CN109825557A

CN109825557A - 一种检测大气环境中磺胺类耐药基因sulI的方法

Info

Publication number: CN109825557A
Application number: CN201910287733.0A
Authority: CN
Inventors: 汪庆; 侯泽林; 王丽涛; 杨光; 张海霞; 齐丽英
Original assignee: Hebei University of Engineering
Current assignee: Hebei University of Engineering
Priority date: 2019-04-11
Filing date: 2019-04-11
Publication date: 2019-05-31

Abstract

本发明公开了一种检测大气环境中磺胺类耐药基因sulI的方法。该方法包括以下两个内容：(1)提取目标大气环境样品中的DNA，以此获取的DNA为模板，用本发明设计的正向引物和反向引物对(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)提取的DNA样品为模板，利用定量PCR扩增技术获得目的基因的PCR产物；(2)运用步骤(1)中得到的PCR扩增循环数，依据定量PCR测定目的基因sulI质粒标准品的标准曲线，得到目标大气环境样品中磺胺类耐药基因sulI的含量。本发明提供的目的基因引物序列和方法可以对大气环境样品中磺胺类耐药基因sulI进行快速精确定量。

Description

一种检测大气环境中磺胺类耐药基因sulI的方法

技术领域

本发明涉及环境生物学领域，具体涉及一种检测大气环境中磺胺类耐药基因sulI的方法。

背景技术

抗生素是指由细菌、霉菌或其他一些微生物产生的次级代谢产品或者人工合成的类似物，现已发展成为世界上使用范围最广泛、剂量最大的药物之一。近年来，抗生素的滥用造成耐药细菌和耐药基因的环境污染问题，已引起全球的高度关注。

有别于一般的环境污染物，抗生素耐药基因主要以质粒作为携带载体，并由特定基因编码的蛋白通道在相同甚至不同种属的细菌之间发生基因水平扩散。研究发现抗生素耐药基因能从肠道耐药细菌向土著敏感菌传播，不仅改变土著菌环境的微生物菌落结构，而且能够在环境中长期残留，对环境安全构成潜在危害，甚至经食物链将抗生素耐药基因向人体内传播，对人类健康构成潜在危害。目前大量研究发现耐药基因在地表水环境和土壤等生态环境中广泛存在，而且含量很高。但是，对雾霾天气的PM_2.5和PM₁₀样品中耐药菌，尤其是耐药基因研究较少。大气环境中，尤其是雾霾天气的高浓度PM_2.5和PM₁₀环境中耐药细菌和耐药基因的含量相对较少，但耐药细菌和耐药基因能通过空气传播进入人体呼吸系统，产生严重的公共健康风险。

磺胺类耐药基因作为在环境介质中被广泛检测到的基因类型，目前主要采用可培养微生物的方法研究耐药性，但是这些方法对不可培养微生物的耐药基因无法进行检测。

定量PCR技术是指通过设计目标基因引物，根据标准曲线对目标基因进行定量分析的方法。该方法可以同时检测环境中的不可培养微生物所携带的耐药基因，尤其对大气环境这种微生物含量相对较低的细菌中耐药基因的检测具有较好的技术优势。因此运用定量PCR技术定量研究大气环境中耐药基因的含量特征，对深入研究大气环境中耐药基因对人类公共健康的环境风险具有重要理论意义。

发明内容

本发明目的是解决大气环境中对不可培养微生物的耐药基因无法进行检测的问题，提供了一种检测大气环境中磺胺类耐药基因sulI的方法，能对大气环境中磺胺类耐药基因sulI进行快速精确定量。

本发明的技术方案

一种检测大气环境中磺胺类耐药基因sulI的引物序列，包括正向引物和反向引物，其碱基序列为：

正向引物：CACCGGAAACATCGCTGCA；

反向引物：AAGTTCCGCCGCAAGGCT。

通过以上设计的已知引物序列检测大气环境中磺胺类耐药基因sulI的方法，具体包括：

(1)提取目标大气环境样品中的DNA，以此提取的DNA为模板，利用以上设计的正向引物和反向引物对此DNA进行定量PCR扩增，并记录达到荧光阈值时的循环数；

(2)运用步骤(1)中得到的循环数，根据定量PCR测定目的基因sulI质粒标准品的标准曲线，得到目标大气环境样品中磺胺类耐药基因sulI的含量。

所述定量PCR的反应体系为25μL：12.5μL浓度为1×的Green qPCR SuperMix溶液，0.5μL浓度为1×的Passive Reference Dye溶液，0.5μL 0.2μM的正向引物，0.5μL 0.2μM的反向引物，10μL ddH₂0，1.0μL Template DNA。

所述DNA的提取方法为：用MP FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒提取。采用该方法提取DNA能够确保在大气环境中微生物样品量较少的情况下获取需要的DNA量，保障后续DNA定量检测和高通量检测的可能；同时该方法提取DNA所需的时间相比较传统的提取DNA的方式较短，大大降低了DNA受污染或降解的可能性。

步骤(2)中所述的标准曲线的标准品的制备方法：通过设计的正向引物和反向引物，PCR扩增获得目的基因PCR产物，然后利用胶回收试剂盒回收获得纯的目的DNA片段。将纯化后的DNA运用载体连接后转化进E.coli DH5α感受态细胞，将培养好的感受态细胞涂抹在含IPTG、X-gal和青霉素的LB固体培养平板上。通过蓝白斑筛选法挑取白色重组菌斑上的阳性克隆子，用含青霉素的LB培养液扩大培养。用质粒提取试剂盒提取菌液中的质粒，切胶后送样测序检测插入基因片断序列。符合要求的质粒作为标准品，运用10倍梯度稀释法作出目的基因的标准曲线。

在相同体系下，对未知DNA样品进行荧光定量PCR检测，获得未知样品的循环数(Ct值)值，代入上述标准曲线中计算得到待测样品目的基因DNA的初始浓度。确保R²>0.99，扩增效率在90％-110％之间时为有效曲线。

本发明的有益效果：

(1)本发明利用MP FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒，能够确保在大气环境中微生物样品量较少的情况下获取需要的DNA量，保障后续DNA定量检测和高通量检测的可能。

(2)本发明提取的DNA样品相对于传统的微生物法培养，提取效率高，并且能检测不可培养的微生物所携带的耐药基因。通过对大气环境样品中微生物细胞破裂，使得DNA充分释放暴露出来。实用性较强、可靠性高。

(3)通过普通PCR反应，可以确定大气环境中磺胺类耐药基因sulI的存在与否；通过实时荧光定量PCR反应，可以确定大气环境中磺胺类耐药基因sulI含量，为大气环境中目标DNA的研究提供技术指导；

(4)该方法提取DNA所需的时间相比较传统的提取DNA的方式较短，大大降低了DNA受污染或降解的可能性，有利于DNA样品长久保存。

附图说明

图1是提取大气环境样品中DNA的电泳图谱；

第1泳道：医院大气环境样品中微生物DNA，

第2泳道：养殖区大气环境品中微生物DNA，

第3泳道：居民区大气环境品中微生物DNA，

第4泳道：教学区区大气环境品中微生物DNA，

空白泳道：阴性对照。

图2是提取大气环境样品中DNA扩增目标基因sulI电泳图谱；

第1泳道：医院大气环境样品中的目标基因sulI，

第2泳道：养殖区大气环境样品中的目标基因sulI，

第3泳道：居民区大气环境样品中的目标基因sulI，

第4泳道：教学区大气环境样品中的目标基因sulI，

空白泳道：阴性对照。

图3是目标基因sulI定量标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图按照具体实施案例，对本发明进行进一步的阐述。

实施例1：大气环境样品中DNA的提取。

利用MP FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒提取大气环境样品中DNA的步骤如下：

(1)取合适大小的采集有大气环境样品的滤膜，用镊子揭下表层部分，放入事先添加有40mL、pH＝2.2的柠檬酸-磷酸氢二钠溶液烧杯中。

(2)震荡溶液5-10min后将样品放入冰水混合物中。

(3)用超声波处理4min后停留3min。

(4)重复(2)、(3)步骤3次。

(5)在处理后的样品中加入25mg纳米四氧化三铁。

(6)超声波处理20秒。

(7)再加入50mL、pH＝2.2的柠檬酸-磷酸氢二钠溶液。

(8)将溶液轻微震荡使溶液混匀后静置3min。

(9)将用石蜡封口膜包裹的磁体放入烧杯中。

(10)将混合物搅拌均匀、使磁体吸附足够多的磁珠。

(11)混合物中加30mL生理盐水，震荡40秒。

(12)室温500×g的离心力下离心12min。

(13)倒掉上清液，收集的溶液即为提取并纯化完成的DNA。

提取的目标DNA进行PCR定性检测电泳图谱见图1，结果显示DNA浓度较高，满足后续实验需要。

实施例2：引物的设计

(1)从http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网址中下载磺胺类耐药基因sulI基因序列(Accession No.AY049746.1，AY152821.1，DQ205474.1，DQ352176.1，DQ881445.1，EU886980.1，EU886977.1，FJ457611.1，HM370392.1，JN003421.1，JN849690.1，JQ937275.1，KF856624.1，KF856624.1，KF906550.1，KM975296.1，KJ801663.1，U13880.2，X58425.1，X68232.1)。将引物序列全部导入MEGA5.0，使用alignment进行序列比对，找到不同来源磺胺类耐药基因sulI保守区。以此作为目标基因sulI的DNA序列。

(2)将获得的保守区序列输入到DNAMAN软件，设计出满足定量PCR要求的引物，定量PCR要求扩增产物片段长度一般在100-200bp范围，经过指标优化选择与验证，确定基因sulI扩增产物片段长度为157bp的引物，退火温度为60℃。正向引物sulI-F：5′-CACCGGAAACATCGCTGCA-3′(SEQ ID NO：1)；反向引物sulI-R：5′-AAGTTCCGCCGCAAGGCT-3′(SEQ ID NO：2)。

实施例3：定性检测

本实验PCR反应体系选择25μL的反应体系，定性PCR反应体系(表1)和定性PCR反应程序(表2)分别为：

表1定性PCR反应体系

表2定性PCR反应程序

(1)运用FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒提取大气环境样品中的DNA，用实施例2中设计的磺胺类耐药基因sulI引物序列，利用表1的定性PCR反应体系和表2反应程序条件下进行定性PCR扩增。取5μL反应后的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。在1×TAE的电泳缓冲液中用1.5％的琼脂糖凝胶，电泳检测PCR扩增结果，电泳条件为90mV，30min。在凝胶成像仪下观察凝胶上条带情况，以已知的标准DNA分子条带大小为基准，检测目的基因sulI的存在，结果见图2。结果显示PCR产物有目的基因sulI存在。

(2)在凝胶成像仪下切割获得含有目的基因sulI片段的凝胶，利用胶回收试剂盒回收凝胶并纯化。回收的DNA需要重新进行凝胶电泳检测，并通过观察目的DNA片段亮度大小把握DNA浓度，才可以进行接下来的PCR克隆。

(3)将PCR产物与pEASY-T1Simple CloningVector连接后，转化进E.coliDH5α感受态细胞中，加入LB液体培养基培养。

(4)将培养好的感受态细胞均匀涂抹在含IPTG、X-gal和青霉素的LB固体培养平板上培养12-20小时。通过蓝白斑筛选法选取同时含有蓝色菌落和白色菌落的合适培养皿，挑取白色重组菌斑上的3个阳性克隆子用含青霉素的LB培养液扩大培养。用质粒提取试剂盒提取菌液中的质粒，切胶后送样测序插入基因片断。测序获得的2个DNA序列片段大小均为157bp(碱基序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)。

(5)将测序序列结果在NCBI网页上进行BLAST序列比对，直接比较核酸序列的同源性，发现同源性达100％，证明本发明设计引物特异性很高。

实施例4：标准曲线的准备

(1)拷贝数计算公式为：拷贝数(copies/mL)＝(质粒浓度/分子量)×10^-9×6.02×10²³。其中：6.02×10²³为阿伏伽德罗常数(即每摩尔的微粒数)。质粒浓度为实验样品测得浓度(ng/μL)。质粒总长度为目的DNA片段与T载体长度之和(本实验为：3829bp)，实验中每个碱基的平均分子量为330，则每对碱基的平均分子量为660。质粒原液为C(ng/μL)，目的基因长度为L(bp)，则目的基因拷贝数公式(copies/mL)＝[C/(3829+L)×660]×10^-9×6.02×10²³，计算目的基因的初始拷贝数。

(2)符合要求的质粒作为标准品，运用10倍梯度稀释法，利用已知浓度模板起始拷贝数标准品做出目的基因的标准曲线。使标准质粒浓度分别为：10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷，10⁸。确保R²>0.99，扩增效率在90％-110％之间时为有效曲线。

(3)标准曲线反应体系为：1.0μL DNA待测样品，12.5μL浓度为1×的Green qPCRSuperMix溶液，0.5μL浓度为1×的Passive Reference Dye溶液，0.5μL 0.2μM的正向引物，0.5μL 0.2μM的反向引物，10μL ddH₂0。

通过实验得到目标基因标准曲线为：Ct＝-3.343lgC+42.006；扩增效率：99.1％；相关系数R²＝0.997，满足要求。

实施例5：定量检测

本实验定量PCR反应体系选择25μL的反应体系，定量PCR反应体系(表3)和定量PCR反应程序(表4)分别为：

表3实时荧光定量PCR反应体系

表4实时荧光定量PCR反应程序

(1)采集教学区大气环境样品，用实施例1中的方法提取DNA，测定浓度为12ng/μL，满足浓度要求，保存待测；

(2)用实施例2中设计的正反引物，根据表3反应体系和表4反应程序运用荧光定量PCR技术检测教学区大气环境样品磺胺类耐药基因sulI的浓度含量。

(3)对待测基因sulI进行荧光定量PCR进行检测。将反应液体系转移至96孔反应板的反应孔中，通过定量PCR系统软件对待测基因sulI进行荧光定量PCR检测，记录每一轮扩增扫描到的信号强弱，获得基因sulI的循环数(Ct)值，代入实施例4的标准曲线中，计算得到实验样品目的基因sulI的初始浓度。

(4)待测样品DNA重复检测三次，将获得的Ct值分别代入标准曲线中计算得到实验样品目的基因sulI的初始浓度分别为8.16×10⁴copies/uL、7.98×10⁴copies/uL、8.19×10⁴copies/uL，说明目标大气环境样品中含有磺胺类耐药基因sulI。由此可见利用实施例2中设计的引物序列，运用定量PCR技术可以快速精准检测目标大气环境样品中的磺胺类耐药基因sulI浓度含量。

Claims

1.一种检测大气环境中磺胺类耐药基因sulI的引物序列，其特征在于，包括正向引物和反向引物，碱基序列为：

正向引物：CACCGGAAACATCGCTGCA；

反向引物：AAGTTCCGCCGCAAGGCT。

2.一种利用权利要求1所述的目的基因引物序列检测大气环境中磺胺类耐药基因sulI的方法，其特征在于，包括：

(1)提取目标大气环境样品中的DNA，以此提取的DNA为模板，运用权利要求1中的正向引物和反向引物进行PCR定量扩增，并记录得到PCR产物的循环数；

(2)将步骤(1)中PCR定量扩增获得的循环数，根据定量PCR测定目的基因sulI质粒标准品的标准曲线，计算得到目标大气环境样品中磺胺类耐药基因sulI的含量。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述定量PCR的反应体系为25μL：12.5μL浓度为1×的Green qPCR SuperMix溶液，0.5μL浓度为1×的Passive Reference Dye溶液，0.5μL 0.2μM的正向引物，0.5μL 0.2μM的反向引物，10μL ddH₂0，1.0μL Template DNA。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述目的基因sulI质粒标准品的标准曲线的绘制方法如下：

a)目的基因sulI质粒标准品的制备：通过权利要求1设计的正向引物和反向引物，PCR扩增获得目的基因PCR产物，然后利用胶回收试剂盒回收获得纯的目的DNA片段；将纯化后的DNA运用载体连接后转化进E.coli DH5α感受态细胞，将培养好的感受态细胞涂抹在含IPTG、X-gal和青霉素的LB固体培养平板上；通过蓝白斑筛选法挑取白色重组菌斑上的阳性克隆子，用含青霉素的LB培养液扩大培养；用质粒提取试剂盒提取菌液中的质粒，切胶后送样测序检测插入基因片断序列；符合要求的质粒作为标准品；

b)运用10倍梯度稀释法作出所述标准品的目的基因的标准曲线。