CN109207553A - 一种β溶血的葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的鉴别方法 - Google Patents

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李泽玉
赵振
刘�文
杨成良
许军
张玲
汪道明
徐春丽
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Abstract

本发明公开了一种金黄色葡萄球菌与其它β‑溶血葡萄球菌的鉴别方法，所述方法为利用β溶血的葡萄球菌和金黄色葡萄球菌同时存在时，β溶血的葡萄球菌产CAMP因子，表现CAMP试验阳性，而金黄色葡萄球菌不产CAMP因子，表现CAMP试验阴性来鉴别金黄色葡萄球菌。本发明可以最简单的鉴别金黄色葡萄球菌与其它β溶血的葡萄球菌，降低鉴定成本，又可以节约时间。

Description

一种β溶血的葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的鉴别方法
技术领域
本发明属于临床微生物检验技术领域，特别是一种β溶血的葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的鉴别方法。
背景技术
CAMP试验即CAMP因子反应于1944年最初由Christie、Atkins以及Munch-Petersen最先报道，指金黄色葡萄球菌的β-溶血素与无乳链球菌的细胞外CAMP因子协同作用，增强红细胞溶解。绝大多数无乳链球菌菌落（＞98％）含有cfb基因并且表达CAMP因子，但是的确发现CAMP阴性突变菌株。待测菌株与金黄色葡萄球菌标准菌株（ATCC25923），在羊血平皿上成90°角垂直划线。血平皿在空气中，（36±1）℃培养过夜。如果在金黄色葡萄球菌的β-溶血素与CAMP因子扩散区域出现三角形增强β-溶血区，则为试验阳性。CAMP因子阳性的菌株也可以采用含有β-溶血素的纸片（Remel Inc.，Lenexa，KS）或者快速CAMP因子斑点法进行检测。尽管许多化脓链球菌包含CAMP因子基因的同源基因，除了无乳链球菌与一些罕见的人分离的海豚链球菌（S.iniae）、豕链球菌（S.porcinus）、假豕链球菌（S.pseudoporcinus）外，多数β-溶血链球菌的上述CAMP因子试验均为阴性。某些革兰阳性杆菌也呈CAMP因子阳性，包括棒杆菌（corynebacteria）与单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）。到目前为止，未提及β溶血的葡萄球菌有CAMP试验阳性，更是未提及过此实验可用于鉴别金黄色葡萄球菌和其它β溶血的葡萄球菌。
发明内容
本发明的目的提供一种β溶血的葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的鉴别方法，方便临床鉴别使用。
经查阅相关专业教科书和文献，除了无乳链球菌与一些罕见的人分离的海豚链球菌（S.iniae）、豕链球菌（S.porcinus）、假豕链球菌（S.pseudoporcinus）外，某些革兰阳性杆菌也呈CAMP因子阳性，即CAMP试验阳性，包括棒杆菌（corynebacteria）与单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes），但是，未发现有报道路邓葡萄球菌、溶血葡萄球菌、β溶血的表皮葡萄球菌或β溶血的人型葡萄球菌呈CAMP因子阳性。
本发明技术方案是：
一种β溶血的葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的鉴别方法，所述方法为利用β溶血的葡萄球菌和金黄色葡萄球菌同时存在时，β溶血的葡萄球菌产CAMP因子，表现CAMP试验阳性，而金黄色葡萄球菌不产CAMP因子，表现CAMP试验阴性来鉴别金黄色葡萄球菌。
优选地，所述β溶血的葡萄球菌包括路邓葡萄球菌、溶血葡萄球菌或β溶血的表皮葡萄球菌或β溶血的人型葡萄球菌。
优选地，所述方法鉴别时采用的金黄色葡萄球菌标准菌株保藏编号为ATCC25923。
优选地，所述方法包括以下步骤：
1）将临床各科室送检的培养标本根据不同标本接种不同的平皿，放置35±1℃恒温培养箱；
2）第二天，阅读所有的平皿，选取在血平皿上有β溶血，触酶阳性，革兰染色为阳性球菌的纯菌落；
3）第三天，将步骤3）纯菌落上基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪鉴定，然后把鉴定为路邓葡萄球菌或溶血葡萄球菌或β溶血的表皮葡萄球菌或β溶血的人型葡萄球菌与金黄色葡萄球菌的菌落再做CAMP试验，上细菌鉴定仪同步验证；
4）第四天，阅读细菌鉴定仪的结果与质谱仪上的鉴定结果是否一致，对于鉴定结果一致的菌，观察其CAMP试验结果；
完成β溶血的葡萄球菌与金黄色葡萄球菌的鉴别。
优选地，所述步骤1）呼吸道标本和生殖道标本放置35±1℃含5%二氧化碳恒温培养箱16-24h。
优选地，所述步骤3）基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪为［MALDI-TOP（MS ）］VITEK MS IVD。
优选地，所述步骤3）细菌鉴定仪为美国BD公司细菌鉴定仪phoenix100 和法国梅里埃Compact鉴定仪。
优选地，所述步骤4）质谱仪、细菌鉴定仪鉴定一致的结果中除金黄色葡萄球菌，路邓葡萄球菌或溶血葡萄球菌或β溶血的表皮葡萄球菌或β溶血的人型葡萄球菌的CAMP因子阳性，即CAMP试验阳性，而金黄色葡萄球菌的CAMP试验阴性
本发明的有益效果如下：
本发明可以最简单的鉴别金黄色葡萄球菌与其它β溶血的葡萄球菌，降低鉴定成本，又可以节约时间。本发明的基础是发现了除金黄色葡萄球菌外的β溶血的葡萄球菌都产生CAMP因子，即，CAMP试验阳性。
附图说明
图1是实施例1路邓葡萄球菌的CAMP实验效果图:其中横线为金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923，竖线为临床分离菌株编号C-18306775路邓葡萄球菌；
图2是实施例1金黄色葡萄球菌CAMP试验效果图: 其中横线为金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923，竖线为临床分离的金黄色葡萄球菌编号C-18306694；
图3是实施例2溶血葡萄球菌的CAMP实验效果图:其中横线为金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923，图3a竖线为临床分离的溶血葡萄球菌编号C-18307009,图3b竖线为C-18307019）；
图4实施例2金黄色葡萄球菌CAMP试验效果图:其中横线为金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923，竖线为临床分离的金黄色葡萄球菌编号C-18306694）；
图5实施例3β-溶血的表皮葡萄球菌的CAMP试验效果图: 其中横线为金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923，竖线为临床分离的β-溶血的表皮葡萄球菌，编号C-18307042；
图6实施例3β-溶血人型葡萄球菌CAMP试验效果图：其中横线为金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 25923，竖线为临床分离的β-溶血人型葡萄球菌，图6a编号是C-18308717图6b为C-18308672；
图7实施例3金黄色葡萄球菌CAMP试验效果图：其中横线为金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 25923，竖线为临床分离的金黄色葡萄球菌，编号是C-18306694。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1 路邓葡萄球菌与金黄色葡萄球菌的鉴别
鉴别方法为：将临床各科室送检的培养标本根据不同标本接种不同的平皿，放置35±1℃恒温培养箱，其中，呼吸道标本和生殖道标本放置35±1℃含5%二氧化碳恒温培养箱过夜；第二天，阅读所有的平皿，在血平皿上有β溶血，革兰染色为阳性球菌、且触酶阳性的菌落纯分；第三天，将纯菌落上基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪［MALDI-TOP（MS ）］VITEK MS IVD鉴定，然后把鉴定为路邓葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的菌落再做CAMP试验，上美国BD公司的凤凰100和法国梅里埃Compact鉴定仪同步验证；第四天，阅读美国BD公司的凤凰100和法国梅里埃Vitek2 Compact鉴定仪的结果与质谱仪上的鉴定结果是否一致，对于鉴定结果一致的菌，观察其CAMP试验结果。结果发现：质谱仪，凤凰100和Vitek2Compact鉴定一致结果是路邓葡萄球菌的CAMP因子阳性，即CAMP试验阳性，而金黄色葡萄球菌的CAMP试验阴性。
本发现实验技术的目的是这样实现的：路邓葡萄球菌、金黄色葡萄球菌这两种细菌都具有β-溶血现象，两种细菌的生化特点极其相似，鉴别这两细菌其它的鉴定方法比如凝固酶试验，路邓葡萄球菌的凝固酶试验，用人血浆做结果不可靠，这样的情况，在基层医院没有比较先进的鉴定设备的情况下，鉴定起来很困难。本新型试验方法发现路邓葡萄球菌CAMP试验阳性，能有效地鉴别金黄色葡萄球菌和路邓葡萄球菌，而且，增强的溶血区域大小和形状都很稳定。
本新型试验的主要目的是路邓葡萄球菌的CAMP试验阳性，即产生CAMP因子。并且，试验结果稳定可靠，试验菌株12株，都是CAMP试验阳性，而且，增强溶血区域形状一致，即为扇形（半圆形）。由图1、图2可知临床分离的路邓葡萄球菌编号是C-18306775，CAMP试验阳性，增强溶血区域呈半圆形；临床分离的金黄色葡萄球菌编号是C-18306694，CAMP试验阴性。
实施例2 溶血葡萄球菌与金黄色葡萄球菌的鉴别
鉴别方法为：将临床各科室送检的培养标本根据不同标本接种不同的平皿，放置35±1℃恒温培养箱，其中，呼吸道标本和生殖道标本放置35±1℃含5%二氧化碳恒温培养箱过夜；第二天，阅读所有的平皿，在血平皿上有β溶血，革兰染色为阳性球菌的菌落纯分；第三天，将纯菌落上基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪［MALDI-TOP（MS ）］VITEK MS IVD鉴定，然后把鉴定为溶血葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的菌落再做CAMP试验，上美国BD公司的凤凰100和法国梅里埃Compact鉴定仪同步验证；第四天，阅读美国BD公司的凤凰100和法国梅里埃Vitek2 Compact鉴定仪的结果与质谱仪上的鉴定结果是否一致，对于鉴定结果一致的菌，观察其CAMP试验结果。结果发现：质谱仪，凤凰100和Vitek2 Compact鉴定一致结果是溶血葡萄球菌的CAMP因子阳性，即CAMP试验阳性，而金黄色葡萄球菌的CAMP试验阴性。
本发现实验技术的目的是这样实现的：近年以来，表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌通常被称为“medium pathogenicity”葡萄球菌，主要引起伴有诱发因素的患者，如免疫缺陷和（或）存在内源或外源植入体的患者院内感染。但是，我们在研究阴道分泌物微生物组成中发现，金黄色葡萄球菌和溶血葡萄球菌同时存在的机会很多，溶血葡萄球菌CAMP试验阳性，即产CAMP因子，势必会引起致病性增强的风险。这两种细菌都具有β-溶血现象，鉴别这两细菌其它的鉴定方法也不是百分百的敏感，这样的情况，在基层医院没有比较先进的鉴定设备的情况下，鉴定起来会有一定的难度。本新型试验方法发现溶血葡萄球菌CAMP试验阳性，就给鉴别金黄色葡萄球菌和溶血葡萄球菌增加了一道保险，而且，增强的溶血区域大小和形状都很稳定。
本新型试验的主要目的是溶血葡萄球菌的CAMP试验阳性，即产生CAMP因子。并且，试验结果稳定可靠，试验菌株50株，都是CAMP试验阳性，而且，增强溶血区域形状一致，即为扇形（半圆形）。由图3、图4可知临床分离的溶血葡萄球菌编号是C-18307009，C-18307019，CAMP试验阳性，增强溶血区呈半圆形；临床分离的金黄色葡萄球菌，编号是C-18306694，CAMP试验阴性。
实施例3 β溶血的表皮葡萄球菌或β溶血的人型葡萄球菌与金黄色葡萄球菌的鉴别
鉴别方法为：将临床各科室送检的培养标本根据不同标本接种不同的平皿，放置35±1℃恒温培养箱，其中，呼吸道标本和生殖道标本放置35±1℃含5%二氧化碳恒温培养箱过夜；第二天，阅读所有的平皿，在血平皿上有β溶血，革兰染色为阳性球菌的菌落纯分；第三天，将纯菌落上基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪［MALDI-TOP（MS ）］VITEK MS IVD鉴定，然后把鉴定为溶血葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的菌落再做CAMP试验，上美国BD公司的凤凰100和法国梅里埃Compact鉴定仪同步验证；第四天，阅读美国BD公司的凤凰100和法国梅里埃Vitek2 Compact鉴定仪的结果与质谱仪上的鉴定结果是否一致，对于鉴定结果一致的菌，观察其CAMP试验结果。结果发现：质谱仪，凤凰100和Vitek2 Compact鉴定一致结果是β溶血的表皮葡萄球菌和β溶血人型葡萄球菌的CAMP因子阳性，即CAMP试验阳性，β-溶血的表皮葡萄球菌和人型葡萄球菌也产CAMP因子，呈CAMP试验阳性，而金黄色葡萄球菌的CAMP试验阴性。
本发现实验技术的目的是这样实现的：自1980年以来，凝固酶阴性尤其是表皮葡萄球菌逐步被公认为医院感染病原菌。表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌通常被称为“mediumpathogenicity”葡萄球菌，主要引起伴有诱发因素的患者，如免疫缺陷和（或）存在内源或外源植入体的患者院内感染。但是，我们在研究阴道分泌物微生物组成的发现，金黄色葡萄球菌与溶血葡萄球菌；β溶血的表皮葡萄球菌与金黄色葡萄球菌；β溶血的人型葡萄球菌与金黄色葡萄球菌同时存在的机会很多，而且，β溶血的表皮葡萄球菌、β溶血的人型葡萄球菌也具有β-溶血现象，β溶血的表皮葡萄球菌、β溶血的人型葡萄球菌都呈CAMP试验阳性，即产CAMP因子。CAMP因子也是致病因子，说明，β溶血的表皮葡萄球菌或β溶血的人型葡萄球菌比传统认为的的致病性要强。由图5-图7可知临床分离的β溶血的表皮葡萄球菌或β溶血的人型葡萄球菌，编号是C-18307042，C-18308717，C-18308672，CAMP试验阳性；临床分离的金黄色葡萄球菌，编号C-18306694，CAMP试验阴性。
以上所述实施案例仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种β溶血的葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的鉴别方法，其特征在于，所述方法为利用β溶血的葡萄球菌和金黄色葡萄球菌同时存在时，β溶血的葡萄球菌产CAMP因子，表现CAMP试验阳性，金黄色葡萄球菌不产CAMP因子，表现CAMP试验阴性来鉴别金黄色葡萄球菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述β溶血的葡萄球菌包括路邓葡萄球菌、溶血葡萄球菌或β溶血的表皮葡萄球菌或β溶血的人型葡萄球菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法鉴别时采用的金黄色葡萄球菌标准菌株保藏编号为ATCC25923。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
1）将临床各科室送检的培养标本根据不同标本接种不同的平皿，放置35±1℃恒温培养箱；
2）第二天，阅读所有的平皿，选取在血平皿上有β溶血，触酶阳性，革兰染色为阳性球菌的纯菌落；
3）第三天，将步骤3）纯菌落上基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪鉴定，然后把鉴定为路邓葡萄球菌或溶血葡萄球菌或β溶血的表皮葡萄球菌或β溶血的人型葡萄球菌与金黄色葡萄球菌的菌落再做CAMP试验，上细菌鉴定仪同步验证；
4）第四天，阅读细菌鉴定仪的结果与质谱仪上的鉴定结果是否一致，对于鉴定结果一致的菌，观察其CAMP试验结果；
完成β溶血的葡萄球菌与金黄色葡萄球菌的鉴别。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1）呼吸道标本和生殖道标本放置35±1℃含5%二氧化碳恒温培养箱16-24h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在：所述步骤3）基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪为［MALDI-TOP（MS ）］VITEK MS IVD。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3）细菌鉴定仪为美国BD公司细菌鉴定仪phoenix100 和法国梅里埃Compact鉴定仪。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤4）质谱仪、细菌鉴定仪鉴定一致的结果中除金黄色葡萄球菌，路邓葡萄球菌或溶血葡萄球菌或β溶血的表皮葡萄球菌或β溶血的人型葡萄球菌的CAMP因子阳性，即CAMP试验阳性，而金黄色葡萄球菌的CAMP试验阴性。
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