CN105368985A - 对虾tsv和imnv荧光定量检测引物和探针及试剂盒 - Google Patents

对虾tsv和imnv荧光定量检测引物和探针及试剂盒 Download PDF

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Abstract

对虾TSV和IMNV荧光定量检测引物和探针及试剂盒，涉及海洋生物病原检测。所述引物和探针包括TSV上游引物、TSV下游引物、TSV探针、IMNV上游引物、IMNV下游引物和IMNV探针。所述引物和探针可在制备检测TSV和IMNV制品中应用。用于定量检测TSV和IMNV的试剂盒包括引物和探针。检测方法：1)病毒核酸的提取；2)扩增检测在至少二通道荧光定量PCR仪上进行；3)荧光定量结果报告。

Description

对虾TSV和IMNV荧光定量检测引物和探针及试剂盒
技术领域
本发明涉及海洋生物病原检测，尤其是涉及对虾桃拉病毒(TSV)和对虾传染性肌肉坏死病毒(IMNV)荧光定量检测引物和探针及试剂盒。
背景技术
对虾桃拉病毒(TSV)和对虾传染性肌肉坏死病毒(IMNV)是引起养殖对虾发病的两种常见的病毒性疾病。对虾桃拉病毒(TSV)为有包涵体，直径30nm，单链RNA病毒，长度10.2kb；对虾传染性肌肉坏死病毒(IMNV)为有囊膜，直径40nm，双链RNA病毒，长度7560bp，两种病毒均被国际兽医局(TheWorldOrganisationanimalHealth,OIE)列入需要报告的水生动物病毒性疫病。凡纳滨对虾(P.vannamei)是两种病毒的易感宿主，而凡纳滨对虾也是我国主要的对虾养殖品种，占养殖对虾总量的80％以上，对虾感染这两种病毒后，均表现为不摄食、反应迟钝、肝胰腺肿大、抵抗力下降，一旦气候或环境因素发生变化，极易造成对虾大面积死亡，从而造成严重经济损失。因此建立早期预警技术，加强苗种和成虾检疫，对预防病毒感染，有效切断病毒传播，减少病害造成的损失至关重要。目前有关病毒检测方法，包含组织病理学、电镜观察、原位杂交、PCR或RT-PCR、荧光定量等方法，但传统检测方法操作繁琐费时、灵敏度低、不适合早期的预防检测；而PCR或RT-PCR相比传统方法虽然灵敏度有了提高，但其后续的电泳，极易造成交叉污染，那么随着近几年来荧光定量方法的应用和荧光标记物的发展，该方法通过对荧光信号的采集实现对PCR过程中产物量的实时监测，可精确计算出初始模板量。同时，由于荧光信号引入，灵敏度比普通的PCR提高10～100倍，不同病毒的检测可用不同的荧光素标记特异探针，运用多重荧光定量PCR(qPCR)技术，可实现多种病毒的同时检测。
发明内容
本发明的第一目的是提供二重荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)引物和探针。
本发明的第二目的是提供所述二重荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)引物和探针在制备检测对虾桃拉病毒(TSV)和对虾传染性肌肉坏死病毒(IMNV)制品中的应用。
本发明的第三目的是提供用于检测对虾桃拉病毒(TSV)和对虾传染性肌肉坏死病毒(IMNV)二重荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)试剂盒。
本发明的第四目的是提供对虾桃拉病毒(TSV)和对虾传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的检测方法。
所述二重荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)引物和探针包括：
TSV上游引物：5’-AAGGAGCATTGTGGCTGTG-3’；
TSV下游引物：5’-CTTCAGACTGCAAGTTCATCTCA-3’；
TSV探针：FAM-AATAAGATGAATGCTAAGCAGA-MGB；
IMNV上游引物：GCTGATATGACGGCACAAAGAAG；
IMNV下游引物：CGTCGGCCCTAATAGAGTCATT；
IMNV探针：HEX-CTGGTAATCATCTTCG-MGB。
所述二重荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)引物和探针可在制备检测对虾桃拉病毒(TSV)和对虾传染性肌肉坏死病毒(IMNV)制品中应用。
所述制品可为用于定量检测对虾桃拉病毒(TSV)和对虾传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的系列阳性标准品，所述系列阳性标准品分别含5×101、5×103、5×105、5×107copies/μL的对虾桃拉病毒(TSV)和对虾传染性肌肉坏死病毒(IMNV)核酸片段。
所述对虾桃拉病毒(TSV)和对虾传染性肌肉坏死病毒(IMNV)核酸片段，具体信息如下：
TSV片段序列：
AAGCCACGCCATTTTTACAAGGAGCATTGTGGCTGTGGAATAAGATGAATGCTAAGCAGACATCAATTATTCGACGCACTCTTACAGAACACCTACGCTCTATTACATCATTTCCTGGCATTGAGATGAACTTGCAGTCTGAAGCTCGAGCTA
IMNV片段序列：
GTAGATGAGCTAAGAGTATTAGCTGATATGACGGCACAAAGAAGCAACGTAAACACTGCTGGTAATCATCTTCGTGATAATGACTCTATTAGGGCCGACGCTGTTCTAGCTAACAATACAGT
所述阳性标准品可在制备检测对虾桃拉病毒(TSV)和对虾传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的制品中应用。
一种用于定量检测对虾桃拉病毒(TSV)和对虾传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的试剂盒，所述试剂盒包括所述二重荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)引物和二重荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)探针。
所述试剂盒还包括用于定量检测对虾桃拉病毒(TSV)和对虾传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的系列阳性标准品，-20℃保藏，用于标准曲线绘制。
所述试剂盒还包括以下组分：
1)2×RT-qPCR反应液，所述2×RT-qPCR反应液内含有耐热DNA聚合酶(TaqDNApolymerase)、反转录酶(SuperScriptIIIReverseTranscriptase)，-20℃保藏；
2)重蒸水，重蒸水用于阴性对照(NTC)实验，检测试剂盒所含的试剂和操作过程是否污染，-20℃保藏。
所述对虾桃拉病毒(TSV)和对虾传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的检测方法，采用所述用于定量检测对虾桃拉病毒(TSV)和对虾传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的试剂盒，具体步骤如下：
1)病毒核酸的提取：按照商品化核酸RNA提取试剂盒QIAGENViralRNAMiniExtractionKit(QIAGEN，Cat#：52904)操作，从活样品组织中提取病毒RNA；取2μL提取的病毒RNA作为RT-qPCR模板，同时做一份阴性对照，所述阴性对照可取适量重蒸水或无TSV和IMNV感染的虾组织，与样品同时进行以上核酸提取，以便评估核酸提取过程中是否存在交叉污染；
2)扩增检测在至少二通道荧光定量PCR仪上进行，总体积20μL，其中2×RT-qPCR反应液10μL，引物和探针混合液8μL，2μL检测样品(重蒸水、阳性系列、阴性对照、提取产物)；探针检测模式设置为ReporterDye：FAM、HEX通道，分别用于检测TSV和IMNV；扩增条件50℃10min，1个循环，95℃2min，1个循环，94℃15s，60℃40s，40个循环；设置完成后，保存文件，运行程序；
3)荧光定量结果报告：首先对标准曲线进行归一化，评价扩增效率，扩增效率应保持在90％～105％，标准曲线的R2≥0.990，阴性对照、重蒸水的扩增曲线应没有对数增长期，即Ct值≥40；然后进行样品数据分析，通过样品的Ct值与标准曲线进行比较，仪器将自动计算并显示待测样品的拷贝数，即能换算出组织所含的病毒数。
本发明根据GenBank已收录的全长或部分基因组序列，经过比对选择一段较为保守的序列设计特异性引物和Taqman-MGB探针；分别克隆了两种病毒片段，通过体外转录方法获得病毒RNA片段，作为阳性对照标准品，本发明还提供了一种包含反转录酶和DNA聚合酶的试剂，一步即能完成反转录和扩增，完全闭管操作，减少污染，实现对虾桃拉病毒(TSV)和对虾传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的快速定量分析。
本发明以对虾桃拉病毒(TSV)和对虾传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的保守序列，设计两对引物，两条荧光标记TaqMan-MGB探针，利用二重实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)技术，操作简单规范，灵敏度高，特异性好，适合苗种筛选和养成期快速检测。
附图说明
图1为TSV扩增曲线。在图1中，1～5：阳标加入量分别为108、106、104、102拷贝。
图2为图1TSV扩增曲线所对应的标准曲线。
图3为IMNV扩增曲线。在图3中，1～5：阳标加入量分别为108、106、104、102拷贝。
图4为图3IMNV扩增曲线所对应的标准曲线。
具体实施方式
以下通过实施例和附图对本发明作进一步说明。
1.阳标片段的确定与引物和探针的设计：
根据GenBank已收录的全长或部分基因组序列，经过比对选择一段较为保守的序列确定为阳标片段，并设计特异性引物和Taqman-MGB探针，委托上海基康生物技术有限公司合成。
将上述引物和探针用重蒸水(RNase，DNase－free)配制成混合液，每条引物和探针浓度均为0.625μmol/L，
2.阳性标准品的制备：
将两种病毒片段分别克隆至pUC57载体上，通过体外转录方法合成单链的RNA片段，方法参照T7RiboMAXExpressRNAiSystem(Promega，Cat#：P1700)试剂盒方法，获得RNA粗品后，再用RNA提取试剂盒QIAGENViralRNAMiniExtractionKit(QIAGEN，Cat#：52904)纯化，获得较纯RNA片段，用紫外分光光度计测定吸光值，根据公式：拷贝数＝(质粒质量/质粒摩尔质量)×6.02×1023，将质粒浓度换算成拷贝数(copies/μL)，并作系列稀释，稀释成5×101、5×103、5×105、5×107copies/μLRNA片段溶液。
3.反应体系及扩增条件：
利用上述引物探针混合液及阳性标准系列配制反应体系并进行扩增。优化结果，反应体系20μL：其中2×RT-qPCR反应液10μL(含TaqDNApolymerase、SuperScriptIIIReverseTranscriptase)，引物和探针混合液8μL，模板2μL；扩增条件：50℃10min，1个循环，95℃2min，1个循环，94℃15s，60℃40s，40个循环。
4.阳性标准品中残留的DNA检查：
由于阳性标准品RNA制备原理是DNA片段通过体外转录方法产生RNA片段，制备过程需要用DNase降解残余的DNA片段，但是仍有可能降解不完全，因此需要检测阳性标准品中残留的DNA，方法是将系列阳性标准品同时做qPCR和RT-qPCR反应，通过比较Ct值的差异，即可获得阳性标准品中DNA残留量，表1为TSV/IMNV阳性标准品中残留DNA检测结果，TSV阳性标准品中DNA残留量约为百万分之一，IMNV阳性标准品中DNA残留量约为万分之一，不影响TSV和IMNV检测。
表1
5.灵敏度、重复性、标准品相关系数分析：
将重蒸水、稀释的阳性标准品作为模板，按试剂盒RT-qPCR方法进行检测分析，灵敏度检测可达到100拷贝；将扩增曲线Ct值与标准品初始拷贝数作图，即得标准曲线(图1，图2)，TSV和IMNV相关系数R2分别为：0.9997、0.9995，扩增效率分别为：105.1％、104.1％；实验进行三次平行试验，TSV重复性实验和IMNV重复性实验结果参见表2和3，由表2和3可以看出，重复性较好。
表2
表3
6.特异性检测
从对虾组织中(TSV和IMNV呈阴性)提取核酸，设立二个实验组进行特异性检测分析，实验组(1)：同上述的灵敏度检测反应，实验组(2)：除了阳标梯度系列外，每个反应管中还加入了从阴性对虾组织中制备的核酸。RT-qPCR扩增结果表明：加了虾组织核酸后的最低检测限度基本上没有改变，仍达到100拷贝，而且阴性对照同样未出现荧光信号(数据未显示)，两组实验的Ct值一致，说明制备的生物样品模板不会引起非特异性扩增，也不会干扰TSV和IMNV的检测，检测引物和探针具有很好的特异性。
7.试剂盒组成、稳定性试验
试剂盒由2×RT-qPCR反应液，引物和探针混合液、系列阳性标准品、重蒸水组成，见表4；本品-20℃保存，运输过程需冷藏。将试剂盒内所有试剂于-20℃放置3个月、6个月、9个月、12个月后，与现配试剂一起按RT-qPCR方法进行检测分析，扩增效果基本一致，见表5和6，说明本试剂盒所有试剂在-20℃保存，一年内是稳定有效的。
表4
表5
表6
综上所述，本发明的检测试剂盒及检测方法可应用于对虾TSV和IMNV两种病毒的同时检测，适用于无特定病原苗种的筛选和养殖过程的病原检测。

Claims (10)

1.二重荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)引物和探针，其特征在于包括：
TSV上游引物：5’-AAGGAGCATTGTGGCTGTG-3’；
TSV下游引物：5’-CTTCAGACTGCAAGTTCATCTCA-3’；
TSV探针：FAM-AATAAGATGAATGCTAAGCAGA-MGB；
IMNV上游引物：GCTGATATGACGGCACAAAGAAG；
IMNV下游引物：CGTCGGCCCTAATAGAGTCATT；
IMNV探针：HEX-CTGGTAATCATCTTCG-MGB。
2.如权利要求1二重荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)引物和探针在制备检测对虾桃拉病毒和对虾传染性肌肉坏死病毒制品中应用。
3.如权利要求2所述应用，其特征在于所述制品为用于定量检测对虾桃拉病毒和对虾传染性肌肉坏死病毒的系列阳性标准品。
4.如权利要求3所述应用，其特征在于所述系列阳性标准品分别含5×101、5×103、5×105、5×107copies/μL的对虾桃拉病毒核酸片段和对虾传染性肌肉坏死病毒核酸片段。
5.如权利要求4所述应用，其特征在于所述对虾桃拉病毒核酸片段和对虾传染性肌肉坏死病毒核酸片段，具体信息如下：
对虾桃拉病毒核酸片段序列：
AAGCCACGCCATTTTTACAAGGAGCATTGTGGCTGTGGAATAAGATGAATGCTAAGCAGACATCAATTATTCGACGCACTCTTACAGAACACCTACGCTCTATTACATCATTTCCTGGCATTGAGATGAACTTGCAGTCTGAAGCTCGAGCTA
对虾传染性肌肉坏死病毒核酸片段序列：
GTAGATGAGCTAAGAGTATTAGCTGATATGACGGCACAAAGAAGCAACGTAAACACTGCTGGTAATCATCTTCGTGATAATGACTCTATTAGGGCCGACGCTGTTCTAGCTAACAATACAGT。
6.如权利要求3所述应用，其特征在于所述阳性标准品在制备检测对虾桃拉病毒和对虾传染性肌肉坏死病毒的制品中应用。
7.用于定量检测对虾桃拉病毒和对虾传染性肌肉坏死病毒的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括所述二重荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)引物和二重荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)探针。
8.如权利要求7所述用于定量检测对虾桃拉病毒和对虾传染性肌肉坏死病毒的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括用于定量检测对虾桃拉病毒和对虾传染性肌肉坏死病毒的系列阳性标准品。
9.如权利要求7所述用于定量检测对虾桃拉病毒和对虾传染性肌肉坏死病毒的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括以下组分：
1)2×RT-qPCR反应液，所述2×RT-qPCR反应液内含有耐热DNA聚合酶(TaqDNApolymerase)、反转录酶(SuperScriptIIIReverseTranscriptase)，-20℃保藏；
2)重蒸水，重蒸水用于阴性对照(NTC)实验，检测试剂盒所含的试剂和操作过程是否污染，-20℃保藏。
10.对虾桃拉病毒和对虾传染性肌肉坏死病毒的检测方法，其特征在于采用如权利要求7所述用于定量检测对虾桃拉病毒和对虾传染性肌肉坏死病毒的试剂盒，具体步骤如下：
1)病毒核酸的提取：按照商品化核酸RNA提取试剂盒QIAGENViralRNAMiniExtractionKit(QIAGEN，Cat#：52904)操作，从活样品组织中提取病毒RNA；取2μL提取的病毒RNA作为RT-qPCR模板，同时做一份阴性对照，所述阴性对照是取适量重蒸水或无TSV和IMNV感染的虾组织，与样品同时进行以上核酸提取，以便评估核酸提取过程中是否存在交叉污染；
2)扩增检测在至少二通道荧光定量PCR仪上进行，总体积20μL，其中2×RT-qPCR反应液10μL，引物和探针混合液8μL，2μL检测样品(重蒸水、阳性系列、阴性对照、提取产物)；探针检测模式设置为ReporterDye：FAM、HEX通道，分别用于检测TSV和IMNV；扩增条件50℃10min，1个循环，95℃2min，1个循环，94℃15s，60℃40s，40个循环；设置完成后，保存文件，运行程序；
3)荧光定量结果报告：首先对标准曲线进行归一化，评价扩增效率，扩增效率应保持在90％～105％，标准曲线的R2≥0.990，阴性对照、重蒸水的扩增曲线应没有对数增长期，即Ct值≥40；然后进行样品数据分析，通过样品的Ct值与标准曲线进行比较，仪器将自动计算并显示待测样品的拷贝数，即能换算出组织所含的病毒数。
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