CN104017889B - 一种快速检测结核分枝杆菌的分子信标探针及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测结核分枝杆菌的分子信标探针，其特征在于，所述分子信标探针的碱基序列为：Beacon？TB：5’-FAM-<b>CACCT</b>ATCCGAGAGAACCCGGACCT<b>AGGTG</b>-DABCAL-3’；所述探针的5’端用FAM标记，3’端用DABCAL标记，荧光基团激发波长495nm，检测波长520nm。本发明的分子信标探针信号强度高，并且特异性高，可以有效、快速地检测结核分枝杆菌。本发明还公开了一种快速检测结核分枝杆菌的试剂盒及检测方法。

Description

一种快速检测结核分枝杆菌的分子信标探针及检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种分子信标探针和试剂盒，通过使用荧光原位杂交的手段，检测样品中少量的结核分枝杆菌。

背景技术

根据中国卫生部组织的第四次全国结核病流行病抽样调查(2000年)得出的结果，我国有4亿人感染过结核菌，现有的传染性结核病人达200万人，结核病的人数位居世界第二，仅次于印度。中国卫生部2006年3月公布的全国传染病疫情报告中指出，肺结核仍然占甲、乙类传染病种中发病数和死亡数的首位。大部分的结核病人或生活在结核病高发地区的居民，都很难得到迅速、准确的诊断。因此，开发相应的快速诊断产品显得尤为重要。

结核病主要是由结核分枝杆菌复合菌群(Mycobacterium tuberculosis Complex，MTC)引起，其中主要包括结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)。据文献显示85％的人体分枝杆菌感染都是由结核分枝杆菌引起的，并且结核分枝杆菌是全球最重要的引发死亡的病原菌。此外，结节病是一种病因未明的全身多脏器和组织内均可发生的肉芽肿性疾病，以肺结节病最为常见，其临床表现与肺结核非常相似，容易混淆误诊，因此，准确及时地检测结核分枝杆菌是否存在，以区分肺结核和肺结节病对于临床也具有重要意义。

目前临床上检测结核分枝杆菌最常用的方法是抗酸染色镜检法，该方法具有简单、快速、成本低的优点，缺点是灵敏度低，痰内或者其它标本内含菌量少时往往不能得出阳性结果，并且不能区分是结核分枝杆菌还是非结核分枝杆菌。分离培养法的结果相对可靠，特异性高，是目前结核病诊断的金标准。但是由于结核分枝杆菌的生长速度缓慢，大约需要4到8周才能得出结果，不利于对患者作出快速诊断和及时治疗。利用PCR方法可在短时间内使特定的核酸序列拷贝数几何级数增加，有很高的灵敏度和特异性，但缺点是假阳性率高，另一方面，患者分泌物中有往往含有抑制PCR反应的成分，这又会导致假阴性的出现，这两方面的缺点限制了PCR检测的临床应用。目前，已有用FISH检测结核分枝杆菌的报道，但均采用的是线形探针，该方法的缺点是，杂交完成后，必须用严格的洗涤条件来除去未杂交的探针，而且经常会因为探针清洗不完全而造成假阳性。由此可见，结核病临床诊断，急需更简洁、灵敏的检测方法。

分子信标探针(Molecular beacon probe)，具有灵敏度高、特异性强、只有和靶序列杂交上了才会发出荧光等优点，被应用于荧光原位杂交。本发明通过对大量结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌菌株的16S rRNA序列进行比对，挑选结核分枝杆菌的特异性序列，设计、合成分子信标探针，建立稳定的分子信标原位杂交反应体系，克服了结核病当前临床检测的诸多问题，为结核病的诊断、预防和控制提供新的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分子信标探针，通过荧光原位杂交的手段，建立一种快速、灵敏、特异性地检测样品中结核分枝杆菌的方法。

一种快速检测结核分枝杆菌的分子信标探针，其特征在于，所述分子信标探针的碱基序列为：

Beacon TB：5’-FAM-CACCTATCCGAGAGAACCCGGACCTAGGTG-DABCAL-3’；

所述探针的5’端用FAM标记，3’端用DABCAL标记，荧光基团激发波长495nm，检测波长520nm。

进一步地，所述分子信标浓度为10ng/μL。

本发明还提供了一种快速检测结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(1)裂解液：4％(w/v)氢氧化钠；

(2)杂交液：10％(w/v)硫酸葡聚糖，10mM NaCl，20％(v/v)甲酰胺，0.1％(w/v)焦磷酸钠，0.2％(w/v)聚乙烯基吡咯烷酮，0.2％(w/v)聚鹿糖，5mM Na2EDTA，0.1％(v/v)TritonX-100，50mM Tris/HCl(pH7.5)，10ng/μL分子信标探针，所述分子信标探针的碱基序列为：

Beacon TB：5’-FAM-CACCTATCCGAGAGAACCCGGACCTAGGTG-DABCAL-3’；

(3)终止液：1％(v/v)稀硫酸；

(4)洗涤液：5mM Tris，15mM NaCl，0.1％(v/v)Triton X-100，pH值为10。

本发明最后提供了一种上述试剂盒快速检测结核分枝杆菌的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)吸取10μL样品滴在载玻片上，自然风干；

(2)在风干的样品上加入10μL裂解液，待其自然风干后，浸入无水乙醇中，浸泡5分钟；

(3)52℃杂交10分钟；

(4)液侵泡1分钟，终止反应；

(5)滴加封片剂后，用荧光显微镜镜检，用20×物镜扫视和计数，用60或100×物镜观察细菌形态。

本发明的技术要点或原理：荧光原位杂交(Flourescence in situ Hybridization，FISH)是一种应用标记有荧光物质的探针，通过杂交的方法来检测细胞或组织内特异性DNA或RNA的方法；分子信标探针是一种具有独特“发夹”空间结构的探针，在未与靶序列结合时，分子信标呈“发夹”结构，有一环序列(loop)和一茎序列(stem)，其中环序列是与靶位点互补的碱基序列，而茎序列是与靶位点无关的互补序列；在探针的两端分别标记有荧光基团和荧光猝灭基团，当探针处于发卡结构时，荧光基团和猝灭基团相邻，产生能量共振转移效应，使得荧光基团被猝灭，不能产生荧光信号，而当探针与靶位点结合时，发夹结构被打开，荧光基团和猝灭基团分开，产生荧光信号，通过荧光显微镜可以检测到该荧光信号。

本发明通过比对多个结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的16S rRNA序列，筛选出1条结核分枝杆菌特有的靶序列。根据该靶序列，人工合成分子信标探针，其碱基组成为：

Beacon TB：5’-FAM-CACCTATCCGAGAGAACCCGGACCTAGGTG-DABCAL-3’

探针的5’端用FAM标记，3’端用DABCAL标记，荧光基团激发波长495nm，检测波长520nm。

本发明通过大量实验，确定荧光原位杂交的最佳温度为52℃，甲酰胺最佳浓度为20％，分子信标最佳浓度为10ng/μL。

本发明分子信标探针5’端的荧光标记，包括但不限于FITC、FAM或Cy3等等，3’端的荧光猝灭标记，包括但不限于DABCYL、BDH或TANRA等，荧光基团或荧光猝灭基团可以根据现有技术进行添加。

本发明的分子信标探针能够用于检测的样本范围广泛，包括但不限于，痰、咽拭子、胃灌洗液、支气管灌洗液、活体组织、吸引物、咳出物、体液(脊髓、胸腹水、心包液等)、血液、脓液、骨髓、尿液、组织切片、食物样本、来自土壤、空气和水的样本，以及它们的培养物。这些样本经相应处理后，原则上是只要保持细胞形态完整并且靶核酸未被破坏，均可使用本发明的分子信标探针检测。这些样本的处理方法是本领域技术人员所掌握的，例如：

痰：痰液涂片法；

脓液：同痰液涂片法；

病灶组织：先用组织研磨器磨碎后再行涂片；

尿液：留全量夜尿，静置4～5h后，弃上清液，取沉淀部分尿液10ml，3000rpm，离心30min，取沉淀物涂片；

胸、腹水标本：参照尿液涂片法；

脑脊液：无菌操作收集脑脊液，放置冰箱或室温24h，待薄膜形成后涂片。也可将脑脊液离心沉淀，3000rpm，离心30min，弃上清液，取沉淀物涂片。

本发明的分子信标探针信号强度高，并且特异性高，可以有效、快速地检测结核分枝杆菌。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：分子信标探针及寡聚核苷酸序列的设计与合成

选择出能特异性地检测结核分枝杆菌的靶序列，在该段靶序列上设计与其完全互补的分子信标探针：

Beacon TB(5’-FAM-CACCTATCCGAGAGAACCCGGACCTAGGTG-DABCAL-3’)

该分子信标是由碱基组成的颈环结构的特异序列，其中5，端用FAM标记，3，端用DABCTL标记，荧光基团要求激发波长495nm，检测波长520nm；人工设计合成分子信标及与其完全互补的寡核苷酸(5’-AGGTCCGGGTTCTCTCGGAT-3’)。通过对分子信标和寡聚核苷酸做热变性曲线实验，确定荧光原位杂交的最佳反应温度为52℃，去离子甲酰胺的最佳浓度为20％。实施例2：三种方法检测痰样本的对比试验

A、罗氏培养法

选用改良的Lowenstein-Jensen培养基，将处理过的痰液进行培养。具体为取痰标本ImL加入4％氢氧化钠2mL，涡旋震荡30秒混匀，室温静置20min，其间振荡2～3次，促痰液化。以灭菌刻度毛细吸管取0.1mL消化后痰液，缓缓均匀地接种每支培养基斜面上，放37℃培养箱内培养。接种后第3天和第7天观察培养的情况，之后每周观察1次，直到第8周末。若出现培养阳性则随时报告，培养至8周未见细菌生长，报告为培养阴性。

B、抗酸染色法检测

检测原理：结核分枝杆菌含脂质多，不易着色，先用石炭酸复红初染，染色时间要稍长，且需要加温。一旦细菌染上颜色，由于脂质的存在，即使强脱色剂也不能使之脱色，其它细菌均脱色，经碱性美兰复染，所以结核分枝杆菌呈红色，其它细菌呈蓝色

检测方法：

1、涂片：直接挑取痰液0.05-0.1mL，置于载玻片正面右侧2/3处，均匀涂抹成10mm×20mm的卵圆形膜状，自然干燥，使用火焰固定两三次。

2、染色：1)初染，用苯酚复红液染色3-5分钟；2)用盐酸乙醇液脱色两遍；3)复染，用亚甲蓝液染色1-3分钟，洗去多余染料，自然干燥。

3、镜检与报告：用双目光学显微镜(目镜10×，油镜100×)镜检，在淡蓝色背景下，分枝杆菌等抗酸杆菌呈红色，其他细菌或细胞呈蓝色。按照下列标准报告镜检结果：

抗酸杆菌阴性(-)：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌。

抗酸杆菌阳性(报告杆菌数)：1-8条/300视野。

抗酸杆菌阳性(1+)：3-9条/100视野。

抗酸杆菌阳性(2+)：1-9条/10视野。

抗酸杆菌阳性(3+)：1-9条每视野。

抗酸杆菌阳性(4+)：>10条每视野。

C、分子信标探针FISH检测

检测试剂盒包括：

(1)裂解液：4％(w/v)氢氧化钠

(2)杂交液：10％(w/v)硫酸葡聚糖，10mM NaCl，20％(v/v)甲酰胺，0.1％(w/v)焦磷酸钠，0.2％(w/v)聚乙烯基吡咯烷酮，0.2％(w/v)聚鹿糖，5mM Na2EDTA，0.1％(v/v)TritonX-100，50mM Tris/HCl(pH7.5)，10ng/μL分子信标探针，所述分子信标探针的碱基序列为：

Beacon TB：5’-FAM-CACCTATCCGAGAGAACCCGGACCTAGGTG-DABCAL-3’；

(3)终止液：1％(v/v)稀硫酸；

(4)洗涤液：5mM Tris，15mM NaCl，0.1％(v/v)Triton X-100，pH值为10。

检测方法：

(1)吸取10μL痰液样品滴在载玻片上，自然风干；

(2)在风干的样品上加入10μL裂解液，待其自然风干后，浸入无水乙醇中，浸泡5分钟；

(3)在样品上加入10μL杂交液，置于杂交炉中52℃杂交10分钟；

(4)用终止液侵泡1分钟，终止反应；

(5)滴加封片剂后，用荧光显微镜镜检，用20×物镜扫视和计数，用60或100×物镜观察细菌形态。在暗色背景中，结核分枝杆菌发出绿色荧光。

结果判定方法：

结核分枝杆菌阴性(-)：连续观察50个不同视野，未发现结核分枝杆菌。

结核分枝杆菌阳性(报告杆菌数)：1-9条/50视野。

结核分枝杆菌阳性(1+)：10-99条/50视野。

结核分枝杆菌阳性(2+)：1-9条每视野。

结核分枝杆菌阳性(3+)：10-99条每视野。

结核分枝杆菌阳性(+)：>100条每视野。

D、三种检测方法的结果及分析

采用罗氏培养法、抗酸染色法、分子信标探针FISH法三种方法对169份病人痰液样本的进行检测(将169份病人痰液样本的检测结果分为8种情形)，检测结果如表一所示：

表一：三种方法检测的结果

	罗氏培养法	抗酸染色	分子信标FISH	样品数
					A	+	+	+	44
B	+	-	+	29
					C	+	+	-	4
D	+	-	-	6
					E	-	+	+	3
F	-	+	-	12
					G	-	-	+	1
H	-	-	-	70

以罗氏培养为金标准，抗酸染色的阳性检出率为(4+44)/(4+44+29)×100％＝62.3％，分子信标FISH的阳性检出率为(29+44)/(4+44+29)×100％＝94.8％；抗酸染色的假阳性率为(12+3)/(12+3+1+70)×100％＝17.4％，分子信标FISH的假阳性率为(1+3)/(12+3+1+70)×100％＝4.7％。

本发明所述的分子信标探针FISH检测结核分枝杆菌，与抗酸染色法相比，阳性检测率远达到了罗氏培养法的94.8％，远高于后者(62.3％)；同时假阳性率仅有4.7％，远低于后者的17.4％。与罗氏检测法相比，不论阳性检测率和假阳性率都很接近，而又比罗氏培养法提前一个月得到检测结果，大大提高了检测效率。

实施例3：使用分枝信标探针FISH检测分枝杆菌标准菌株。

分枝杆菌标准菌株购自ATCC，共检测5种结核分枝杆菌和12种非结核分枝杆菌。除了被检样品不同，具体的检测方法和阳性判定方法参见实施例2中“分子信标探针FISH检测”部分，检测结果如表二所示。

表二：使用结核分枝杆菌分子信标探针FISH检测分枝杆菌标准菌株

检测结果分析：5种结核分枝杆菌检测结果全为阳性，12种非结核分枝杆菌，检测结果全为阴性，说明本检测方法检测结核分枝杆菌有很好的特异性。

     SEQUENCE LISTING

 

<110>  方, 华成

 

<120>  一种快速检测结核分枝杆菌的分子信标探针及检测方法

 

<130> 

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

cacctatccg agagaacccg gacctaggtg                                      30

 

Claims (2)

1.一种快速检测结核分枝杆菌的分子信标探针，其特征在于，所述分子信标探针的碱基序列为：

Beacon TB：5’-FAM-CACCTATCCGAGAGAACCCGGACCTAGGTG-DABCAL-3’；

所述探针的5’端用FAM标记，3’端用DABCAL标记，荧光基团激发波长495nm，检测波长520nm。

2.一种快速检测结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(1)裂解液：4％(w/v)氢氧化钠；

(2)杂交液：10％(w/v)硫酸葡聚糖，10mM NaCl，20％(v/v)甲酰胺，0.1％(w/v)焦磷酸钠，0.2％(w/v)聚乙烯基吡咯烷酮，0.2％(w/v)聚鹿糖，5mM Na2EDTA，0.1％(v/v)TritonX-100，50mM Tris/HCl(pH 7.5)，10ng/μL分子信标探针，所述分子信标探针的碱基序列为：

Beacon TB：5’-FAM-CACCTATCCGAGAGAACCCGGACCTAGGTG-DABCAL-3’；

(3)终止液：1％(v/v)稀硫酸；

(4)洗涤液：5mM Tris，15mM NaCl，0.1％(v/v)Triton X-100，pH值为10。