氏培养液中。将实施例1C培养基及Lim氏培养液放到35℃的一般培养箱,而经接种的BAP则放置于35℃、5%CO2培养箱中,18~24小时后分别观察实施例1C培养基的变色情形及BAP上的菌落特征。同时将增菌18~24小时的Lim氏培养液震荡混匀后,以棉棒沾取增菌液以四区接种法涂划另一片BAP,同样地,将此BAP放置于35℃的5%CO2培养箱,18~24小时后再观察生长状况。
表8.多种产道常见菌以不同比例与S.agalactiae混合后实施例1C培养基的变色结果
a S.agalactiae接种菌量为皆为102CFU,混入之另一菌株接种菌量分别为低菌量(102CFU)以及高菌量(105CFU)。
b表中分数在BAP及Lim broth结果表示在三重复实验中移种于BAP后有S.agalactiae菌落生长之重复数;在变色结果中表示在三重复实验中出现变色结果之重复数。
实施例1C培养基的侦测极限(limit of detection)
将前述相当于McFarland No.0.5的新鲜生长菌悬浮液进行系列十倍稀释,再分别从浓度104、103及102CFU/mL稀释液中取100μL菌量加至不同的无菌棉棒中,使棉棒上含有103、102及10CFU的菌量,然后插入含实施例1C培养基的试剂盒,各稀释液分别进行20次重复,最后,再将含实施例1C培养基的试剂盒放入35℃一般培养箱后,每18~24小时观察实施例1C培养基变色情形直到72小时,并依据临床与实验室标准协会(CLSI)规范选出接种菌量达到95%以上阳性结果的组别作为实施例1C培养基的侦测极限。
模拟检体采集后不同输送时间的回收(recovery)菌量
将前述方法配制的S.agalactiae悬浮菌液稀释十倍(相当于约107CFU/mL),取100μL沾附于棉棒上(约含106CFU的菌量),再将棉棒插入含实施例1C培养基的试剂盒中,共进行三重复,然后放置于室温下0、24、48及72小时(模拟不同输送时间),到达这些时间后,将棉棒置于含1mL无菌蒸馏水的试管中,剧烈震荡15秒,然后进行连续五次的系列十倍稀释,最后将不同稀释度的菌液各取100μL分别接种于三片BAP上,以无菌玻棒操作涂抹法,将涂抹后的BAP置于35℃的5%CO2培养箱,培养18~24小时后进行菌落计数,并将所得数据平均,再换算成对数值进行比较。
以临床检体实际评估实施例1C培养基的效能
由中国大台北地区多家医疗院所于2012年8~9月间,以实施例1C培养基包装内的无菌棉棒进行产前检查生殖道及直肠分泌物采检,采检后棉棒插入含实施例1C培养基的试剂盒,再输送至台美医事检验所(新北市);检验人员收到后在最短时间内取出棉棒涂划BAP,然后折断浸入Lim氏培养液,再将含实施例1C培养基的试剂盒、Lim氏培养液及BAP置于35℃一般培养箱,18~24小时后观察实施例1C培养基的变色状况(流程如图6)。同时,将增菌18~24小时的Lim氏培养液震荡混匀后,以无菌棉棒沾取菌液以四区划线方式涂划BAP,将BAP放置于35℃的5%CO2培养箱中,18~24小时后再观察生长状况及判读。
成本结构评估
为了了解使用含实施例1C培养基的试剂盒进行孕妇产前检查B群链球菌(图5b)的成本结构,以操作100例检体所需的时间、耗材及人力需求进行成本统计,并与现行孕妇产前检查B群链球菌的操作流程(图5a)进行比较。
结果
实施例1C培养基的特异性
将实施例1C培养基接种固定菌量的不同菌种,结果显示只有接种S.agalactiae的阳性对照组产生胡萝卜色,接种其他菌种包括E.faecalis、E.coli、C.albicans、S.aureus、S.marcescens及R.equi的实验组别及阴性对照组皆未发生颜色变化(表7)。此结果指出实施例1C培养基在所有测试菌株中具有100%的特异性。
生殖道栖息菌对实施例1C培养基的干扰
本试验模拟B群链球菌与其他常见阴道栖息菌共存时是否会影响实施例1C培养基的显色效能。将S.agalactiae(菌量为102CFU)分别与E.coli、C.albicans以及S.aureus进行混菌试验,结果发现无论其他菌为低菌量(102CFU)或高菌量(105CFU)均不会影响S.agalactiae在实施例1C培养基中的变色能力(表8),但E.faecalis与S.agalactiae混合时,低菌量(102CFU)的E.Faecalis会使33%(2/6)实施例1C培养基不会产生胡萝卜色,而高菌量(105CFU)更提升到66%(4/6)。此结果指出实施例1C培养基的变色虽不受E.coli、C.albicans及S.aureus的干扰,但若检体中含有E.faecalis时,则可能出现伪阴性结果,菌量越多,影响更为显著。
实施例1C培养基的侦测极限
本试验将侦测极限定义为能使实施例1C培养基变色阳性率95%的最低接种菌量,在20个重复的试验中,结果显示实施例1C培养基对B群链球菌的侦测极限为102CFU(表9)。
表9.接种不同菌量S.agalactiae于实施例1C培养基所呈现的变色百分比
a操作20次重复试验。分子代表产生变色支数,分母代表试验总数。
检体采集后不同输送时间的回收菌量
接种后0小时实施例1C培养基中S.agalactiae菌量为4.4x105CFU;接种后24小时、48小时及72小时的平均回收菌量分别增至1.7x108、2.8x108及2.5x108CFU,结果指出实施例1C培养基在室温存放24小时或以上,S.agalactiae将可增菌400倍以上。
以临床检体实际评估实施例1C培养基的效能
实施例1C培养基采检输送的孕妇产前检查检体共161例,以目前B群链球菌检验操作流程(图5a)发现阳性检体32件,而阴性检体129件,B群链球菌的阳性率为19.88%(32/161),至于使实施例1C培养基变色的检体共有30件(表10),其阳性率为18.63%(30/161),灵敏度为93.8%(30/32),实施例1C培养基的变色与传统的操作流程的阳性检体均相符合,其特异性100%(129/129)。
表10.以实际临床检体比较实施例1C培养基操作流程与使用Lim氏培养液之一般操作流程对B群链球菌的侦测效能
实施例1C培养基的灵敏度为93.8%(30/32),而特异性为100%(129/129)。
成本结构评估
假设B群链球菌的阳性率为20%,以实施例1C培养基(图6)与目前检测方法(图5a)筛检100位孕妇所花费的时间及使用的耗材与人力成本进行分析,结果发现使用实施例1C培养基虽比嗜氧检体输送管的成本稍高,但对整体耗材成本及人力操作时间而言,却可分别降低25%及60%,更重要地,使用实施例1C培养基可提早两天以上时间发出报告(表11)。
表11.比较当前检验流程与使用实施例1C培养基操作100份孕妇产前检查B群链球菌之成本差异(假设孕妇产前检查B群链球菌的阳性率为20%)
a耗材包括运送管及后续移种或鉴定所使用之Lim broth,GBS carrot agar/BAP及鉴定用试剂。
b包括2次之移种及操作CAMP test。
实施例4:评估实施例1A液体培养基鉴别GBS的效能
材料与方法
培养基
实施例1A培养基是针对孕妇产前检查乙型链球菌(Streptococcus agalactiae)的增菌鉴别培养基,为单一增菌、选择和鉴别功能的流体培养基,另准备Lim氏培养液做为比照用增菌培养基。
测试菌株
本测试选用的乙型链球菌为β溶血型Streptococcus agalactiae(ATCC 12386)与γ溶血型Streptococcus agalactiae(ATCC 13813);其他生殖道或肠道常见菌与其他致病测试菌株以及部分临床采集的菌株(表13)。测试菌株皆保存于GermBank-70℃冰箱。各菌种试验前,从GermBank装置中取出,移种于BAP,并培养于35±2℃的5%CO2培养箱18-24小时,挑取单一菌落再移种两次备用。
侦测极限(Detection Limit)
本步骤简述如下:为检测实施例1A培养基的最低侦测浓度,将S.agalactiae(ATCC12386)以0.1%的蛋白胨水配制为McFarland No.0.5(约1.5×108CFU/ml)的悬浮菌液,再进行连续十倍稀释,分别从108~102CFU/mL稀释液中取100μL加入棉棒后,插入实施例1A培养基,再放入35±2℃的5%的CO2培养箱中培养,于培养时数18±1、20±1、22±1、24±1、36±1与48±1hr观察其显色情形。根据CLSI规范,以判定达到95%以上阳性结果的最低浓度作为其侦测极限。
特异性(Specificity)
为了解实施例1A培养基是否为仅对β溶血型GBS产生胡萝卜色变化,将各测试菌种(表13)以0.1%的蛋白胨水配制为McFarland No.0.5(约1.5×108CFU/ml)的悬浮菌液,再稀释10倍后取100μL稀释菌液沾附于棉棒上,使棉棒上约含106CFU的菌量,分别插入实施例1A培养基后,置入35±2℃的5%CO2培养箱,24±2小时后观察显色情形。
干扰性(Interference)
为了解实施例1A培养基是否会受到产道中栖息菌的干扰,影响结果的判读;本测定将S.agalactiae(ATCC 12386)取约102与各测试菌种两种浓度(分别约102及106)混合(表14),并分别接种于棉棒上,再插入实施例1A培养基中,置入35±2℃,5%CO2培养箱,24±2小时后观察显色情形。为了更进一步确认E.faecalis对于其显色的干扰,各别约取100~106CFU E.faecalis(ATCC 29212)分别与102和103的S.agalactiae(ATCC 12386)混合,插入实施例1A培养基中,置入35±2℃,5%CO2培养箱,24±2小时后观察显色情形,以确认E.faecalis的干扰线性。
增菌效能
将S.agalactiae(ATCC 12386)以0.1%的蛋白胨水配制为McFarland No.0.5(约1.5×108CFU/ml)的悬浮菌液,以序列稀释的方式稀释1000倍后取100μL滴加至无菌棉棒上(约104CFU),并分别将棉棒插入实施例1A培养基与Lim氏培养液,35±2℃,5%CO2培养,24±2小时。再取出增菌后的棉棒置于含5ml无菌蒸馏水的试管中,震荡15秒,细菌悬浮液进行系列稀释后,各取100μL涂布于BAP上,于35±2℃,5%CO2培养24±2小时候计算菌落数,并换算一棉棒可取得的菌量。
结果
侦测极限(Detection Limit)
本实验根据CLSI规范,将变色阳性率达95%以上的最低菌量定义为其侦测极限。将约10CFU的Streptococcus agalactiae(ATCC 12386)接种于实施例1A培养基,并于35±2℃,5%CO2培养,24±2小时后。结果显示实施例1A培养基的最低侦测极限皆为10CFU(表12)。
表12.实施例1A培养基的侦测极限
a棉棒上接种菌量。
b 20重复中,出现呈色的百分比。
特异性(Specificity)
将各测试菌种接种于实施例1A培养基并培养,其结果显示只有接种Streptococcus agalactiae(ATCC 12386)与临床来源的S.agalactiae产生胡萝卜色,其他测试菌种皆无颜色变化(表13)。其中S.agalactiae(ATCC 13813)虽同为GBS但由于其为γ溶血型,在此实验中仍不产生颜色。以上结果只显示,实施例1A培养基对于GBS显色的特异性皆为100%,但对于γ溶血型的GBS并无显色。
表13.以试验菌株评估实施例1A培养基的特异性
a试验菌株接种菌量约为106CFU,阴性对照组接种0.1%的蛋白胨水
b为γ溶血型GBS。
c每项测试皆为三重复实验,实验结果相同,+表示产生胡萝卜色变化,-表示无颜色变化。
干扰性(Interference)
本实验以测试菌株的混合培养做为模拟临床的干扰性实验。干扰性实验的结果显示其他常见菌种对于实施例1A培养基阳性呈色并无影响。但当γ溶血型S.agalactiae(ATCC 13813)或E.faecalis(ATCC 29212)混合菌量比β溶血型S.agalactiae(ATCC 12386)高时,会使实施例1A培养基无法顺利显色,若使用临床来源试验菌株E.faecalis与E.faecium高菌量混合也无法顺利显色(表14)。由线性干扰试验的结果(表15),显示出当E.faecalis高于S.agalactiae十倍CFU时,即会出现伪阴性的结果。
表14.以试验菌株混合GBS评估实施例1A培养基
a阳性对照组仅接种102CFU S.agalactiae(ATCC 12386)
阴性对照组接种0.1%蛋白胨水。
b低菌量为混合102CFU试验菌株与102CFU S.agalactiae(ATCC 12386)
高菌量为混合106CFU试验菌株与102CFU S.agalactiae(ATCC 12386)
c表中分数结果表示在GBS carrot broth三重复中的呈色数
d为γ溶血型GBS。
表15.评估实施例1A培养基的E.faecalis干扰线性
a测试用标准菌株分别S.agalactiae(ATCC 12386)与E.faecalis(ATCC 29212)。
b表中分数结果表示在实施例1A培养基三重复中的呈色数。
测试产品的增菌效能
将接种约104CFU的Streptococcus agalactiae(ATCC 12386)的棉棒放入实施例1A培养基与Lim氏培养液后,35±2℃,5%CO2的增菌结果如(图7)所示,在24±2hr后即可达到显色的菌量并可判定S.agalactiae的存显色外,实施例1A培养基的增菌效能与Lim氏培养液并无明显差异。
在中国台湾,GBS的孕妇带原者约为15–30%。临床上对于乙型链球菌的治疗方法为提供预防性的抗生素治疗,若在乙型链球菌的检测当中产生伪阴性报告,尽管一般临床医师所使用的抗生素为对孕妇较低风险的penicillin,仍对孕妇与胎儿造成不必要的负担。目前公告的传统检测流程(图8),在发布报告需要3-5天,虽然抗生素施用的时机为分娩前4小时,但若发生早产情形,羊水提早破裂,胎儿很可能因此受到感染。因此在孕妇产前乙型链球菌检查的正确性与效率是相当重要的。根据台大医学院云林分院的统计;经由劝导乙型链球菌采检流程与送检流程的标准化下,乙型链球菌检出率的质量指针由14.8%提升至20.1%,这证实了中国台湾目前各医院的采检流程仍有改善的空间。在目前未能全面普及采检流程与送检流程的标准化前,改善检验流程,提高乙型链球菌检出率的质量仍属必要。本实施例中所测试的实施例1A培养基,目的为增菌中便能以显色的方式提早侦测GBS,缩短报告时间。在不改变公告的检验流程,采用实施例1A培养基(图8)将能缩短报告时数2-3天。为了避免因检体的低菌量及运送过程使菌量减少,导致伪阴性的产生,本研究以1至103CFU的S.agalactiae(ATCC 12386)来测试实施例1A培养基的侦测极限,结果显示在棉棒中含菌量约10CFU下并培养24hr仍可正确显示阳性反应(表12)。
另外,经由本实施例中的特异性实验(表13)证实,实施例1C培养基与实施例1A培养基的阳性显色仅在S.agalactiae(ATCC 12386)与临床株产生,其他菌种皆不会产生颜色反应,显示实施例1C培养基与实施例1A培养基的特异性高达100%。
利用其他菌种混合S.agalactiae以观测是否会干扰培养基的阳性显色。结果显示多数菌种即使含量远高于S.agalactiae(104倍),实施例1A培养基仍能维持正常的显色效果(表14),但混合菌种为E.faecalis、S.agalactiae(γ溶血型)与E.faecium时有所影响。当实施例1A培养基中的E.faecalis、S.agalactiae(γ溶血型)及E.faecium与S.agalactiae(β溶血型)等量时(102CFU),仍能正常产生稍弱的阳性反应,但在E.faecalis、S.agalactiae(γ溶血型)及E.faecium高于S.agalactiae(β溶血型)时,则会受到干扰所抑制。在利用E.faecalis进行浓度的线性测试后(表15),发现E.faecalis高于S.agalactiae(β溶血型)十倍量即会抑制显色,而此现象可配合藉由例如进行CAMP试验以降低伪阴性。
临床检体来源的菌株数量一般不足以达到检测实验所需的数量,因此公告方法建议检体需先进行增菌后方可进行检测。实施例1A培养基的设计即带有针对GBS增菌的功能,能在增菌同时进行乙型链球菌的检测,本研究将实施例1A培养基和传统方法的Lim氏培养液进行增菌效能比较(图7),发现实施例1A培养基在效能上与Lim氏培养液并无显著差异,显示着实施例1A培养基具有增菌并缩短检验时程的功能。如图8所示,采用实施例1A培养基,将可提早2-3天发出阳性报告,并提早操作药敏试验。综上所述,以本揭露的培养基进行GBS检验的流程,将可达到高正确性、简易操作、结果快速、正确,缩短报告时间与降低人员操作的人力的目标。
综合上述的实施例,可知本揭露的培养基不仅能降低耗材成本、人力操作时间、报告时效、及操作便利性(例如液体培养基,使用前不需加入产色纸条),同时仍有优异的菌株分离率表现。
虽然本发明已以较佳实施例揭露如上,然其并非用以限定本发明。熟悉此项技术的人士,在不悖离本发明的精神和范围下,当可进行许多改变及修饰。本发明所请范围当视所附的权利要求所界定者为准。
Claims (8)
1.一种用于检测B群链球菌的培养基,其特征在于,包含:
富集调合物,该富集调合物是Todd-Hewitt氏培养基,该富集调合物含量是每1升培养基为15至30克;
右旋糖;
盐类,该盐类是丙酮酸钠及硫酸镁;
缓冲剂,该缓冲剂包含吗福林丙磺酸及7.5克的磷酸氢二钠;
氨基酸或其盐类,该氨基酸或其盐类是L-半胱氨酸盐酸盐;
多糖类,该多糖类是淀粉,该多糖类含量是每1升培养基为10至25克;
微生物筛选剂,该微生物筛选剂包含硫酸黏菌素、硫酸庆大霉素和萘啶酮酸的组合,其中,硫酸黏菌素含量是每1升培养基为0.005至0.015克,硫酸庆大霉素是每1升培养基为0.005至0.010克,萘啶酮酸是每1升培养基为0.005至0.015克;以及
琼脂。
2.如权利要求1的培养基,其特征在于,形成该多糖类的单体包含六碳糖。
3.如权利要求1的培养基,其特征在于,该琼脂含量是每1升培养基为4至6克。
4.如权利要求1的培养基,其特征在于,该琼脂含量是每1升培养基为15克。
5.一种用于检测B群链球菌的试剂盒,其特征在于,包含如权利要求1至4项中任一项的培养基,及
一或多种容器,其用于容置如权利要求1至4项中任一项的培养基,该一或多种容器独立选自由采样管、试管及培养皿所组成的群组。
6.如权利要求5的试剂盒,其特征在于,进一步包含用于取得样品的工具。
7.如权利要求6的试剂盒,其特征在于,该工具为无菌棉棒。
8.一种用于检测样品中GBS的存在的非诊断性方法,该方法包含:
将样品培养于如权利要求1至4项中任一项的培养基,
约18至约24小时后,若培养基有淡橘至红色的色素产生,则判读为阳性。
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