CN101348835B - 一种利用环介导等温扩增技术检测创伤弧菌的试剂盒 - Google Patents
一种利用环介导等温扩增技术检测创伤弧菌的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种利用环介导等温扩增(LAMP)技术检测创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的试剂盒和检测方法，属于病原菌诊断领域。主要技术方案是利用LAMP技术，针对创伤弧菌毒性相关基因(virulence-correlated gene)的六个区域，设计四条高特异性引物，达到特异性检测创伤弧菌的目的。与传统方法相比，该方法所需设备和操作步骤简单，而且具有快速，高特异性，稳定性强以及灵敏度高等优点，检测成本较低，适合普通诊所和野外检验。
Description
技术领域
本发明属于病原菌诊断领域，主要内容是通过用环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification LAMP)技术特异性扩增毒性相关基因(virulence-correlatedgene)，对致病性创伤弧菌(Vibrio vulnificus)进行快速检测。在等温条件(62℃左右)保温几十分钟即可达到区分创伤弧菌(Vibrio vulnificus)和相似致病菌的目的。能够大大提高环境检测及临床检测创伤弧菌的效率。
背景技术
创伤弧菌是一种自然分布于海洋环境中的低度嗜盐菌，可以从近岸海水、贝类等海产品中分离得到。美国、日本、以色列和我国均有相当数量的创伤弧菌感染病例。它能引起多种感染，主要临床表现有败血症、伤口感染、急性肠胃炎等，并且具有较高的致死率，可高达50％以上。目前随着渔业和滨海旅游业的发展以及海产品消费的增多，快速准确地检测致病性创伤弧菌的存在状况变得越来越重要。
目前，检测创伤弧菌的存在状况使用最多的是生化培养法。但是在某些环境条件下比如低温、营养匮乏等，致病弧菌有可能以不能被培养的方式存在，仍然具有致病潜能。所以，用培养条件检测致病弧菌的方法并不全面。聚合酶链式反应方法近年来也有所发展，与生化培养方法相比具有较高的灵敏度。但是由于创伤弧菌主要分布于海产品和海水，检测样本中不可避免地存在聚合酶链式反应抑制剂，常常能够导致检测的错误。所以发展一种快速可靠和高灵敏度监测试剂盒非常有必要。环介导等温扩增技术和聚合酶链式反应相比具有更高的灵敏度和可靠性，并且反应时间短，操作简单，是研发创伤弧菌快速检测试剂盒的良好技术基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种创伤弧菌环介导等温扩增快速检测试剂盒和检测方法。运用环介导等温扩增技术检测创伤弧菌的方法，能够提高检测效率和检测的准确度，本发明针对毒性相关基因的6个区域设计4种特异引物，具有极高的特异性和灵敏度。检测时间只需2个小时左右。此外，由于本检测方法和所需设备简单，因此还可用于野外实地检测。
1.试剂盒成分
为了解决该致病菌常规检测方法效率低下的问题，本发明是通过利用一种创伤弧菌环介导等温扩增快速检测试剂盒而实现的，它的成分和浓度如下：
1)特异性寡核苷酸引物：vvFIP、vvBIP、vvF3、vvB3(各引物浓度均为5-15μmol/L)
vvFIP：5’GCGCTAATGCGAGGAGTGAGCTTTCAAATAGGAGCCGCCGATTGC3’
vvBIP：5’TCTATGAGTTATCGGGGCTCATTTGCTAGTTAAAGCCGTCCAGTCG3’
vvF3：5’TCGCCTTTCTCAGTGTTGGAG3’
vvB3：5’TACGCTCTTAACCGTATCGTA3’
2)DNA提取试剂：TE缓冲液(5-15mmol/LTris，0.5-1.5mmol/L EDTA，pH8.0)；十二烷基磺酸钠(浓度10％)；蛋白酶K溶液(浓度10-20mg/mL，pH8.0)；Tris饱和酚(pH8.0)；乙酸钠(浓度2-5mol/L)；乙醇(浓度95％)。
3)环介导等温扩增体系：
10×反应缓冲液(200mmol/L Tris-HCl(pH8.8)，100mmol/L KCl，100mmol/L(NH4)2SO4，20mmol/L MgSO4，1％Triton X-100)
4)dNTPs(dATP，dTTP，dCTP，dGTP的混合物，每种浓度为5-15mmol/L)。
5)双蒸水。
6)Bst DNA聚合酶(8u/μL)
2.试剂盒使用方法
1)DNA抽提
挑取疑似菌落加入到0.4mL TE缓冲液(pH8.0)中振荡混匀。加入40μL十二烷基磺酸钠(10％)，加蛋白酶K溶液10μL于55℃保温1-2小时，加同体积Tris饱和酚(pH8.0)，强烈振荡，8000转/分离心3分钟，取上清液，重复酚抽提；取上清液，加入0.1倍体积的乙酸钠(3mol/L)，混匀，再加等体积的冰乙醇，混匀后低温静置30分钟，12000转/分离心5分钟，弃上清，加70％冷乙醇洗涤一次，室温下12000转/分离心5分钟，弃上清，加入50μL TE溶液，置-20℃保存。
2)环介导等温扩增(LAMP)
在PCR试剂管内加入下列试剂，使总体积为25μL：
10×反应缓冲液(2.5μL)
(200mmol/L Tris-HCl(pH8.8)，100mmol/L KCl，100mmol/L(NH4)2SO4，20mmol/LMgSO4，1％TritonX-100)
Bst DNA聚合酶 8U(1μL)
vvFIP 40pmol(4μL)
vvBIP 40pmol(4μL)
vvF3 5pmol(0.5μL)
vvB3 5pmol(0.5μL)
dNTPs 每种80nmol/L(10mmol/L0.5μL)
DNA样品 50ng(2μL)
双蒸水 10μL
LAMP扩增程序：①将模板DNA95℃变性5分钟，立即插到冰上；②62℃保持60分钟；③80℃保持2分钟。
3)电泳检查
LAMP产物用2.0％琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙啶染色，电泳结果在紫外分析仪下观察，阳性结果应是呈梯状分布的条带，且间距为50bp左右。
本发明利用创伤弧菌毒性相关基因的特异性，通过六个区域设计四对特异性引物，扩增出容易判断的梯状条带，在已试验的60个其它致病细菌中均未发现假阳性结果。
本发明与现有技术相比的优点在于：基于DNA的鉴定方法适用于直接从患者含菌海产品、海水、患者组织等样品中直接运用环介导等温扩增方法扩增特异性靶基因，从而检测创伤弧菌。LAMP方法具有检测准确、特异性强，操作方便，设备简单的特点，可以快速、准确地鉴定特异的目标细菌。它用环介导等温扩增方法扩增细菌特异性靶基因，避免了反复培养，冗长的一系列生化反应，节约时间，劳动力和成本。LAMP鉴定方法不受培养条件和细菌生理状态的影响，较生理生化鉴定方法更为准确，能够排除一些生理生化鉴定方法不能排除的干扰菌。
附图说明
附图：引物特异性测试图和海水样本检测结果图
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述。
实施例1：海水样本1
1.DNA抽提
挑取疑似海水分离菌落加入到0.4mL TE缓冲液(pH8.0)中振荡混匀。加入40μL十二烷基磺酸钠(10％)，再加入蛋白酶K溶液10μL于55℃保温1-2小时。加同体积Tris饱和酚(pH8.0)，强烈振荡，8000转/分离心3分钟，取上清液，重复酚抽提。取上清液，加入0.1倍体积的乙酸钠(3mol/L)，混匀，再加等体积的冰乙醇，混匀后低温静置30分钟，12000转/分离心5分钟，弃上清，加70％冷乙醇洗涤一次，室温下12000转/分离心5分钟，弃上清，加入50μL TE溶液，置-20℃保存。
2)环介导等温扩增(LAMP)
在扩增管内加入下列试剂，使总体积为25μL：
成分 体系中各组分终浓度和体积
10×反应缓冲液 (2.5μL)
(200mmol/L Tris-HCl(pH8.8)，100mmol/L KCl，100mmol/L(NH4)2SO4，20mmol/LMgSO4，1％Triton X-100)
Bst DNA聚合酶 8U(1μL)
vvFIP 40pmol(4μL)
vvBIP 40pmol(4μL)
vvF3 5pmol(0.5μL)
vvB3 5pmol(0.5μL)
dNTPs 每种80nmol/L(10mmol/L0.5μL)
DNA样品 50ng(2μL)
双蒸水 10μL
LAMP扩增程序：①将模板DNA95℃变性5分钟，立即插到冰上；②62℃保持60分钟；③80℃保持2分钟。
3.被检测样品目的LAMP扩增和电泳检查
LAMP产物用2.0％琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙啶染色。电泳结果在紫外分析仪下观察，阳性结果应是呈梯状分布的条带。且间距为50bp左右(附图，泳道2)。
附图中各个泳道表示的样本如下
1，8：分子量maker
2：创伤弧菌海水分离株
3：创伤弧菌临床分离株1
4：创伤弧菌临床分离株2
5：副溶血弧菌
6：弗尼斯弧菌
7：拟态弧菌
实施例2：临床分离株样本1
1.DNA抽提
挑取菌落加入到0.4mL TE缓冲液(pH8.0)中振荡混匀。加入40μL十二烷基磺酸钠(10％)，再加入蛋白酶K溶液10μL于55℃保温1-2小时。加同体积Tris饱和酚(pH8.0)，强烈振荡，8000转/分离心3分钟，取上清液，重复酚抽提。取上清液，加入0.1倍体积的乙酸钠(3mol/L)，混匀，再加等体积的冰乙醇，混匀后低温静置30分钟，12000转/分离心5分钟，弃上清，加70％冷乙醇洗涤一次，室温下12000转/分离心5分钟，弃上清，加入50μLTE溶液，置-20℃保存。
2)环介导等温扩增(LAMP)
在PCR试剂管内加入下列试剂，使总体积为25μL：
10×反应缓冲液 (2.5μL)
(200mmol/L Tris-HCl(pH8.8)，100mmol/L KCl，100mmol/L(NH4)2SO4，20mmol/LMgSO4，1％Triton X-100)
Bst DNA聚合酶 8U(1μL)
vvFIP 40pmol(4μL)
vvBIP 40pmol(4μL)
vvF3 5pmol(0.5μL)
vvB3 5pmol(0.5μL)
dNTPs 每种80nmol/L(10mmol/L0.5μL)
DNA样品 50ng(2μL)
双蒸水 10μL
LAMP扩增程序：①将模板DNA95℃变性5分钟，立即插到冰上；②62℃保持60分钟；③80℃保持2分钟。
3.被检测样品目的LAMP扩增和电泳检查
LAMP产物用2.0％琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙啶染色。电泳结果在紫外分析仪下观察，阳性结果应是呈梯状分布的条带。且间距为50bp左右(附图，泳道3)。
实施例3：临床样本2
1.DNA抽提
挑取疑似菌落加入到0.4mL TE缓冲液(pH8.0)中振荡混匀。加入40μL十二烷基磺酸钠(10％)，再加入蛋白酶K溶液10μL于55℃保温1-2小时。加同体积Tris饱和酚(pH8.0)，强烈振荡，8000转/分离心3分钟，取上清液，重复酚抽提。取上清液，加入0.1倍体积的乙酸钠(3mol/L)，混匀，再加等体积的冰乙醇，混匀后低温静置30分钟，12000转/分离心5分钟，弃上清，加70％冷乙醇洗涤一次，室温下12000转/分离心5分钟，弃上清，加入50μLTE溶液，置-20℃保存。
2)环介导等温扩增(LAMP)
在PCR试剂管内加入下列试剂，使总体积为25μL：
10×反应缓冲液(2.5μL)
(200mmol/L Tris-HCl(pH8.8)，100mmol/L KCl，100mmol/L(NH4)2SO4，20mmol/LMgSO4，1％Triton X-100)
Bst DNA聚合酶 8U(1μL)
vvFIP 40pmol(4μL)
vvBIP 40pmol(4μL)
vvF3 5pmol(0.5μL)
vvB3 5pmol(0.5μL)
dNTPs 每种80nmol/L(10mmol/L0.5μL)
DNA样品 50ng(2μL)
双蒸水 10μL
LAMP扩增程序：①将模板DNA95℃变性5分钟，立即插到冰上；②62℃保持60分钟；③80℃保持2分钟。
3.被检测样品目的LAMP扩增和电泳检查
LAMP产物用2.0％琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙啶染色。电泳结果在紫外分析仪下观察，阳性结果应是呈梯状分布的条带。且间距为50bp左右(附图，泳道4)。
序列列表
SEQUENCE LISTING
<110>南开大学
<120>一种利用环介导等温扩增技术检测创伤弧菌的试剂盒
<130>20080816
<160>4
<170>PatentIn version3.3
<210>1
<211>45
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>primer_b ind
<222>(1)..(45)
<400>1
<210>2
<211>46
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(46)
<400>2
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(21)
<400>3
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(21)
<400>4
Claims (2)
1.一种利用环介导等温扩增技术检测创伤弧菌的试剂盒，其特征在于，它包括如下成分及各成分的作用浓度：
(1)特异性寡核苷酸引物：vvFIP、vvBIP、vvF3、vvB3，各引物浓度均为5-15μmol/L；
vvFIP：5’GCGCTAATGCGAGGAGTGAGCTTTCAAATAGGAGCCGCCGATTGC 3’
vvBIP：5’TCTATGAGTTATCGGGGCTCATTTGCTAGTTAAAGCCGTCCAGTCG 3’
vvF3：5’TCGCCTTTCTCAGTGTTGGAG 3’
vvB3：5’TACGCTCTTAACCGTATCGTA 3’
(2)DNA提取试剂：TE缓冲液，配方为5-15mmol/L Tris，0.5-1.5mmol/L EDTA，pH 8.0；10％十二烷基磺酸钠；10-20mg/mL蛋白酶K溶液，pH8.0；Tris饱和酚，pH8.0；2-5mol/L乙酸钠；95％乙醇；
(3)环介导等温扩增试剂管成分为：
10×反应缓冲液，配方为pH 8.8的200mmol/L Tris-HCl，100mmol/L KCl，100mmol/L(NH4)2SO4，20mmol/L MgSO4，1％Triton X-100；
(4)dNTPs，即dATP，dTTP，dCTP，dGTP的混合物，每种浓度为5-15mmol/L；
(5)双蒸水；
(6)8u/μL Bst DNA聚合酶。
2.按照权利要求1所述的一种利用环介导等温扩增技术检测创伤弧菌的试剂盒，其特征在于，该试剂盒检测使用方法如下：
(1)DNA抽提
挑取待检测菌落加入到0.4mL TE缓冲液中振荡混匀；加入40μL 10％十二烷基磺酸钠水溶液，加蛋白酶K溶液10μL于55℃保温1-2小时，加同体积Tris饱和酚，强烈振荡，8000转/分离心3分钟，取上清液，重复酚抽提；取上清液，加入0.1倍体积3mol/L的乙酸钠，混匀，再加等体积的冰乙醇，混匀后低温静置30分钟，12000转/分离心5分钟，弃上清，加70％冷乙醇洗涤一次，室温下12000转/分离心5分钟，弃上清，加入50μL TE溶液，置-20℃保存；
(2)环介导等温扩增，即LAMP
在PCR试剂管内加入下列试剂，使总体积为25μL：
PCR反应体系：
10×反应缓冲液 2.5μL
200mmol/L Tris-HCl，100mmol/L KCl，100mmol/L(NH4)2SO4，20mmol/L MgSO4，1％Triton X-100
Bst DNA聚合酶 8U 1μL
vvFIP 40pmol 4μL
vvBIP 40pmol 4μL
vvF3 5pmol 0.5μL
vvB3 5pmol 0.5μL
dNTPs 10mmol/L 0.5μL
DNA样品 50ng 2μL
双蒸水 10μL
LAMP扩增程序：
①将模板DNA 95℃变性5分钟，立即插到冰上；
②62℃保持60分钟；
③80℃保持2分钟；
(3)电泳检查
LAMP产物用2.0％琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙啶染色，电泳结果在紫外分析仪下观察，阳性结果应是呈梯状分布的条带，且间距为50bp左右。
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| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20110817 Termination date: 20120909 |