CN102827945A

CN102827945A - 一种水霉菌孢子检测试剂及检测方法

Info

Publication number: CN102827945A
Application number: CN2012103691746A
Authority: CN
Inventors: 吕利群; 王浩; 张楠
Original assignee: Shanghai Maritime University
Current assignee: Shanghai Maritime University; Shanghai Ocean University
Priority date: 2012-09-27
Filing date: 2012-09-27
Publication date: 2012-12-19

Abstract

本发明涉及菌类检测技术，提供的水霉菌检测试剂包括以下组分：(1)检测反应液：20mmol/L Tri-HCl；10mmol/L(NH₄)₂SO₄；10mmol/L KCL；0.1％Triton X-100；MgSO₄ 10mmol/L；dNTPs1mmol/L；Betaine0.6mmol/L；内引物FIP和内引物BIP1.5μmol/L、外引物F3和外引物B30.8μmol/L；8U BstDNA聚合酶大片段；(2)反应显色液：10％SYBR Green荧光染料/TAE缓冲液；(3)核酸裂解液，包括：核酸裂解溶液A：100mmol/L Tris HCl，pH9.0、40mmol/L EDTA，pH8.0；核酸裂解溶液B：10％SDS；核酸裂解溶液C：100％氯化苄。本发明方法简单、费用低、操作简便，检疫人员可在鱼塘附近进行现场采样操作。

Description

一种水霉菌孢子检测试剂及检测方法

技术领域

本发明涉及菌类检测技术，尤其涉及一种水霉菌孢子检测试剂及检测方法。

背景技术

水霉病(Saprolegniasis)，又叫肤霉病(Dermatomyucosis)，是淡水鱼类中最为常见的一种疾病。水霉菌是引起水生动物发生水霉病的主要病原，其适应温度范围广，分布范围亦很广，一年四季都可以引起鱼类发病。水霉菌隶属于卵菌纲中的水霉目(Saprolegniales)、霜霉目(Peronosporales)和芽枝菌目(Blaslociadiales)，其中水霉科(Saprolegniaceae)的水霉属(Saprolegnia)、绵霉属(Achlya)和丝囊霉属(Aphanomyces)最为常见，是鱼卵孵化、鱼类培育和成鱼养殖中主要的病原体。

水霉菌对宿主无严格的选择性，在水生动物的各个生长阶段均有发生，主要寄生在鱼体伤口和死卵上，危害养殖鱼类和降低鱼卵孵化率。在适当条件下，水霉菌丝发育为动孢子囊，动孢子囊内形成游动孢子，游动孢子逸出到水体中，当鱼类皮肤或鳃受到机械损伤及其他病原体的伤害时，鱼体抵抗力降低，水霉孢子在伤口处萌发并开始寄生。

水霉菌传统的检测方法主要是通过游动孢子释放形式、有性生殖、无性生殖、菌丝形态等进行鉴定，然而这些结构的形成需要较长时间的发育，因而形态学方法难以短时间准确鉴定分离得到的水霉菌株。随着分子生物学的快速发展，人们开始采用许多分子生物学手段，如DNA G+C mol％含量测定、蛋白电泳技术、DNA指纹(DNA，Fingerprinting)、核糖体rDNA内部转录间隔区(Internal Transcribed Spacer，ITS)、扩增多态性DNA(Randomamplification of polymorphic DNA，RAPD)等已有效的用于水霉菌的检测中。但由于上述手段均需要昂贵的仪器设备、繁琐的检测过程以及对检测人员较高的技术要求，而使其难以在基层普及推广。

环介导等温扩增(LAMP)技术(国际专利公开号WO00/28082)是Notomi等在2000年开发出的一种新的核酸扩增方法，即针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒温条件下即可完成核酸扩增反应。已经广泛应用于细菌、寄生虫和病毒的定性检测。该技术较常规PCR扩增方法提高了敏感性、特异性，并且具有操作简单、设备要求低、检测费用较少、等温高效的特点。目前尚未有本方案中检测水霉菌孢子或水霉菌菌丝团的检测方法和检测试剂盒。

因此本发明建立了检测水产养殖水体中水霉菌孢子或水霉菌丝团的检测方法和水产养殖水体中水霉菌孢子或水霉菌菌丝团的检测试剂。

发明内容

本发明的目的是要解决传统的水产养殖水体中水霉菌孢子或其菌丝团检测方法存在繁琐、费时费力、特异性低、对检测的数据处理费时且准确性难以把握的问题。为解决上述问题，本发明采用的技术方案包括水产养殖水体中水霉菌孢子或其菌丝团的检测方法和水产养殖水体中水霉菌孢子或水霉菌菌丝团的检测试剂。

本发明所建立的试剂盒特异性强，敏感性高；本发明水霉菌孢子或水霉菌菌丝团检测方法利用所述试剂盒检测，该方法方便、灵敏、准确、快速、便捷。

本发明提供的检测试剂包括以下组分：

(1)检测反应液：20mmol/L Tri-HCl；10mmol/L(NH₄)₂5O₄；10mmol/LKCL；0.1％Triton X-100；MgSO₄10mmol/L、dNTPs1mmol/L、Betaine0.6mmol/L、内引物(FIP和BIP)各1.5μmol/L、外引物(F3和B3)各0.8μmol/L及8U Bst DNA聚合酶大片段。

其中内引物FIP和BIP，外引物F3和B3分别是

SP-FIP：

GTTGTATTTCAATTGCATGCAGACATGAATCCTTTTTAAACTACGACTG

SP-BIP：

TTCAACAGTGGATGTCTAGGCTCACTGAATTCTGCAATTCGC

SP-F3：GCAAGAAGCCGATGTCAAT

SP-B3：GCGTTCAAAATTTTGATGACT。

(2)反应显色液：10％SYBR Green荧光染料/TAE缓冲液；

(3)核酸裂解液：

核酸裂解溶液A(100mmol/L Tris HCl，pH9.0；40mmol/L EDTA，pH8.0)；

核酸裂解溶液B10％SDS；

核酸裂解溶液C氯化苄。

本发明还提供一种水霉菌的检测方法，包括如下步骤：

1)待检样品的核酸提取：

使用本方案中的核酸裂解试剂提取待测样品的核酸得到核酸提取液。

2)进行本方案中的检测反应：

向20μL检测反应液中加入3μL步骤1的核酸提取液，60℃下反应45min；

3)在步骤2中的检测反应液中加入2μL反应显色液，直接肉眼观察颜色变化，反应液呈绿色说明反应呈阳性，反应液呈橘红色说明反应呈阴性。

本发明方法简单、费用低、操作简便，检测操作不需要费用高昂的仪器，费用低廉操作简便，检疫人员或渔民即可在鱼塘附近进行现场采样操作。本方法克服了传统的养殖水体中水霉菌孢子或水霉菌丝团检测方法的检测周期长、步骤繁琐、技术性强等缺点，使得广大检疫人员和渔民可以及时的预警养殖池塘水霉病得爆发。

附图说明

图1示出的是检测反应可视化结果

其中，

A试管中是水霉菌JL1；

B试管中是阴性对照水；

C试管中是近平滑念珠菌标准株；

图2示出的是检测反应电泳结果

其中，

1号试管中是阴性对照水；

2号试管中是水霉菌JLl；

3号试管中是近平滑念珠菌标准株；

图3示出的是水霉菌特异性检测电泳结果

图中

1号试管中是水霉菌JL1；

2号试管中是水霉菌L2；

3号试管中是水霉菌L5；

4号试管中是水霉菌L6；

5号试管中是水霉菌L7；

6号试管中是对照例霉菌节菱孢菌；

7号试管中是对照例白色念珠球菌；

8号试管中是热带念珠菌；

9号试管中是近平滑念珠菌标准株。

具体实施方式

下列实施例进一步说明本发明，但不应当作本发明的限制。

发明水霉菌孢子或水霉菌菌丝团检测试剂，包括水霉菌孢子或菌丝团核酸提取试剂和检测反应试剂，所述检测反应试剂中含有用于检测水霉菌扩增核酸引物组，该引物组包含引物SP-FIP、SP-BIP、引物SP-F3、SP-B3，其特殊之处是所述引物SP-FIP、引物SP-BIP、引物SP-F3、引物SP-B3分别为：

SP-FIP：

GTTGTATTTCAATTGCATGCAGACATGAATCCTTTTTAAACTACGACTG

SP-BIP：

TTCAACAGTGGATGTCTAGGCTCACTGAATTCTGCAATTCGC

SP-F3：GCAAGAAGCCGATGTCAAT

SP-B3：GCGTTCAAAATTTTGATGACT。

所述检测反应试剂包括以下组分：

(1)检测反应液：20mmol/L Tri-HCl、10mmol/L(NH₄)₂SO₄、10mmol/LKCL、0.1％Triton X-100、MgSO₄10mmol/L、dNTPs1mmol/L、Betaine0.6mmol/L、内引物(FIP和BIP)1.5μmol/L、外引物(F3和B3)0.8μmol/L及8U Bst DNA聚合酶大片段；

(2)反应显色液：10％ SYBR Green荧光染料；

(3)核酸裂解液：

核酸裂解溶液A(100 mmol/L Tris HCl，pH 9.0；40mmol/L EDTA，pH8.0)；

核酸裂解溶液B10％SDS；

核酸裂解溶液C氯化苄。

实施案例一

本发明应用于水霉病的预警，即水产养殖水体中水霉菌孢子浓度的检测方法，其特殊之处是按照以下步骤：

待测样品(水产养殖水体中水霉菌孢子)收集，用定量吸管吸取1mL待测水样，10倍倍比稀释成5个梯度，样品分别为：1号管样品为1mL待测水样原液、2号管取1号管100μL样品加入900μL双蒸水中(相当于1号管的10^-1浓度)、3号管取2号管100μL样品加入900μL双蒸水中(相当于1号管10^-2浓度)、4号管取3号管100μL样品加入900μL双蒸水中(相当于1号管10^-3浓度)、5号管取4号管100μL样品加入900μL双蒸水中(相当于1号管10^-4浓度)；

1)待测样品核酸提取，离心收集待测样品(水产养殖水体中的水霉菌孢子)弃去上清，加入500μL核酸裂解液A充分混匀；再加入100μL核酸裂解液B和300μL核酸裂解液C剧烈震荡；

2)进行检测反应，取20μL反应缓冲液，加入3μL步骤1的核酸提取液；

3)在60℃反应45min后加入2μL反应显色液，反应呈绿色说明样品呈阳性，若呈橘红色说明样品呈阴性。也可以在显色液显色后利1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果在紫外分析仪下观察，如果发现有阶梯状的扩增特征条带，说明检测样品呈阳性。

检测结果的分析见表1

表1

实施案例二

本发明应用于疑似水霉病样品的检测，即水霉菌菌丝团的检测方法，其特殊之处是按照以下步骤：

待测样品(发病样品上水霉菌丝团)收集，用灭菌镊子刮取病灶处菌丝团放入试管中；

1)待测样品核酸提取，离心收集待测样品(发病样品上水霉菌丝团)弃去上清，加入500μL核酸裂解液A充分混匀；再加入100μL核酸裂解液B和300μL核酸裂解液C剧烈震荡；

2)进行检测反应，取20μL反应缓冲液，加入3μL步骤1中的核酸提取液；

3)在60℃反应45min后加入2μL反应显色液，反应呈绿色说明样品呈阳性，若呈橘红色说明样品呈阴性即不是水霉菌。也可以显色液显色后利用1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果在紫外分析仪下观察，如果发现有阶梯状的扩增特征条带，说明检测样品呈阳性即检测样品为水霉菌。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。

Claims

1.一种水霉菌检测试剂，包括以下组分：

(1)检测反应液：

20mmol/L Tri-HCl

10mmol/L(NH₄)₂SO₄

10mmol/L KCL

0.1％Triton X-100

MgSO₄10mmol/L；

dNTPs1mmol/L；

Betaine0.6mmol/L；

内引物FIP和内引物BIP1.5μmol/L；

外引物F3和外引物B30.8μmol/L；

8U Bst DNA聚合酶大片段。

其中内引物FIP和BIP，外引物F3和B3分别是

SP-FIP：

GTTGTATTTCAATTGCATGCAGACATGAATCCTTTTTAAACTACGACTG

SP-BIP：

TTCAACAGTGGATGTCTAGGCTCACTGAATTCTGCAATTCGC

SP-F3：GCAAGAAGCCGATGTCAAT

SP-B3：GCGTTCAAAATTTTGATGACT。

(2)反应显色液：10％SYBR Green荧光染料/TAE缓冲液；

(3)核酸裂解液，包括：

核酸裂解溶液A；100mmol/L Tris HCl，pH9.0、40mmol/L EDTA，pH8.0；

核酸裂解溶液B：10％SDS；

核酸裂解溶液C：氯化苄。

2.一种使用权利要求1所述的水霉菌检测试剂进行检测的方法，包括以下步骤：

1)待测样品核酸提取，离心收集待测样品弃去上清，加入500μL核酸裂解液A充分混匀；再加入100μL核酸裂解液B和300μL核酸裂解液C剧烈震荡得到核酸提取液；

2)进行检测反应，取20μL检测反应液(1)，加入3μL步骤1的核酸提取液；

3)在60℃反应45min后加入2μL反应显色液(2)，反应呈绿色说明样品呈阳性，若呈橘红色说明样品呈阴性；或者在加入反应显色液显色后利用1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果在紫外分析仪下观察，如果发现有阶梯状的扩增特征条带，说明检测样品呈阳性。