CN104313174A - 一种快速检测肺炎链球菌的分子信标探针及检测方法 - Google Patents
一种快速检测肺炎链球菌的分子信标探针及检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104313174A CN104313174A CN201410635300.7A CN201410635300A CN104313174A CN 104313174 A CN104313174 A CN 104313174A CN 201410635300 A CN201410635300 A CN 201410635300A CN 104313174 A CN104313174 A CN 104313174A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- molecular beacon
- streptococcus pneumoniae
- probe
- beacon probe
- fam
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 62
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 title claims abstract description 46
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 title claims abstract description 42
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims abstract 2
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 27
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 4
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 claims description 3
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 claims description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 claims description 2
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Natural products C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- -1 methane amide Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 229910000406 trisodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000019801 trisodium phosphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000007605 air drying Methods 0.000 claims 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims 1
- 239000001117 sulphuric acid Substances 0.000 claims 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 claims 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims 1
- 201000005010 Streptococcus pneumonia Diseases 0.000 abstract description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 7
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 7
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 6
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 6
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 6
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 6
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 4
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 3
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 3
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 3
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- 206010062717 Increased upper airway secretion Diseases 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229960004756 ethanol Drugs 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 208000026435 phlegm Diseases 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 208000008967 Enuresis Diseases 0.000 description 1
- 240000004859 Gamochaeta purpurea Species 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 206010027202 Meningitis bacterial Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 208000005228 Pericardial Effusion Diseases 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 206010061372 Streptococcal infection Diseases 0.000 description 1
- HVYLDJKDVOOTHV-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-iminoethanethiol Chemical compound CC(O)=O.CC(O)=O.SCC=N HVYLDJKDVOOTHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009904 bacterial meningitis Diseases 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004912 pericardial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000004910 pleural fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种快速检测肺炎链球菌的分子信标探针，其特征在于，所述分子信标探针的碱基序列为：BeaconSP：5’-FAM- CTGCA TATTGGAAACGATAGCTAAT TGCAG -DABCAL-3’；所述探针的5’端用FAM标记，3’端用DABCAL标记，荧光基团激发波长495nm，检测波长520nm。本发明的分子信标探针信号强度高，并且特异性高，可以有效、快速地检测肺炎链球菌。本发明还公开了一种快速检测肺炎链球菌的试剂盒及检测方法。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种分子信标探针和试剂盒，通过使用荧光原位杂交的手段，检测样品中少量的肺炎链球菌。
背景技术
肺炎链球菌是临床上重要的致病菌，2012年WHO数据显示：全球每年由肺炎链球菌感染引起的死亡病例达210万，其中100万以上是5岁以下儿童。据统计，中国53％的肺炎链球菌可引起儿童的社区获得性肺炎，7％-9％的肺炎链球菌感染会引起细菌性脑膜炎。此外，中国是肺炎链球菌引起感染病例最多的国家之一，占全球病例的12％，也是5岁以下儿童肺炎链球菌感染引起死亡病例数最多的国家之一。为有效控制肺炎链球菌感染的传播，以及降低疾病造成的危害，建立准确，快速的检测方法是首要任务。
目前临床上检测肺炎链球菌常用的方法有细菌培养法、乳胶凝集法和PCR法。其中细菌培养法是检测肺炎链球菌的金标准，但(1)抗生素的广泛使用要以使其分离率大大降低；(2)非侵袭性疾病不伴有菌血症，血液培养难有阳性结果；(3)因为肺炎链球菌常在上呼吸道定植，呼吸道标本的细菌培养结果会受到干扰。深部呼吸道标本的细菌培养可以确诊，去需要侵入性操作，如肺穿刺等，通常令患儿的家长难以接受。此外该方法需要二氧化碳培养箱和脱纤维羊血培养基，并且需要16-18小时才能看到检测结果，检测成本高、检测周期长。乳胶凝集法原理是利用肺炎链球菌荚膜的抗原性，用覆盖了所有肺炎链球菌血清型的抗体来致敏乳胶颗粒。有肺炎链球菌存在时，其荚膜上的抗原和乳胶颗粒上的抗体可发生抗原抗体反应，产生肉眼可见的乳胶颗粒凝集现象。此法可以快速鉴定肺炎链球菌。乳胶凝集法的局限性在于如果检测的细菌数量较少，会出现假阴性结果，需要传以获得足够量的菌；此外有些C群链球菌可能发生假阳性反应。利用PCR方法可在短时间内使特定的核酸序列拷贝数几何级数增加，有很高的灵敏度和特异性，但缺点是假阳性率高，另一方面，患者分泌物中有往往含有抑制PCR反应的成分，这又会导致假阴性的出现，这两方面的缺点限制了PCR检测的临床应用。目前，已有用荧光原位杂交(FISH)检测肺炎链球菌的报道，但均采用的是线形探针，该方法的缺点是，杂交完成后，必须用严格的洗涤条件来除去未杂交的探针，而且经常会因为探针清洗不完全而造成假阳性。由此可见，肺炎链球菌感染的临床诊断，急需更简洁、灵敏的检测方法。
分子信标探针(Molecular beacon probe)，具有灵敏度高、特异性强、只有和靶序列杂交上了才会发出荧光等优点，被应用于荧光原位杂交。本发明通过对大量肺炎链球菌菌株的16S rRNA序列进行比对，挑选肺炎链球菌的特异性序列，设计、合成分子信标探针，建立稳定的分子信标原位杂交反应体系，克服了肺炎链球菌当前临床检测的诸多问题，为肺炎链球菌感染的诊断、预防和控制提供新的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分子信标探针，通过荧光原位杂交的手段，建立一种快速、灵敏、特异性地检测样品中肺炎链球菌的方法。
一种快速检测肺炎链球菌的分子信标探针，其特征在于，所述分子信标探针的碱基序列为：
Beacon SP：5’-FAM-CTGCATATTGGAAACGATAGCTAATTGCAG-DABCAL-3’；
所述探针的5’端用FAM标记，3’端用DABCAL标记，荧光基团激发波长495nm，检测波长520nm。
进一步地，所述分子信标浓度为10ng/μL。
本发明还提供了一种快速检测肺炎链球菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(1)裂解液：1％TritonX-100,2％NaOH,50mM Tris-HCl(pH 7.5)
(2)杂交液：10％(w/v)硫酸葡聚糖，10mM NaCl，20％(v/v)甲酰胺，0.1％(w/v)焦磷酸钠，0.2％(w/v)聚乙烯基吡咯烷酮，0.2％(w/v)聚蔗糖，5mM Na2EDTA，0.1％(v/v)TritonX-100，50mM Tris-HCl(pH 7.5)，10ng/μL分子信标，其碱基序列为：
Beacon SP：5’-FAM-CTGCATATTGGAAACGATAGCTAATTGCAG-DABCAL-3’；
(3)终止液：1％稀硫酸
(4)洗涤液：5mM Tris，15mM NaCl，0.1％(v/v)Triton X-100，pH值为10。
本发明最后提供了一种上述试剂盒快速检测肺炎链球菌的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)吸取10μL样品滴在载玻片上，杂交炉加热至52℃风干；
(2)在风干的样品上加入10μL裂解液，杂交炉加热至52℃风干，浸入无水乙醇中，浸泡5分钟；
(3)待乙醇完全挥发后，加入10μL含Beacon探针的杂交液，52℃杂交10分钟；
(4)终止液侵泡1分钟，终止反应；
(5)滴加封片剂后，用荧光显微镜镜检，用20×物镜扫视和计数，用60或100×物镜观察细菌形态。
本发明的技术要点或原理：荧光原位杂交(Flourescence in situ Hybridization，FISH)是一种应用标记有荧光物质的探针，通过杂交的方法来检测细胞或组织内特异性DNA或RNA的方法；分子信标探针是一种具有独特“发夹”空间结构的探针，在未与靶序列结合时，分子信标呈“发夹”结构，有一环序列(loop)和一茎序列(stem)，其中环序列是与靶位点互补的碱基序列，而茎序列是与靶位点无关的互补序列；在探针的两端分别标记有荧光基团和荧光猝灭基团，当探针处于发卡结构时，荧光基团和猝灭基团相邻，产生能量共振转移效应，使得荧光基团被猝灭，不能产生荧光信号，而当探针与靶位点结合时，发夹结构被打开，荧光基团和猝灭基团分开，产生荧光信号，通过荧光显微镜可以检测到该荧光信号。
本发明通过比对多个肺炎链球菌菌株的16S rRNA序列，筛选出1条肺炎链球菌特有的靶序列。根据该靶序列，人工合成分子信标探针，其碱基组成为：
Beacon SP：5’-FAM-CTGCATATTGGAAACGATAGCTAATTGCAG-DABCAL-3’
探针的5’端用FAM标记，3’端用DABCAL标记，荧光基团激发波长495nm，检测波长520nm。
本发明通过大量实验，确定荧光原位杂交的最佳温度为52℃，甲酰胺最佳浓度为20％，分子信标最佳浓度为10ng/μL。
本发明分子信标探针5’端的荧光标记，包括但不限于FITC、FAM或Cy3等等，3’端的荧光猝灭标记，包括但不限于DABCYL、BDH或TANRA等，荧光基团或荧光猝灭基团可以根据现有技术进行添加。
本发明的分子信标探针能够用于检测的样本范围广泛，包括但不限于，痰、咽拭子、胃灌洗液、支气管灌洗液、活体组织、吸引物、咳出物、体液(脊髓、胸腹水、心包液等)、血液、脓液、骨髓、尿液、组织切片、食物样本、来自土壤、空气和水的样本，以及它们的培养物。这些样本经相应处理后，原则上是只要保持细胞形态完整并且靶核酸未被破坏，均可使用本发明的分子信标探针检测。这些样本的处理方法是本领域技术人员所掌握的，例如：
痰：痰液涂片法；
脓液：同痰液涂片法；
病灶组织：先用组织研磨器磨碎后再行涂片；
尿液：留全量夜尿，静置4～5h后，弃上清液，取沉淀部分尿液10ml，3000rpm，离心30min，取沉淀物涂片；
胸、腹水标本：参照尿液涂片法；
脑脊液：无菌操作收集脑脊液，放置冰箱或室温24h，待薄膜形成后涂片。也可将脑脊液离心沉淀，3000rpm，离心30min，弃上清液，取沉淀物涂片。
本发明的分子信标探针信号强度高，并且特异性高，可以有效、快速地检测肺炎链球菌。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：分子信标探针及寡聚核苷酸序列的设计与合成
选择出能特异性地检测肺炎链球菌的靶序列，在该段靶序列上设计与其完全互补的分子信标探针：
Beacon SP(5’-FAM-CTGCATATTGGAAACGATAGCTAATTGCAG-DABCAL-3’)
该分子信标是由碱基组成的颈环结构的特异序列，其中5，端用FAM标记，3，端用DABCTL标记，荧光基团要求激发波长495nm，检测波长520nm；人工设计合成分子信标及与其完全互补的寡核苷酸(5’-AGGTCCGGGTTCTCTCGGAT-3’)。通过对分子信标和寡聚核苷酸做热变性曲线实验，确定荧光原位杂交的最佳反应温度为52℃，去离子甲酰胺的最佳浓度为20％。
实施例2：三种方法检测痰样本的对比试验
A、培养法检测
将痰液样本放入CO2培养箱，37℃培养4小时，震荡10-20秒，取40μL液体转种于5％脱纤维羊血培养皿上。为了提高肺炎链球菌培养的阳性率，抑制杂菌，可以在培养基中加入终浓度为5mg/L的庆大霉素，37℃培养过夜。平板上的菌落应该有草绿色的溶血环，边缘整齐，呈脐窝状。
B、PCR法检测
用细菌基因组DNA提取试剂盒(HYQ)提取痰液中的细菌DNA，肺炎链球菌特异性引物，荧光定量PCR检测。以无菌水为阴性对照，CT值比阴性对照小10及以上的视为阳性。
C、分子信标探针FISH检测
检测试剂盒包括：
(1)裂解液：1％TritonX-100,2％NaOH,50mM Tris-HCl(pH 7.5)
(2)杂交液：10％(w/v)硫酸葡聚糖，10mM NaCl，20％(v/v)甲酰胺，0.1％(w/v)焦磷酸钠，0.2％(w/v)聚乙烯基吡咯烷酮，0.2％(w/v)聚蔗糖，5mM Na2EDTA，0.1％(v/v)TritonX-100，50mM Tris-HCl(pH 7.5)，10ng/μL分子信标，其碱基序列为：
Beacon SP：5’-FAM-CTGCATATTGGAAACGATAGCTAATTGCAG-DABCAL-3’；
(3)终止液：1％稀硫酸
(4)洗涤液：5mM Tris，15mM NaCl，0.1％(v/v)Triton X-100，pH值为10。
检测方法：
(1)吸取10μL样品滴在载玻片上，杂交炉加热至52℃风干；
(2)在风干的样品上加入10μL裂解液，杂交炉加热至52℃风干，浸入无水乙醇中，浸泡5分钟；
(3)待乙醇完全挥发后，加入10μL含Beacon探针的杂交液，52℃杂交10分钟；
(4)终止液侵泡1分钟，终止反应；
(5)滴加封片剂后，用荧光显微镜镜检，用20×物镜扫视和计数，用60或100×物镜观察细菌形态。
在暗色背景中，肺炎链球菌发出绿色荧光。
结果判定方法：
肺炎链球菌阴性(-)：连续观察50个不同视野，未发现肺炎链球菌。
肺炎链球菌阳性(报告细菌数)：1-9条/50视野。
肺炎链球菌阳性(1+)：10-99条/50视野。
肺炎链球菌阳性(2+)：1-9条每视野。
肺炎链球菌阳性(3+)：10-99条每视野。
肺炎链球菌阳性(+)：>100条每视野。
D、三种检测方法的结果及分析
采用培养法、PCR法、分子信标探针FISH法三种方法对145份病人痰液样本的进行检测(将145份病人痰液样本的检测结果分为8种情形)，检测结果如表一所示：
表一：三种方法检测的结果
| 培养法 | PCR法 | 分子信标FISH | 样品数 | |
| A | + | + | + | 52 |
| B | + | - | + | 19 |
| C | + | + | - | 6 |
| D | + | - | - | 3 |
| E | - | + | + | 4 |
| F | - | + | - | 11 |
| G | - | - | + | 2 |
| H | - | - | - | 48 |
以培养法为金标准，PCR法的阳性检出率为(52+6)/(52+19+6+3)×100％＝72.5％，分子信标FISH的阳性检出率为(52+19)/(52+19+6+3)×100％＝88.8％；抗酸染色的假阳性率为(4+11)/(4+11+2+48)×100％＝23.4％，分子信标FISH的假阳性率为(4+2)/(4+11+2+48)×100％＝9.2％。
本发明所述的分子信标探针FISH检测肺炎链球菌，与PCR法相比，阳性检测率达到了培养法的88.8％，高于后者(72.5％)；同时假阳性率仅有9.2％，也低于后者的23.4％。与培养法相比，不论阳性检测率和假阳性率都很接近，而操作上远远比培养法简便快捷，大大提高了检测效率。
实施例3：使用分枝信标探针FISH检测标准菌株。
细菌标准菌株购自ATCC，共检测4种肺炎链球菌和12种其它细菌。除了被检样品不同，具体的检测方法和阳性判定方法参见实施例2中“分子信标探针FISH检测”部分，检测结果如表二所示。
表二：使用肺炎链球菌分子信标探针FISH检测细菌标准菌株
检测结果分析：4种肺炎链球菌菌株检测结果全为阳性，12种其它细菌，检测结果全为阴性，说明本检测方法检测肺炎链球菌有很好的特异性。
SEQUENCE LISTING
<110> 方, 华成
<120> 一种快速检测肺炎链球菌的分子信标探针及检测方法
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctgcatattg gaaacgatag ctaattgcag 30
Claims (4)
1.一种快速检测肺炎链球菌的分子信标探针，其特征在于，所述分子信标探针的碱基序列为：
Beacon SP：5’-FAM-CTGCATATTGGAAACGATAGCTAATTGCAG-DABCAL-3’；
所述探针的5’端用FAM标记，3’端用DABCAL标记，荧光基团激发波长495nm，检测波长520nm。
2.如权利要求1所述的分子信标探针，其特征在于，所述分子信标浓度为10ng/μL。
3.一种快速检测肺炎链球菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(1)裂解液：1％TritonX-100,2％NaOH,50mM Tris-HCl(pH7.5)
(2)杂交液：10％(w/v)硫酸葡聚糖，10mM NaCl，20％(v/v)甲酰胺，0.1％(w/v)焦磷酸钠，0.2％(w/v)聚乙烯基吡咯烷酮，0.2％(w/v)聚蔗糖，5mM Na2EDTA，0.1％(v/v)TritonX-100，50mM Tris-HCl(pH7.5)，10ng/μL分子信标探针，所述分子信标探针的碱基序列为：
Beacon SP：5’-FAM-CTGCATATTGGAAACGATAGCTAATTGCAG-DABCAL-3’；
(3)终止液：1％稀硫酸；
(4)洗涤液：5mM Tris，15mM NaCl，0.1％(v/v)Triton X-100，pH值为10。
4.一种利用权利要求3所述试剂盒快速检测肺炎链球菌的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)吸取10μL样品滴在载玻片上，自然风干；
(2)在风干的样品上加入10μL裂解液，待其自然风干后，浸入无水乙醇中，浸泡5分钟；
(3)在样品上加入10μL杂交液，置于杂交炉中52℃杂交10分钟；
(4)用终止液侵泡1分钟，终止反应；
(5)滴加封片剂后，用荧光显微镜镜检，用20×物镜扫视和计数，用60或100×物镜观察细菌形态。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410635300.7A CN104313174A (zh) | 2014-11-12 | 2014-11-12 | 一种快速检测肺炎链球菌的分子信标探针及检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410635300.7A CN104313174A (zh) | 2014-11-12 | 2014-11-12 | 一种快速检测肺炎链球菌的分子信标探针及检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104313174A true CN104313174A (zh) | 2015-01-28 |
Family
ID=52368483
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410635300.7A Pending CN104313174A (zh) | 2014-11-12 | 2014-11-12 | 一种快速检测肺炎链球菌的分子信标探针及检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104313174A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104651510A (zh) * | 2015-02-13 | 2015-05-27 | 苏州达麦迪生物医学科技有限公司 | 一种用于检测水体中细菌污染的探针、试剂盒和方法 |
| CN104651512A (zh) * | 2015-02-13 | 2015-05-27 | 苏州达麦迪生物医学科技有限公司 | 一种用于检测食品中细菌的探针、试剂盒和方法 |
| CN116254351A (zh) * | 2022-08-08 | 2023-06-13 | 领航基因科技（杭州）有限公司 | 同时检测草绿色链球菌、β溶血性链球菌和肺炎链球菌的试剂盒 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009011971A2 (en) * | 2007-05-18 | 2009-01-22 | The Govt. Of The U.S.A. As Represented By The Secretary Of The Dept. Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Primers and probes for the detection of streptococcus pneumoniae |
| CN102876774A (zh) * | 2012-08-31 | 2013-01-16 | 武汉百泰基因工程有限公司 | 一种肺炎链球菌核酸定量检测引物、荧光探针、试剂盒及其检测方法 |
| CN104017889A (zh) * | 2014-06-19 | 2014-09-03 | 方华成 | 一种快速检测结核分枝杆菌的分子信标探针及检测方法 |
-
2014
- 2014-11-12 CN CN201410635300.7A patent/CN104313174A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009011971A2 (en) * | 2007-05-18 | 2009-01-22 | The Govt. Of The U.S.A. As Represented By The Secretary Of The Dept. Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Primers and probes for the detection of streptococcus pneumoniae |
| CN102876774A (zh) * | 2012-08-31 | 2013-01-16 | 武汉百泰基因工程有限公司 | 一种肺炎链球菌核酸定量检测引物、荧光探针、试剂盒及其检测方法 |
| CN104017889A (zh) * | 2014-06-19 | 2014-09-03 | 方华成 | 一种快速检测结核分枝杆菌的分子信标探针及检测方法 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104651510A (zh) * | 2015-02-13 | 2015-05-27 | 苏州达麦迪生物医学科技有限公司 | 一种用于检测水体中细菌污染的探针、试剂盒和方法 |
| CN104651512A (zh) * | 2015-02-13 | 2015-05-27 | 苏州达麦迪生物医学科技有限公司 | 一种用于检测食品中细菌的探针、试剂盒和方法 |
| CN116254351A (zh) * | 2022-08-08 | 2023-06-13 | 领航基因科技（杭州）有限公司 | 同时检测草绿色链球菌、β溶血性链球菌和肺炎链球菌的试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104017889B (zh) | 一种快速检测结核分枝杆菌的分子信标探针及检测方法 | |
| CN100580091C (zh) | 人与动物共患结核病荧光pcr快速诊断试剂盒 | |
| CN106661606A (zh) | 用于检测和表征微生物的方法 | |
| CN101144775B (zh) | 细菌实时荧光定量聚合酶链反应检测试剂盒 | |
| CN106987626A (zh) | 用于快速检测多种真菌并鉴定菌种的引物和探针及其应用 | |
| CN104032023B (zh) | 一种快速检测非结核分枝杆菌的分子信标探针及检测方法 | |
| CN110982881A (zh) | 检测幽门螺杆菌的分子信标探针、试剂盒及其检测方法 | |
| CN104313174A (zh) | 一种快速检测肺炎链球菌的分子信标探针及检测方法 | |
| CN102424862B (zh) | 嗜肺军团菌的基因分型芯片及检测用试剂盒 | |
| CN102952850B (zh) | 用于检测结核分枝杆菌的实时荧光定量pcr方法、引物、探针及试剂盒 | |
| CN104388558B (zh) | 一种快速检测无乳链球菌的分子信标探针及检测方法 | |
| CN104694638A (zh) | 一种用于检测沙门氏菌的探针、试剂盒和方法 | |
| CN104032033B (zh) | 用于荧光原位杂交检测粪肠球菌和/或其他肠球菌的肽核酸探针组及其试剂盒、使用方法、用途 | |
| CN107312849B (zh) | 一种检测牛支原体的cpa检测方法及其试剂盒与应用 | |
| JP2013504319A (ja) | ヘリコバクター・ピロリ及び／又はクラリスロマイシン抵抗性を検出するためのペプチド核酸プローブ、キット及び方法、及びその使用 | |
| CN105349661A (zh) | 一种沙眼衣原体/淋球菌核酸检测试剂盒 | |
| CN105567802A (zh) | 肺炎衣原体荧光pcr检测试剂盒 | |
| CN102304571A (zh) | 一种用分子信标快速检测金黄色葡萄球菌的方法 | |
| CN104031129A (zh) | 用于检测金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌的肽核酸探针组及其试剂盒、使用方法、用途 | |
| CN105524988A (zh) | 一种快速检测痰液中结核分支杆菌的试剂盒 | |
| CN104032032B (zh) | 用于检测铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌的肽核酸探针组及其试剂盒 | |
| CN106916903A (zh) | 结核分枝杆菌85B mRNA的实时荧光RT‑PCR检测方法及试剂盒 | |
| CN102952888A (zh) | 解脲脲原体和微小脲原体的检测方法 | |
| CN103160587A (zh) | 10种常见致病军团菌的基因分型芯片及检测用试剂盒 | |
| CN102533955B (zh) | 一种肽核酸探针、含有该肽核酸探针的组合物及其用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: SUZHOU DMD BIO-MEDICAL CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: FANG HUACHENG Effective date: 20150114 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20150114 Address after: 501, room 1, building 8, Medical Instrument Industrial Park, No. 215163 Jinfeng Road, Suzhou hi tech Zone, Jiangsu, China Applicant after: DMD BIOMED LTD. Address before: 501, room 1, building 8, medical instrument industry park, No. 215163 Jinfeng Road, Suzhou hi tech Zone, Jiangsu Applicant before: Fang Huacheng |
|
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Fang Guowei Inventor after: Hong Ran Inventor after: Yi Chun Inventor after: Liu Zhenshi Inventor before: Fang Huacheng Inventor before: Hong Ran Inventor before: Yi Chun Inventor before: Liu Zhenshi |
|
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: FANG HUACHENG HONG RAN YI CHUN LIU ZHENSHI TO: FANG GUOWEI HONG RAN YI CHUN LIU ZHENSHI |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150128 |