CN106755275A - 同时侦测B群链球菌β溶血型及γ溶血型菌株的培养基及其应用 - Google Patents
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Abstract
怀孕妇女产前检查B群链球菌(Group B Streptococcus，简称为GBS，即无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)，又名乙型链球菌)为预防新生儿及产妇受到此菌感染的重要措施。公知的检验方式约有3至5％的无溶血型(γ溶血型)GBS菌株常被忽略，为了解决此项缺失，提供一种用于同时侦测β及γ溶血型B群链球菌(Group B Streptococcus(GBS))的培养基，其包含：生长因子；脱氧核糖核酸(DNA)；革兰氏阳性菌筛选剂；哺乳动物去血纤维血液(defibrinated blood)；及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 25923菌株的培养物上清液。
Description
技术领域
本揭露是关于用于培养微生物的培养基。更具体而言，本揭露是关于用于同时侦测B群链球菌(Group B Streptococcus，简称为GBS，即无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)，又名乙型链球菌)β溶血型及γ溶血型菌株的培养基。本揭露亦同时提供使用该培养基同时侦测B群链球菌β溶血型及γ溶血型菌株的方法。
背景技术
由于B群链球菌可引起新生儿败血症、肺炎及脑膜炎以及产妇的败血症及肺炎，美国疾病控制中心(CDC)及卫福部国民健康署公告方法建议怀孕妇女在35至37周时的产前检查必须包括阴道及肛门直肠棉拭检体的GBS检查。中国台湾医事检验学会公布的方法中建议实验室收到产前检查的嗜氧检体运送管后，需先插入Lim氏培养液(Lim broth)或胡萝卜色培养液(carrot broth)增菌培养基，放置于35至37℃培养箱内增菌18至24小时后，若使用Lim氏培养液，则移种血琼脂平板(blood agar plate，简称为BAP)；若使用胡萝卜色培养液而出现胡萝卜色则可直接发出阳性报告，若无显色，亦同样地移种至BAP，培养隔日再观察在BAP上生长的菌落是否有疑似呈β溶血型(β-hemolytic，菌落周围呈完全溶血)的GBS菌落生长，然后进行鉴定，此操作流程的GBS分离率约17～20％。
虽然GBS在BAP的生长菌落大多呈β溶血型，然而约有3至5％的菌株呈γ溶血型(即不溶血)。一般认为GBS的溶血能力与在胡萝卜色培养液增菌培养基的显色有关，这些不溶血型菌株将不会产生胡萝卜颜色，因此若胡萝卜色培养液无显色，必须移种至BAP或其他适当的培养基，以便观察GBS的典型β溶血型 或γ溶血型菌落。由于在BAP的γ溶血型菌落不易与其他具有小、且不溶血菌落的菌种区分，因此，除非检验人员特别警觉，否则将忽略而导致错误的报告。
为解决上述问题，已有厂商试图开发能可准确侦测出GBS存在的培养基，即，不只是典型GBS的β溶血型菌株，样品中若有BAP的γ溶血型菌株，亦不会遗漏。CHROMagar StrepB平板(CHROMagar Microbiology所产制)为其中一种商业上可获得、用于侦测GBS的培养基，凡GBS菌株，不论β溶血型或γ溶血型，均可在CHROMagar StrepB平板上呈现淡紫色菌落。但是，许多非GBS菌亦能在CHROMagar StrepB平板上生长，导致伪阳性比率提高。
另外，Hardy Diagnostics公司亦发展出GBS DetectTM平板，以侦测γ溶血型GBS。美国六家大型医院利用CDC公告的方法同时以BAP及GBS DetectTM平板的移种共评估619个临床检体(Hardy Diagnostics(n.d.)Evaluation of GBS DetectTM:a New Medium for the Detection of Non-Hemolytic Group B Strep in Subcultures of Carrot BrothTM and LIM Broth.Results of a Multi-Center Trial.http://www.hardydiagnostics.com/pdf/sc_posters/gbs_detect_poster_c135.pdf)，结果共分离107株GBS(分离率为17.2％)，其中由BAP及GBS DetectTM两种培养基分离者为83株，仅由GBS DetectTM分离者24株，仅由BAP分离者0株。此指出GBS DetectTM可额外增加22.4％(24/107)的分离率，不过GBS DetectTM上生长的溶血型菌不属于GBS(即伪阳性)高达58％(62/107)，因此，伪阳性比率同样也必须予以改善。
有鉴于此，需要可准确侦测GBS存在的培养基，即，不只是典型GBS的β溶血型菌株，样品中若有GBS的γ溶血型菌株，亦可侦测出。
发明内容
为解决前述的问题，本揭露提供一种用于同时侦测β及γ溶 血型B群链球菌(Group B Streptococcus(GBS))的培养基，其包含：生长因子；脱氧核糖核酸(DNA)；革兰氏阳性菌筛选剂；哺乳动物去血纤维血液(defibrinated blood)；及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 25923菌株的培养物上清液。在此等实施方式中，该培养基中的生长因子可包含右旋糖(dextrose)、氨基酸或其盐类(例如L-半胱氨酸盐酸盐)、辅酶(例如烟碱酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD))、及维生素(例如维生素K)。又，该脱氧核糖核酸的含量在每1升培养基中为0.5至2.0g，较佳的是每1升培养基中为1g。另外，该革兰氏阳性菌筛选剂可为黏菌素硫酸盐(colistin sulfate)、奈啶酮酸(nalidixic acid)及结晶紫(crystal violet)，其中黏菌素硫酸盐的含量在每1升培养基中为0.005至0.015g，较佳的是每1升培养基中为0.0125g；奈啶酮酸的含量在每1升培养基中为0.005至0.015g，较佳的是每1升培养基中为0.0125g；而结晶紫的含量在每1升培养基中为0.0001至0.0010g，较佳的是每1升培养基中为0.0002g。又，该哺乳动物去纤维血液是绵羊或马的去血纤维血液，该哺乳动物去纤维血液的含量是每升培养基为50至70mL。
本揭露的培养基中所含的该培养物上清液是来自将金黄色葡萄球菌ATCC 25923菌株接种至增菌培养液并于33至37℃中培养所分离出的上清液，其中该增菌培养液可包含胰蛋白酶大豆培养液(tryptic soy broth(TSB))、L-半胱氨酸盐酸盐、NAD、及维生素K。该金黄色葡萄球菌ATCC 25923菌株接种至增菌培养液并于33至37℃中培养的其他条件，诸如时间、是否震荡培养、培养箱中的气体组成(例如CO2比例)、收取上清液前的培养物(即培养液、细菌本身、细菌分泌至培养液中的代谢物等等)吸光值，并无限制，只要不会对同时侦测GBS的β溶血型及γ溶血型菌株的判读结果有不良影响即可。该培养物上清液可先与无菌水以1:2至1:80的体积比混合后，再将所得的混合液加入该培养基。在一实施方式中，该混合液加至培养基的量是每升培养基为10至25mL。
本揭露所提供的用于同时侦测β及γ溶血型B群链球菌 (Group B Streptococcus(GBS))的培养基，基底可为、但不限于本技术领域中公知的胰蛋白(酶)大豆培养基(Tryptic Soy Agar)。具体言之，胰蛋白大豆培养基可包括酪蛋白胰酶消化物(pancreatic digest of casein)、大豆木瓜酶水解物(papaic digest of soybean meal)、氯化钠(sodium chloride)及琼脂(agar)。又，本文中所述的生长因子可加至胰蛋白大豆培养基以利培养基的调制。
在一实施方式中，本揭露亦提供一种同时侦测样品中β及γ溶血型GBS的方法，其包含：以本揭露的用于同时侦测β及γ溶血型B群链球菌(Group B Streptococcus(GBS))的培养基培养自样品分离的菌株；及观察所形成的菌落是否具有溶血特征。菌株为γ溶血型GBS，则该菌株不会在血琼脂平板(blood agar plate(BAP))上呈现溶血特征，但可在本揭露的同时侦测β及γ溶血型GBS的培养基上呈现溶血特征。
在本文中，用语“自样品分离的菌株”是指以本领域技术人员已知的任何适当分离方式所获得的菌株，该些适当的分离方式可例如参照医检学会公布的孕妇乙型链球菌筛检检体采集、检验及药敏标准作业、保存与运输作业等须知来进行。
在本文中，用语“同时侦测β及γ溶血型B群链球菌(GBS)”是指在某一培养基上γ溶血型GBS可呈现与β溶血型相同菌落特性，该菌落特性包括但不限于：溶血特征、菌落颜色等等。
本揭露所提供的用于同时侦测β及γ溶血型B群链球菌(Group B Streptococcus(GBS))的培养基可搭配目前公知惯用的孕妇乙型链球菌筛检检体采集及检验流程，以提高检验灵敏度。举例而言，首先，可用无菌棉棒拭子自阴道及/或直肠口采检后，放入一般嗜氧检体运送管运送到检验室，检验室收到后，立即取出棉棒拭子划种于GBS胡萝卜色培养基平板(GBS carrot agar)(并插种)及本揭露的同时侦测β及γ溶血型GBS的培养基上，再将拭子插入Lim氏培养液或胡萝卜色培养液增菌培养基。经划种或接种的GBS胡萝卜色培养基、本揭露的同时侦测β及γ溶血型GBS的培养基、Lim氏培养液及胡萝卜色培养液置于35℃的厌氧箱或CO2培养箱培养，并于18至24小时后判读，若胡萝 卜色培养液出现胡萝卜色及/或于本揭露的同时侦测β及γ溶血型GBS的培养基观察到疑似GBS的β溶血菌落，且GBS胡萝卜色培养基平板上也出现胡萝卜色菌落，则可直接发出GBS阳性报告；若无怀疑菌落，可再将Lim氏培养液或胡萝卜色培养液增菌培养基以同样方式移种至另一片GBS胡萝卜色培养基平板及本揭露的同时侦测β及γ溶血型GBS的培养基上，于培养后做同样观察。若需操作药敏试验，则可直接挑取培养基上经确认为B群链球菌的生长菌落进行测试。若GBS胡萝卜色培养基平板未产生胡萝卜色，应注意观察本揭露的同时侦测β及γ溶血型GBS的培养基上是否有β溶血的疑似GBS菌落，必要时，可选取此疑似的菌落进行GBS的鉴定流程，若经鉴定为GBS，再进行药物感受性试验。
附图说明
图1显示S.agalactiae ATCC 13813(左)及ATCC 12386(右)生长菌落分别在BAP(上排)及实例1培养基(下排)显示的溶血型。ATCC 13813在BAP(左上)箭头指出溶血型菌落，但在实例1培养基(左下)箭头则显示溶血型菌落。
具体实施方式
以下配合图式而说明本发明的实施例以详细说明本发明，但这并不意味本发明仅局限于这些实施例所揭示的内容。
实例1：培养基的制备
表1提供根据本揭露的培养基的配方例示性实施方式，并说明每1升所包括的各成分的含量。
表1
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 25923菌株的培养物上清液混合稀释液的配制如下：
将金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 25923菌株移种 至血琼脂平板培养基上，于35℃培养18至24小时。
挑起血琼脂平板上单一金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 25923菌株菌落，并接种至增菌培养液(即改良式TSB 50mL x2瓶(改良式TSB配方，每公升含：30g的TSB、0.25g的L-半胱氨酸盐酸盐、0.25g的NAD、0.001g的维生素K1)，于35℃培养48至72小时后，将培养液以121℃蒸气灭菌15至30分钟，再分装倒入50mL无菌离心管×2支。
将培养液放在低温离心机相对位置以达平衡，以3,000xg的条件于2至8℃离心10分钟，用无菌吸管取出离心管中的上清液后，将上清液以0.45μm滤膜过滤2次，分装至无菌15mL离心管×6支。
分装后的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 25923菌株的培养物上清液放在-70℃冷冻保存。配制培养基前2至5小时取出放在室温溶解，再以无菌水配制稀释比例1:2至1:80的混合稀释液，例如：1:2稀释比例为取金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC25923菌株的培养物上清液5mL加无菌水5mL，1:80稀释比例为取金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 25923菌株的培养物上清液0.125mL加无菌水9.875mL，获得总体积10mL的混合稀释液。
欲配制培养基时，秤量40g的胰蛋白大豆培养基及1g的DNA(来自鲱鱼(Herring)精子)，加入950mL的纯水中，混合均匀后，于121℃灭菌22分钟。之后，放入恒温水箱，冷却至46℃至48℃，再加入下列组分，并混合均匀：0.0125g的黏菌素硫酸盐(先溶于10mL纯水，并以0.22μm滤膜过滤)；0.0125g的奈啶酮酸(溶于数滴1N NaOH再加10mL纯水，以0.22μm滤膜过滤)；0.0002g的结晶紫(先将0.002g的结晶紫溶于100mL纯水，以0.22μm滤膜过滤后，再取10mL加入)；10mL的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 25923菌株的培养物上清液混合稀释液、及新鲜的去血纤维绵羊血50mL。
混合均匀后即可分装。待培养基冷却凝固后，即获得可用于同时侦测β及γ溶血型B群链球菌(Group B Streptococcus(GBS))的培养基。
实例2：培养基测试
材料及方法
试验菌种来源
本研究使用的试验菌共计12菌株(参见表2)，除了1株G群链球菌(GGS)为来自台美医事检验所(新北市，中国台湾)的临床菌株外，其他11株测试菌包括Staphylococcus aureus(金黄色葡萄球菌)、S.epidermidis(表皮葡萄球菌)、S.saprophyticus(腐生葡萄球菌)、S.pyogenes(GAS，化脓性链球菌)、S.pneumoniae(肺炎链球菌)、Enterococcus faecalis(粪肠球菌)及一些其他菌种均为ATCC标准菌株，皆购自美国菌种保存中心(ATCC)的授权公司MicroBioLogicals公司(MBL，加拿大)。这些菌种/菌株种入GermBank菌种保存管(启新公司，中国台湾)，然后放置于-70℃冷冻柜中保存。
试验菌种的移种培养
进行试验前，从Germbank装置中分别取出ATCC及临床分离株移种BAP，将BAP培养于35℃的5％至10％CO2培养箱，18至24小时后，再以四区划线法移种至BAP以便获得单一菌落，共移种三次。
菌种的确认
进行移种后生长菌落的观察以了解是否符合该测试菌应有的特征，其中二个GBS菌株以GBS胡萝卜色培养基、CAMP试验与马尿酸水解(hippurate hydrolysis)试验确认其反应为阳性，并配合链球菌分群套组(Streptococcal Grouping Kit,目录号DR0585A，Oxoid公司，英国)的快速乳胶凝集试验(latex agglutination test)结果，确认其为GBS。至于Group A Streptococcus(GAS)与Group G Streptococcus(GGS)亦以快速乳胶凝集试验进行群别确认，而其他测试菌则依传统方法进行鉴定。
培养基与试剂
除了实例1培养基外，所使用的培养基包括BAP与各种鉴定用培养基/试剂皆购自启新生物科技有限公司。
测试培养基的接种步骤
接种BAP及实例1培养基前将培养基回复至室温，操作时将测试菌分别以一般的四分划线法接种，置于35℃的一般或CO2培养箱，18至24小时后观察各菌在三种培养基生长的菌落特征与溶血型态。
结果
GBS ATCC 13813生长在BAP的菌落为不溶血性(即γ溶血型，图1左上)，但在实例1培养基则转变为β溶血型(图1左下)；而GBS ATCC12386在BAP及实例1培养基均呈同样的β溶血型(图1右上及右下)(表2)。
表2
a在BAP生长菌落呈γ溶血型。
b在BAP生长菌落呈β溶血型。
cα溶血型为不完全溶血，菌落周围有灰绿色的狭窄晕环，如镜检此处的培养基将仅能发现少数红血球被溶解；β溶血型为完全溶血，菌落周围有明显宽广的完全透明环，环内的红血球全部被破坏；而γ溶血型为不溶血，菌落周围没有任何改变。
三种葡萄球菌、2株GAS及各1株Group G Streptococcus(GGS)、S.pneumoniae、E.faecalis、L.monocytogenes在BAP及实例1培养基均能生长良好，且溶血型均不变(表2)。至于Bacillus cereus在BAP生长良好，但不能在实例1培养基生长。
将1个溶血型菌株(ATCC 13813)及1个溶血型菌株(ATCC14289)的GBS分别划种在实例1培养基，培养后的生长菌落均呈现β溶血型特征(图1)，显示实例1培养基对GBS的β及γ溶血型株侦测效果良好。其他能够在BAP与实例1培养基生长的革兰氏阳性球菌或杆菌所显现的溶血型均相同，此指出实例1培养基的检验室应用将不改变其他菌在BAP应有的溶血型式(表2)。
一些在BAP呈β溶血型的菌种亦能在实例1培养基产生同样的溶血型(包括S.aureus、GAS、GGS及L.monocytogenes)，可利用菌落的大小或其他特征与GBS区分，若有不确定性，可再将任何疑似GBS的生长菌落进一步鉴定加以确认。唯一不能在实例1培养基生长的测试菌为B.cereus(表2)，这是因为B.cereus对任何抗微生物剂均呈敏感性，因此，其不能生长在含有抗微生物剂的实例1培养基是可预期的。
虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明。熟悉本领域技术的人员，在不悖离本发明的精神和范围下，当可进行许多改变及修饰。本发明所请范围当视所附的权利要求所界定者为准。
Claims (12)
1.一种用于同时侦测β及γ溶血型B群链球菌(Group BStreptococcus)的培养基，其包含：
生长因子；
脱氧核糖核酸；
革兰氏阳性菌筛选剂；
哺乳动物去血纤维血液；及
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 25923菌株的培养物上清液。
2.如权利要求1的培养基，其中该生长因子包含右旋糖、氨基酸或其盐类、辅酶、及维生素。
3.如权利要求2的培养基，其中该氨基酸或其盐类为L-半胱氨酸盐酸盐；该辅酶为烟碱酰胺腺嘌呤二核苷酸；且该维生素为维生素K。
4.如权利要求1的培养基，其中该脱氧核糖核酸的含量在每1升培养基中为0.5至2.0g。
5.如权利要求1的培养基，其中该革兰氏阳性菌筛选剂为黏菌素硫酸盐、奈啶酮酸及结晶紫，其中黏菌素硫酸盐的含量在每1升培养基中为0.005至0.015g，奈啶酮酸的含量在每1升培养基中为0.005至0.015g，而结晶紫的含量在每1升培养基中为0.0001至0.0010g。
6.如权利要求1的培养基，其中该哺乳动物去纤维血液是绵羊或马的去血纤维血液，该哺乳动物去纤维血液的含量是每升培养基为50至70mL。
7.如权利要求1的培养基，其中该培养物上清液是来自将金黄色葡萄球菌ATCC 25923菌株接种至增菌培养液并于33至37℃中培养所分离出的上清液。
8.如权利要求1的培养基，其中该培养物上清液先与无菌水以1:2至1:80的体积比混合后，再将所得的混合液加入该培养基。
9.如权利要求8的培养基，其中该混合液加至培养基的量是每升培养基为10至25mL。
10.如权利要求7的培养基，其中该增菌培养液包含胰蛋白酶大豆培养液、L-半胱氨酸盐酸盐、NAD、及维生素K。
11.一种同时侦测样品中β及γ溶血型GBS的方法，其包含：
以权利要求1至10中任一项的培养基培养自样品分离的菌株；及
观察所形成的菌落是否具有溶血特征。
12.如权利要求11的方法，若该菌株为γ溶血型GBS，则该菌株不会在血琼脂平板上呈现溶血特征。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20170531 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |