CN109554441A - 一种通过扩增16S rDNA保守区序列检测细菌的方法 - Google Patents

一种通过扩增16S rDNA保守区序列检测细菌的方法 Download PDF

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Abstract

一种通过扩增16S rDNA保守区序列检测细菌的方法，利用RT‑PCR方法扩增细菌16S rDNA的保守区序列，标准品为含有16S rDNA部分保守区序列的pUC57质粒，在PCR反应体系中含有200nM正向引物，200nM反向引物，再加入适量模板，通过含有16S rDNA部分保守区序列的pUC57质粒建立标准曲线，再根据待检测样本的CT值来计算细菌的浓度。本发明方法在阈值设定在10000时，待检测样本CT值<35，且Tm在83.6℃‑85℃之间为细菌污染，能检测的大肠杆菌浓度极限在3‑33cfu/μl之间，能检测的DNA拷贝数极限在1.6×102copies左右，2h即可得出结果。

Description

一种通过扩增16S rDNA保守区序列检测细菌的方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种检测方法，具体来说是一种通过扩增16SrDNA保守区序列检测细菌的方法。
背景技术
细菌体积小、形状多样、种类繁多、繁殖快、生命力顽强，在基础研究和临床试验中危害极大。细菌污染是细胞培养中常见的污染问题。细菌增殖会消耗营养液，同时产生的毒素会导致细胞表面粗糙，抑制细胞生长，严重时使细胞停止生长，最终导致细胞破裂死亡。此外，致病菌一旦进入人体，会引起多种感染和传染疾病，例如破伤风、伤寒、肺结核等。抗生素能够预防细菌污染及感染，但并不能完全抑制细菌生长，因此对细菌进行实时检测在基础研究和临床试验中尤为重要。
根据卫生部制定的一系列标准，几乎所有的细菌检测标准均以传统的细菌培养方法为基础，包括涂片法、分离培养法、生化试验，血清学试验等。传统检测细菌的方法步骤繁琐，工作量大，耗时长，报告结果通常需要5-7d，甚至几周，大大的延缓了细胞上临床的时间。目前有用全自动微生物生化鉴定系统例如梅里埃等检测细菌，是根据生物孔中的生长变化和呈色反应得到结果，该方法操作简单，但仪器成本高，报告结果通常也需要5d。目前还有商业化的快速检测试纸片法，只需培养24h，但该方法易出现假阴性的结果。特异酶的使用、质谱技术、免疫传感器和免疫磁性分离技术特异性高，针对特定的细菌灵敏度高，但广泛性差，对于未知的细菌检测不适用。
随着PCR、基因测序等技术的不断进步，细菌检测由最初的表型和化学鉴定演变成分子水平的研究。荧光定量PCR方法因其特异性好、速度快、灵敏度高、重复性好、定量准确等优点成为分子生物学研究中的重要工具。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种通过扩增16S rDNA保守区序列检测细菌的方法，所述的这种通过扩增16S rDNA保守区序列检测细菌的方法要解决现有技术中检测细菌的方法步骤繁琐、工作量大、耗时长、易出现假阴性的技术问题。
本发明提供了一种通过扩增16S rDNA保守区序列检测细菌的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)利用RT-PCR方法扩增标准品的16S rDNA部分保守区序列，所述的标准品为含有16S rDNA部分保守区序列的pUC57质粒，所述的16S rDNA部分保守区序列如SEQ ID NO.6所示，采用的正向引物如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或者SEQ ID NO.4所示；反向引物如SEQ ID NO.5所示；
2)在定量PCR反应体系中加入200nM的正向引物，200nM的反向引物，再加入模板；通过测量不同拷贝数的CT值结果，建立拷贝数/μl与CT值的标准曲线；反应条件分为三个阶段，第一阶段为预变性阶段，95℃10min；第二阶段为PCR反应阶段，95℃20s，58℃30s，72℃30s；第三阶段扩增产物熔解阶段，95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s；
3)利用RT-PCR方法，采用上述的方法扩增待检测样本，根据待检测样本的CT值来计算细菌的浓度。
具体的，在检测的过程中，待检测样本需要用100℃预处理10min。
16S rDNA是原核生物16S rRNA的DNA序列，其序列具有高度的保守性，较强的普遍性。16S rDNA的特点：1、多拷贝，检测敏感性高；2、多信息，由可变区和保守区组成，保守区为大部分细菌所有，可根据保守区设计通用引物，利用可变区设计出细菌特异引物，作为细菌检测最理想的序列。
本发明采用的标准品为含有16S rDNA部分保守区序列的pUC57质粒，通过含有16SrDNA部分保守区序列的pUC57质粒建立标准曲线，通过扩增细菌16S rDNA保守区序列检测样本是否含有细菌，再根据待检测样本的CT值来计算细菌的浓度。本发明的方法在阈值设定在10000时，如果待检测样本的CT值<35，且Tm在83.6℃-85℃之间为细菌污染，能检测的大肠杆菌浓度极限在3-33cfu/μl之间，能检测的DNA拷贝数极限在1.6×102copies左右，2h即可得出结果。
在本发明的检测方法中，16S rDNA部分保守区序列具有高度保守性，通过16SrDNA部分保守区序列在NCBI能查出多种菌种，主要包括大肠埃希杆菌、费格森埃希菌、弗氏志贺菌、痢疾志贺菌、弗氏柠檬酸杆菌等，并能检测出多种细菌，如常见细菌枯草芽孢杆菌(G+)、大肠埃希杆菌(G-)，院感中常见的致病菌金黄色葡萄球菌(G+)、铜绿假单胞菌(G-)。在本发明的检测方法中，16S rDNA部分保守区序列具有特异性，不适用于检测非细菌种属的细胞DNA，如人源细胞、大鼠细胞。
本发明是利用荧光定量PCR技术，通过扩增细菌16S rDNA保守区序列检测细菌的方法。用常见细菌大肠杆菌为例梯度稀释后用涂板、梅里埃检测、荧光定量PCR法检测，将细菌浓度和CT值相关联。本发明方法能检测的大肠杆菌浓度极限在3-33cfu/μl之间，检测时间与涂板法相比缩短了15h，与梅里埃检测相比缩短12h。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明建立了一种快速、高效、广泛、高灵敏度、可定量的细菌检测和细菌定量的方法，利用荧光定量PCR技术检测扩增细菌16S rDNA片段，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程的方法。不仅可以通过标准曲线对未知模板进行定量分析，还可通过CT值预测细菌数。本发明的方法不需抽提RNA，操作方便，2h即可得出结果。
附图说明
图1显示了细菌采用荧光定量PCR检测过程中，拷贝数和CT值的标准曲线。
图2显示了细菌采用荧光定量PCR检测过程中，稀释倍数和CT值的标准曲线。
图3显示了采用菌液涂板检测的方法，检测大肠杆菌的最低浓度。
具体实施方式
实施例1
一、引物和标准品的制备
1、本发明正向引物：5'-cagcagccgcggtaatac-3'(SEQ ID NO.1所示)；或者
5'-cagcagccgcggtaattc-3'(SEQ ID NO.2所示)；或者
5'-cagccgccgcggtaatac-3'(SEQ ID NO.3所示)；或者
5'-cagccgccgcggtaattc-3'(SEQ ID NO.4所示)；或者
2、反向引物：5'-ggactaccagggtatctaat-3'。由桑尼公司合成。引物加水溶解至浓度为10μM。
3、本发明的标准品是含有16S rDNA部分保守区序列的pUC57质粒，由桑尼公司合成。pUC57碱基数为2710bp。16S rDNA部分保守区序列为ccgtgc cagcagccgc ggtaatacggagggtgcaag cgttaatcgg aattactggg cgtaaagcgc acgcaggcgg tttgttaagt cagatgtgaaatccccgggc tcaacctggg aactgcatct gatactggca agcttgagtc tcgtagaggg gggtagaattccaggtgtag cggtgaaatg cgtagagatc tggaggaata ccggtggcga aggcggcccc ctggacgaagactgacgctc aggtgcgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccg(SEQ IDNO.5所示)，碱基数为300bp。标准品用TE buffer溶解，得到浓度为160ng/μl，计算出拷贝数为4.8×1010copies/μl。
二、标准曲线制备及灵敏限度检测
1、标准品稀释：取200μl PCR小管，其中加入TE buffer稀释标准品。标准品稀释3×103倍后再10倍梯度稀释6个浓度。
2、在定量PCR反应体系中含有200nM正向引物，200nM反向引物，再加入适量模板或待检测样本；
3、PCR反应：设置反应条件，第一阶段为预变性阶段，95℃10min；第二阶段为PCR反应阶段，95℃20s，58℃30s，72℃30s；第三阶段扩增产物熔解阶段，95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。
4、根据表格中质粒不同拷贝数的CT值结果，得出标准曲线，如图1所示，y＝-1.66ln(x)+43.351，R2＝0.9918，根据CT值在15-35范围内有参考意义，本发明能检测的DNA拷贝数检测下限在1.6×102copies左右。
拷贝数 16 160 1600 16000 160000 1600000 16000000
副孔1 37.5360 34.8388 32.1043 27.6731 23.1224 18.8201 15.9540
副孔2 37.7684 35.8375 32.1812 28.0025 23.2071 19.3019 15.6259
副孔3 37.3679 35.5709 32.1016 27.8362 23.2319 19.1993 15.6205
三、常见污染和致病菌的检测
1、取冻存的枯草芽孢杆菌(G+)、金黄色葡萄球菌(G+)、铜绿假单胞菌(G-)、大肠埃希杆菌(G-)，先用100℃预处理10min，细菌悬液稀释10倍后取1μl检测，检测方法同二中2、3步骤。检测结果均为阳性。且Tm值差距不超过2℃。
菌种 CT值 Tm值
枯草芽孢杆菌 20.3465 83.9℃
金黄色葡萄球菌 18.8651 83.6℃
铜绿假单胞菌 16.7008 84.0℃
大肠埃希杆菌 19.5949 85.0℃
四、人源和鼠源细胞的检测
1、取冻存的人免疫细胞、大鼠干细胞，用PBS清洗3遍后，用DNA抽提试剂盒抽提DNA，再取DNA悬液1μl用本发明检测，检测方法同二中2、3步骤。检测结果均为阴性。
种属 CT值
人源 39.3504
鼠源 Undet
五、通过涂板法和荧光定量PCR法，将细菌浓度和CT值相关联。
1、大肠杆菌复苏：用移液枪吸取40μl大肠杆菌冻存菌融于2ml LB液体培养基中，37℃，250rpm，过夜培养16h。
2、大肠杆菌活化：取复苏后的菌液至3ml LB液体培养基中37℃，250rpm，过夜培养15h。
3、不同菌浓度做PCR检测：取OD值约为0.4-0.5的大肠杆菌菌液，用生理盐水10倍梯度稀释至107倍，100℃裂解10min，10000g离心5min后取1μl做检测。检测方法同二中2、3步骤。根据表格中菌液稀释不同倍数的CT值结果，得出曲线，检测结果如图2所示，y＝1.677ln(x)+13.191，R2＝0.9916，本发明能检测的OD值约为0.4-0.5大肠杆菌稀释倍数极限在105-106倍。
4、菌液涂板：荧光定量PCR结果出来后，取稀释104，105，106，107倍的菌液涂板，每个大肠杆菌浓度取1μl+99μl生理盐水涂于固体培养基中，37℃倒置过夜培养。阴性对照为生理盐水。检测结果如图3所示，本发明菌浓度约450cfu/μl其CT值为28.9，33cfu/μl其CT值为33.1，3cfu/μl其CT值为36.0。本发明能检测的大肠杆菌浓度极限在3-33cfu/μl之间。
5、梅里埃检测：取稀释105，106，107倍的菌液做梅里埃，每组取1μl+2999μl生理盐水，注入需氧培养瓶中，梅里埃检测记录天数。阴性对照为生理盐水，阳性对照为稀释10倍的菌液。稀释105倍大肠杆菌检测出时间为12h，稀释106倍大肠杆菌检测出时间为14h，稀释107倍大肠杆菌未检测出阳性。
序列表
<110> 同济大学
上海思济细胞技术中心（有限合伙）
<120> 一种通过扩增16S rDNA保守区序列检测细菌的方法
<141> 2018-12-29
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagcagccgc ggtaatac 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagcagccgc ggtaattc 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagccgccgc ggtaatac 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagccgccgc ggtaattc 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggactaccag ggtatctaat 20
<210> 6
<211> 300
<212> DNA
<213> 支原体(Mycoplasma)
<400> 6
ccgtgccagc agccgcggta atacggaggg tgcaagcgtt aatcggaatt actgggcgta 60
aagcgcacgc aggcggtttg ttaagtcaga tgtgaaatcc ccgggctcaa cctgggaact 120
gcatctgata ctggcaagct tgagtctcgt agaggggggt agaattccag gtgtagcggt 180
gaaatgcgta gagatctgga ggaataccgg tggcgaaggc ggccccctgg acgaagactg 240
acgctcaggt gcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg 300

Claims (2)

1.一种通过扩增16S rDNA保守区序列检测细菌的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)利用RT-PCR方法扩增标准品的16S rDNA部分保守区序列，所述的标准品为含有16SrDNA部分保守区序列的pUC57质粒，所述的16S rDNA部分保守区序列如SEQ ID NO.6所示，采用的正向引物如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或者SEQ ID NO.4所示；反向引物如SEQ ID NO.5所示；
2)在定量PCR反应体系中加入200nM的正向引物，200nM的反向引物，再加入模板；通过测量不同拷贝数的CT值结果，建立拷贝数/μl与CT值的标准曲线；反应条件分为三个阶段，第一阶段为预变性阶段，95℃10min；第二阶段为PCR反应阶段，95℃20s，58℃30s，72℃30s；第三阶段扩增产物熔解阶段，95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s；
3)利用RT-PCR方法，采用上述的方法扩增待检测样本，根据待检测样本的CT值来计算细菌的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种通过扩增16S rDNA保守区序列检测细菌的方法，其特征在于：在检测的过程中，待检测样本采用100℃预处理10min。
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