CN107365858A - 脊尾白虾感染wssv后检测健康状态lamp检测引物及体系与方法 - Google Patents

脊尾白虾感染wssv后检测健康状态lamp检测引物及体系与方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于检测脊尾白虾感染白斑综合征病毒前后健康状态的LAMP检测方法。该方法是在脊尾白虾中经大量筛选获得的在WSSV爆发前期表达量呈大幅上调的基因，针对该基因的cDNA序列设计6条引物，并建立了一套环介导等温扩增反应(Loop‑mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法。本方法无需进行核酸提取纯化，成本低，操作方便，检测过程快速，灵敏。利用这一方法可以快速有效地在感染WSSV的脊尾白虾发病前期起到诊断和预警作用。

Description

脊尾白虾感染WSSV后检测健康状态LAMP检测引物及体系与 方法
技术领域
本发明涉及感染白斑综合征病毒后脊尾白虾健康状态评估的LAMP检测方法。
背景技术
脊尾白虾是我国大陆沿海一种重要的小型经济虾类，具有生长快速、口感鲜美等特点，但是，随着养殖规模的扩大，病害问题成为严重影响产业发展的阻碍。白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)是其中最为严重的病原之一。WSSV属线形病毒科(Nimaviridae)白斑病毒属(Whispovirus)，是一种环状双链DNA病毒，能感染脊尾白虾、对虾、螯虾等各种虾类。脊尾白虾在感染WSSV后，一旦发病，宿主死亡率在7-10天内达到100％，给虾类养殖业带来严重的经济损失。目前针对WSSV的诊断方法，主要是以PCR、realtime-PCR等手段检测病毒核酸的情况，还没有检测和评估宿主健康状态的检测方法。而高等动物，例如人的健康状态检测方法，往往是从人体的一些健康指标和参数出发，如各类血细胞数目，血糖，血脂，尿酸，肌酐，转氨酶等方面进行检测。这些参数在人体健康状态下往往处在一个相对稳定的范围内，但是当机体收到病原入侵，或者其他外界不良刺激时，就会导致以上的某一或某些指标的升高或者降低，出现不正常的波动。因此通过检测这些指标，可以直接反映机体的健康状态。本方法从脊尾白虾中筛选到与WSSV感染后的健康状态相关的一个基因，并针对这一基因设计了快速，有效的环介导等温扩增反应(Loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)的检测方法。可以用于评估虾的健康状态。
发明内容
本发明旨在提供一种用于评价感染白斑综合征病毒后脊尾白虾健康状况的LAMP检测方法。
本发明提供的LAMP检测用到的检测引物为：
F3-1(SEQ ID NO:2)：
5'-TCGTCAGCAGAACATGACAG-3'
B3-1(SEQ ID NO:3)：
5'-GCCACTTTGTCGCTAACGT-3'
FIP-1(SEQ ID NO:4)：
5'-AGGGCTTCGAAGGCCAGTACTA-AGGAAATCCTCCAGTCCCA-3'
BIP-1(SEQ ID NO:5)：
5'-AGTAACACAGGGGTACTGGCCA-CCGTAGCCACTTCCTCATCA-3'
LF-1(SEQ ID NO:6)：
5'-CCGAGGCCAAAGATGCCA-3'
LB-1(SEQ ID NO:7)：
5'-CGCCTGCTCAAGTTCAGGA-3'
所述的用于检测感染WSSV前后脊尾白虾健康状态的LAMP检测方法，其检测体系(检测体系也可为制备的试剂或试剂盒)包括：
(1)采样管，用来盛放、研磨待检虾组织样品；
(2)漂洗管，内装蒸馏水；
(3)核酸变性管，内装TE缓冲液；
(4)扩增检测管，内装扩增反应液和染料，扩增反应液组成成分如下：扩增引物的上游引物FIP-1和下游引物BIP-1各1～3μM，扩增引物的解链引物LF-1和LB-1各0.5～1.5μM，扩增引物的上游引物F3-1和下游引物B3-1各0.1～0.5μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各0.8～2.2mM，MgCl2 2～8mM，Betaine(甜菜碱)0.6～1.5M，Tris-HCl 10～40mM，KCl 10～20mM，MgSO4 1～6mM，(NH4)2SO4 6～12mM，Triton X-100 0.05％～1.0％，反转录酶1～20U，BstDNA聚合酶2～20U；染料使用核酸染料，可选用SYBR Green、GelRed、GelGreen、GoldViewTM或GeneFinderTM等核酸染料中的任意一种，核酸染料预先粘附于扩增检测管管壁内侧上方或扩增检测管盖子内侧；
(5)阴性对照管，内装吸附了未感染WSSV的脊尾白虾RNA的FTA膜片；
(6)阳性对照管，内装吸附了感染WSSV后脊尾白虾RNA的FTA膜片；
(7)快速干燥液，为无水乙醇；
(8)分别封装于无菌袋中的FTA膜片、研磨棒、牙签和吸管。
具体检测步骤如下：
(1)取待检测虾的组织样品0.1-1g，置于采样管中，使用研磨棒将组织样品研磨匀浆；
(2)用牙签挑取膜片，置于样品浆中，充分润湿后，再用牙签挑回膜片管中；
(3)用吸管吸取无水乙醇，滴2～3滴于管内润湿的采样用膜片上，轻弹管底搅动膜片30秒；
(4)用新牙签将上述采样用膜片转移到相应编号的漂洗管内，将漂洗管晃荡3～4分钟；
(5)用新牙签将上述漂洗管内的膜片以及阳性和阴性对照管中的阳性对照FTA膜片、阴性对照FTA膜片转移到相应编号的核酸变性管内，95℃保温5分钟，然后再置于冷水中快速冷却2分钟；
(6)再用新牙签将上述核酸变性管内的膜片转移到相应编号的检测管内的液体中，将检测管置于60℃(可以用水浴锅、金属浴或PCR仪保温；使用PCR仪时切勿用热盖程序)保温70-75分钟；
(7)90～95℃下保温2～5分钟，然后迅速将检测管上下剧烈晃动5～10秒；反复几次直到反应液与管盖上的核酸染料混匀，管内反应液出现颜色，而管盖上的红点消失；
(8)向下甩动检测管，使管内有颜色反应液集聚于管底，再竖直在90～95℃保温1分钟，取出反应管，让其自然冷却，观察反应液颜色，判断检测结果；
(9)如果反应液呈现绿色则表示该样品的检测结果为阳性，如果反应液呈现橙黄色则表示该样品的检测结果为阴性。
本发明的优点
1.本发明基于环介导等温扩增反应(Loop-mediated isothermalamplification,LAMP)检测方法，无需进行核酸提取纯化，成本低、操作方便，检测过程快速、灵敏。
2.本方法可以快速有效地在感染WSSV的脊尾白虾发病前期起到诊断和预警作用。
附图说明
图1为实际样品检测分析效果图，NC，为阴性对照；PC，为阳性对照；S1-S4为实际检测样品，S1，S2为两个WSSV感染24h时采集的样品，检测结果显示为阳性；S3，S4为健康虾采集样品，检测结果显示为阴性。
具体实施方式
实施例一
脊尾白虾中与健康状态相关的基因的筛选及基于该基因的LAMP检测体系的构建过程如下：
(1)根据感染白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)前后的脊尾白虾转录组数据，选取感染前后转录水平的表达量差异显著的57条序列作为备选基因，分别设计引物，对WSSV感染前后的样品进行实时荧光定量PCR检测。
(2)根据初筛的结果，选取感染病原后，转录水平出现明显变化的七个基因进行了单个样品的统计学检测验证。选取养殖的健康脊尾白虾100尾(平均体重，2.8±0.4g)，暂养3天，待适应养殖环境后，分成两组：WSSV感染组和PBS组，每组50尾。WSSV感染组每尾注射无菌PBS稀释的WSSV提取液10μL(500copies/μL)，PBS组注射10μL无菌PBS做为对照。注射后，按照正常条件继续养殖，水温控制在25±1℃。在感染后24小时，进行样品采集，每尾虾采集去除复眼、额角、头胸甲和步足后，剩余的头胸部，放入1.5mL离心管，1尾/管，WSSV感染组和PBS组各采集30尾，液氮迅速冷冻后-80℃保存。使用RNAiso Plus(TaKaRa，日本)试剂，按照说明书的方法进行RNA提取，用RR047A反转录试剂盒(TaKaRa，日本)将所提取的RNA样品反转录为cDNA样品。使用Mastercycler ep Realplex4(eppendorf公司，德国)的实时荧光定量仪和SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)SuperReal(TIANGEN，中国)试剂对EcTPI基因的相对表达量进行Real time-PCR检测。10μL扩增体系包括：2×SuperReal PreMix Plus 5μL，正向引物0.3μL，反向引物0.3μL，RNase-Free ddH2O 3.4μL。扩增程序为95℃15min，循环内95℃15s，退火15s，72℃20s反复40个循环，最后加入溶解曲线分析，检验产物特异性。EcTPI基因正向引物为EcTPI-QF(5’-ATGATGAGGAAGTGGCTACGG-3’)，反向引物为EcTPI-QR(5’-TGATGTCAACGATGTCGGTCT-3’)，退火温度为53℃，产物长度为172bp；以18S rRNA基因作为内参基因,其正向引物为18S-F(5’-TATACGCTAGTGGAGCTGGAA-3’)，反向引物为18S-F(5’-GGGGAGGTAGTGACGAAAAAT-3’)退火温度为55℃，产物长度为145bp；每个样品设置3次重复。数据处理采用2-ΔΔCt法，并且利用R-Studio软件对数据进行统计分析。
(3)筛选在病原感染前后样品中转录水平显著变化的基因，做为健康指标。最终筛选得到脊尾白虾的一个基因，其在WSSV感染前后的样品中转录水平有显著的变化，该基因在人工感染WSSV后24h采集的30尾脊尾白虾和注射PBS相同时间的对照组采集的30尾脊尾白虾的单个样品中的相对表达量检测结果如表1所示。
(4)该基因的核苷酸序列为：
5’-GACAAATCGTGAGACGATCAATATCTACATTAGAGATTTGTATTAGCTCCTTTCAACAAGATTTCTTATACAATACTCTTGCGCAGATTAAGTTCACTTGCTTCGTACTTTAATTTACTTCGTCAGACCAAATACGTTGGGTTTATAACATCCACAACTGCGTTTAGAATTTTAGTAATTACTAAGAAAAAAAAAAAAAGCTTAGATATCACCATGTCGAACAACAGAAAGTTTTTCGTTATCGGAAACTGGAAAATGAATGTGAACAAGGCTAAAATTGACTCCATTGTAAAGATCATGTCAAACGCCTCACTGGATTCCAACACTGAGGCCGTGGTTGGATGCCCCTCGTGTTACCTTTCTTATGCCCGACAGCAGCTTCCTCCAGGAATCAGTGTGGCTGCTCAAAATTGTTACAAGGTGTCCCGTGGAAACTTCAGTGGTGAAATATCTCCTGAAATGATCCAGGAATGCGGAGGGGATTGGGTTATTATCGGTCATCCAGAAAGAAGAACCGTTTTTGGAGAAAAGGATGACTTCATACAGGAAAAGATGGCGCATGCCCAGGAGGCTGGCATCAAAGTGATAGCTTGTGTTTGCGAAACGCAAGAAGATCGTCAGCAGAACATGACAGAGGAAATCCTCCAGTCCCAAATGGCATCTTTGGCCTCGGCCATTACCGACTGGTCTCGAGTAGTACTGGCCTTCGAAGCCCTTTGGGCAAGTAACACAGGGGTACTGGCCACGCCTGCTCAAGTTCAGGAGGTCCTATCCATGATGAGGAAGTGGCTACGGGACAACGTTAGCGACAAAGTGGCCAACAGTACCCGCATCCTTTATGCAGGTTCTGTGTCATCTTCCAACTGCCAGCGTCTGGCCCTTTTGCCAGACCTCGACGGATTCTTAGTGGGCAGCGCCGCCCTCAAGACCGACATCGTTGACATCATCAATTCCAGAAGTTCTCGAGTGTCTCAAATCATTGATTTCTCAACTGATCAGATTTCTACGATGACACTTTAAACTTTAAGAAACTTCGATGACACCCGATGAAGCGCACAAGAGGCA-3’
(5)针对上述(4)的TPI基因，建立一套快速，有效的LAMP检测方法：
①首先(4)中的核酸序列利用分子生物学软件BioEitd 7.0设计用于LAMP检测引物组，并利用NCBI在线程序Blastn对引物序列进行特异性分析；
②反应体系及条件的优化，首先根据通用反应体系：上游引物FIP-1和下游引物BIP-1各1.6μM，扩增引物的解链引物LF-1和LB-1各0.8μM，扩增引物的上游引物F3-1和下游引物B3-1各0.2μM，四种dNTPs(dATP、dTTP、dGTP和dCTP)各1.0mM，10×ThermoPol Buffer2.5μL、2×EvaGreen(Biotum，USA)1μL，Bst DNA聚合酶(NEB,ENG)8U，M-MLV反转录酶(Promega，USA)40U，MgCl2 4mM，Betaine(Sigma,USA)1.2M，最后加入脊尾白虾总RNA作为模板，在CFX-96荧光定量仪(Bio-Rad,China)上60℃温育60min。以此，做为基础反应体系及反应条件；
③Mg2+和dNTP浓度的优化，在步骤②的基础体系及反应条件下，设置Mg2+终浓度2、4、6、和8mM，dNTPs终浓度0.8、1.2、1.6和2.0mM，将两者进行正交分组，每组设3个重复，根据扩增效率，Mg2+最终选择8mM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1.4mM，；
④Mg2+反应温度的优化，在步骤③优化的体系下，设置反应温度为54、56、60、64℃，分别反应60min，每个温度设置3个重复，根据扩增效率选择60℃做为最佳反应温度；
⑤根据步骤②～④优化的条件配制LAMP实际样品检测体系，选取脊尾白虾感染WSSV后27h的研磨组织样品和健康脊尾白虾的研磨组织样品，做为实际待检样品，进行实际检测条件优化。按照优化的反应温度下，设置70、75、78、80min进行实际检测，选取能够有效区分感染虾和健康虾的反应时间做为实际检测使用时间，选择70-75min做为最佳反应时间，最终确定有效的LAMP检测方法。
具体实施例二
(1)取待检虾S1、S2和健康虾S3、S4的鳃丝约分别0.2g克，分别置于采样管中，用研磨棒快速磨碎至浆状；
(2)用牙签挑取膜片，置于样品浆中，充分润湿后，再用牙签挑回膜片管中；
(3)用吸管吸取无水乙醇，滴2～3滴于管内润湿的采样用膜片上，轻弹管底搅动膜片30秒；
(4)用新牙签将上述采样用膜片转移到相应编号的漂洗管内，将漂洗管晃荡3～4分钟；
(5)用新牙签将上述漂洗管内的膜片以及阳性和阴性对照管中的阳性对照FTA膜片、阴性对照FTA膜片转移到相应编号的核酸变性管内，95℃保温5分钟，然后再置于冷水中快速冷却2分钟；
(6)再用新牙签将上述核酸变性管内的膜片转移到相应编号的检测管 内的液体中，将检测管置于60℃(可以用水浴锅、金属浴或PCR仪保温；使用PCR仪时切勿用热盖程序)保温70-75分钟；
(7)90～95℃下保温2～5分钟，然后迅速将检测管上下剧烈晃动5～10秒；反复几次直到反应液与管盖上的核酸染料混匀，管内反应液出现颜色，而管盖上的红点消失；
(8)向下甩动检测管，使管内有颜色反应液集聚于管底，再竖直在90～95℃保温1分钟，取出反应管，让其自然冷却，观察反应液颜色，判断检测结果；
(9)结果如附图1显示，待测样品S1、S2与阳性对照信号相同，反应液呈现绿色，表示S1、S2样品的TPI检测结果为阳性，即样品已被WSSV感染；健康虾对照样品S3、S4与阴性对照信号相同，反应液呈现橙黄色，表示S3、S4样品的TPI检测结果为阴性，及样品未受WSSV感染。
表1：EcTPI基因相对表达量Real time-PCR检测统计学分析结果，对人工感染WSSV后24h采集的30尾脊尾白虾和注射PBS相同时间的对照组采集的30尾脊尾白虾的单个样品，进行了EcTPI基因相对表达量的Real time-PCR统计学检测分析。表中展示的为30尾感染WSSV后24h样品和30尾PBS对照组的EcTPI的相对表达量。
表2：对表1中的数据，利用R-Project进行Kruskal-Wallis test(非参数单因素方差分析)检验，结果显示WSSV感染24h后EcTPI基因相对表达量显著高于同时期对照组样品的相对表达量，表现出差异显著。表中展示的PBS对照组与WSSV组Kruskal-Wallis test检验结果的P值和差异情况。
表1:EcTPI基因Real time-PCR检测统计学分析结果
表2Kruskal-Wallis test结果
本方法无需进行核酸提取纯化，成本低，操作方便，检测过程快速，灵敏。利用这一方法可以快速有效地在感染WSSV的脊尾白虾发病前期起到诊断和预警作用。
序列表
<110> 中国科学院海洋研究所
<120> 脊尾白虾感染WSSV后检测健康状态LAMP检测引物及体系与方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1065
<212> DNA
<213> gene
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1065)
<400> 1
gacaaatcgt gagacgatca atatctacat tagagatttg tattagctcc tttcaacaag 60
atttcttata caatactctt gcgcagatta agttcacttg cttcgtactt taatttactt 120
cgtcagacca aatacgttgg gtttataaca tccacaactg cgtttagaat tttagtaatt 180
actaagaaaa aaaaaaaaag cttagatatc accatgtcga acaacagaaa gtttttcgtt 240
atcggaaact ggaaaatgaa tgtgaacaag gctaaaattg actccattgt aaagatcatg 300
tcaaacgcct cactggattc caacactgag gccgtggttg gatgcccctc gtgttacctt 360
tcttatgccc gacagcagct tcctccagga atcagtgtgg ctgctcaaaa ttgttacaag 420
gtgtcccgtg gaaacttcag tggtgaaata tctcctgaaa tgatccagga atgcggaggg 480
gattgggtta ttatcggtca tccagaaaga agaaccgttt ttggagaaaa ggatgacttc 540
atacaggaaa agatggcgca tgcccaggag gctggcatca aagtgatagc ttgtgtttgc 600
gaaacgcaag aagatcgtca gcagaacatg acagaggaaa tcctccagtc ccaaatggca 660
tctttggcct cggccattac cgactggtct cgagtagtac tggccttcga agccctttgg 720
gcaagtaaca caggggtact ggccacgcct gctcaagttc aggaggtcct atccatgatg 780
aggaagtggc tacgggacaa cgttagcgac aaagtggcca acagtacccg catcctttat 840
gcaggttctg tgtcatcttc caactgccag cgtctggccc ttttgccaga cctcgacgga 900
ttcttagtgg gcagcgccgc cctcaagacc gacatcgttg acatcatcaa ttccagaagt 960
tctcgagtgt ctcaaatcat tgatttctca actgatcaga tttctacgat gacactttaa 1020
actttaagaa acttcgatga cacccgatga agcgcacaag aggca 1065

Claims (4)

1.脊尾白虾感染WSSV后检测健康状态LAMP检测引物，其6条引物核苷酸序列信息如下：
SEQ ID NO:1(F3-1)：
5'-TCGTCAGCAGAACATGACAG-3'
SEQ ID NO:2(B3-1)：
5'-GCCACTTTGTCGCTAACGT-3'
SEQ ID NO:3(FIP-1)：
5'-AGGGCTTCGAAGGCCAGTACTA-AGGAAATCCTCCAGTCCCA-3'
SEQ ID NO:4(BIP-1)：
5'-AGTAACACAGGGGTACTGGCCA-CCGTAGCCACTTCCTCATCA-3'
SEQ ID NO:5(LF-1)：
5'-CCGAGGCCAAAGATGCCA-3'
SEQ ID NO:6(LB-1)：
5'-CGCCTGCTCAAGTTCAGGA-3'。
2.一种包含有权利要求1所述的引物组的感染WSSV的脊尾白虾发病前期健康状态的检测体系。
3.一种检测感染WSSV的脊尾白虾发病前期健康状态的LAMP检测体系，其特征在于，所述的检测体系包含有权利要求1所述的引物组；
具体为：
(1)采样管，用来盛放、研磨待检虾组织样品；
(2)漂洗管，内装蒸馏水；
(3)核酸变性管，内装TE缓冲液；
(4)扩增检测管，内装扩增反应液和染料，扩增反应液组成成分如下：扩增引物的上游引物FIP-1和下游引物BIP-1各1～3μM，扩增引物的解链引物LF-1和LB-1各0.5～1.5μM，扩增引物的上游引物F3-1和下游引物B3-1各0.1～0.5μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各0.8～2.2mM，MgCl2 2～8mM，Betaine(甜菜碱)0.6～1.5M，Tris-HCl 10～40mM，KCl 10～20mM，MgSO4 1～6mM，(NH4)2SO4 6～12mM，Triton X-100 0.05％～1.0％，反转录酶1～20U，BstDNA聚合酶2～20U；染料使用核酸染料，可选用SYBR Green、GelRed、GelGreen、GoldViewTM或GeneFinderTM核酸染料中的任意一种，核酸染料预先粘附于扩增检测管管壁内侧上方或扩增检测管盖子内侧；
(5)阴性对照管，内装吸附了未感染WSSV的脊尾白虾RNA的FTA膜片；
(6)阳性对照管，内装吸附了感染WSSV后脊尾白虾RNA的FTA膜片；
(7)快速干燥液，为无水乙醇；
(8)分别封装于无菌袋中的FTA膜片、研磨棒、牙签和吸管。
4.一种检测感染WSSV的脊尾白虾发病前期健康状态的LAMP检测体系，其特征在于，采用权利要求3所述的检测体系，
具体检测步骤如下：
(1)取待检测虾的组织样品0.1-1g，置于采样管中，使用研磨棒将组织样品研磨匀浆；
(2)用牙签挑取膜片，置于样品浆中，充分润湿后，再用牙签挑回膜片管中；
(3)用吸管吸取无水乙醇，滴2～3滴于管内润湿的采样用膜片上，轻弹管底搅动膜片30秒以上；
(4)用新牙签将上述采样用膜片转移到相应编号的漂洗管内，将漂洗管晃荡3～4分钟；
(5)用新牙签将上述漂洗管内的膜片以及阳性和阴性对照管中的阳性对照FTA膜片、阴性对照FTA膜片转移到相应编号的核酸变性管内，95℃保温5分钟，然后再置于冷水中快速冷却2分钟以上；
(6)再用新牙签将上述核酸变性管内的膜片转移到相应编号的检测管内的液体中，将检测管置于60℃(可以用水浴锅、金属浴或PCR仪保温；使用PCR仪时切勿用热盖程序)保温70-75分钟；
(7)90～95℃下保温2～5分钟，然后迅速将检测管上下剧烈晃动5～10秒；反复几次直到反应液与管盖上的核酸染料混匀，管内反应液出现颜色，而管盖上的红点消失；
(8)向下甩动检测管，使管内有颜色反应液集聚于管底，再竖直在90～95℃保温1分钟以上，取出反应管，让其自然冷却，观察反应液颜色，判断检测结果；
(9)如果反应液呈现绿色则表示该样品的检测结果为阳性，如果反应液呈现橙黄色则表示该样品的检测结果为阴性。
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