CN101845493A

CN101845493A - 一种志贺氏菌的检测用引物及检测方法

Info

Publication number: CN101845493A
Application number: CN201010105741A
Authority: CN
Inventors: 钟青萍; 王丽; 陈红远; 廖振林; 方祥
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2010-01-29
Filing date: 2010-01-29
Publication date: 2010-09-29

Abstract

本发明公开了一种志贺氏菌的检测用引物及检测方法。本发明志贺氏菌的检测用引物的序列如SEQ ID NO：1～4所示。本发明志贺氏菌的检测方法包括如下步骤：(1)提取DNA作为模板；(2)环介导等温扩增反应体系为：模板2μL、引物各1μL、Bst DNA聚合酶1μL、扩增反应液7.5～12.5μL，加水至25μL的反应体系，63～65℃恒温反应1～1.5h；然后置于80℃下2～10min，终止反应；(3)结果观察：用肉眼观察到检测管出现浑浊为志贺氏菌阳性，无浑浊为阴性。本发明利用引物进行环介导等温扩增反应来检测志贺氏菌，不需要特殊设备，可快速检测样品中的痢疾志贺氏菌基因，具有特异性、灵敏度高，鉴定方法简易的优点。

Description

一种志贺氏菌的检测用引物及检测方法

技术领域

本发明涉及一种基于环介导等温扩增检测食源性病原菌的方法，具体涉及一种志贺氏菌的检测用引物及检测方法。

背景技术

志贺氏菌属(Shigella)的细菌(通称痢疾杆菌)，是细菌性痢疾的病原菌。临床上能引起痢症状的病原生物很多，有志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌、大肠杆菌等，还有阿米巴原虫、鞭虫、以及病毒等均可引起人类痢疾，其中以志贺氏菌引起的细菌性痢疾最为常见。人类对志贺氏菌有很高的易感性，在幼儿可引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。

目前，传统志贺氏菌的常规检验检验程序：样品→增菌→分离培养(并作菌数测定)→分离纯化→革兰染色镜检/生化及菌落观察/生化反应试验/肠毒素检查。整个检测程序复杂，步骤繁琐，需要3～5d完成，检测时间长，检出限为10⁴CFU/mL。已经愈来愈跟不上人类对致病微生物微量、快速、简易、高特异性的鉴定要求。因此，在分子生物学水平上来研究这些病原菌的核酸结构和分子特征将对样品中微量和非可培养状态的病原微生物进行正确地鉴定非常适用，以大大提高对病原菌的检测和研究能力。目前，在病原菌的分子生物学检测技术中，核酸扩增法是最有效的方法之一。

在食品病原菌检测这一领域中，聚合酶链式反应(PCR)方法是至今使用得最广泛的核酸扩增方法，尽管它作为一种简便高效的基因扩增技术在病原菌检测中发挥着重大作用，且具有操作简单易行的优点，但在操作过程中必须有高精密的温度循环装置，从而使得其在推广应用中难以在基层普及而受到限制。以检测核酸为基础的其他分子生物学技术如：核酸等温扩增法(nucleic acidsequence-based amplification，NAS-BA)、自序列复制法(self-sustained sequencereplication，3SR)和链置换扩增法(strand displacement amplification，SDA)等相继出现。虽然它们的检测灵敏度大大提高，但是它们对目标序列的扩增特异性不强，使得扩增后还需要详尽的实验操作手段来检测扩增产物。而近年来，全球流行病趋势表明，致病微生物越来越以微小多变甚至是分子的形式穿越人类空间，难培养、非可培养的病原微生物已经成为传染性和感染性疾病的主要根源。所以，及时将生物技术发展的最新成果应用于病原微生物检测，具有重要意义。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是2000年Notomi等开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，利用4条不同的特异性引物识别靶基因的6个独立区域，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，靶DNA序列大量交替重复产生，从而使靶基因高效扩增，在15～60min扩增数量级可达10⁹，特异性高，所有靶基因序列的检测可只通过扩增产物的有、无来判别。有、无扩增反应是利用荧光定量PCR仪检测反应的荧光强度或利用核酸扩增过程中产生的焦磷酸镁沉淀肉眼来判定的。LAMP技术克服以往基因扩增方法的不足，在等温条件下能够特异性、高效、快速地进行核酸的扩增，不需特殊的仪器，具有很多的优越性。

发明内容

本发明的目的在于根据现有技术中存在的食源性致病菌检测程序复杂、步骤繁琐的问题，提供一种操作步骤简单，可快速检测出志贺氏菌的引物。

本发明还有一个目的在于提供一种使用上述引物检测志贺氏菌的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

一种志贺氏菌检测用引物，可以扩增靶基因的特异碱基序列，所述靶基因为志贺氏菌的ipaH-GenBank，登录号为M32063，所述引物与靶基因的1075～1267bp位的核酸序列的片段或片段的互补链互补。

本发明所述引物如SEQ ID NO：1～4所示，其中，序列为SEQ ID NO：1的引物扩增片段为1075～1093bp；序列为SEQ ID NO：2的引物扩增片段为1248～1267bp；序列为SEQ ID NO：3的引物扩增片段为1135～1154bp的互补序列及1094～1111bp；序列为SEQ ID NO：4的引物扩增片段为1165～1184bp和1209～1227bp的互补序列。

本发明利用上述引物对志贺氏菌进行检测的方法包括如下步骤：

(1)提取DNA作为模板；

(2)环介导等温扩增反应体系为：模板2μL、引物各1μL、Bst DNA聚合酶1μL、扩增反应液7.5～12.5μL，加水至25μL的反应体系，63～65℃恒温反应1～1.5h；然后置于80℃下2～10min，终止反应；

(3)结果观察：用肉眼观察到检测管出现浑浊为志贺氏菌阳性，无浑浊为阴性；或在检测管中加入核酸染料，置于320nm紫外光下观察，检测管为绿色的是志贺氏菌阳性，黄色的是阴性；或取3～5μL反应物，进行琼脂糖凝胶电泳，电泳图谱显示有产物特征阶梯状条带的为志贺氏菌阳性，反之为阴性。

其中，步骤(2)中所述扩增反应液包括10×聚合酶反应缓冲液、10mmol/LdNTP、150mmol/L MgSO₄，体积比为2.5∶4∶1。

上述扩增反应液的配方，也可以是包括10×聚合酶反应缓冲液、10mmol/LdNTP、150mmol/L MgSO₄和5mol/L Betaine，其体积比为2.5∶4∶1∶0.5～5。

作为一种优选方案，步骤(3)中所述核酸染料为SYBR Green I、Goldview或EB替代物。

作为一种优选方案，本发明检测方法步骤可以如下：

(1)被检样品的预处理：将细胞悬浮于无菌生理盐水中，10000～12000r/min离心2～3min，去掉上清，然后用无菌生理盐水洗涤细胞2～3次，风干；

(2)模板的制备：在上述得到的细胞样品中加入50μL ddH₂O，充分混匀后，于100℃沸水浴10min，冰浴5min，4℃12000r/min离心5min，上清液即为DNA模板；或者在上述得到的细胞样品中依次加入TE 567μL，10wt％SDS30μL和20mg/mL蛋白酶K 3μL，于37℃温育1h，加入5mol/L NaCl 100μL，CTAB/NaCl溶液80μL，于65℃温育10min，加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，离心5min。上清液转入一个新管并加等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，离心5min，上清液再转入一只新管中，加入50μL的醋酸钠，1mL无水乙醇，轻轻混匀，于-20℃下沉淀过夜，然后离心5min，弃上清，加入70wt％乙醇洗涤1min，离心，弃上清，将沉淀的DNA风干完全后，溶于ddH₂O中；

(3)环介导等温扩增(LAMP)反应：取上述模板2μL、引物各1μL、BstDNA聚合酶1μL(8U)、扩增反应液7.5～12.5μL，加水至25μL的反应体系，63～65℃恒温反应1～1.5h；然后置于80℃下2～10min，终止反应；

(4)结果观察：用肉眼观察到反应检测管出现明显浑浊为阳性，无浑浊为阴性；或在各检测管中加入1～2μL的核酸染料后，置于320nm的紫外光下观察，观察到检测管为绿色者为阳性，黄色者为阴性；或取3～5μL的反应物于2wt％的琼脂糖凝胶，75V电泳50～70min，电泳图谱显示LAMP产物的特征阶梯状条带。

在检测时，可以设置阳性对照组和阴性对照组，阳性对照组为痢疾志贺氏菌基因组DNA，阴性对照组为无菌去离子水。

附图说明

图1为SYBR Green I检测LAMP扩增产物，其中，1为阴性对照，2为阳性对照，3为志贺氏菌液；

图2为通过白色沉淀检测LAMP扩增反应，其中，1为阴性对照，2为阳性对照，3为志贺氏菌液；

图3为LAMP扩增产物的电泳图，其中，M为DL marker 2000，1为阴性对照，2为阳性对照，3为志贺氏菌液；

图4为LAMP检测志贺氏菌的灵敏度实验，其中，M为DL marker 2000，1为阴性对照，2为1.0×10⁹cfu/mL；3为1.0×10⁸cfu/mL；4为1.0×10⁷cfu/mL；5为1.0×10⁶cfu/mL；6为1.0×10⁵cfu/mL；7为1.0×10⁴cfu/mL；8为1.0×10³cfu/mL；9为1.0×10²cfu/mL；10为1.0×10¹cfu/mL；11为1.0cfu/mL；12为0.10cfu/mL。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1

利用环介导恒温基因扩增检测志贺氏菌，按照以下步骤进行：

(1)被检样品的预处理

将被检样品悬浮于无菌生理盐水中，10000r/min离心3min，去掉上清，然后用无菌生理盐水洗涤细胞2次，风干；

(2)模板的制备

在上述得到的细胞样品中加入50μL ddH₂O，充分混匀后，于100℃沸水浴10min，冰浴5min，4℃12000r/min离心5min，上清液即为DNA模板。

(3)环介导等温扩增(LAMP)反应

取上述模板2μL、引物各1μL、Bst DNA聚合酶1μL(8U)、扩增反应液7.5～12.5μL，加水至25μL的反应体系，65℃恒温反应1.5h；然后置于80℃下10min，终止反应。

所用引物如SEQ ID NO：1～4所示。所用扩增反应液为10mmol/L dNTP 4μL，10×聚合酶反应缓冲液2.5μL，150mmol/L MgSO₄1μL，5mol/L Betaine 5μL。

所用阳性对照为志贺氏菌基因组DNA，阴性对照液为无菌去离子水。

(4)结果观察

用肉眼观察到反应检测管出现明显浑浊为阳性，无浑浊为阴性。

实施例2

从食品样品中检测志贺氏菌，按以下步骤进行：

(1)被检样品的预处理

取样品25g加入到225mL的GN增菌液中，于组织捣碎机中匀浆，制成匀浆液。将此匀浆液10倍倍比稀释，各取1mL为样品。

(2)模板的制备

将上述样品分别于100℃沸水浴10min，冰浴5min，4℃12000r/min离心5min，上清液即为DNA模板。

(3)环介导等温扩增(LAMP)反应：

取上述模板2μL、引物各1μL、Bst DNA聚合酶1μL(8U)、扩增反应液7.5μL，加水至25μL的反应体系，63℃恒温反应1h；然后置于80℃下2min，终止反应。

所用引物如SEQ ID NO：1～4所示；所用扩增反应液为10mmol/L dNTP 4μL，10×聚合酶反应缓冲液2.5μL，150mmol/L MgSO₄ 1μL。

(4)结果观察

在各检测管中加入1μL的核酸染料后，置于320nm的紫外光下观察，观察到检测管为绿色者为阳性，黄色者为阴性。

一种志贺氏菌的检测用引物及检测方法序列表

SEQUENCE LISTING

<110>华南农业大学

<120>一种志贺氏菌的检测用引物及检测方法

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gttccttgac cgcctttcc 19

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gagggttttc cggagattgt 20

<210>3

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tttccagcca tgcagcgacc gataccgtct ctgcacgc 38

<210>4

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ctctgcggag cttcgacagc tcctcacagc tctcagtgg 39

Claims

1.一种志贺氏菌的检测用引物，其特征在于所述引物与志贺氏菌ipaH基因的1075～1267bp位的核酸序列的片段或片段的互补链互补。

2.根据权利要求1所述志贺氏菌的检测用引物，其特征在于所述引物序列如SEQ ID NO：1～4所示。

3.根据权利要求2所述志贺氏菌的检测用引物，其特征在于序列为SEQ IDNO：1的引物扩增片段为1075～1093bp；序列为SEQ ID NO：2的引物扩增片段为1248～1267bp；序列为SEQ ID NO：3的引物扩增片段为1135～1154bp的互补序列及1094～1111bp；序列为SEQ ID NO：4的引物扩增片段为1165～1184bp和1209～1227bp的互补序列。

4.使用权利要求1～3中任意一条权利要求所述引物检测志贺氏菌的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)提取DNA作为模板；(2)环介导等温扩增反应体系为：模板2μL、引物各1μL、Bst DNA聚合酶1μL、扩增反应液7.5～12.5μL，加水至25μL的反应体系，63～65℃恒温反应1～1.5h；然后置于80℃下2～10min，终止反应；(3)结果观察：用肉眼观察到检测管出现浑浊为志贺氏菌阳性，无浑浊为阴性；或在检测管中加入核酸染料，置于320nm紫外光下观察，检测管为绿色的是志贺氏菌阳性，黄色的是阴性；或取3～5μL反应物，进行琼脂糖凝胶电泳，电泳图谱显示有产物特征阶梯状条带的为志贺氏菌阳性，反之为阴性。

5.根据权利要求4所述检测志贺氏菌的方法，其特征在于步骤(2)中所述扩增反应液包括10×聚合酶反应缓冲液、10mmol/L dNTP、150mmol/L MgSO₄，三者的体积比为2.5∶4∶1。

6.根据权利要求5所述检测志贺氏菌的方法，其特征在于步骤(2)中所述扩增反应液包括10×聚合酶反应缓冲液、10mmol/L dNTP、150mmol/L MgSO₄和5mol/L Betaine，其体积比为2.5∶4∶1∶0.5～5。

7.根据权利要求4所述检测志贺氏菌的方法，其特征在于步骤(3)中所述核酸染料为SYBR Green I、Goldview或EB替代物。