CN104651512A - 一种用于检测食品中细菌的探针、试剂盒和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于检测食品中细菌的探针，该探针为分子信标探针，未与靶位点杂交上时呈发夹结构，不会发出荧光，只有与靶位点特异性地结合后，才有荧光产生；本发明还提供了一种快速检测食品中细菌的方法，本发明的检测方法信号强度高，特异性强，操作简单，检测成本低，可以高效、快速地检测食品中的细菌；本发明还提供了一种用于检测食品中细菌的试剂盒。

Description

一种用于检测食品中细菌的探针、试剂盒和方法
技术领域
本发明涉及一种检测用的探针，具体涉及一种用于检测食品中细菌的探针、试剂盒和方法。
背景技术
食品细菌即指常在食品中存在的细菌，自然界的细菌种类繁多，但由于食品理化性质，所处环境条件及加工处理等因素的限制，在食品中存在的细菌只是自然界细菌的一小部分。食品细菌包括致病菌和非致病菌：致病菌是指随食物进入人体后可引起食源性疾病，常见者如沙门氏菌、志贺氏菌等，与疾病直接有关，一般规定在食品中不允许检出。非致病菌一般不引起人类疾病，但其中一部分为腐败菌，如假单胞菌，与食品变质有密切关系，是评价食品卫生质量的重要指标。
在我国的食品卫生标准中，测定食品中细菌数量的方法，是在严格规定的培养方法和培养条件下进行的，使得适应这些条件的每一个活菌细胞能够生成一个肉眼可见的菌落，所生成的菌落总数即是该食品中的细菌总数。食品中细菌的种类很多，它们的生理特性和所需要的培养条件不尽相同。如果要采用培养的方法计数食品中所有的细菌种类和数量，必须采用不同的培养基及培养条件，其工作量很大，通常会采用检测指标菌的方法来替代。
例如，肠道致病菌如沙门氏菌属和志贺氏菌属是引起食物中毒的重要致病菌，然而这些致病菌往往数量较少且难以培养，对食品进行逐批逐件地检验又不可能，鉴于大肠菌群与肠道致病菌来源相同，而且一般在外环境中生存时间也与主要肠道病原菌一致，所以大肠菌群通常就作为肠道病原菌污染食品的指示菌。通过检测指标菌来大致判断食品中的致病菌存在状况，不失为一种简便方法，但很显然，指标菌和病原菌的存在并非完成平行的关系——食品中检出大肠菌群，只能说明有肠道病原菌存在的可能性，食品中未检测大肠菌群，也不能完全排除食品中可能有肠道病原体污染。
由此可见，当前的食品细菌检测方法并不能很好地满足简便、快速、准确的检测需求，对于难培养、难鉴定的食品源致病菌，需要更高效的检测手段。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种探针，所述探针能用于检测食品中细菌，通过荧光原位杂交的手段，本发明还提供了一种快速、灵敏、特异性地检测食物中常见细菌的试剂盒和方法。
为实现上述目的，所采取的技术方案：一种用于检测食品中细菌的探针，所述探针呈分子信标结构，即探针序列由茎、环两部分组成，总长度25～60个碱基，其中中间的环序列部分与细菌16s rRNA或23s rRNA序列相匹配，两端茎部分是5～8个互补的DNA或PNA序列，探针在常温下会自动退火形成发夹结构；探针的5’端用荧光基团标记，3’端用荧光淬灭基团标记，常态下游离的探针由于呈发夹结构，荧光基团因紧挨荧光淬灭基团，而不会有荧光发出，只有当探针与靶序列成功杂交上之后，荧光基团和荧光淬灭基团分离开来，才会发出荧光；
所述探针是通过核酸杂交的原理检测食品中的细菌的，所述细菌包括食品中正常携带的细菌以及食品被污染后带上的致病菌。
优选地，所述探针5’端的荧光基团为FITC、FAM和Cy3中的一种，所述探针3’端的荧光淬灭基团为DABCYL、BDH和TANRA中的一种。
本发明提供了一种用于检测食品中细菌的试剂盒，所述试剂盒包括：
(1)上述所述的探针；
(2)重悬固定液；
(3)杂交液；
(4)洗涤液；
所述重悬固定液包括：
优选地，所述杂交液包括5％(w/v)PEG，50mM NaCl，40％(v/v)甲酰胺，0.5％(w/v)过硫酸铵，1％(w/v)DEPC，1％(w/v)聚蔗糖，50mM EDTA，0.1％(v/v)TritonX-100，50mM pH 8.0的Tris-HCl；
所述洗涤液包括50mM Tris-HCl(pH 10.0)，0.5M NaCl，0.1％(v/v)NP-40，0.5％(v/v)Triton X-100。
本发明还提供了一种用于检测食品中细菌的方法，所述方法采用上述所述试剂盒来检测，所述方法包括以下步骤：
(1a)取待检食品样品，加入到重悬固定液中，震荡混匀；
(2a)取步骤(1a)中混匀后的液体滴在载玻片上，然后烘干；
(3a)将步骤(2a)中获得的载玻片浸入甲醇中浸泡，然后烘干；
(4a)在浸泡后的载玻片上的待检位置加入杂交液和探针，置于杂交炉中避光杂交；
(5a)将步骤(4a)中获得的载玻片浸入预热的洗涤液中洗涤，然后烘干；
(6a)滴加封片剂后，用荧光显微镜镜检，用10×物镜扫视和计数，用40或100×物镜观察细菌形态；
或者所述方法包括以下步骤：
(1b)取待检食品样品，加入到重悬固定液中，震荡混匀；
(2b)过滤得到滤液；
(3b)取步骤(2b)中得到的滤液滴在载玻片上，然后烘干；
(4b)将步骤(3b)中获得的载玻片浸入甲醇中浸泡，然后烘干；
(5b)在浸泡后的载玻片上的待检位置加入杂交液和探针，置于杂交炉中避光杂交；
(6b)将步骤(5b)中获得的载玻片浸入预热的洗涤液中洗涤，然后烘干；
(7b)滴加封片剂后，用荧光显微镜镜检，用10×物镜扫视和计数，用40或100×物镜观察细菌形态。
上述所述步骤(1a)、(1b)是通过重悬固定液使食品样品中的细菌与食品成分分开，并且使分开的细菌悬浮于重悬固定液中，上述所述步骤(2a)、(3b)是为了使待检食品样品中的细菌固定在载玻片上。
优选地，所述步骤(1a)、(1b)中所述待检食品样品与所述重悬固定液的体积比为1:1～1:5，所述步骤(2a)中所述液体滴加的体积为10μL，所述步骤(3b)中所述滤液滴加的体积为10μL，所述步骤(2a)、(3a)、(5a)、(3b)、(4b)、(6b)中的烘干温度为52～58℃，所述步骤(3a)、(4b)中所述浸泡时间为5分钟，所述步骤(5a)、(6b)中洗涤液的预热温度为52～58℃，所述步骤(5a)、(6b)中所述洗涤时间为5～20分钟。
优选地，所述步骤(3a)、(4b)中所述杂交液的加入体积为20μL，所述探针加入后的浓度为20ng/L。
优选地，所述步骤(3a)、(4b)中杂交温度为52℃，杂交时间为30分钟。
本发明所述试剂盒和检测方法的技术要点或原理：本发明所述重悬固定液可以快速将食品中的细菌与食品成分分开，并使之易于结合到载玻片上。荧光原位杂交(Flourescence in situ Hybridization，FISH)是一种应用标记有荧光物质的探针，通过杂交的方法来检测细胞或组织内特异性DNA或RNA的方法；分子信标探针是一种具有独特“发夹”空间结构的探针，在未与靶序列结合时，分子信标呈“发夹”结构，有一环序列(loop)和一茎序列(stem)，其中环序列是与靶位点，即细菌16sRNA互补的碱基序列，而茎序列是与靶位点无关的互补序列；在探针的两端分别标记有荧光基团和荧光猝灭基团，当探针处于发卡结构时，荧光基团和猝灭基团相邻，产生能量共振转移效应，使得荧光基团被猝灭，不能产生荧光信号，而当探针与靶位点结合时，发夹结构被打开，荧光基团和猝灭基团分开，产生荧光信号，通过荧光显微镜可以检测到该荧光信号。
本发明通过大量实验摸索，确定本发明所述检测方法中荧光原位杂交的最佳温度为52℃，甲酰胺的最佳浓度为20％(v/v)，探针的最佳终浓度为20ng/L。
本发明的探针、试剂盒和检测方法检测的样本范围，包括但不限于蔬菜、水果、肉类、面粉、糖果、糕点、调料、饮料等各类食品。
本发明的探针、试剂盒和检测方法检测的细菌，包括但不限于食品中常见的大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、肉毒杆菌、假单胞菌以及其他可能对食品造成污染的细菌。
本发明的有益效果在于：本发明基于荧光原位杂交技术，提供了一种用于检测食品中细菌的探针，该探针特为分子信标探针，其特异性强；本发明还提供了一种用于检测食品中细菌的试剂盒，该试剂盒包含可以使食品中的细菌与食品成分快速分开的重悬固定液；本发明还提供了一种快速检测食品中细菌的方法，本发明的检测方法信号强度高，特异性强，操作简单，检测成本低，可以高效、快速地检测食品中的细菌。
附图说明
图1为分子信标探针游离状态和杂交状态的结构示意图；
图2为本发明所述的试剂盒中载玻片的一种实施例的示意图；
图3为通过本发明所述的检测方法检测食品中大肠杆菌的一种实施例的荧光显微镜镜检结果图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议条件进行。所用仪器或试剂未注明生产厂商者，均为可在市面上购买到的常规产品。本发明实施例中使用的杂交液包括5％(w/v)PEG，50mM NaCl，40％(v/v)甲酰胺，0.5％(w/v)过硫酸铵，1％(w/v)DEPC，1％(w/v)聚蔗糖，50mM EDTA，0.1％(v/v)TritonX-100，50mM pH 8.0的Tris-HCl；洗涤液包括50mM Tris-HCl(pH10.0)，0.5M NaCl，0.1％(v/v)NP-40，0.5％(v/v)Triton X-100；重悬固定液包括：
实施例1：用于检测大肠杆菌的特异性分子信标探针的设计与合成
分子信标探针游离状态和杂交状态的结构示意图如图1，通过对细菌16srRNA的比对，筛选出能特异性地检测大肠杆菌的探针序列，5’-CAAAGAGCAAGCTTCTTCC-3’，该段序列即为分子信标探针的环部分，在此基础上，在该序列两端分别添加5个互补的碱基，构成探针的茎部分，就组成了完整的分子信标探针：
Beacon E coli
(5’-FAM-TGAGACAAAGAGCAAGCTTCTTCCTCTCA-DABCAL-3’)
该分子信标是由碱基组成的具有茎环结构的特异序列，其中5’端用FAM标记，3’端用DABCTL标记，荧光基团要求激发波长495nm，检测波长520nm；人工设计合成分子信标探针及与其环部分完全互补的寡聚核苷酸(5’-GGAAGAAGCTTGCTCTTTG-3’)。通过对分子信标探针和寡聚核苷酸做热变性曲线实验，确定荧光原位杂交的最佳反应温度为52℃，去离子甲酰胺的最佳浓度为20％。
实施例2：使用实施例1中设计合成的探针检测牛奶中的大肠杆菌
检测方法：
(1)取0.1mL牛奶，加入0.3mL重悬固定液，混匀；
(2)吸取10L步骤(1)中混匀后的液体涂于载玻片上，杂交炉加热至52℃烘干；
(3)将载玻片浸入甲醇中，浸泡5分钟，取出后放杂交炉上，52℃烘干；
(4)加入20μL含实施例1中分子信标探针的杂交液，探针加入后的浓度为20ng/L，52℃杂交30分钟；
(5)将载玻片浸泡到洗涤液中，55℃洗涤5分钟，取出后放杂交炉上，52℃烘干。
(6)滴加封片剂后，用荧光显微镜镜检，用10×物镜扫视和计数，用40或100×物镜观察细菌形态。在暗色背景中，大肠杆菌发出绿色荧光，如图3所示。
实施例3：使用本发明所述分子信标探针检测牛肉中的细菌
(1)取待检牛肉1g，切碎，浸泡入2mL固定重悬液中，充分震荡；
(2)用滤纸过滤，去除牛肉残渣；
(3)吸取滤液涂于8孔载玻片上，所示8孔载玻片如图2所示，每孔10μL，杂交炉加热至52℃烘干；
(4)将载玻片浸入甲醇中，浸泡5分钟，取出后放杂交炉上，52℃烘干；
(5)每个孔中加入20μL杂交液和检测各类细菌相应的探针，52℃杂交30分钟；
(6)将载玻片浸泡到洗涤液中，55℃洗涤5分钟，取出后放杂交炉上，52℃风干。
(7)滴加封片剂后，用荧光显微镜镜检，根据孔的编号和荧光颜色的不同，来判读牛肉中有哪些细菌污染。用10×物镜扫视和计数，用40或100×物镜观察细菌形态。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.一种用于检测食品中细菌的探针，其特征在于：所述探针呈分子信标结构，即探针序列由茎、环两部分组成，总长度25～60个碱基，其中中间的环序列部分与细菌16s rRNA或23s rRNA序列相匹配，两端茎部分是5～8个互补的DNA或PNA序列，探针在常温下会自动退火形成发夹结构；探针的5’端用荧光基团标记，3’端用荧光淬灭基团标记，常态下游离的探针由于呈发夹结构，荧光基团因紧挨荧光淬灭基团，而不会有荧光发出，只有当探针与靶序列成功杂交上之后，荧光基团和荧光淬灭基团分离开来，才会发出荧光；
所述探针是通过核酸杂交的原理检测食品中的细菌的，所述细菌包括食品中正常携带的细菌以及食品被污染后带上的致病菌。
2.根据权利要求1所述的用于检测食品中细菌的探针，其特征在于，所述探针5’端的荧光基团为FITC、FAM和Cy3中的一种，所述探针3’端的荧光淬灭基团为DABCYL、BDH和TANRA中的一种。
3.一种用于检测食品中细菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(1)权利要求1或2中所述的探针；
(2)重悬固定液；
(3)杂交液；
(4)洗涤液；
所述重悬固定液包括：
4.根据权利要求3所述的用于检测食品中细菌的试剂盒，其特征在于，所述杂交液包括5％(w/v)PEG，50mM NaCl，40％(v/v)甲酰胺，0.5％(w/v)过硫酸铵，1％(w/v)DEPC，1％(w/v)聚蔗糖，50mM EDTA，0.1％(v/v)TritonX-100，50mM pH 8.0的Tris-HCl；
所述洗涤液包括50mM pH 10.0的Tris-HCl，0.5M NaCl，0.1％(v/v)NP-40，0.5％(v/v)Triton X-100。
5.一种采用如权利要求3-4任一所述试剂盒的用于检测食品中细菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1a)取待检食品样品，加入到重悬固定液中，震荡混匀；
(2a)取步骤(1a)中混匀后的液体滴在载玻片上，然后烘干；
(3a)将步骤(2a)中获得的载玻片浸入甲醇中浸泡，然后烘干；
(4a)在浸泡后的载玻片上的待检位置加入杂交液和探针，置于杂交炉中避光杂交；
(5a)将步骤(4a)中获得的载玻片浸入预热的洗涤液中洗涤，然后烘干；
(6a)滴加封片剂后，用荧光显微镜镜检，用10×物镜扫视和计数，用40或100×物镜观察细菌形态；
或者所述方法包括以下步骤：
(1b)取待检食品样品，加入到重悬固定液中，震荡混匀；
(2b)过滤得到滤液；
(3b)取步骤(2b)中得到的滤液滴在载玻片上，然后烘干；
(4b)将步骤(3b)中获得的载玻片浸入甲醇中浸泡，然后烘干；
(5b)在浸泡后的载玻片上的待检位置加入杂交液和探针，置于杂交炉中避光杂交；
(6b)将步骤(5b)中获得的载玻片浸入预热的洗涤液中洗涤，然后烘干；
(7b)滴加封片剂后，用荧光显微镜镜检，用10×物镜扫视和计数，用40或100×物镜观察细菌形态。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1a)、(1b)中所述待检食品样品与所述重悬固定液的体积比为1:1～1:5，所述步骤(2a)中所述液体滴加的体积为10μL，所述步骤(3b)中所述滤液滴加的体积为10μL，所述步骤(2a)、(3a)、(5a)、(3b)、(4b)、(6b)中的烘干温度为52℃，所述步骤(3a)、(4b)中所述浸泡时间为5分钟，所述步骤(5a)、(6b)中洗涤液的预热温度为55℃，所述步骤(5a)、(6b)中所述洗涤时间为5分钟。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3a)、(4b)中所述杂交液的加入体积为20μL，所述探针加入后的终浓度为20ng/L。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3a)、(4b)中杂交温度为52℃，杂交时间为30分钟。
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