CN108728550A - 一种快速检测鸽子性别的引物及其试剂盒和应用以及检测方法 - Google Patents

一种快速检测鸽子性别的引物及其试剂盒和应用以及检测方法 Download PDF

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Abstract

一种快速检测鸽子性别的引物及其试剂盒和应用以及检测方法，它涉及禽类或鸟类检测领域。本发明的检测引物如SEQ ID No.1至No.4所示。含有上述引物的试剂盒。检测方法包括：鸽子羽髓样本总DNA的提取，LAMP反应和电泳检测或荧光染料检测，确定鸽子性别的方法。本发明可以利用羽髓快速抽提DNA和常规血液抽提DNA，作为模板用于LAMP实验。本发明根据鸽子(CHD1W)基因序列设计了LAMP引物，并建立检测鸽子性别的技术及其应用方法的试剂盒，具有快速、灵敏、高度特异性和易推广实用的优点。在早期雏鸽中快速鉴定出雏鸽性别，使鸽子性别比例适当，利于鸽舍安宁，提高产蛋率，利于产业化饲养管理和繁殖育种。

Description

一种快速检测鸽子性别的引物及其试剂盒和应用以及检测 方法
技术领域
本发明涉及禽类或鸟类检测领域，具体涉及鸽子羽髓DNA的提取、鸽子性别鉴定的LAMP引物组、检测鸽子性别的试剂盒及检测方法。
背景技术
鸽子是一种单态性鸟，其雌雄个体外貌形态几乎没有差别，极难从外形上区分开。鸽子的雌雄鉴别是肉鸽生产、繁殖工作中最为关键的一环，如果性别比例不当，不但鸽舍难以安宁，而且产蛋率也受影响，不利于产业化饲养管理与繁殖育种，尤其在幼鸽期去公留母的蛋鸽产业中更为突出。因此，雌雄鉴别在养鸽业具有重要作用。目前，传统的方法如翻肛鉴别、腹腔镜检、粪便类固醇检测及核型分析，它们存在准确性低、操作复杂、成本高、对鸽子伤害较大等缺点，虽然采用PCR技术对CHD基因内含子在Z和W染色体的差异进行扩增鉴定可以克服这些缺点，但是所需仪器和技术专业性强，检测环境要求苛刻、检测周期长，所以其推广及应用的成本非常高。因此，急需一种成本低，检测准确性高，易于推广的技术。
现有的环介导的等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是根据目的基因的6个特异区域,设计4～6条特异性引物，内引物(FIP、BIP)、外引物(F3、B3)、环引物(LF、LB)，利用Bst DNA聚合酶在60～65℃等温条件下特异地扩增目的基因。LAMP扩增反应可在2小时之内完成，其扩增产物是和靶标反向重复的茎环结构以及多环的菜花样结构，反应过程中产生大量焦磷酸根离子，加入荧光染料钙黄绿素后，焦磷酸根离子与Mn2+结合，钙黄绿素与Mg2+结合形成绿色荧光，没有反应的样品则不能产生焦磷酸根离子，钙黄绿素与Mn2+结合呈棕黄色。也可以通过反应后体系内是否存在白色沉淀物、电泳结果是否具有梯状条带、加入SYBRGreenl是否变成绿色等不同方法进行检测，具有检测灵敏度高，检测方法简单快速、仪器要求不高等特点。LAMP技术现已被广泛应用于微生物检测及胚胎性别鉴定等领域，如，食品安全检测、流行性病毒检测、临床诊断、对病菌、寄生虫等的检测，但是利用该技术对鸟类特别是鸽子的性别进行鉴定还没有报道，因此，如何运用环介导恒温扩增技术检测生产实践中鸽子性别的技术具有重大意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种简便、快速、准确鉴定鸽子性别的试剂盒和LAMP检测方法。
本发明的一种快速检测鸽子性别的引物，所述的引物为LAMP引物，其序列为：
上游外引物FIP序列
CCAGTCTTTTCCTGTATGTAAAATTAAGAAGCCTTGATCTTTACCA；
上游内引物BIP序列
CTGATGAATTAGAAAGATGAAGTGTCAAAACAACTGAGGGGGT；
下游外引物F3序列CAGGTGAGAATTTTTCTGGTA；
下游外引物B3序列AGCAACTTTAATTCTCAATTGC。
本发明的试剂盒为含有上述引物的试剂盒。
本发明的试剂盒用于检测鸽子性别，以及鉴定含Z和W染色体的鸟类和禽类的雌雄性别。
本发明的一种快速检测鸽子性别的方法，它是按照以下步骤进行的：
一、提取鸽子羽髓样品的总DNA，作为LAMP反应模板；
二、使用如权利要求2所述试剂盒，构建LAMP反应体系；
三、步骤二所述的LAMP反应体系的模板包括LAMP反应模板、阳性对照DNA模板和去离子水作为阴性对照模板；
四、将步骤二的LAMP反应体系，置于60～65℃水浴中，反应60～120分钟，得到反应液；
五、对步骤四的反应液在80～100℃处理10分钟，灭活Bst DNA聚合酶；
六、向步骤五处理后的反应液中加入显色剂，进行检测结果判定：若为绿色，则待测样品性别为雌性；若为桔黄色，则待测样品性别为雄性。
本发明的另外一种快速检测鸽子性别的方法，它是按照以下步骤进行的：
一、提取鸽子羽髓样品的总DNA，作为LAMP反应模板；
二、使用如权利要求2所述试剂盒，构建LAMP反应体系；
三、步骤二所述的LAMP反应体系的模板包括LAMP反应模板、阳性对照DNA模板和去离子水作为阴性对照模板；
四、将步骤二的LAMP反应体系，置于60～65℃水浴中，反应60～120分钟，得到反应液；
五、对步骤四的反应液在80～100℃处理10分钟，灭活Bst DNA聚合酶；
六、对步骤五处理后的反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果判定：若电泳结果为梯状条带，则待测样品性别为雌性；若电泳结果为无条带，则待测样品性别为雄性。
所述羽髓DNA的提取液是由Tris-buffer、DTT和蛋白酶K构成；具体是由1×Tris-buffer、100mM DTT和1mg/mL蛋白酶K构成。
所述试剂盒中的引物混合物包括将所述引物组中各单链DNA分别单独进行包装。
本发明包括以下有益效果：
本发明提供的一种快速检测鸽子性别引物，试剂盒及其检测方法，只需1～2根羽髓，利用羽髓DNA的提取液和快速提取方法获得DNA模板，采用环介导等温扩增(LAMP)技术，并根据鸽子染色体W的特异保守的基因序列设计了相应的LAMP检测引物组，用于LAMP反应检测鸽子的性别。
本发明所提供的用于快速检测鸽子性别的试剂盒及其检测方法，不需特殊的PCR仪，具有技术操作简单、适用性强、灵敏度高(比PCR高10-100倍)、特异性强、快速高效(一个样品从DNA提取到结果显示大约3小时)、无需专业性检测设备等特点，符合快速准确的检测要求，具有比现有的传统的方法和PCR技术检测更高的特异性、灵敏度和实用性，可以在实际生产中现场应用检测，为鸽子的产业化养殖和培育提供可靠的科学方法和手段，从而达到降低饲养成本，提高经济效益的目的，在鸽子的产业化养殖和培育中有很高的应用价值。
附图说明
图1为LAMP反应液的凝胶电泳图，以本发明的羽髓DNA提取方法得到的总DNA为模板，加入本发明设计的引物组反应的电泳结果图；M:DNA分子量标准D2000 DNA Marker，CK为试剂盒阳性对照，S2、S3、S5、S6-10为检测鸽子羽髓样品；S3、S10为雌性样品，有梯状条带；S2、S5-9为雄性样品，无扩增条带；
图2为快速检测鸽子性别的试剂盒及其检测方法的特异性验证结果，以PCR方法检测用的引物组，本发明的羽髓DNA提取方法得到的总DNA为模板，进行PCR反应后的产物凝胶电泳图；M:DNA分子量标准D2000 DNA Marker，S1-10为检测鸽子羽髓样品；S3、S10为雌性样品，有两条带；S2、S5-9为雄性样品，只有一条带；
图3为加荧光染料在自然光下检测结果照片；CK，不加模板的对照；S1-4为检测的鸽子羽髓样品；S3为具有绿色荧光的为雌性样品；CK、S1、S2和S4为阴性对照及雄性样品为黄褐色；
图4为加荧光染料在紫外光下检测结果照片；CK，不加模板的对照；S1-4为检测的鸽子羽髓样品；S3为具有绿色荧光的为雌性样品；CK、S1、S2和S4为阴性对照及雄性样品为黄褐色；
图5为样品S1-4LAMP反应的凝胶电泳图；M:DNA分子量标准D2000 DNA Marker；CK，不加模板的对照；S1-4为检测的鸽子羽髓样品，S3为雌性样品有梯状条带，S1、S2、S4为雄性样品无扩增条带。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的一种快速检测鸽子性别的引物，所述的引物为LAMP引物，其序列为：
上游外引物FIP序列
CCAGTCTTTTCCTGTATGTAAAATTAAGAAGCCTTGATCTTTACCA；
上游内引物BIP序列
CTGATGAATTAGAAAGATGAAGTGTCAAAACAACTGAGGGGGT；
下游外引物F3序列CAGGTGAGAATTTTTCTGGTA；
下游外引物B3序列AGCAACTTTAATTCTCAATTGC。
具体实施方式二：本实施方式的试剂盒为含有上述引物的试剂盒。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：所述的试剂盒还包括鸽子羽髓DNA的快速提取液、LAMP反应液和显色剂、阳性对照模板DNA和去离子水。其它与具体实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二不同的是：所述的鸽子羽髓DNA的快速提取液由Tris-buffer、DTT和蛋白酶K构成。其它与具体实施方式二相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二不同的是：所述的显色剂为钙黄绿素荧光染料。其它与具体实施方式二相同。
具体实施方式六：本实施方式的试剂盒用于检测鸽子性别，以及鉴定含Z和W染色体的鸟类和禽类的雌雄性别。
具体实施方式七：本实施方式一种快速检测鸽子性别的方法，它是按照以下步骤进行的：
一、提取鸽子羽髓样品的总DNA，作为LAMP反应模板；
二、使用如权利要求2所述试剂盒，构建LAMP反应体系；
三、步骤二所述的LAMP反应体系的模板包括LAMP反应模板、阳性对照DNA模板和去离子水作为阴性对照模板；
四、将步骤二的LAMP反应体系，置于60～65℃水浴中，反应60～120分钟，得到反应液；
五、对步骤四的反应液在80～100℃处理10分钟，灭活Bst DNA聚合酶；
六、向步骤五处理后的反应液中加入显色剂，进行检测结果判定：若为绿色，则待测样品性别为雌性；若为桔黄色，则待测样品性别为雄性。
本实施方式所述的显色剂为钙黄绿素荧光染料。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式七不同的是：步骤一提取鸽子羽髓样品的总DNA的操作如下：
将鸽子羽髓样品加入到装有100μL鸽子羽髓DNA的快速提取液的eppendorf管中，然后加热至56℃保持30分钟，期间震荡2次；再升温至100℃保持8分钟，期间震荡1次，提取总DNA，并作为LAMP反应模板。
其它与具体实施方式七相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式七不同的是：步骤二的LAMP反应体系为20μL，包括：
2×LAMP Mix反应缓冲液10μL，引物混合物4μL，FIP、BIP引物终浓度0.8μM，F3、B3引物终浓度0.2μM，8U/μL Bst DNA聚合酶1.5μL，25mM MgCl2 3μL，模板2μL。
其它与具体实施方式七相同。
具体实施方式十：本实施方式一种快速检测鸽子性别的方法，它是按照以下步骤进行的：
一、提取鸽子羽髓样品的总DNA，作为LAMP反应模板；
二、使用如权利要求2所述试剂盒，构建LAMP反应体系；
三、步骤二所述的LAMP反应体系的模板包括LAMP反应模板、阳性对照DNA模板和去离子水作为阴性对照模板；
四、将步骤二的LAMP反应体系，置于60～65℃水浴中，反应60～120分钟，得到反应液；
五、对步骤四的反应液在80～100℃处理10分钟，灭活Bst DNA聚合酶；
六、对步骤五处理后的反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果判定：若电泳结果为梯状条带，则待测样品性别为雌性；若电泳结果为无条带，则待测样品性别为雄性。
本实施方式所述的显色剂为钙黄绿素荧光染料。
具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式十不同的是：步骤一提取鸽子羽髓样品的总DNA的操作如下：
将鸽子羽髓样品加入到装有100μL鸽子羽髓DNA的快速提取液的eppendorf管中，然后加热至56℃保持30分钟，期间震荡2次；再升温至100℃保持8分钟，期间震荡1次，提取总DNA，并作为LAMP反应模板。
其它与具体实施方式十相同。
具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式十不同的是：步骤二的LAMP反应体系为20μL，包括：
2×LAMP Mix反应缓冲液10μL，引物混合物4μL，FIP、BIP引物终浓度0.8μM，F3、B3引物终浓度0.2μM，8U/μL Bst DNA聚合酶1.5μL，25mM MgCl2 3μL，模板2μL。
其它与具体实施方式十相同。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1本发明的快速检测鸽子性别的试剂盒的制备
羽髓DNA提取缓冲液，按照以下配方配制：10mM Tris.HCl，pH＝9.0；50mM KCl，0.1％Triton-X；0.1M DTT；1g/L Proteinase K；
快速检测鸽子性别的试剂盒LAMP引物：
外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；外引物B3，其核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；内引物BIP,其核苷酸序列如SEQID No.4所示。其中外引物F3和外引物B3的浓度为1μM，内引物FIP和内引物BIP的浓度为4μM。
LAMP反应液购自北京天恩泽基因科技有限公司。
钙黄绿素荧光染料购自上海笛柏生物科技有限公司，配制成浓度为500μM，检测时加1μL至终浓度为25μM。
PCR扩增引物参照张莉等人的方法(张莉，单达聪，刘彦，潘裕华.通过CHD基因快速鉴定鸽子性别方法的研究[J].中国畜牧兽医,2016,43(5):1379－1384,详细引物序列见序列表SEQ.ID.No.5,No.6。
实施例2羽髓DNA的快速提取
将鸽子1～2支鸽子羽髓样品加入到由1×Tris-buffer、100mM DTT、1mg/mL蛋白酶K组成的100μL快速提取液的eppendorf管中，56℃下保持30分钟，期间震荡2次，接着100℃8分钟，期间震荡1次，短暂离心后作为DNA模板。
快速检测鸽子性别的试剂盒LAMP反应体系的建立。
LAMP反应体系为20μL，包括：2×LAMP Mix反应缓冲液10μL；引物混合物4μL，FIP、BIP引物终浓度0.8μM，F3、B3引物终浓度0.2μM；8U/μL Bst DNA聚合酶1.5μL；25mM MgCl2 3μL；DNA模板2μL，反应条件为60℃水浴反应120分钟，80℃保温10分钟，得到反应液。
LAMP结果电泳检测，取5μL扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶(加入Topred荧光染料)在1×TAE电泳缓冲液和120V电压条件下电泳30-40min，电泳完成后将凝胶放置于荧光成像系统下观察，阳性扩增产物有阶梯状扩增条带，阴性对照无扩增条带，检测的雌性样品有阶梯状扩增条带，雄性样品无扩增条带。
钙黄绿素荧光染料检测LAMP扩增产物
LAMP反应产物电泳检测后，取10μL PCR产物加入钙黄绿素荧光染料1μL，混匀，放置5min后，自然光下阳性和雌性样品显示绿色，阴性和雄性样品显示紫黄色(如图3所示)；置于紫外灯下观察结果，结果如图4所示，图4显示阳性和雌性样品的扩增产物在紫外灯下显示亮绿色荧光，阴性对照和雄性样品保持染料本身颜色淡黄色。
常规PCR法对快速检测鸽子性别的试剂盒及其检测方法的验证
常规PCR反应体系为20μL，包括：10μL 2×MasterMix(购自北京康为世纪生物科技有限公司)，2μL羽髓DNA提取液作模板，正反向引物各1μL，6μL去离子水。95℃预变性3min，然后94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸60s，如此共30个循环，最后72℃继续延伸7min，反应结束。
凝胶电泳分析，取5μL的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若样品只有一条700bp左右的条带，则为雄性；若样品除了一条700bp左右的条带还有一条长约400bp的条带，则为雌性。
结果如图5所示，图5结果显示，所检测样品的常规PCR法和快速检测鸽子性别的试剂盒检测法的雌雄性别鉴定一致。
序列表
<110> 无锡微色谱生物科技有限公司
<120> 一种快速检测鸽子性别的引物及其试剂盒和应用以及检测方法
<160> 6
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>外引物F3。
<400> 1
CAGGTGAGAA TTTTTCTGGT A 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>外引物B3。
<400> 2
AGCAACTTTA ATTCTCAATT GC 22
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>内引物FIP。
<400> 3
CCAGTCTTTTCCTGTATGTAAAATTAAGAAGCCTTGATCTTTACCA 46
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>内引物BIP。
<400> 4
CTGATGAATTAGAAAGATGAAGTGTCAAAACAACTGAGGGGGT 43
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>正向引物F。
<400> 5
GTTACTGATTCGTCTACGAGA 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>反向引物R。
<400> 6
ATTGAAATGATCCAGTGCTTG 21

Claims (10)

1.一种快速检测鸽子性别的引物，其特征在于所述的引物为LAMP引物，其序列为：
上游外引物FIP序列
CCAGTCTTTTCCTGTATGTAAAATTAAGAAGCCTTGATCTTTACCA；
上游内引物BIP序列
CTGATGAATTAGAAAGATGAAGTGTCAAAACAACTGAGGGGGT；
下游外引物F3序列CAGGTGAGAATTTTTCTGGTA；
下游外引物B3序列AGCAACTTTAATTCTCAATTGC。
2.含有权利要求1所述引物的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒还包括鸽子羽髓DNA的快速提取液、LAMP反应液和显色剂、阳性对照模板DNA和去离子水。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述的鸽子羽髓DNA的快速提取液由Tris-buffer、DTT和蛋白酶K构成。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述的显色剂为钙黄绿素荧光染料。
6.如权利要求2所述的试剂盒应用，其特征在于它用于检测鸽子性别，以及鉴定含Z和W染色体的鸟类和禽类的雌雄性别。
7.一种快速检测鸽子性别的方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：
一、提取鸽子羽髓样品的总DNA，作为LAMP反应模板；
二、使用如权利要求2所述试剂盒，构建LAMP反应体系；
三、步骤二所述的LAMP反应体系的模板包括LAMP反应模板、阳性对照DNA模板和去离子水作为阴性对照模板；
四、将步骤二的LAMP反应体系，置于60～65℃水浴中，反应60～120分钟，得到反应液；
五、对步骤四的反应液在80～100℃处理10分钟，灭活Bst DNA聚合酶；
六、向步骤五处理后的反应液中加入显色剂，进行检测结果判定：若为绿色，则待测样品性别为雌性；若为桔黄色，则待测样品性别为雄性。
8.根据权利要求7所述的一种快速检测鸽子性别的方法，其特征在于步骤一提取鸽子羽髓样品的总DNA的操作如下：
将鸽子羽髓样品加入到装有100μL鸽子羽髓DNA的快速提取液的eppendorf管中，然后加热至56℃保持30分钟，期间震荡2次；再升温至100℃保持8分钟，期间震荡1次，提取总DNA，并作为LAMP反应模板。
9.根据权利要求7所述的一种快速检测鸽子性别的方法，其特征在于步骤二的LAMP反应体系为20μL，包括：
2×LAMP Mix反应缓冲液10μL，引物混合物4μL，FIP、BIP引物终浓度0.8μM，F3、B3引物终浓度0.2μM，8U/μL Bst DNA聚合酶1.5μL，25mM MgCl2 3μL，模板2μL。
10.一种快速检测鸽子性别的方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：
一、提取鸽子羽髓样品的总DNA，作为LAMP反应模板；
二、使用如权利要求2所述试剂盒，构建LAMP反应体系；
三、步骤二所述的LAMP反应体系的模板包括LAMP反应模板、阳性对照DNA模板和去离子水作为阴性对照模板；
四、将步骤二的LAMP反应体系，置于60～65℃水浴中，反应60～120分钟，得到反应液；
五、对步骤四的反应液在80～100℃处理10分钟，灭活Bst DNA聚合酶；
六、对步骤五处理后的反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果判定：若电泳结果为梯状条带，则待测样品性别为雌性；若电泳结果为无条带，则待测样品性别为雄性。
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CN109913556A (zh) * 2019-01-08 2019-06-21 北京市农林科学院 一种用于快速鉴定鸽性别的引物、试剂盒及其方法
CN111500530A (zh) * 2020-04-30 2020-08-07 延安大学 一种通用型动物精子分选方法及x精子质控方法
CN112094887A (zh) * 2019-06-17 2020-12-18 南京尧顺禹生物科技有限公司 一种可实用于大规模鸽子性别鉴定的基因识别优化方法

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