CN111004864A - 虾病原体检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测虾病原体的方法。此外，本发明并涉及用于检测虾病原体的寡核苷酸对。

Description

虾病原体检测方法
技术领域
本发明关于检测虾病原体的方法，特别是关于使用寡核苷酸对检测虾病原体的方法。
背景技术
水产动物是人类重要的能量、蛋白质与必需营养的来源之一。大量捕捞野生水产动物对海洋资源耗尽的疑虑，使得水产养殖业日益受到重视。根据联合国粮食及农业组织的统计，水产养殖对全球捕捞及养殖总产量的贡献逐步提升，从2000年的25.7％增至2016年的46.8％。然而，密集养殖加上管理不良可能造成水产动物容易感染疾病、死亡，而造成渔民的损失。此外，水产动物的病害多由细菌或病毒引起，细菌性疾病与病毒性疾病的处理方法相差甚远，一旦误诊，处理不当，就会造成巨大的损失。由此可见，在饲养渔场、虾场密集监控疾病对管理而言是不可或缺的一环。本发明即提供了快速、方便的虾病原体检测方法以供产业利用。
发明内容
于一方面，本发明涉及一种虾病原体检测方法，包含提供一可能含有一虾病原体的一或多个核苷酸序列的样本；提供一寡核苷酸引物对，所述寡核苷酸引物对包含一第一引物与一第二引物，所述寡核苷酸引物对定义在所述病原体的一或多个核苷酸序列上一双股目标序列的二互补股的5’端；提供一聚合酶；在一容器中混合所述样本、所述寡核苷酸引物对、所述聚合酶、脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphates,dATPs)、脱氧胞核苷三磷酸(deoxycytidine triphosphates,dCTPs)、脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosinetriphosphates,dGTPs)，以及脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidine triphosphates,dTTPs)，以形成一聚合酶链锁反应(polymerase chain reaction,PCR)混合物；透过在一固定温度下加热所述容器的底部，使所述PCR混合物进行热对流聚合酶链锁反应(convectivepolymerase chain reaction,cPCR)，以形成一PCR产物；以及侦测所述PCR产物以辨识所述双股目标序列。
在某些实施方案中，所述聚合酶链锁反应(PCR)混合物进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一与所述双股目标序列的一区段互补的寡核苷酸探针序列、一附加于所述寡核苷酸探针上的一第一位置的荧光分子，以及一附加于所述寡核苷酸探针上的一第二位置的荧光抑制分子，当所述寡核苷酸探针未杂合于所述双股目标序列的所述区段时，所述荧光抑制分子大体上抑制所述荧光分子，且当所述寡核苷酸探针杂合于所述双股目标序列的所述区段时，所述荧光分子大体上未被抑制。
于另一方面，本发明涉及一种用于侦测虾病原体的寡核苷酸对，包含一第一引物与一第二引物。
在某些实施方案中，所述寡核苷酸对进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针具有一寡核苷酸探针序列、一附加于所述寡核苷酸探针上的一第一位置的荧光分子，以及一附加于所述寡核苷酸探针上的一第二位置的荧光抑制分子。
在某些实施方案中，所述病原体为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，且所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:1与SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10与SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:16与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:16与SEQID NO:17，以及SEQ ID NO:13与SEQ ID NO:14。
在某些实施方案中，所述病原体为副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体副溶血弧菌的与光杆菌同源性的昆虫相关(Photorhabdusinsect-related,Pir)毒素基因(GenBank accession No.KU145400)的第1824至第1854个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:3所示。
在某些实施方案中，所述病原体为副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:5时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体副溶血弧菌的Pir毒素基因(GenBank accession No.KU145400)的第996至第1065个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:6所示。
在某些实施方案中，所述病原体为副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体副溶血弧菌的Pir毒素基因(GenBank accession No.KU145400)的第520至第599个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:9所示。
在某些实施方案中，所述病原体为副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:17时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体副溶血弧菌的Pir毒素基因(GenBank accession No.KU145400)的第1267至第1320个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:12所示。
在某些实施方案中，所述病原体为副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:16与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:16与SEQ ID NO:17时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体副溶血弧菌的Pir毒素基因(GenBank accession No.KU145400)的第1287至第1320个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:12所示。
在某些实施方案中，所述病原体为副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:13与SEQ ID NO:14时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体副溶血弧菌的Pir毒素基因(GenBank accessionNo.KU145400)的第580至第636个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:15所示。
在某些实施方案中，所述病原体为微孢子虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)，且所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:18与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21与SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24与SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:24与SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:27与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27与SEQ ID NO:28、SEQID NO:29与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29与SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31与SEQ ID NO:32，以及SEQ ID NO:34与SEQ ID NO:35。
在某些实施方案中，所述病原体为微孢子虫(EHP)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:18与SEQ ID NO:19时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体微孢子虫(EHP)的18s核糖体核糖核酸(ribosomal RNA,rRNA)基因(GenBankaccession No.KR021169)的第384至第419个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:20所示。
在某些实施方案中，所述病原体为微孢子虫(EHP)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:21与SEQ ID NO:22时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体微孢子虫(EHP)的18s rRNA基因(GenBankaccessionNo.KR021169)的第388至第412个核苷酸之间的13至25个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:23所示。
在某些实施方案中，所述病原体为微孢子虫(EHP)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:24与SEQ ID NO:25时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体微孢子虫(EHP)的18s rRNA基因(GenBankaccession No.KR021169)的第377至第423个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:26所示。
在某些实施方案中，所述病原体为微孢子虫(EHP)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:24与SEQ ID NO:30时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体微孢子虫(EHP)的18s rRNA基因(GenBank accession No.KR021169)的第377至第420个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:26所示。
在某些实施方案中，所述病原体为微孢子虫(EHP)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:27与SEQ ID NO:25时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体微孢子虫(EHP)的18s rRNA基因(GenBank accession No.KR021169)的第387至第423个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:26所示。
在某些实施方案中，所述病原体为微孢子虫(EHP)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:27与SEQ ID NO:28时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体微孢子虫(EHP)的18s rRNA基因(GenBank accession No.KR021169)的第387至第425个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:26所示。
在某些实施方案中，所述病原体为微孢子虫(EHP)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:29与SEQ ID NO:25时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体微孢子虫(EHP)的18s rRNA基因(GenBank accession No.KR021169)的第391至第423个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:26所示。
在某些实施方案中，所述病原体为微孢子虫(EHP)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:29与SEQ ID NO:28时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体微孢子虫(EHP)的18s rRNA基因(GenBank accession No.KR021169)的第391至第425个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:26所示。
在某些实施方案中，所述病原体为微孢子虫(EHP)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:31与SEQ ID NO:32时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体微孢子虫(EHP)的18s rRNA基因(GenBank accession No.KR021169)的第154至第253个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:33所示。
在某些实施方案中，所述病原体为微孢子虫(EHP)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:34与SEQ ID NO:35时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体微孢子虫(EHP)的18s rRNA基因(GenBankaccessionNo.KR021169)的第275至第339个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:36所示。
在某些实施方案中，所述病原体为白点症病毒(White spot syndrome virus,WSSV)，且所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:37与SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40与SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43与SEQ ID NO:44，以及SEQ ID NO:46与SEQ ID NO:47。
在某些实施方案中，所述病原体为白点症病毒(WSSV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:37与SEQ ID NO:38时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体白点症病毒(WSSV)的类VP664核鞘蛋白基因(GenBank accessionNo.MF101757)的第964至第996个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:39所示。
在某些实施方案中，所述病原体为白点症病毒(WSSV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:40与SEQ ID NO:41时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体白点症病毒(WSSV)的类VP664核鞘蛋白基因(GenBank accessionNo.MF101757)的第959至第993个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:42所示。
在某些实施方案中，所述病原体为白点症病毒(WSSV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:43与SEQ ID NO:44时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体白点症病毒(WSSV)的类VP664核鞘蛋白基因(GenBank accessionNo.MF101757)的第613至第668个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:45所示。
在某些实施方案中，所述病原体为白点症病毒(WSSV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:46与SEQ ID NO:47时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体白点症病毒(WSSV)的类VP664核鞘蛋白基因(GenBank accessionNo.MF101757)的第1121至第1169个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:48所示。
在某些实施方案中，所述病原体为黄头病毒(Yellow-head Virus,YHV)，且所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:49与SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52与SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55与SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58与SEQ IDNO:59、SEQ ID NO:58与SEQ ID NO:61，以及SEQ ID NO:60与SEQ ID NO:61。
在某些实施方案中，所述病原体为黄头病毒(YHV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:49与SEQ ID NO:50时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体黄头病毒(YHV)的开放读码框(Open reading frame,ORF)1B基因(GenBankaccession No.EU784982)的第142至第171个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:51所示。
在某些实施方案中，所述病原体为黄头病毒(YHV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:52与SEQ ID NO:53时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体黄头病毒(YHV)的ORF1B基因(GenBank accession No.EU784982)的第91至第125个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:54所示。
在某些实施方案中，所述病原体为黄头病毒(YHV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:55与SEQ ID NO:56时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体黄头病毒(YHV)的ORF1B基因(GenBank accession No.EU784982)的第306至第349个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:57所示。
在某些实施方案中，所述病原体为黄头病毒(YHV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:58与SEQ ID NO:59时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体黄头病毒(YHV)的ORF1B基因(GenBank accession No.EU784982)的第308至第329个核苷酸之间的13至22个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:57所示。
在某些实施方案中，所述病原体为黄头病毒(YHV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:58与SEQ ID NO:61时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体黄头病毒(YHV)的ORF1B基因(GenBank accession No.EU784982)的第308至第350个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:57所示。
在某些实施方案中，所述病原体为黄头病毒(YHV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:60与SEQ ID NO:61时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体黄头病毒(YHV)的ORF1B基因(GenBank accession No.EU784982)的第305至第350个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:57所示。
在某些实施方案中，所述病原体为传染性肌肉坏死病毒(InfectiousMyonecrosis Virus,IMNV)，且所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:62与SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:63与SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66与SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:68与SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71与SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:71与SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:72与SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:72与SEQ ID NO:74，以及SEQ ID NO:76与SEQ ID NO:77。
在某些实施方案中，所述病原体为传染性肌肉坏死病毒(IMNV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:62与SEQ ID NO:64时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的主要衣壳蛋白(major capsidprotein,MCP)基因(GenBank accession No.KJ636788.1)的第1493至第1529个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ IDNO:65所示。
在某些实施方案中，所述病原体为传染性肌肉坏死病毒(IMNV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:63与SEQ ID NO:64时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的主要衣壳蛋白(MCP)基因(GenBankaccession No.KJ636788.1)的第1483至第1529个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:65所示。
在某些实施方案中，所述病原体为传染性肌肉坏死病毒(IMNV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:66与SEQ ID NO:64时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的主要衣壳蛋白(MCP)基因(GenBankaccession No.KJ636788.1)的第1476至第1529个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:67所示。
在某些实施方案中，所述病原体为传染性肌肉坏死病毒(IMNV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:68与SEQ ID NO:69时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的主要衣壳蛋白(MCP)基因(GenBankaccession No.KJ636788.1)的第1580至第1646个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:70所示。
在某些实施方案中，所述病原体为传染性肌肉坏死病毒(IMNV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:71与SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:72与SEQ IDNO:73时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的主要衣壳蛋白(MCP)基因(GenBank accession No.KJ636788.1)的第1493至第1514个核苷酸之间的13至22个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQID NO:75所示。
在某些实施方案中，所述病原体为传染性肌肉坏死病毒(IMNV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:71与SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:72与SEQ IDNO:74时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的主要衣壳蛋白(MCP)基因(GenBank accession No.KJ636788.1)的第1493至第1532个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQID NO:75所示。
在某些实施方案中，所述病原体为传染性肌肉坏死病毒(IMNV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:76与SEQ ID NO:77时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的主要衣壳蛋白(MCP)基因(GenBankaccession No.KJ636788.1)的第2774至第2829个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:78所示。
在某些实施方案中，所述病原体为传染性皮下及造血组织坏死症病毒(infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus,IHHNV)，且所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:79与SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:79与SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:79与SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:82与SEQ IDNO:83、SEQ ID NO:82与SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:82与SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87与SEQID NO:88、SEQ ID NO:87与SEQ ID NO:91，以及SEQ ID NO:90与SEQ ID NO:88。
在某些实施方案中，所述病原体为传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:79与SEQ ID NO:80时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)的基因组(GenBank accession No.AF218266)的第693至第732个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:81所示。
在某些实施方案中，所述病原体为传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:79与SEQ ID NO:83时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)的基因组(GenBank accession No.AF218266)的第693至第759个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:81所示。
在某些实施方案中，所述病原体为传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:79与SEQ ID NO:85时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)的基因组(GenBank accession No.AF218266)的第693至第757个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:84所示。
在某些实施方案中，所述病原体为传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:82与SEQ ID NO:83时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)的基因组(GenBank accession No.AF218266)的第700至第759个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:84所示。
在某些实施方案中，所述病原体为传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:82与SEQ ID NO:85时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)的基因组(GenBank accession No.AF218266)的第700至第757个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:84所示。
在某些实施方案中，所述病原体为传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:82与SEQ ID NO:86时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)的基因组(GenBank accession No.AF218266)的第700至第745个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:84所示。
在某些实施方案中，所述病原体为传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:87与SEQ ID NO:88时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)的基因组(GenBank accession No.AF218266)的第633至第673个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:89所示。
在某些实施方案中，所述病原体为传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:87与SEQ ID NO:91时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)的基因组(GenBank accession No.AF218266)的第633至第683个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:89所示。
在某些实施方案中，所述病原体为传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:90与SEQ ID NO:88时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)的基因组(GenBank accession No.AF218266)的第640至第673个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:89所示。
在某些实施方案中，所述病原体为陶拉症候群病毒(Taura syndrome virus,TSV)，且所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:92与SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95与SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98与SEQ ID NO:101、SEQID NO:99与SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:99与SEQ ID NO:102，以及SEQ ID NO:100与SEQ IDNO:101。
在某些实施方案中，所述病原体为陶拉症候群病毒(TSV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:92与SEQ ID NO:93时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体陶拉症候群病毒(TSV)的基因组(GenBank accession No.AF277675)的第7125至第7162个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:94所示。
在某些实施方案中，所述病原体为陶拉症候群病毒(TSV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:95与SEQ ID NO:96时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体陶拉症候群病毒(TSV)的基因组(GenBank accession No.AF277675)的第3995至第4051个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:97所示。
在某些实施方案中，所述病原体为陶拉症候群病毒(TSV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:98与SEQ ID NO:101时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体陶拉症候群病毒(TSV)的基因组(GenBank accession No.AF277675)的第9976至第10018个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:103所示。
在某些实施方案中，所述病原体为陶拉症候群病毒(TSV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:99与SEQ ID NO:101时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体陶拉症候群病毒(TSV)的基因组(GenBank accession No.AF277675)的第9985至第10018个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:103所示。
在某些实施方案中，所述病原体为陶拉症候群病毒(TSV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:99与SEQ ID NO:102时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体陶拉症候群病毒(TSV)的基因组(GenBank accession No.AF277675)的第9985至第10049个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:103所示。
在某些实施方案中，所述病原体为陶拉症候群病毒(TSV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:100与SEQ ID NO:101时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体陶拉症候群病毒(TSV)的基因组(GenBank accession No.AF277675)的第9973至第10018个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:103所示。
本说明书中所述的所有技术性及科学术语，除非另外有所定义，皆为该所属领域具有通常技艺者可共同了解的意义。
本发明以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。
具体实施方式
于一方面，本发明涉及一种虾病原体检测方法。在某些实施方案中，所述方法为聚合酶链锁反应(polymerase chain reaction,PCR)。在某些实施方案中，所述方法为反转录聚合酶链锁反应(reverse-transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)。在某些实施方案中，所述方法为热对流聚合酶链锁反应(convective polymerase chainreaction,cPCR)。在某些实施方案中，所述方法为实时聚合酶链锁反应(real-timepolymerase chain reaction,real-time PCR)。
于一方面，本发明涉及一种虾病原体检测方法，包含:
提供一可能含有虾病原体的一或多个核苷酸序列的样本；
提供一寡核苷酸引物对，所述寡核苷酸引物对包含一第一引物与一第二引物，所述寡核苷酸引物对定义在所述病原体的一或多个核苷酸序列上一双股目标序列的二互补股的5’端；
提供一聚合酶；
在一容器中混合所述样本、所述寡核苷酸引物对、所述聚合酶、脱氧腺苷三磷酸(dATPs)、脱氧胞核苷三磷酸(dCTPs)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTPs)，以及脱氧胸苷三磷酸(dTTPs)，以形成一聚合酶链锁反应(PCR)混合物；
透过在一固定温度下加热所述容器的底部，使所述PCR混合物进行热对流聚合酶链锁反应(cPCR)，以形成一PCR产物；以及侦测所述PCR产物以辨识所述双股目标序列。
于另一方面，本发明涉及一种虾病原体检测方法，包含:
提供一可能含有虾病原体的一或多个核苷酸序列的样本；
提供一寡核苷酸引物对，所述寡核苷酸引物对包含一第一引物与一第二引物，所述寡核苷酸引物对定义在所述病原体的一或多个核苷酸序列上一双股目标序列的二互补股的5’端；
提供一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一与所述双股目标序列的一区段互补的寡核苷酸探针序列、一附加于所述寡核苷酸探针上的一第一位置的荧光分子，以及一附加于所述寡核苷酸探针上的一第二位置的荧光抑制分子，当所述寡核苷酸探针未杂合于所述双股目标序列的所述区段时，所述荧光抑制分子大体上抑制所述荧光分子，且当所述寡核苷酸探针杂合于所述双股目标序列的所述区段时，所述荧光分子大体上未被抑制；
提供一聚合酶；
在一容器中混合所述样本、所述寡核苷酸引物对、所述聚合酶、脱氧腺苷三磷酸(dATPs)、脱氧胞核苷三磷酸(dCTPs)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTPs)，以及脱氧胸苷三磷酸(dTTPs)，以形成一聚合酶链锁反应(PCR)混合物；
透过在一固定温度下加热所述容器的底部，使所述PCR混合物进行热对流聚合酶链锁反应(cPCR)，以形成一PCR产物；以及侦测所述PCR产物以辨识所述双股目标序列。
于又一方面，本发明涉及一种用于侦测虾病原体的寡核苷酸对。
于再一方面，本发明涉及一种用于侦测虾病原体的寡核苷酸对与寡核苷酸探针。
应当进一步理解的是，在某些实施方案中，本文揭露的寡核苷酸对及/或寡核苷酸探针可用于各种基础PCR技术之变异，例如，但不限于，反转录聚合酶链锁反应(RT-PCR)、热对流聚合酶链锁反应(cPCR)、实时聚合酶链锁反应(real-time PCR)、巢式聚合酶链锁反应(nested PCR)，以及热不对称性交错聚合酶链锁反应(thermal asymmetric interlacedPCR,TAIL-PCR)。
如本文所用，术语「虾病原体」意指在虾体内外发现的病毒性、细菌性及寄生性病原体。虾病原体的实例如，但不限于：副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、微孢子虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)、白点症病毒(White spot syndrome virus,WSSV)、黄头病毒(Yellow-head Virus,YHV)、传染性肌肉坏死病毒(Infectious MyonecrosisVirus,IMNV)、传染性皮下及造血组织坏死症病毒(infectious hypodermal andhaematopoietic necrosis virus,IHHNV)，以及陶拉症候群病毒(Taura syndrome virus,TSV)。
如本文所用，术语「热对流聚合酶链锁反应(cPCR)」是指一种聚合酶链锁反应，其中，将一装有一PCR样品的管状容器底部嵌入一稳定热源中，并控制所述PCR的参数，包括所述PCR样品的总体积、黏度、表面温度，以及所述管状容器的内径，使得所述PCR样品的底部到顶部的温度梯度下降，诱导热对流并且使得PCR样品的变性、黏合、聚合在所述管状容器的不同区域中依序且重复发生。热对流聚合酶链锁反应(cPCR)的详细描述请参见如美国专利号8,187,813，其以引用的方式将其整体并入本文。
如本文所用，术语「荧光分子」意指一物质或其一部份，其系能够在可侦测的范围内显示荧光。如本文所用，术语「荧光抑制分子」意指一物质或其一部份，其系能够抑制当由一光源激发时由所述荧光分子所发射的荧光。在某些实施方案中，术语「荧光分子」与「荧光抑制分子」为TaqManTM分析套组(Applied Biosystems Inc.，加州，美国)的荧光分子与荧光抑制分子。TaqManTM分析套组的详细描述请参见如，Holland et al.,Proc.Natl.Acad.Sci,U.S.A.(1991)88:7276-7280；美国专利号5,538,848、5,723,591、5,876,930，以及7,413,708皆以引用的方式将其整体并入本文。
所述荧光分子的例子包括，但不限于，3-(ε-羧)-3'-乙基-5,5'-二甲基己羰花青(3-(ε-carboxypentyl)-3'-ethyl-5,5'-dimethyloxa-carbocyanine,CYA)、6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein,FAM)、5,6-羧基罗丹明-L LO(5,6-carboxyrhodamine-l lO,R110)、6羧基罗丹明-6G(6-carboxyrhodamine-6G,R6G)、N’,N’,N’,N’-四甲基-6-羧基罗丹明(N’,N’,N’,N’-tetramethyl-6-carboxyrhodamine,TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(6-carboxy-X-rhodamine,ROX)、2’,4’,5’,7’-四氯4-7-二氯荧光素(2’,4’,5’,7’-tetrachloro-4-7-dichlorofluorescein,TET)、2',7-二甲氧基-4',5'-6羧基罗丹明(2’,7-dimethoxy-4’,5’-6carboxyrhodamine,JOE)、6-羧基-2',4,4',5',7,7'-六氯荧光素(6-carboxy-2’,4,4’,5’,7,7’-hexachlorofluorescein,HEX)、ALEXA荧光、Cy3荧光与Cy5荧光。所述荧光抑制分子的例子包括，但不限于，4-(4'-二甲基氨基-苯偶氮基)苯甲酸(4-(4’-dimethylamino-phenylazo)-benzoic acid,Dabcyl)、黑洞荧光抑制剂1(Black HoleQuencher 1,BHQ1)、黑洞荧光抑制剂2(Black Hole Quencher 2,BHQ2)、黑洞荧光抑制剂3(Black Hole Quencher 3,BHQ3)、二氢环吡咯并吲哚三肽小沟结合物(dihydro cyclopyrrolo indole tripeptide minor groove binder,MGB)、四甲基罗丹明(tetramethylrhodamine,TAMRA)。在某些实施方案中，所述荧光分子为6-羧基荧光素(FAM)，且所述荧光抑制分子为二氢环吡咯并吲哚三肽小沟结合物(MGB)。在某些实施方案中，所述荧光分子为6-羧基荧光素(FAM)，且所述荧光抑制分子为黑洞荧光抑制剂1(BHQ1)或二氢环吡咯并吲哚三肽小沟结合物(MGB)。
除非本文另有定义，否则用以与本文结合的科学与技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。本发明的方法与技术一般可根据本领域已知的常规方法进行。一般而言，本文所描述之用以连结以下技术的命名法，以及生物化学、酵素学、分子及细胞生物学、微生物学、遗传学与蛋白质及核酸化学及杂合反应的技术皆为本领域已知且经常使用者。除非另有说明，本发明的方法与技术一般可根据本领域已知的常规方法进行，且被描述于在本说明书中被引用且讨论的各种一般及更具体的参考文献中。
本发明进一步透过以下的实施例阐释，其不应以任何方式被解释为进一步的限缩。本申请案中引用的所有引用文件(包括参考文献、核准的专利、公开的专利申请，以及一同在申请中的专利申请案)的整体内容，在此透过引用的方式明确地并入本案中。
实施例
实施例1病原体副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)的检测
副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)为急性肝胰脏坏死病(Acutehepatopancreatic necrosis disease,AHPND，旧称EMS)的病原体。副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)的与光杆菌同源性的昆虫相关(Photorhabdus insect-related,Pir)毒素基因(GenBank accession No.KU145400)的片段被插入一选殖载体中，所述选殖载体可为，但不限于，pUC57、pGEM-T，以得到pEMS质粒。
1.传统聚合酶链锁反应
进行传统PCR所用的50μl PCR混合物含有：106个拷贝数的pEMS质粒、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.2μM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一热循环仪(例如，但不限于PC818,Astec Co.Ltd.，日本)中进行扩增反应，且包含一个变性的初始循环94℃持续3分钟，以及35个循环的94℃ 30秒、60℃ 30秒以及72℃延展30秒。扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)在TAE缓冲液(40mM Tris,20mM acetic acid,1mM EDTA)中分析，并且以溴化乙锭(ethidium bromide)染色显现。
传统PCR的结果如表1所示，各引物对扩增了各目标序列的正确大小的片段，而在负对照组中则无目标序列被扩增(结果未显示)。所述结果表明，各引物对可用于传统PCR扩增反应以检测副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)的存在。
表1各引物对与探针组合进行传统PCR的结果
Figure BDA0002218387390000121
Figure BDA0002218387390000131
2.热对流聚合酶链锁反应(cPCR)
50μl的PCR混合物含有5μl副溶血弧菌的与光杆菌同源性的昆虫相关(Pir)毒素基因的RNA(分别为102,103,104,105,106拷贝数/μl)或pEMS质粒(分别为102,103,104,105,106个拷贝数)、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.01-2μM探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(FAM)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(BHQ1))、0.2μM dNTP、1X cPCR缓冲液，以及1-5U Taq DNA聚合酶、1-5U反转录酶。将PCR混合物加入一反应试管中，并置于一热对流聚合酶链锁反应(cPCR)仪中一段指定的时间(约30～45分钟)。以所述cPCR仪侦测每个样本中的FAM荧光。重复上述cPCR分析试验8次(n＝8)以评各估引物对与探针的敏感度。
敏感度测试的结果如表2所示，各引物对及探针的组合皆可100％正确侦测到样品中含有102拷贝数/μl的副溶血弧菌的与光杆菌同源性的昆虫相关(Pir)毒素基因的RNA或102个拷贝数的pEMS质粒，其敏感度可达102拷贝数/μl及102个拷贝数。
表2各引物对与探针组合的敏感度测试结果(n＝8)
Figure BDA0002218387390000132
Figure BDA0002218387390000141
此外，以不同的虾病原体基因质粒(106拷贝数/μl)作为cPCR模板分析上述各引物对及探针组合的专一性。cPCR方法如上所述。专一性测试的结果如表3所示，各引物对及探针的组合皆可正确侦测到含有副溶血弧菌(V.parahaemolyticus，EMS)的样品，而侦测不到含有微孢子虫(EHP)、白点症病毒(WSSV)、黄头病毒(YHV)、传染性肌肉坏死病毒(IMNV)、传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)，以及陶拉症候群病毒(TSV)的样品。所述结果显示各引物对及探针组合具有专一性。
表3各引物对与探针组合的专一性测试结果
Figure BDA0002218387390000142
Figure BDA0002218387390000151
“+”表示在所述样本中侦测到荧光讯号，而“-”表示在所述样本中未侦测到荧光讯号。
3.实时聚合酶链锁反应(real-time PCR,qPCR)
以稀释的pEMS质粒(分别为101,102,103,104,105,106,107个拷贝数)于一实时PCR仪(例如，但不限于ABI StepOnePlusTM；Applied BioSystem,Life Technologies，加州，美国)中进行实时PCR分析。以含有2μl pEMS质粒、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.01-2μM探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(FAM)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(BHQ1))，总体积为20μl的商用RT-PCR套组(例如，但不限于，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit；Takara Bio Inc.，日本)进行实时PCR分析。实时PCR的程序为42℃ 5分钟、94℃ 10秒，以及40个循环的94℃ 10秒以及60℃ 30分钟。在60℃的步骤中记录荧光测量的结果并计算。连续稀释(10倍)的pEMS质粒的实时PCR分析的标准曲线。结果显示，至少102个拷贝数的pEMS质粒可被侦测到，且各引物对与探针组合的标准曲线的R2值皆大于0.99，表示本发明的引物对与探针可以被用于实时PCR，并产生可信的结果。
上述实施例结果表明，本发明的引物对与探针可用于cPCR扩增反应以检测副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)的存在，并且具有高度敏感度及专一性。
实施例2病原体微孢子虫(E.hepatopenaei,EHP)的检测
病原体微孢子虫(E.hepatopenaei,EHP)的18s核糖体核糖核酸(ribosomal RNA,rRNA)基因(GenBank accession No.KR021169)的片段被插入一选殖载体中，所述选殖载体可为，但不限于，pUC57、pGEM-T，以得到pEHP质粒。
1.传统聚合酶链锁反应
进行传统PCR所用的50μl PCR混合物含有：106个拷贝数的pEHP质粒、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.2μM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一热循环仪(例如，但不限于PC818,Astec Co.Ltd.，日本)中进行扩增反应，且包含一个变性的初始循环94℃持续3分钟，以及35个循环的94℃ 30秒、60℃ 30秒以及72℃延展30秒。扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶在TAE缓冲液(40mM Tris,20mM acetic acid,1mM EDTA)中分析，并且以溴化乙锭染色显现。
传统PCR的结果如表4所示，各引物对扩增了各目标序列的正确大小的片段，而在负对照组中则无目标序列被扩增(结果未显示)。所述结果表明，各引物对可用于传统PCR扩增反应以检测微孢子虫(E.hepatopenaei)的存在。
表4各引物对与探针组合进行传统PCR的结果
Figure BDA0002218387390000152
Figure BDA0002218387390000161
2.热对流聚合酶链锁反应(cPCR)
50μl的PCR混合物含有5μl微孢子虫(E.hepatopenaei)的18s rRNA基因的RNA(分别为102,103,104,105,106拷贝数/μl)或pEHP质粒(分别为102,103,104,105,106个拷贝数)、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.01-2μM探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(FAM)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(BHQ1))、0.2μMdNTP、1X cPCR缓冲液，以及1-5U Taq DNA聚合酶、1-5U反转录酶。将PCR混合物加入一反应试管中，并置于一热对流聚合酶链锁反应(cPCR)仪中一段指定的时间(约30～45分钟)。以所述cPCR仪侦测每个样本中的FAM荧光。重复上述cPCR分析试验8次(n＝8)以评各估引物对与探针的敏感度。
敏感度测试的结果如表5所示，各引物对及探针的组合皆可100％正确侦测到样品中含有102拷贝数/μl的微孢子虫(E.hepatopenaei)的18s rRNA基因的RNA或102个拷贝数的pEHP质粒，其敏感度可达102拷贝数/μl及102个拷贝数。
表5各引物对与探针组合的敏感度测试结果(n＝8)
Figure BDA0002218387390000162
Figure BDA0002218387390000171
此外，以不同的虾病原体基因质粒(106拷贝数/μl)作为cPCR模板分析上述各引物对及探针组合的专一性。cPCR方法如上所述。专一性测试的结果如表6所示，各引物对及探针的组合皆可正确侦测到含有微孢子虫(E.hepatopenaei，EHP)的样品，而侦测不到含有副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、白点症病毒(WSSV)、黄头病毒(YHV)、传染性肌肉坏死病毒(IMNV)、传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)，以及陶拉症候群病毒(TSV)的样品。所述结果显示各引物对及探针组合具有专一性。
表6各引物对与探针组合的专一性测试结果
Figure BDA0002218387390000172
Figure BDA0002218387390000181
“+”表示在所述样本中侦测到荧光讯号，而“-”表示在所述样本中未侦测到荧光讯号。
3.实时聚合酶链锁反应(real-time PCR,qPCR)
以稀释的pEHP质粒(分别为101,102,103,104,105,106,107个拷贝数)于一实时PCR仪(例如，但不限于ABI StepOnePlusTM；Applied BioSystem,Life Technologies，加州，美国)中进行实时PCR分析。以含有2μl pEHP质粒、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.01-2μM探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(FAM)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(BHQ1))，总体积为20μl的商用RT-PCR套组(例如，但不限于，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit；Takara Bio Inc.，日本)进行实时PCR分析。实时PCR的程序为42℃ 5分钟、94℃ 10秒，以及40个循环的94℃ 10秒以及60℃ 30分钟。在60℃的步骤中记录荧光测量的结果并计算。连续稀释(10倍)的pEHP质粒的实时PCR分析的标准曲线。结果显示，至少10个拷贝数的pEHP质粒可被侦测到，且各引物对与探针组合的标准曲线的R2值皆大于0.99，表示本发明的引物对与探针可以被用于实时PCR，并产生可信的结果。
上述实施例结果表明，本发明的引物对与探针可用于cPCR扩增反应以检测微孢子虫(E.hepatopenaei)的存在，并且具有高度敏感度及专一性。
实施例3病原体白点症病毒(WSSV)的检测
病原体白点症病毒(WSSV)的类VP664核鞘蛋白基因(GenBank accessionNo.MF101757)的片段被插入一选殖载体中，所述选殖载体可为，但不限于，pUC57、pGEM-T，以得到pWSSV质粒。
1.传统聚合酶链锁反应
进行传统PCR所用的50μl PCR混合物含有：106个拷贝数的pWSSV质粒、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.2μM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一热循环仪(例如，但不限于PC818,Astec Co.Ltd.，日本)中进行扩增反应，且包含一个变性的初始循环94℃持续3分钟，以及35个循环的94℃ 30秒、60℃ 30秒以及72℃延展30秒。扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶在TAE缓冲液(40mM Tris,20mM acetic acid,1mM EDTA)中分析，并且以溴化乙锭染色显现。
传统PCR的结果如表7所示，各引物对扩增了各目标序列的正确大小的片段，而在负对照组中则无目标序列被扩增(结果未显示)。所述结果表明，各引物对可用于传统PCR扩增反应以检测白点症病毒(WSSV)的存在。
表7各引物对与探针组合进行传统PCR的结果
正向引物 反向引物 合成片段大小(bp)
WSSV-F1(SEQ ID NO:37) WSSV-R1(SEQ ID NO:38) 70
WSSV-F2(SEQ ID NO:40) WSSV-R2(SEQ ID NO:41) 73
WSSV-F3(SEQ ID NO:43) WSSV-R3(SEQ ID NO:44) 96
WSSV-F4(SEQ ID NO:46) WSSV-R4(SEQ ID NO:47) 90
2.热对流聚合酶链锁反应(cPCR)
50μl的PCR混合物含有5μl白点症病毒(WSSV)的类VP664核鞘蛋白基因的RNA(分别为102,103,104,105,106拷贝数/μl)或pWSSV质粒(分别为102,103,104,105,106个拷贝数)、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.01-2μM探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(FAM)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(BHQ1))、0.2μMdNTP、1X cPCR缓冲液，以及1-5U Taq DNA聚合酶、1-5U反转录酶。将PCR混合物加入一反应试管中，并置于一热对流聚合酶链锁反应(cPCR)仪中一段指定的时间(约30～45分钟)。以所述cPCR仪侦测每个样本中的FAM荧光。重复上述cPCR分析试验8次(n＝8)以评各估引物对与探针的敏感度。
敏感度测试的结果如表8所示，各引物对及探针的组合皆可100％正确侦测到样品中含有102拷贝数/μl的白点症病毒(WSSV)的类VP664核鞘蛋白基因的RNA或102个拷贝数的pWSSV质粒，其敏感度可达102拷贝数/μl及102个拷贝数。
表8各引物对与探针组合的敏感度测试结果(n＝8)
Figure BDA0002218387390000191
Figure BDA0002218387390000201
此外，以不同的虾病原体基因质粒(106拷贝数/μl)作为cPCR模板分析上述各引物对及探针组合的专一性。cPCR方法如上所述。专一性测试的结果如表9所示，各引物对及探针的组合皆可正确侦测到含有白点症病毒(WSSV)的样品，而侦测不到含有副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、微孢子虫(EHP)、黄头病毒(YHV)、传染性肌肉坏死病毒(IMNV)、传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)，以及陶拉症候群病毒(TSV)的样品。所述结果显示各引物对及探针组合具有专一性。
表9各引物对与探针组合的专一性测试结果
Figure BDA0002218387390000202
“+”表示在所述样本中侦测到荧光讯号，而“-”表示在所述样本中未侦测到荧光讯号。
3.实时聚合酶链锁反应(real-time PCR,qPCR)
以稀释的pWSSV质粒(分别为101,102,103,104,105,106,107个拷贝数)于一实时PCR仪(例如，但不限于ABI StepOnePlusTM；Applied BioSystem,Life Technologies，加州，美国)中进行实时PCR分析。以含有2μl pWSSV质粒、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.01-2μM探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(FAM)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(BHQ1))，总体积为20μl的商用RT-PCR套组(例如，但不限于，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit；Takara Bio Inc.，日本)进行实时PCR分析。实时PCR的程序为42℃ 5分钟、94℃ 10秒，以及40个循环的94℃ 10秒以及60℃ 30分钟。在60℃的步骤中记录荧光测量的结果并计算。连续稀释(10倍)的pWSSV质粒的实时PCR分析的标准曲线。结果显示，至少102个拷贝数的pWSSV质粒可被侦测到，且各引物对与探针组合的标准曲线的R2值皆大于0.99，表示本发明的引物对与探针可以被用于实时PCR，并产生可信的结果。
上述实施例结果表明，本发明的引物对与探针可用于cPCR扩增反应以检测白点症病毒(WSSV)的存在，并且具有高度敏感度及专一性。
实施例4病原体黄头病毒(YHV)的检测
病原体黄头病毒(YHV)的开放读码框(Open reading frame,ORF)1B基因(GenBankaccession No.EU784982)的片段被插入一选殖载体中，所述选殖载体可为，但不限于，pUC57、pGEM-T，以得到pYHV质粒。
1.传统聚合酶链锁反应
进行传统PCR所用的50μl PCR混合物含有：106个拷贝数的pYHV质粒、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.2μM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一热循环仪(例如，但不限于PC818,Astec Co.Ltd.，日本)中进行扩增反应，且包含一个变性的初始循环94℃持续3分钟，以及35个循环的94℃ 30秒、60℃ 30秒以及72℃延展30秒。扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶在TAE缓冲液(40mM Tris,20mM acetic acid,1mM EDTA)中分析，并且以溴化乙锭染色显现。
传统PCR的结果如表10所示，各引物对扩增了各目标序列的正确大小的片段，而在负对照组中则无目标序列被扩增(结果未显示)。所述结果表明，各引物对可用于传统PCR扩增反应以检测黄头病毒(YHV)的存在。
表10各引物对与探针组合进行传统PCR的结果
正向引物 反向引物 合成片段大小(bp)
YHV-F1(SEQ ID NO:49) YHV-R1(SEQ ID NO:50) 73
YHV-F2(SEQ ID NO:52) YHV-R2(SEQ ID NO:53) 79
YHV-F3(SEQ ID NO:55) YHV-R3(SEQ ID NO:56) 88
YHV-F4(SEQ ID NO:58) YHV-R4(SEQ ID NO:59) 71
YHV-F4(SEQ ID NO:58) YHV-R5(SEQ ID NO:61) 86
YHV-F5(SEQ ID NO:60) YHV-R5(SEQ ID NO:61) 89
2.热对流聚合酶链锁反应(cPCR)
50μl的PCR混合物含有5μl黄头病毒(YHV)的ORF1B基因的RNA(分别为102,103,104,105,106拷贝数/μl)或pYHV质粒(分别为102,103,104,105,106个拷贝数)、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.01-2μM探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(FAM)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(BHQ1))、0.2μM dNTP、1X cPCR缓冲液，以及1-5U Taq DNA聚合酶、1-5U反转录酶。将PCR混合物加入一反应试管中，并置于一热对流聚合酶链锁反应(cPCR)仪中一段指定的时间(约30～45分钟)。以所述cPCR仪侦测每个样本中的FAM荧光。重复上述cPCR分析试验8次(n＝8)以评各估引物对与探针的敏感度。
敏感度测试的结果如表11所示，各引物对及探针的组合皆可100％正确侦测到样品中含有102拷贝数/μl的黄头病毒(YHV)的ORF1B基因的RNA或102个拷贝数的pYHV质粒，其敏感度可达102拷贝数/μl及102个拷贝数。
表11各引物对与探针组合的敏感度测试结果(n＝8)
Figure BDA0002218387390000221
此外，以不同的虾病原体基因质粒(106拷贝数/μl)作为cPCR模板分析上述各引物对及探针组合的专一性。cPCR方法如上所述。专一性测试的结果如表12所示，各引物对及探针的组合皆可正确侦测到含有黄头病毒(YHV)的样品，而侦测不到含有副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、微孢子虫(EHP)、白点症病毒(WSSV)、传染性肌肉坏死病毒(IMNV)、传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)，以及陶拉症候群病毒(TSV)的样品。所述结果显示各引物对及探针组合具有专一性。
表12各引物对与探针组合的专一性测试结果
Figure BDA0002218387390000222
Figure BDA0002218387390000231
“+”表示在所述样本中侦测到荧光讯号，而“-”表示在所述样本中未侦测到荧光讯号。
3.实时聚合酶链锁反应(real-time PCR,qPCR)
以稀释的pYHV质粒(分别为101,102,103,104,105,106,107个拷贝数)于一实时PCR仪(例如，但不限于ABI StepOnePlusTM；Applied BioSystem,Life Technologies，加州，美国)中进行实时PCR分析。以含有2μl pYHV质粒、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.01-2μM探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(FAM)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(BHQ1))，总体积为20μl的商用RT-PCR套组(例如，但不限于，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit；Takara Bio Inc.，日本)进行实时PCR分析。实时PCR的程序为42℃ 5分钟、94℃ 10秒，以及40个循环的94℃ 10秒以及60℃ 30分钟。在60℃的步骤中记录荧光测量的结果并计算。连续稀释(10倍)的pYHV质粒的实时PCR分析的标准曲线。结果显示，至少102个拷贝数的pYHV质粒可被侦测到，且各引物对与探针组合的标准曲线的R2值皆大于0.99，表示本发明的引物对与探针可以被用于实时PCR，并产生可信的结果。
上述实施例结果表明，本发明的引物对与探针可用于cPCR扩增反应以检测黄头病毒(YHV)的存在，并且具有高度敏感度及专一性。
实施例5病原体传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的检测
病原体传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的主要衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因(GenBank accession No.KJ636788.1)的片段被插入一选殖载体中，所述选殖载体可为，但不限于，pUC57、pGEM-T，以得到pIMNV质粒。
1.传统聚合酶链锁反应
进行传统PCR所用的50μl PCR混合物含有：106个拷贝数的pIMNV质粒、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.2μM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一热循环仪(例如，但不限于PC818,Astec Co.Ltd.，日本)中进行扩增反应，且包含一个变性的初始循环94℃持续3分钟，以及35个循环的94℃ 30秒、60℃ 30秒以及72℃延展30秒。扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶在TAE缓冲液(40mM Tris,20mM acetic acid,1mM EDTA)中分析，并且以溴化乙锭染色显现。
传统PCR的结果如表13所示，各引物对扩增了各目标序列的正确大小的片段，而在负对照组中则无目标序列被扩增(结果未显示)。所述结果表明，各引物对可用于传统PCR扩增反应以检测传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的存在。
表13各引物对与探针组合进行传统PCR的结果
正向引物 反向引物 合成片段大小(bp)
IMNV-F1(SEQ ID NO:62) IMNV-R1(SEQ ID NO:64) 87
IMNV-F2(SEQ ID NO:63) IMNV-R1(SEQ ID NO:64) 99
IMNV-F3(SEQ ID NO:66) IMNV-R1(SEQ ID NO:64) 102
IMNV-F4(SEQ ID NO:68) IMNV-R4(SEQ ID NO:69) 107
IMNV-F5(SEQ ID NO:71) IMNV-R5(SEQ ID NO:73) 65
IMNV-F5(SEQ ID NO:71) IMNV-R6(SEQ ID NO:74) 86
IMNV-F6(SEQ ID NO:72) IMNV-R5(SEQ ID NO:73) 69
IMNV-F6(SEQ ID NO:72) IMNV-R6(SEQ ID NO:74) 90
IMNV-F7(SEQ ID NO:76) IMNV-R7(SEQ ID NO:77) 96
2.热对流聚合酶链锁反应(cPCR)
50μl的PCR混合物含有5μl传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的主要衣壳蛋白(MCP)基因的RNA(分别为102,103,104,105,106拷贝数/μl)或pIMNV质粒(分别为102,103,104,105,106个拷贝数)、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.01-2μM探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(FAM)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(BHQ1))、0.2μM dNTP、1X cPCR缓冲液，以及1-5U Taq DNA聚合酶、1-5U反转录酶。将PCR混合物加入一反应试管中，并置于一热对流聚合酶链锁反应(cPCR)仪中一段指定的时间(约30～45分钟)。以所述cPCR仪侦测每个样本中的FAM荧光。重复上述cPCR分析试验8次(n＝8)以评各估引物对与探针的敏感度。
敏感度测试的结果如表14所示，各引物对及探针的组合皆可100％正确侦测到样品中含有102拷贝数/μl的传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的主要衣壳蛋白(MCP)基因的RNA或102个拷贝数的pIMNV质粒，其敏感度可达102拷贝数/μl及102个拷贝数。
表14各引物对与探针组合的敏感度测试结果(n＝8)
Figure BDA0002218387390000241
Figure BDA0002218387390000251
此外，以不同的虾病原体基因质粒(106拷贝数/μl)作为cPCR模板分析上述各引物对及探针组合的专一性。cPCR方法如上所述。专一性测试的结果如表15所示，各引物对及探针的组合皆可正确侦测到含有传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的样品，而侦测不到含有副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、微孢子虫(EHP)、白点症病毒(WSSV)、黄头病毒(YHV)、传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)，以及陶拉症候群病毒(TSV)的样品。所述结果显示各引物对及探针组合具有专一性。
表15各引物对与探针组合的专一性测试结果
Figure BDA0002218387390000252
Figure BDA0002218387390000261
“+”表示在所述样本中侦测到荧光讯号，而“-”表示在所述样本中未侦测到荧光讯号。
3.实时聚合酶链锁反应(real-time PCR,qPCR)
以稀释的pIMNV质粒(分别为101,102,103,104,105,106,107个拷贝数)于一实时PCR仪(例如，但不限于ABI StepOnePlusTM；Applied BioSystem,Life Technologies，加州，美国)中进行实时PCR分析。以含有2μl pIMNV质粒、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.01-2μM探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(FAM)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(BHQ1))，总体积为20μl的商用RT-PCR套组(例如，但不限于，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit；Takara Bio Inc.，日本)进行实时PCR分析。实时PCR的程序为42℃ 5分钟、94℃ 10秒，以及40个循环的94℃ 10秒以及60℃ 30分钟。在60℃的步骤中记录荧光测量的结果并计算。连续稀释(10倍)的pIMNV质粒的实时PCR分析的标准曲线。结果显示，至少102个拷贝数的pIMNV质粒可被侦测到，且各引物对与探针组合的标准曲线的R2值皆大于0.99，表示本发明的引物对与探针可以被用于实时PCR，并产生可信的结果。
上述实施例结果表明，本发明的引物对与探针可用于cPCR扩增反应以检测传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的存在，并且具有高度敏感度及专一性。
实施例6病原体传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)的检测
病原体传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)的基因组(GenBank accessionNo.AF218266)的片段被插入一选殖载体中，所述选殖载体可为，但不限于，pUC57、pGEM-T，以得到pIHHNV质粒。
1.传统聚合酶链锁反应
进行传统PCR所用的50μl PCR混合物含有：106个拷贝数的pIHHNV质粒、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.2μM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一热循环仪(例如，但不限于PC818,Astec Co.Ltd.，日本)中进行扩增反应，且包含一个变性的初始循环94℃持续3分钟，以及35个循环的94℃ 30秒、60℃ 30秒以及72℃延展30秒。扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶在TAE缓冲液(40mM Tris,20mM acetic acid,1mM EDTA)中分析，并且以溴化乙锭染色显现。
传统PCR的结果如表16所示，各引物对扩增了各目标序列的正确大小的片段，而在负对照组中则无目标序列被扩增(结果未显示)。所述结果表明，各引物对可用于传统PCR扩增反应以检测传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)的存在。
表16各引物对与探针组合进行传统PCR的结果
正向引物 反向引物 合成片段大小(bp)
IHHNV-F1(SEQ ID NO:79) IHHNV-R1(SEQ ID NO:80) 79
IHHNV-F1(SEQ ID NO:79) IHHNV-R2(SEQ ID NO:83) 106
IHHNV-F1(SEQ ID NO:79) IHHNV-R3(SEQ ID NO:85) 104
IHHNV-F2(SEQ ID NO:82) IHHNV-R2(SEQ ID NO:83) 101
IHHNV-F2(SEQ ID NO:82) IHHNV-R3(SEQ ID NO:85) 99
IHHNV-F2(SEQ ID NO:82) IHHNV-R4(SEQ ID NO:86) 88
IHHNV-F5(SEQ ID NO:87) IHHNV-R5(SEQ ID NO:88) 91
IHHNV-F5(SEQ ID NO:87) IHHNV-R6(SEQ ID NO:91) 101
IHHNV-F6(SEQ ID NO:90) IHHNV-R5(SEQ ID NO:88) 84
2.热对流聚合酶链锁反应(cPCR)
50μl的PCR混合物含有5μl传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)的基因组片段的RNA(分别为102,103,104,105,106拷贝数/μl)或pIHHNV质粒(分别为102,103,104,105,106个拷贝数)、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.01-2μM探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(FAM)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(BHQ1))、0.2μM dNTP、1X cPCR缓冲液，以及1-5U Taq DNA聚合酶、1-5U反转录酶。将PCR混合物加入一反应试管中，并置于一热对流聚合酶链锁反应(cPCR)仪中一段指定的时间(约30～45分钟)。以所述cPCR仪侦测每个样本中的FAM荧光。重复上述cPCR分析试验8次(n＝8)以评各估引物对与探针的敏感度。
敏感度测试的结果如表17所示，各引物对及探针的组合皆可100％正确侦测到样品中含有102拷贝数/μl的传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)的基因组片段的RNA或102个拷贝数的pIHHNV质粒，其敏感度可达102拷贝数/μl及102个拷贝数。
表17各引物对与探针组合的敏感度测试结果(n＝8)
Figure BDA0002218387390000281
此外，以不同的虾病原体基因质粒(106拷贝数/μl)作为cPCR模板分析上述各引物对及探针组合的专一性。cPCR方法如上所述。专一性测试的结果如表18所示，各引物对及探针的组合皆可正确侦测到含有传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)的样品，而侦测不到含有副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、微孢子虫(EHP)、白点症病毒(WSSV)、黄头病毒(YHV)、传染性肌肉坏死病毒(IMNV)，以及陶拉症候群病毒(TSV)的样品。所述结果显示各引物对及探针组合具有专一性。
表18各引物对与探针组合的专一性测试结果
Figure BDA0002218387390000282
Figure BDA0002218387390000291
“+”表示在所述样本中侦测到荧光讯号，而“-”表示在所述样本中未侦测到荧光讯号。
3.实时聚合酶链锁反应(real-time PCR,qPCR)
以稀释的pIHHNV质粒(分别为101,102,103,104,105,106,107个拷贝数)于一实时PCR仪(例如，但不限于ABI StepOnePlusTM；Applied BioSystem,Life Technologies，加州，美国)中进行实时PCR分析。以含有2μl pIHHNV质粒、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.01-2μM探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(FAM)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(BHQ1))，总体积为20μl的商用RT-PCR套组(例如，但不限于，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit；Takara Bio Inc.，日本)进行实时PCR分析。实时PCR的程序为42℃ 5分钟、94℃ 10秒，以及40个循环的94℃ 10秒以及60℃ 30分钟。在60℃的步骤中记录荧光测量的结果并计算。连续稀释(10倍)的pIHHNV质粒的实时PCR分析的标准曲线。结果显示，至少102个拷贝数的pIHHNV质粒可被侦测到，且各引物对与探针组合的标准曲线的R2值皆大于0.99，表示本发明的引物对与探针可以被用于实时PCR，并产生可信的结果。
上述实施例结果表明，本发明的引物对与探针可用于cPCR扩增反应以检测传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)的存在，并且具有高度敏感度及专一性。
实施例7病原体陶拉症候群病毒(TSV)的检测
病原体陶拉症候群病毒(TSV)的基因组(GenBank accession No.AF277675)片段被插入一选殖载体中，所述选殖载体可为，但不限于，pUC57、pGEM-T，以得到pTSV质粒。
1.传统聚合酶链锁反应
进行传统PCR所用的50μl PCR混合物含有：106个拷贝数的pTSV质粒、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.2μM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一热循环仪(例如，但不限于PC818,Astec Co.Ltd.，日本)中进行扩增反应，且包含一个变性的初始循环94℃持续3分钟，以及35个循环的94℃ 30秒、60℃ 30秒以及72℃延展30秒。扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶在TAE缓冲液(40mM Tris,20mM acetic acid,1mM EDTA)中分析，并且以溴化乙锭染色显现。
传统PCR的结果如表19所示，各引物对扩增了各目标序列的正确大小的片段，而在负对照组中则无目标序列被扩增(结果未显示)。所述结果表明，各引物对可用于传统PCR扩增反应以检测陶拉症候群病毒(TSV)的存在。
表19各引物对与探针组合进行传统PCR的结果
正向引物 反向引物 合成片段大小(bp)
TSV-F1(SEQ ID NO:92) TSV-R1(SEQ ID NO:93) 90
TSV-F2(SEQ ID NO:95) TSV-R2(SEQ ID NO:96) 98
TSV-F3(SEQ ID NO:98) TSV-R3(SEQ ID NO:101) 79
TSV-F4(SEQ ID NO:99) TSV-R3(SEQ ID NO:101) 74
TSV-F4(SEQ ID NO:99) TSV-R4(SEQ ID NO:102) 111
TSV-F5(SEQ ID NO:100) TSV-R3(SEQ ID NO:101) 82
2.热对流聚合酶链锁反应(cPCR)
50μl的PCR混合物含有5μl陶拉症候群病毒(TSV)的基因组片段的RNA(分别为102,103,104,105,106拷贝数/μl)或pTSV质粒(分别为102,103,104,105,106个拷贝数)、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.01-2μM探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(FAM)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(BHQ1))、0.2μM dNTP、1XcPCR缓冲液，以及1-5U Taq DNA聚合酶、1-5U反转录酶。将PCR混合物加入一反应试管中，并置于一热对流聚合酶链锁反应(cPCR)仪中一段指定的时间(约30～45分钟)。以所述cPCR仪侦测每个样本中的FAM荧光。重复上述cPCR分析试验8次(n＝8)以评各估引物对与探针的敏感度。
敏感度测试的结果如表20所示，各引物对及探针的组合皆可100％正确侦测到样品中含有102拷贝数/μl的陶拉症候群病毒(TSV)的基因组片段的RNA或102个拷贝数的pTSV质粒，其敏感度可达102拷贝数/μl及102个拷贝数。
表20各引物对与探针组合的敏感度测试结果(n＝8)
Figure BDA0002218387390000301
Figure BDA0002218387390000311
此外，以不同的虾病原体基因质粒(106拷贝数/μl)作为cPCR模板分析上述各引物对及探针组合的专一性。cPCR方法如上所述。专一性测试的结果如表21所示，各引物对及探针的组合皆可正确侦测到含有陶拉症候群病毒(TSV)的样品，而侦测不到含有副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、微孢子虫(EHP)、白点症病毒(WSSV)、黄头病毒(YHV)、传染性肌肉坏死病毒(IMNV)，以及传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)的样品。所述结果显示各引物对及探针组合具有专一性。
表21各引物对与探针组合的专一性测试结果
Figure BDA0002218387390000312
Figure BDA0002218387390000321
“+”表示在所述样本中侦测到荧光讯号，而“-”表示在所述样本中未侦测到荧光讯号。
3.实时聚合酶链锁反应(real-time PCR,qPCR)
以稀释的pTSV质粒(分别为101,102,103,104,105,106,107个拷贝数)于一实时PCR仪(例如，但不限于ABI StepOnePlusTM；Applied BioSystem,Life Technologies，加州，美国)中进行实时PCR分析。以含有2μl pTSV质粒、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.01-2μM探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(FAM)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(BHQ1))，总体积为20μl的商用RT-PCR套组(例如，但不限于，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit；TakaraBio Inc.，日本)进行实时PCR分析。实时PCR的程序为42℃ 5分钟、94℃ 10秒，以及40个循环的94℃ 10秒以及60℃ 30分钟。在60℃的步骤中记录荧光测量的结果并计算。连续稀释(10倍)的pTSV质粒的实时PCR分析的标准曲线。结果显示，至少102个拷贝数的pTSV质粒可被侦测到，且各引物对与探针组合的标准曲线的R2值皆大于0.99，表示本发明的引物对与探针可以被用于实时PCR，并产生可信的结果。
上述实施例结果表明，本发明的引物对与探针可用于cPCR扩增反应以检测陶拉症候群病毒(TSV)的存在，并且具有高度敏感度及专一性。
上列详细说明系针对本发明之一可行实施例的具体说明，惟该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。
序列表
<110> 福又达生物科技股份有限公司
<120> 虾病原体检测方法
<130> P19-0208
<160> 103
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtttgcaact ggaaggtcat ttt 23
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aacgcggcaa ctttgtcag 19
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atttgtggca tgcttgcgga tca 23
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccatttacaa cgccctgata 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atggcgctag tcgtggtttc tgtaca 26
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgtgggctga taacgactct t 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
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caaagccgtg aaccgtacac 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgtgtatgat gaagtgatgg gtgctcgtag 30
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<211> 21
<212> DNA
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<400> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agggttaaat tccgtcaaag atg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aagaaggtgc tcacatgact aacgaatacg 30
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tcttacaata atgcaaacca agat 24
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gttcaaagcc gtgaaccgta cacc 24
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gcaattaaaa ggtggtgtta aaagc 25
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tttgcccacc tataccatgc 20
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ttgagtttgt tgagagtagc ggaacggata g 31
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aattaaaagg tggtgttaaa agccatt 27
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cccacctata ccatgctccc tat 23
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
agtttgttga gagtagcgga a 21
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cgtagatgca attaaaaggt ggtgt 25
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tcattctttg cccacctata cc 22
<210> 26
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tttgttgaga gtagcggaac ggataggga 29
<210> 27
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
aattaaaagg tggtgttaaa agccat 26
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
atttcattct ttgcccacct ata 23
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
aaaggtggtg ttaaaagcca ttgag 25
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
attctttgcc cacctatacc atg 23
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gagggagcct gagagatggc 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tgccctccaa ttgcttcacg 20
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
cgcgcctgct gccgtccttg g 21
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
cgtgaagcaa ttggagggca a 21
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gcatctacga ctacggaccc t 21
<210> 36
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
tggtgccagc agccgcggta attcca 26
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
atggtcccgt cctcatctca 20
<210> 38
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gctgccttgc cggaaat 17
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
tgtgatagac ggcattcttc atggc 25
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
aacaatggtc ccgtcctca 19
<210> 41
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ctgccttgcc ggaaattag 19
<210> 42
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
tctcagaagc catgaagaat gccgtct 27
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ccaagggaac tgtcgcttca 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
tccttggcag agcattctgg 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tgccagccgt cttccaggca 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
aaagaacgcc gaacaaggtg 20
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
actcgagcca aatgcttacg a 21
<210> 48
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
ctgccgtatc ctctacct 18
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
cgtggaatcg tcgtcagcta 20
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
gactgacggc tacattcaca atg 23
<210> 51
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
cgcaatactg cgttcacaaa ggatcca 27
<210> 52
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
tgacattcaa atccccatct acac 24
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
gcggtagctg acgacgattc 20
<210> 54
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
catcgcaagg cagaacattt gaccg 25
<210> 55
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
agaaatccac tacagtcatc gcat 24
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
tggtatggga atggcttgat 20
<210> 57
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
atggaccaca gaacaaa 17
<210> 58
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
aatccactac agtcatcgca tac 23
<210> 59
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
cttgatgttg tcagtgtaca trttgg 26
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
agaaatccac tacagtcatc gca 23
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
gtggtatggg aakggcttga 20
<210> 62
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
tttgactgac tatcttgtat cctggg 26
<210> 63
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
gccaactgta aatttgactg actatctt 28
<210> 64
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
ggcagtgttg ttttcattct ttca 24
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
aaccgatttc acacttggcg a 21
<210> 66
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
cytgccaact gtaaatttga ctga 24
<210> 67
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
caaccgattt cacacttggc gacataa 27
<210> 68
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
cgagacttga tggcagcac 19
<210> 69
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
gctgttcctg ggacttcctt t 21
<210> 70
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
attcagagca atgtggc 17
<210> 71
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
actgactatc ttgtatcctg gg 22
<210> 72
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
tttgactgac tatcttgtat cctggg 26
<210> 73
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
tctttcaacc aattgtttta tg 22
<210> 74
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
attggcagtg ttgttttcat tctt 24
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
aaccgatttc acacttggcg a 21
<210> 76
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
gtaaacgcaa tgcagaggaa ac 22
<210> 77
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
ccctggacga ctgctgtc 18
<210> 78
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
atgctcagag acaacg 16
<210> 79
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
cgtcagggcg aaccagaat 19
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
gagaaattcc ctggctggag 20
<210> 81
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
cacttagtga attgcttcga gaacgcacga 30
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
gggcgaacca gaatcactta g 21
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
gatttggacc tggggtgaga 20
<210> 84
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
agaacgcacg aacgaa 16
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
tttggacctg gggtgagaag 20
<210> 86
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
ggtgagaagg cttggagaaa t 21
<210> 87
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
tcaacactgt catcccgacg acg 23
<210> 88
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
actaagtgat tctggttcgc cctgacg 27
<210> 89
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
agaaaatatg gccaaggaca tactgcatac 30
<210> 90
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
tgtcatcccg acgacgaaga atg 23
<210> 91
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
gaagcaattc actaagtgat tctggtt 27
<210> 92
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
acagataacc tgtttgaagt ccagg 25
<210> 93
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
actagatgtc caactgtcgt tatgaag 27
<210> 94
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
ccaagctctc attgaatctc tctctcgcg 29
<210> 95
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
gaaatcgctc ggaaggtgt 19
<210> 96
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
aacaggcact tcacacacat cc 22
<210> 97
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
caggtgatrt taggcgagtt gcgcg 25
<210> 98
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
ttttggacct gccgaattg 19
<210> 99
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
gacctgccga attggcttaa ttt 23
<210> 100
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
cacttttgga cctgccgaa 19
<210> 101
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
ggcacctcaa cccacgc 17
<210> 102
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
aactgttgag ataaatgcac cat 23
<210> 103
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
acccttcagg tgtagacccg tcattgtg 28

Claims (16)

1.一种用于侦测虾病原体的寡核苷酸对，包含一第一引物与一第二引物，所述病原体选自由下列所组成之群组：副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、微孢子虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)、白点症病毒(White spot syndrome virus,WSSV)、黄头病毒(Yellow-head Virus,YHV)、传染性肌肉坏死病毒(Infectious MyonecrosisVirus,IMNV)、传染性皮下及造血组织坏死症病毒(infectious hypodermal andhaematopoietic necrosis virus,IHHNV)，以及陶拉症候群病毒(Taura syndrome virus,TSV)；
其中所述病原体为副溶血弧菌时，所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:16与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:16与SEQ ID NO:17，以及SEQ ID NO:13与SEQ ID NO:14；
其中所述病原体为微孢子虫(EHP)时，所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:18与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21与SEQ ID NO:22、SEQID NO:24与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:24与SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:27与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27与SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29与SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:31与SEQ ID NO:32，以及SEQ ID NO:34与SEQ ID NO:35；
其中所述病原体为白点症病毒(WSSV)时，所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:37与SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40与SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43与SEQ ID NO:44，以及SEQ ID NO:46与SEQ ID NO:47；
其中所述病原体为黄头病毒(YHV)时，所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:49与SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52与SEQ ID NO:53、SEQID NO:55与SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58与SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:58与SEQ ID NO:61，以及SEQ ID NO:60与SEQ ID NO:61；
其中所述病原体为传染性肌肉坏死病毒(IMNV)时，所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:62与SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:63与SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:66与SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:68与SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71与SEQID NO:73、SEQ ID NO:71与SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:72与SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:72与SEQ ID NO:74，以及SEQ ID NO:76与SEQ ID NO:77；
其中所述病原体为传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)时，所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:79与SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:79与SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:79与SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:82与SEQ ID NO:83、SEQID NO:82与SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:82与SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87与SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:87与SEQ ID NO:91，以及SEQ ID NO:90与SEQ ID NO:88；以及
其中所述病原体为陶拉症候群病毒(TSV)时，所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:92与SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95与SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98与SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:99与SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:99与SEQID NO:102，以及SEQ ID NO:100与SEQ ID NO:101。
2.如权利要求1所述的寡核苷酸对，进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针具有一寡核苷酸探针序列、一附加于所述寡核苷酸探针上的一第一位置的荧光分子，以及一附加于所述寡核苷酸探针上的一第二位置的荧光抑制分子。
3.如权利要求2所述的寡核苷酸对，其中所述病原体为副溶血弧菌，且
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体副溶血弧菌的与光杆菌同源性的昆虫相关(Photorhabdus insect-related,Pir)毒素基因的第1824至第1854个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:5时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体副溶血弧菌的Pir毒素基因的第996至第1065个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体副溶血弧菌的Pir毒素基因的第520至第599个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:10与SEQ ID NO:17时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体副溶血弧菌的Pir毒素基因的第1267至第1320个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:16与SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:16与SEQ ID NO:17时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体副溶血弧菌的Pir毒素基因的第1287至第1320个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸；以及
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:13与SEQ ID NO:14时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体副溶血弧菌的Pir毒素基因的第580至第636个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸。
4.如权利要求2所述的寡核苷酸对，其中所述病原体为副溶血弧菌，且
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:3所示；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:5时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:6所示；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:9所示；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:16与SEQ ID NO:11，以及SEQ IDNO:16与SEQ ID NO:17时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:12所示；以及
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:13与SEQ ID NO:14时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:15所示。
5.如权利要求2所述的寡核苷酸对，其中所述病原体为微孢子虫(EHP)，且
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:18与SEQ ID NO:19时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体微孢子虫(EHP)的18s核糖体核糖核酸(ribosomalRNA,rRNA)基因的第384至第419个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:21与SEQ ID NO:22时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体微孢子虫(EHP)的18s rRNA基因的第388至第412个核苷酸之间的13至25个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:24与SEQ ID NO:25时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体微孢子虫(EHP)的18s rRNA基因的第377至第423个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:24与SEQ ID NO:30时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体微孢子虫(EHP)的18s rRNA基因的第377至第420个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:27与SEQ ID NO:25时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体微孢子虫(EHP)的18s rRNA基因的第387至第423个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:27与SEQ ID NO:28时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体微孢子虫(EHP)的18s rRNA基因的第387至第425个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:29与SEQ ID NO:25时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体微孢子虫(EHP)的18s rRNA基因的第391至第423个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:29与SEQ ID NO:28时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体微孢子虫(EHP)的18s rRNA基因的第391至第425个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:31与SEQ ID NO:32时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体微孢子虫(EHP)的18s rRNA基因的第154至第253个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；以及
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:34与SEQ ID NO:35时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体微孢子虫(EHP)的18s rRNA基因的第275至第339个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸。
6.如权利要求2所述的寡核苷酸对，其中所述病原体为微孢子虫(EHP)，且
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:18与SEQ ID NO:19时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:20所示；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:21与SEQ ID NO:22时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:23所示；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:24与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:24与SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:27与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27与SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29与SEQ ID NO:25，以及SEQ ID NO:29与SEQ ID NO:28时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:26所示；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:31与SEQ ID NO:32时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:33所示；以及
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:34与SEQ ID NO:35时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:36所示。
7.如权利要求2所述的寡核苷酸对，其中所述病原体为白点症病毒(WSSV)，且
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:37与SEQ ID NO:38时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体白点症病毒(WSSV)的类VP664核鞘蛋白基因的第964至第996个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:40与SEQ ID NO:41时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体白点症病毒(WSSV)的类VP664核鞘蛋白基因的第959至第993个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:43与SEQ ID NO:44时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体白点症病毒(WSSV)的类VP664核鞘蛋白基因的第613至第668个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；以及
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:46与SEQ ID NO:47时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体白点症病毒(WSSV)的类VP664核鞘蛋白基因的第1121至第1169个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸。
8.如权利要求2所述的寡核苷酸对，其中所述病原体为白点症病毒(WSSV)，且
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:37与SEQ ID NO:38时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:39所示；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:40与SEQ ID NO:41时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:42所示；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:43与SEQ ID NO:44时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:45所示；以及
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:46与SEQ ID NO:47时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:48所示。
9.如权利要求2所述的寡核苷酸对，其中所述病原体为黄头病毒(YHV)，且
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:49与SEQ ID NO:50时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体黄头病毒(YHV)的开放读码框(Open reading frame,ORF)1B基因的第142至第171个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:52与SEQ ID NO:53时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体黄头病毒(YHV)的ORF1B基因的第91至第125个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:55与SEQ ID NO:56时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体黄头病毒(YHV)的ORF1B基因的第306至第349个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:58与SEQ ID NO:59时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体黄头病毒(YHV)的ORF1B基因的第308至第329个核苷酸之间的13至22个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:58与SEQ ID NO:61时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体黄头病毒(YHV)的ORF1B基因的第308至第350个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；以及
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:60与SEQ ID NO:61时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体黄头病毒(YHV)的ORF1B基因的第305至第350个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸。
10.如权利要求2所述的寡核苷酸对，其中所述病原体为黄头病毒(YHV)，且
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:49与SEQ ID NO:50时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:51所示；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:52与SEQ ID NO:53时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:54所示；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:55与SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58与SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:58与SEQ ID NO:61，以及SEQ IDNO:60与SEQ ID NO:61时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:57所示。
11.如权利要求2所述的寡核苷酸对，其中所述病原体为传染性肌肉坏死病毒(IMNV)，且
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:62与SEQ ID NO:64时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的主要衣壳蛋白(majorcapsid protein,MCP)基因的第1493至第1529个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:63与SEQ ID NO:64时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的主要衣壳蛋白(MCP)基因的第1483至第1529个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:66与SEQ ID NO:64时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的主要衣壳蛋白(MCP)基因的第1476至第1529个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:68与SEQ ID NO:69时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的主要衣壳蛋白(MCP)基因的第1580至第1646个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:71与SEQ ID NO:73或SEQ IDNO:72与SEQ ID NO:73时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的主要衣壳蛋白(MCP)基因的第1493至第1514个核苷酸之间的13至22个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:71与SEQ ID NO:74或SEQ IDNO:72与SEQ ID NO:74时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的主要衣壳蛋白(MCP)基因的第1493至第1532个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；以及
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:76与SEQ ID NO:77时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的主要衣壳蛋白(MCP)基因的第2774至第2829个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸。
12.如权利要求2所述的寡核苷酸对，其中所述病原体为传染性肌肉坏死病毒(IMNV)，且
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:62与SEQ ID NO:64或SEQ IDNO:63与SEQ ID NO:64时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:65所示；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:66与SEQ ID NO:64时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:67所示；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:68与SEQ ID NO:69时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:70所示；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:71与SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:71与SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:72与SEQ ID NO:73，以及SEQ IDNO:72与SEQ ID NO:74时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:75所示；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:76与SEQ ID NO:77时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:78所示。
13.如权利要求2所述的寡核苷酸对，其中所述病原体为传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)，且
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:79与SEQ ID NO:80时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)的基因组的第693至第732个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:79与SEQ ID NO:83时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)的基因组的第693至第759个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:79与SEQ ID NO:85时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)的基因组的第693至第757个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:82与SEQ ID NO:83时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)的基因组的第700至第759个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:82与SEQ ID NO:85时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)的基因组的第700至第757个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:82与SEQ ID NO:86时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)的基因组的第700至第745个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:87与SEQ ID NO:88时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)的基因组的第633至第673个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:87与SEQ ID NO:91时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)的基因组的第633至第683个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；以及
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:90与SEQ ID NO:88时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)的基因组的第640至第673个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸。
14.如权利要求2所述的寡核苷酸对，其中所述病原体为传染性皮下及造血组织坏死症病毒(IHHNV)，且
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:79与SEQ ID NO:80或SEQ IDNO:79与SEQ ID NO:83时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:81所示；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:79与SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:82与SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:82与SEQ ID NO:85，以及SEQ IDNO:82与SEQ ID NO:86时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:84所示；以及
所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:87与SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:87与SEQ ID NO:91，以及SEQ ID NO:90与SEQ ID NO:88时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:89所示。
15.如权利要求2所述的寡核苷酸对，其中所述病原体为陶拉症候群病毒(TSV)，且
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:92与SEQ ID NO:93时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体陶拉症候群病毒(TSV)的基因组的第7125至第7162个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:95与SEQ ID NO:96时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体陶拉症候群病毒(TSV)的基因组的第3995至第4051个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:98与SEQ ID NO:101时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体陶拉症候群病毒(TSV)的基因组的第9976至第10018个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:99与SEQ ID NO:101时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体陶拉症候群病毒(TSV)的基因组的第9985至第10018个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:99与SEQ ID NO:102时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体陶拉症候群病毒(TSV)的基因组的第9985至第10049个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；以及
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:100与SEQ ID NO:101时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体陶拉症候群病毒(TSV)的基因组的第9973至第10018个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸。
16.如权利要求2所述的寡核苷酸对，其中所述病原体为陶拉症候群病毒(TSV)，且
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:92与SEQ ID NO:93时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:94所示；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:95与SEQ ID NO:96时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:97所示；以及
所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:98与SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:99与SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:99与SEQ ID NO:102，以及SEQID NO:100与SEQ ID NO:101时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:103所示。
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