CN109593868A - 一种用于检测假单胞菌属细菌的特征性核苷酸序列及其特异性引物、试剂盒和检测方法 - Google Patents

一种用于检测假单胞菌属细菌的特征性核苷酸序列及其特异性引物、试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测假单胞菌属细菌的特征性核苷酸序列及其特异性引物、试剂盒和检测方法。本发明从NCBI数据库中下载假单胞菌(61株)和非假单胞菌(38株)的全基因组序列，通过比较基因组的方法寻找假单胞菌属特异性基因，通过DNAMAN 8软件对特异性基因进行序列比对，寻找假单胞菌属特异性基因的保守片段，利用Oligo7软件设计仅能扩增假单胞菌属特异性基因的引物。本发明的特异性引物特异性强，灵敏度高，检测结果准确。本发明的检测方法稳定性好，可用于生鲜肉中假单胞菌属细菌的定量检测。

Description

一种用于检测假单胞菌属细菌的特征性核苷酸序列及其特异 性引物、试剂盒和检测方法
技术领域：
本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及用于检测假单胞菌属细菌的特征性核苷酸序列及其特异性引物、试剂盒和检测方法。
背景技术：
假单胞菌是一种革兰氏阴性、专性需氧、无芽孢、非发酵杆菌。目前，假单胞菌属共有上百个种，包括铜绿假单胞菌群(铜绿假单胞菌、产碱假单胞菌、假产碱假单胞菌等)、绿针假单胞菌群(绿针假单胞菌、草莓假单胞菌等)、荧光假单胞菌群(荧光假单胞菌、类黄假单胞菌等)、穿孔假单胞菌群(脱氮假单胞菌和穿孔假单胞菌)、恶臭假单胞菌群(恶臭假单胞菌、香鱼假单胞菌等)、施氏假单胞菌群(浅黄假单胞菌、施氏假单胞菌等)、丁香假单胞菌群(褐鞘假单胞菌、绿黄假单胞菌等)等，其中铜绿假单胞菌为代表菌种。
食品腐败主要是由食品本身存在的酶以及微生物产生的各种酶引发的。据报道，生鲜产品的腐败率超过35％，其中肉类和水产品占据了10％-15％，为我国的食品行业带来很大的经济损失(王永锋2012)。生鲜产品的腐败变质主要是由于微生物的代谢活动引起的(Kodogiannis,Pachidis et al.2014,Gopal,Hill et al.2015)，当微生物的数量达到一定值时则会引起食品的腐败(Jones 2004)，如感官颜色的变化、腐臭味、粘液等，研究表明假单胞菌属是新鲜肉类产品中主要的腐败菌，如荧光假单胞菌、草莓假单胞菌、恶臭假单胞菌等(Andreani and Fasolato 2017)。对肉类产品中的假单胞菌属进行快速检测，能够在合理的时间内采取措施以提高货架期，最大限度的减少生鲜肉的损失。
目前，对生鲜肉中腐败微生物的检测方法主要包括传统的培养方法、16S rDNA一代基因测序、高通量测序、荧光定量PCR等方法(Olsson,Ahrne et al.2003,Handelsman2004,Russo,Ercolini et al.2006,Broekaert,Heyndrickx et al.2011,Noseda,Islamet al.2012)。传统的培养方法可准确的鉴定并计数微生物的菌落数，但该方法只能鉴定可培养的微生物，后期需进行各种生化反应，耗时耗力。16S rDNA一代基因测序可鉴定出腐败微生物的种类，但是无法对微生物进行准确的定量。高通量测序技术可用于分析样本中微生物的多样性以及动态变化，通过该方法可确定样本中的优势微生物，但是仍无法对微生物进行计数。荧光定量PCR检测法既可以对微生物的种类进行定性检测，也可对微生物的数量进行定量检测。但是，目前对微生物的荧光定量PCR检测方法局限于种水平上的微生物，缺乏对属水平上的微生物的检测。造成食品腐败的微生物并非单一微生物作用的结果，而是多种微生物共同作用的结果，因此，对微生物进行属水平上的检测具有重要意义。
发明内容：
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种用于检测假单胞菌属细菌的特征性核苷酸序列及其特异性引物、试剂盒和检测方法。
本发明从NCBI数据库中下载假单胞菌(61株)和非假单胞菌(38株)的全基因组序列，通过比较基因组的方法使用Perl编程语言寻找假单胞菌属特异性基因，对特异性基因于NCBI数据库中进行比对验证基因的特异性，然后通过DNAMAN 8软件对假单胞菌属特异性基因进行序列比对，寻找假单胞菌属特异性基因的保守片段，利用Oligo7软件设计仅能扩增假单胞菌属特异性基因的引物，建立一种假单胞菌属细菌荧光定量PCR检测方法，能够鉴定假单胞菌属细菌。
因此，本发明的第一个目的是提供一种用于检测假单胞菌属细菌的特征性核苷酸序列，所述的特征性核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的第二个目的是提供一种用于检测假单胞菌属细菌的特异性引物，所述的特异性引物如下所示：
上游引物sucD F：5’-CGTCCTGATCAATAAAGACACC-3’(如SEQ ID NO.1所示)；
下游引物sucD R：5’-GATGCAGACGATCAGCTTG-3’(如SEQ ID NO.2所示)。
本发明的第三个目的是提供一种假单胞菌属细菌的荧光定量PCR检测试剂盒，包括所述的特异性引物。
所述的荧光定量PCR检测试剂盒，还包括2×TB GreenTM Premix和无核酸酶纯水。
本发明的第四个目的是提供一种非疾病的诊断和治疗目的的假单胞菌属细菌的检测方法，包括以下步骤：提取待测样品的基因组DNA作为模板，利用所述的特异性引物sucD F和sucD R进行PCR扩增，扩增产物进行电泳检测，若扩增出条带，则待测样品中含有假单胞菌属细菌，若没有扩增出条带，则待测样品中不含有假单胞菌属细菌。
所述的PCR扩增的反应体系优选为20μL：包括2×Taq Master Mix 10μL、模板DNA2μL、10μM上游引物sucD F 0.6μL、10μM下游引物sucD R 0.6μL和无核酸酶纯水6.8μL。
所述的PCR扩增的反应条件优选为：94℃预变性3min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。
本发明的第五个目的是提供一种假单胞菌属细菌荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：
(1)将铜绿假单胞菌ATCC27853的纯培养物进行梯度稀释，提取不同浓度铜绿假单胞菌ATCC27853的纯培养物的基因组DNA作为模板，采用权利要求2所述的特异性引物sucDF和sucD R进行荧光定量PCR扩增反应；
(2)以模板对应的铜绿假单胞菌ATCC27853的纯培养物浓度的对数为横坐标，以相应的阈值循环数为纵坐标，建立假单胞菌属的标准曲线；
(3)提取待测样品的基因组DNA作为模板，采用所述的特异性引物sucD F和sucD R进行荧光定量PCR扩增反应，反应后得到阈值循环数，将其代入假单胞菌属的标准曲线，计算得到待测样品中假单胞菌属细菌的含量。
所述的荧光定量PCR扩增反应的反应体系优选为20μL：包括2×TB GreenTM Premix10μL、模板DNA 2μL、10μM上游引物sucD F 0.6μL、10μM下游引物sucD R 0.6μL和无核酸酶纯水6.8μL。
所述的荧光定量PCR扩增反应的反应条件优选为：95℃预变性30s；95℃变性5s、60℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)快速、简便、费用低：相比传统培养方法以及16S rDNA一代基因测序，假单胞菌属细菌荧光定量PCR检测方法更加快速，这个鉴定过程不超过3.5h。采用传统的培养方法和生化鉴定，需耗时3-4天，操作繁琐，购买培养基与试剂的成本昂贵。16S rDNA一代基因测序，需要专业公司进行测序、专业人员进行结果分析，期间耗时2-3天，而且无法对假单胞菌属细菌进行定量。
(2)灵敏度高：将假单胞菌的纯培养物，使用去离子水按照10倍梯度稀释，得浓度为101，102，103，104，105，106，107，108CFU/mL的菌株纯培养物。然后，对上述各稀释度的假单胞菌纯培养物提取DNA模板，分别取一定量作为荧光定量PCR反应的模板，检测最低检测下限，做标准曲线。通过实验，结果表明假单胞菌属细菌DNA模板最低检测限为102CFU/mL，标准曲线为y＝-3.2034x+40.364，R2＝0.9956。
(3)特异性强：利用建立的假单胞菌属细菌荧光定量PCR检测方法，如图1所示，对12株假单胞菌进行PCR扩增，全部检测为阳性，空白对照无扩增条带；对22株非假单胞菌进行检测，均无扩增条带。研究结果表明，建立的假单胞菌属细菌荧光定量PCR检测方法特异性强，仅能扩增出假单胞菌属细菌，无法扩增出其它细菌。
附图说明：
图1为本发明的假单胞菌属荧光定量PCR检测方法的特异性检测结果；其中A为假单胞菌荧光定量PCR检测方法的特异性检测结果，1-12分别对应表1对应序号的假单胞菌，B为非假单胞菌荧光定量PCR检测方法的特异性检测结果，13-34分别对应表1对应序号的非假单胞菌；Mark为DL2000DNA marker，CK为空白对照。
图2为假单胞菌纯培养物标准品荧光信号值。
图3为假单胞菌属细菌纯培养物标准品菌株纯培养物浓度的对数值-Ct对应标准曲线。
具体实施方式：
以下结合实施例对本发明的具体实施方案作进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于此。
实施例1：
1、特异性基因的挖掘
本发明从NCBI数据库中下载假单胞菌(61株)和非假单胞菌(38株)的全基因组序列，通过比较基因组的方法使用Perl编程语言寻找假单胞菌属特异性基因，对特异性基因于NCBI数据库中进行Blast比对验证基因的特异性，选取假单胞菌属的特异性基因sucD。
2、引物设计及特异性验证
将步骤1中选取的假单胞菌属特异性基因sucD，通过DNAMAN 8软件对假单胞菌属特异性基因sucD进行序列比对，寻找假单胞菌属特异性基因sucD的保守片段，利用Oligo7软件设计仅能扩增假单胞菌属特异性基因sucD的引物，具体如下：
上游引物sucD F：5’-CGTCCTGATCAATAAAGACACC-3’(如SEQ ID NO.1所示)；
下游引物sucD R：5’-GATGCAGACGATCAGCTTG-3’(如SEQ ID NO.2所示)。
该引物的扩增产物长283bp，扩增产物的全部核苷酸序列如下：CGTCCTGATCAATAAAGACACCAAAGTCATCTGCCAGGGCTTCACCGGCTCGCAAGGTACTTTCCACTCCGAACAGGCCATCGCCTACGGCACCAAGATGGTCGGCGGCGTAACCCCAGGCAAGGGTGGCACCACCCACCTGGGCCTGCCGGTGTTCAACACCGTCAAGGAAGCCGTGGAAGCTACCGGCGCTGACGCTTCGGTCATCTACGTACCGGCTCCGTTCTGCAAAGACTCGATCCTGGAAGCTGCCTTCGGCGGCATCAAGCTGATCGTCTGCATC(如SEQ ID NO.3所示)。
表1实验菌株
采用细菌DNA提取试剂盒提取假单胞菌和非假单胞菌基因组DNA作为模板，利用上述引物sucD F/sucD R进行普通PCR扩增，扩增产物进行电泳检测。PCR反应体系为：包括2×Taq Master Mix 10μL，模板DNA 2μL，上游引物sucD F(初始浓度10μM)0.6μL，下游引物sucD R(初始浓度10μM)0.6μL，无核酸酶纯水6.8μL。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。检测结果如图1所示。只有假单胞菌属菌株扩增出条带，表明该引物sucD F/sucD R特异性强。
3、DNA模板提取
本发明模板DNA的提取采用试剂盒提取。具体步骤，按照Magen公司细菌DNA提取试剂盒步骤进行模板DNA的提取。
4、荧光定量PCR扩增
荧光定量PCR扩增反应体系以20μL计为：2×TB GreenTM Premix 10μL，模板DNA 2μL，上游引物sucD F(初始浓度10μM)0.6μL，下游引物sucD R(初始浓度10μM)0.6μL，无核酸酶纯水6.8μL。
荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；溶解曲线分析：95℃0秒20℃/秒，65℃15秒20℃/秒，95℃0秒0.1℃/秒。通过阈值循环数(Ct值)可对待测样品进行定性检测，Ct≤35，而且出现明显的扩增曲线则为阳性结果；无Ct值且无扩增曲线，则为阴性结果。
5、标准曲线制备与样品检测
将培养至浓度为108CFU/mL的铜绿假单胞菌ATCC27853菌株，使用去离子水按照10倍梯度稀释，得浓度为101，102，103，104，105，106，107，108CFU/mL的菌株纯培养物，按照步骤3进行DNA模板的提取，即为假单胞菌属荧光定量PCR的标准品，按照步骤4进行荧光定量PCR反应，每个模板分别进行三组实验。
绘制标准曲线：以标准品的菌株纯培养物浓度的对数为横坐标，以相应的荧光定量PCR的实时Ct值为纵坐标，拟合所得曲线即为假单胞菌属的标准曲线。
标准曲线如图2和图3所示。检测下限为102CFU/mL，检测上限为107CFU/mL。假单胞菌属的拟合标准曲线为y＝-3.2034x+40.364，R2＝0.9956。扩增效率105％。
6、人工污染生鲜肉中假单胞菌属细菌的检测
用0.85％的生理盐水将生鲜肉(打碎成肉泥)10倍稀释，并进行人工污染12株假单胞菌(如表1所示的12株假单胞菌)的混合物，按照步骤3进行DNA模板的提取，按照步骤4进行荧光定量PCR检测，通过检测得Ct值为22.34，根据上述标准曲线进行计算，样品中含有假单胞菌为5.2×104CFU/mL，即样品中含有5.2×105CFU/g。平板计数为4.9×105CFU/g。荧光定量PCR检测结果与平板计数所得结果相符。
序列表
<110> 广东省微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)
<120> 一种用于检测假单胞菌属细菌的特征性核苷酸序列及其特异性引物、试剂盒和检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
cgtcctgatc aataaagaca cc 22
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
gatgcagacg atcagcttg 19
<210> 3
<211> 283
<212> DNA
<213> 假单胞菌属(pseudomonas)
<400> 3
cgtcctgatc aataaagaca ccaaagtcat ctgccagggc ttcaccggct cgcaaggtac 60
tttccactcc gaacaggcca tcgcctacgg caccaagatg gtcggcggcg taaccccagg 120
caagggtggc accacccacc tgggcctgcc ggtgttcaac accgtcaagg aagccgtgga 180
agctaccggc gctgacgctt cggtcatcta cgtaccggct ccgttctgca aagactcgat 240
cctggaagct gccttcggcg gcatcaagct gatcgtctgc atc 283

Claims (10)

1.一种用于检测假单胞菌属细菌的特征性核苷酸序列，其特征在于，所述的特征性核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一种用于检测假单胞菌属细菌的特异性引物，其特征在于，所述的特异性引物如下所示：
上游引物sucD F：5’-CGTCCTGATCAATAAAGACACC-3’；
下游引物sucD R：5’-GATGCAGACGATCAGCTTG-3’。
3.一种假单胞菌属细菌的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的特异性引物。
4.根据权利要求3所述的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括2×TB GreenTMPremix和无核酸酶纯水。
5.一种非疾病的诊断和治疗目的的假单胞菌属细菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测样品的基因组DNA作为模板，利用权利要求2所述的特异性引物sucD F和sucD R进行PCR扩增，扩增产物进行电泳检测，若扩增出条带，则待测样品中含有假单胞菌属细菌，若没有扩增出条带，则待测样品中不含有假单胞菌属细菌。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述的PCR扩增的反应体系为20μL：包括2×Taq Master Mix 10μL、模板DNA 2μL、10μM上游引物sucD F 0.6μL、10μM下游引物sucD R 0.6μL和无核酸酶纯水6.8μL。
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述的PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。
8.一种假单胞菌属细菌荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将铜绿假单胞菌ATCC27853的纯培养物进行梯度稀释，提取不同浓度铜绿假单胞菌ATCC27853的纯培养物的基因组DNA作为模板，采用权利要求2所述的特异性引物sucD F和sucD R进行荧光定量PCR扩增反应；
(2)以模板对应的铜绿假单胞菌ATCC27853的纯培养物浓度的对数为横坐标，以相应的阈值循环数为纵坐标，建立假单胞菌属的标准曲线；
(3)提取待测样品的基因组DNA作为模板，采用权利要求2所述的特异性引物sucD F和sucD R进行荧光定量PCR扩增反应，反应后得到阈值循环数，将其代入假单胞菌属的标准曲线，计算得到待测样品中假单胞菌属细菌的含量。
9.根据权利要求8所述的假单胞菌属细菌荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述的荧光定量PCR扩增反应的反应体系为20μL：包括2×TB GreenTM Premix 10μL、模板DNA 2μL、10μM上游引物sucD F 0.6μL、10μM下游引物sucD R 0.6μL和无核酸酶纯水6.8μL。
10.根据权利要求8所述的假单胞菌属细菌荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述的荧光定量PCR扩增反应的反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s、60℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环。
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