CN104846098A - 一种试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于养殖领域，具体公开了一种试剂盒及检测方法。本发明所述的试剂盒，包括：2×反应混合缓冲液；优选设计的上、下游引物；Taq DNA聚合酶；阳性对照液；阴性对照液；ddH2O。本发明克服了现有肠道上皮细胞微孢子虫检测方法的不足，提供一种新型PCR快速检测试剂盒及检测方法。本发明对凡纳滨对虾肠道上皮细胞微孢子虫进行临床诊断不仅切实可行，且具有快速、准确、特异的优点，满足了临床诊断的要求，为检测凡纳滨对虾肠道上皮细胞微孢子虫提供了便利条件。

Description

一种试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及养殖领域，具体涉及一种凡纳滨对虾肠道上皮细胞微孢子虫的基因检测试剂及检测方法，适用于凡纳滨对虾肠道上皮细胞微孢子虫的流行病学监测、肠道上皮细胞微孢子虫的检测及基因工程技术等领域。
背景技术
肠道上皮细胞微孢子虫(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)，简称“虾肝肠胞虫”，是一种很小的孢子虫，体长不到1微米。肠道上皮细胞微孢子虫最早于2009年由泰国科学家在养殖的斑节对虾发现并报道。2014年，泰国科学家研究发现肠道上皮细胞微孢子虫是近年来引起凡纳滨对虾生长缓慢的主要原因之一。中国水产科学研究院黄海水产研究所也对肠道上皮细胞微孢子虫开展相关调查研究，这种寄生虫主要集中侵害对虾的肝脏，感染了肠道上皮细胞微孢子虫的凡纳滨对虾，不会出现太多明显的死亡，主要引起肠道吸收功能下降，导致虾生长缓慢。尽管染病虾比较小，但食欲正常，一样能正常吃料，肠、胃充满着食物，肝胰腺略微萎缩，发软，但颜色比较深，从表面上看起来，虾并没有明显病症。因为感染肠道上皮细胞微孢子虫的凡纳滨对虾一直吃饲料，因此养殖户会把时间和饲料都用于养殖这种患病而根本长不大的对虾身上，而到头来往往达不到有效的收获，造成巨大的经济损失。肠道上皮细胞微孢子虫可以经口传播，也可以垂直传播，目前还没有很好的治疗方法。为了及早发现养殖凡纳滨对虾是否被肠道上皮细胞微孢子虫感染，有必要建立一种快速、准确、灵敏的检测方法。PCR方法具有操作简单、特异、快速、敏感等优点，正逐步应用于病原微生物的检测与研究中。
经对现有技术的文献检索发现，尚未发明与本发明的凡纳滨对虾肠道上皮细胞微孢子虫PCR检测方法、核酸及引物对有关的报道。本发明研制的凡纳滨对虾肠道上皮细胞微孢子虫PCR检测方法，弥补了该技术领域的缺陷,为凡纳滨对虾肠道上皮细胞微孢子虫的监测提供有力手段。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种凡纳滨对虾肠道上皮细胞微孢子虫特异性PCR检测方法，能快速、高效地用于凡纳滨对虾肠道上皮细胞微孢子虫的检测。
本发明通过下述技术方案实现的。
.凡纳滨对虾肠道上皮细胞微孢子虫的PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(1)2×反应混合缓冲液，包含以下成分：
KCl，
MgCl2，
Tris-HCl，pH5.8，
dNTP；
(2)检测引物的设计合成：上游引物ECZ-F：5’-TGTGGGAGAAATCTTAGTTTT-3’，下游引物ECZ-R：5’-ATTGCGCTTGCTGCCCAGGAT-3’；
(3)Taq酶；
(4)灭菌的ddH2O；
(5)阳性对照液：肠道上皮细胞微孢子虫基因组DNA；
(6)阴性对照液：健康凡纳滨对虾基因组DNA。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，采用试剂盒检测肠道上皮细胞微孢子虫的方法为：
(1)肠道上皮细胞微孢子虫DNA的提取：取凡纳滨对虾肝胰腺和肠道组织，加入灭菌处理的双蒸水，用玻璃匀浆器充分研磨后，置于-20℃冰箱反复冻融3次，6000rpm低温离心10分钟，取上清，加入Tris-饱和酚，充分振荡混匀后，静置5分钟，然后12000rpm离心5分钟，取上清液加入等量的酚：氯仿：异戊醇抽提二次，取上清加入2倍体积的异丙醇，混匀后，静置10分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清后，加入1mL预冷的75％的乙醇，静置5分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清，置于真空干燥箱干燥后，用ddH2O溶解，即为试验用DNA模板，提取的DNA模板置于-70℃保存备用；
(2)PCR反应体系：采用20μL的PCR反应体系，在PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液，上游引物、下游引物，Taq DNA聚合酶，DNA模板，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上；
(4)PCR反应条件：95℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸40秒，共循环30次；72℃延伸10分钟，最后4℃保存；
(5)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取产物在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小；
(6)结果与判定：在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，若检测样品在330bp处出现明亮的条带，而阴性对照没有目的条带，则为肠道上皮细胞微孢子虫阳性；若阳性对照可见目的条带，而检测样品无目的条带出现，则为阴性，没有或不是所要检测的目的肠道上皮细胞微孢子虫。
优选的技术方案如下：
1.凡纳滨对虾肠道上皮细胞微孢子虫的PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(3)2×反应混合缓冲液1.0mL，包含以下成分：
(4)检测引物的设计合成：根据GenBank中发布的肠道上皮细胞微孢子虫的基因序列，设计一对特异性检测引物，上游引物ECZ-F：5’-TGTGGGAGAAATCTTAGTTTT-3’，下游引物ECZ-R：5’-ATTGCGCTTGCTGCCCAGGAT-3’，浓度为10μM；
(3)Taq酶         5U/μL；
(4)灭菌的ddH2O   1.0mL；
(5)阳性对照液：肠道上皮细胞微孢子虫基因组DNA；
(6)阴性对照液：健康凡纳滨对虾基因组DNA。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，采用试剂盒检测凡纳滨对虾肠道上皮细胞微孢子虫的方法为：
(1)肠道上皮细胞微孢子虫DNA的提取：取50-100mg的凡纳滨对虾肝胰腺和肠道组织，加入600μL灭菌处理的双蒸水，用玻璃匀浆器充分研磨后，置于-20℃冰箱反复冻融3次，6000rpm低温离心10分钟，取上清，加入200μL Tris-饱和酚，充分振荡混匀后，静置5分钟，然后12000rpm离心5分钟，取上清液加入等量的酚：氯仿：异戊醇抽提二次，取上清加入2倍体积的异丙醇，混匀后，静置10分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清后，加入1mL预冷的75％的乙醇，静置5分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清，置于真空干燥箱干燥后，用50μL的ddH2O溶解，即为试验用DNA模板，提取的DNA模板置于-70℃保存备用；
(2)PCR反应体系：采用20μL的PCR反应体系，在0.2mL PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液10μL，上游引物、下游引物各0.5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL，DNA模板3.0μL，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上；
(4)PCR反应条件：95℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸40秒，共循环30次；72℃延伸10分钟，最后4℃保存；
(5)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10μL产物在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小；
(6)结果与判定：在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，若检测样品在330bp处出现明亮的条带，而阴性对照没有目的条带，则为肠道上皮细胞微孢子虫阳性；若阳性对照可见目的条带，而检测样品无目的条带出现，则为阴性，没有或不是所要检测的目的肠道上皮细胞微孢子虫。
与现有技术相比，本发明所述的凡纳滨对虾的病原肠道上皮细胞微孢子虫的特异性PCR快速检测试剂盒及其检测方法具有以下特点及优点：
(1)本发明采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术检测凡纳滨对虾肠道上皮细胞微孢子虫的方法，适用于对凡纳滨对虾肠道上皮细胞微孢子虫进行快速检测。
(2)与现有技术相比，本发明的有益效果包括：①检测快速、效率高：从核酸提取、聚合酶链反应(PCR)到结果判定仅需要3小时；一次可以进行多个样品的检测，具有高效性。②检测准确：检测引物只与凡纳滨对虾肠道上皮细胞微孢子虫特异性地结合，与其他虾类病毒都没有交叉反应。③检测灵敏度高，适合用于凡纳滨对虾肠道上皮细胞微孢子虫的早期监控。
附图说明
图1为感染肠道上皮细胞微孢子虫凡纳滨对虾肝胰腺和肠道组织的PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为阴性对照(以阴性对照液作为模板)；标号2为阳性对照(以阳性对照液作为模板)；标号3为肠道上皮细胞微孢子虫感染凡纳滨对虾肝胰腺和肠道组织样品；标号M为分子量标准DL2000(购自宝生物工程有限公司)；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。
图2为对不同病原的PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为肠道上皮细胞微孢子虫；标号2白斑综合症病毒；标号3为传染性皮下及造血器官坏死病毒；标号4为对虾杆状病毒；标号5为肝胰腺细小病毒；标号6为桃拉病毒；标号7为黄头病毒；标号8为传染性肌肉坏死病毒；标号9为副溶血弧菌；标号10为溶藻弧菌；标号M为分子量标准DL2000；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。
图3为同一池塘所取4尾生长缓慢凡纳滨对虾肝胰腺、肠道组织样品的PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为阳性对照(以阳性对照液作为模板)；标号2为阴性对照(以阴性对照液作为模板)；标号3-6为4尾凡纳滨对虾肝胰腺、肠道组织样品；标号M为分子量标准DL2000；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。
图4为不同地区所取6尾生长缓慢凡纳滨对虾肝胰腺、肠道组织样品的PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为阳性对照(以阳性对照液作为模板)；标号2为阴性对照(以阴性对照液作为模板)；标号3-8为6尾凡纳滨对虾肝胰腺、肠道组织样品；标号M为分子量标准DL2000；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明：
实施例一：凡纳滨对虾肠道上皮细胞微孢子虫PCR快速检测试剂盒
本实施例所述的凡纳滨对虾肠道上皮细胞微孢子虫PCR快速检测试剂盒的所有化学试剂及引物均从专业的试剂公司购买。但上述试剂和引物来源不构成对本发明的任何限制，本发明可自行配制有关试剂和合成有关引物。
试剂盒由下列部分构成(9样份)：
(1)2×反应混合缓冲液(Reaction Mix Buffer)1.0mL，包含以下成分：
(2)检测引物：上游引物ECZ-F：5’-TGTGGGAGAAATCTTAGTTTT-3’，下游引物ECZ-R：5’-ATTGCGCTTGCTGCCCAGGAT-3’，浓度为10μM，上下游引物混合，400μL。
(3)Taq酶         5U/μL。
(4)灭菌的ddH2O   1.0mL。
(5)阳性对照液：肠道上皮细胞微孢子虫基因组DNA。
(6)阴性对照液：健康凡纳滨对虾基因组DNA。
(7)操作说明书一份。
(8)长方体盒子，可装上述1～7号部件，9.0×5.0×5.0cm3。
(9)一块硬纸板，其大小与盒子的底面相同，高2.5cm，有2排孔，每排4个孔，孔径1.0cm，上述各小管分别对应放置于这些小孔中，装于长方体盒子中。
上述阳性对照和阴性对照是分别取100mg肠道上皮细胞微孢子虫感染的凡纳滨对虾和健康的凡纳滨对虾的肝胰腺、肠道组织，加入600μL灭菌处理的双蒸水，用玻璃匀浆器充分研磨后，置于-20℃冰箱反复冻融3次，6000rpm低温离心10分钟，取上清，加入200μL Tris-饱和酚，充分振荡混匀后，静置5分钟，然后12000rpm离心5分钟，取上清液加入等量的酚：氯仿：异戊醇抽提二次，取上清加入2倍体积的异丙醇，混匀后，静置10分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清后，加入1mL预冷的75％的乙醇，静置5分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清，置于真空干燥箱干燥后，用100μL的ddH2O溶解而得。
PCR扩增反应体系(20μL)为：
PCR扩增反应条件为：
95℃   5min
1个循环
94℃   30s
53℃   30s
72℃   40s
30个循环
72℃   10min
1个循环
扩增产物4℃保存。
实施例二：凡纳滨对虾肠道上皮细胞微孢子虫PCR检测方法
使用实施例一所述的试剂盒，按下列步骤进行：
(1)取50mg待检凡纳滨对虾的肝胰腺和肠道样品，加入600μL灭菌处理的双蒸水，用玻璃匀浆器充分研磨后，置于-20℃冰箱反复冻融3次，6000rpm低温离心10分钟，取上清，加入200μL Tris-饱和酚，充分振荡混匀后，静置5分钟，然后12000rpm离心5分钟，取上清液加入等量的酚：氯仿：异戊醇抽提二次，取上清加入2倍体积的异丙醇，混匀后，静置10分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清后，加入1mL预冷的75％的乙醇，静置5分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清，置于真空干燥箱干燥后，用100μL的ddH2O溶解，作为PCR反应的模板。
(2)分别取2×反应混合缓冲液10μL，上、下游引物(ECZ-F、ECZ-R)各0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，ddH2O 5.5μL，模板3.0μL，另取阳性对照液和阴性对照液各3μL作为模板，作为阳性和阴性对照组。混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上。
(3)按下列条件进行PCR扩增：95℃5min，1个循环；94℃30s，53℃30s，72℃40s，35个循环；72℃10min，最后4℃保存。
(4)反应结束后，取10μL加入2μL溴酚蓝混匀，经1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)电泳25min后，于紫外仪上观察，若在330bp处出现明亮的反应条带，则为肠道上皮细胞微孢子虫阳性；若无反应条带出现，则为阴性。
(5)实验结果分析：如图1所示，在标号3(待测样品)的电泳带中330bp处出现明亮的反应条带，在标号2(阳性对照)的电泳带中也出现同样的反应条带，而在标号1(阴性对照)的电泳带中未出现反应条带，表明本PCR试剂盒的检测效果符合预期。
实施例三：凡纳滨对虾肠道上皮细胞微孢子虫PCR快速检测试剂盒特异性实验
使用实施例一所述的试剂盒，按下列步骤进行：
(1)分别以提取的肠道上皮细胞微孢子虫、白斑综合症病毒、传染性皮下及造血器官坏死病毒、对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒、桃拉病毒、黄头病毒、传染性肌肉坏死病毒、副溶血弧菌、溶藻弧菌的核酸作为模板，进行PCR检测。
(2)分别取2×反应混合缓冲液10μL，上、下游引物(ECZ-F、ECZ-R)各0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，ddH2O 5.5μL，模板3.0μL。混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上。
(3)按下列条件进行PCR扩增：95℃5min，1个循环；94℃30s，53℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min，最后4℃保存。
(4)反应结束后，取10μL加到2μL溴酚蓝混匀，经1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)电泳25min后，于紫外仪上观察，若在330bp处出现明亮的反应条带，则为肠道上皮细胞微孢子虫阳性；若无反应条带出现，则为阴性。
(5)实验结果分析：如图2所示，标号1的电泳带在330bp处出现明亮的反应条带，显示肠道上皮细胞微孢子虫阳性。标号2～10(白斑综合症病毒、传染性皮下及造血器官坏死病毒、对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒、桃拉病毒、黄头病毒、传染性肌肉坏死病毒、副溶血弧菌、溶藻弧菌)的电泳带在330bp处无反应条带出现，显示肠道上皮细胞微孢子虫阴性。表明本发明所述的试剂盒对肠道上皮细胞微孢子虫的特异性强。
实施例四：凡纳滨对虾肠道上皮细胞微孢子虫PCR快速检测试剂盒对同一池塘生长缓慢凡纳滨对虾的检测
使用实施例一所述的试剂盒，按下列步骤进行：
(1)从一生长缓慢凡纳滨对虾养殖池塘取4尾凡纳滨对虾，分别以所取的4尾凡纳滨对虾肝胰腺、肠道组织提取的DNA作为模板，进行PCR检测。
(3)分别取2×反应混合缓冲液10μL，上、下游引物(ECZ-F、ECZ-R)各0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，ddH2O 5.5μL，模板3.0μL，另取阳性对照液和阴性对照液各3μL作为模板，作为阳性和阴性对照组。混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上。
(3)按下列条件进行PCR扩增：95℃5min，1个循环；94℃30s，53℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min，最后4℃保存。
(4)反应结束后，取10μL加到2μL溴酚蓝混匀，经1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)电泳25min后，于紫外仪上观察，若在330bp处出现明亮的反应条带，则为肠道上皮细胞微孢子虫阳性；若无反应条带出现，则为阴性。
(5)实验结果分析：检测所取4尾生长缓慢凡纳滨对虾中，4尾凡纳滨对虾肠道上皮细胞微孢子虫阳性，通过进一步测序表明，其检测结果均为肠道上皮细胞微孢子虫，且核苷酸同源性都在99％以上，PCR检测结果见图3。
实施例五：凡纳滨对虾肠道上皮细胞微孢子虫PCR快速检测试剂盒对不同地区养殖池塘生长缓慢凡纳滨对虾的检测
使用实施例一所述的试剂盒，按下列步骤进行：
(1)分别从山东，广西，浙江、广东、福建、海南取6尾生长缓慢的凡纳滨对虾，以所取的6尾凡纳滨对虾肝胰腺、肠道组织提取的DNA作为模板，进行PCR检测。
(1)分别取2×反应混合缓冲液10μL，上、下游引物(ECZ-F、ECZ-R)各0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，ddH2O 5.5μL，模板3.0μL，另取阳性对照液和阴性对照液各3μL作为模板，作为阳性和阴性对照组。混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上。
(3)按下列条件进行PCR扩增：95℃5min，1个循环；94℃30s，53℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min，最后4℃保存。
(4)反应结束后，取10μL加到2μL溴酚蓝混匀，经1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)电泳25min后，于紫外仪上观察，若在330bp处出现明亮的反应条带，则为肠道上皮细胞微孢子虫阳性；若无反应条带出现，则为阴性。
(5)实验结果分析：检测所取6尾生长缓慢凡纳滨对虾中，6尾凡纳滨对虾肠道上皮细胞微孢子虫阳性，通过进一步测序表明，其检测结果均为肠道上皮细胞微孢子虫，且核苷酸同源性都在99％以上，PCR检测结果见图4。

Claims (2)

1.凡纳滨对虾肠道上皮细胞微孢子虫的PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(1)2×反应混合缓冲液，包含以下成分：
KCl，
MgCl2，
Tris-HCl，pH5.8，
dNTP；
(2)检测引物的设计合成：上游引物ECZ-F：5’-TGTGGGAGAAATCTTAGTTTT-3’，下游引物ECZ-R：5’-ATTGCGCTTGCTGCCCAGGAT-3’；
(3)Taq酶；
(4)灭菌的ddH2O；
(5)阳性对照液：肠道上皮细胞微孢子虫基因组DNA；
(6)阴性对照液：健康凡纳滨对虾基因组DNA。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，采用试剂盒检测肠道上皮细胞微孢子虫的方法为：
(1)肠道上皮细胞微孢子虫DNA的提取：取凡纳滨对虾肝胰腺和肠道组织，加入灭菌处理的双蒸水，用玻璃匀浆器充分研磨后，置于-20℃冰箱反复冻融3次，6000rpm低温离心10分钟，取上清，加入Tris-饱和酚，充分振荡混匀后，静置5分钟，然后12000rpm离心5分钟，取上清液加入等量的酚：氯仿：异戊醇抽提二次，取上清加入2倍体积的异丙醇，混匀后，静置10分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清后，加入1mL预冷的75％的乙醇，静置5分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清，置于真空干燥箱干燥后，用ddH2O溶解，即为试验用DNA模板，提取的DNA模板置于-70℃保存备用；
(2)PCR反应体系：采用20μL的PCR反应体系，在PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液，上游引物、下游引物，Taq DNA聚合酶，DNA模板，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上；
(4)PCR反应条件：95℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸40秒，共循环30次；72℃延伸10分钟，最后4℃保存；
(5)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取产物在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小；
(6)结果与判定：在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，若检测样品在330bp处出现明亮的条带，而阴性对照没有目的条带，则为肠道上皮细胞微孢子虫阳性；若阳性对照可见目的条带，而检测样品无目的条带出现，则为阴性，没有或不是所要检测的目的肠道上皮细胞微孢子虫。
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