CN104894212A

CN104894212A - 一种检测阪崎克罗诺杆菌的方法及引物、探针和试剂盒

Info

Publication number: CN104894212A
Application number: CN201510256838.1A
Authority: CN
Inventors: 胡双芳; 肖性龙; 李蓉; 余以刚; 庄平
Original assignee: INSPECTION AND QUARANTINE TECHNOLOGY CENTER ZHONGSHAN ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE; South China University of Technology SCUT
Current assignee: INSPECTION AND QUARANTINE TECHNOLOGY CENTER ZHONGSHAN ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE; South China University of Technology SCUT
Priority date: 2015-05-19
Filing date: 2015-05-19
Publication date: 2015-09-09

Abstract

本发明公开了一种检测阪崎克罗诺杆菌的方法及引物、探针和试剂盒，针对阪崎克罗诺杆菌基因组的保守序列设计了用于荧光定量PCR检测的引物及探针，建立了阪崎克罗诺杆菌荧光定量PCR检测技术，反应结束即可根据扩增曲线判定是否有阪崎克罗诺杆菌。所述的引物序列为：由上游引物序列5‘GGGATACGCAGGAGGTGGCA’和下游引物序列5’GATGCTGCCTGCCAGCAGG’组成的引物对；所述的探针序列为：5‘CATTTTAGCGCTTGATACTCCCCTGGGC’。本发明检测方法准确性强，灵敏度高，其能够快速简单地判断样品是否有阪崎克罗诺杆菌。

Description

一种检测阪崎克罗诺杆菌的方法及引物、探针和试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测技术，特别涉及阪崎克罗诺杆菌核苷酸的引物和探针以及检测阪崎克罗诺杆菌的方法。

背景技术

阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)原名阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii)是一种有周生鞭毛、能运动、兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。其流行病学调查显示，其感染病例大多数为婴幼儿，主要引起菌血症、脑膜炎、坏死性小肠结膜炎等，并伴随有严重的神经系统后遗症。作为一种条件致病菌，其对特殊人群具有高达40％～80％的致死率。克罗诺杆菌广泛分布在婴幼儿奶粉、奶酪、腌肉、水、蔬菜、大米、面包、茶叶、草药、调味品及豆腐等多种食品及食品原料中。随着一系列与该菌相关的婴幼儿奶粉召回和重大感染事件的爆发，婴幼儿配方奶粉中阪崎克罗诺杆菌的污染问题受到全世界的关注。

目前包括阪崎克罗诺杆菌在内的苏黎世克罗诺杆菌(C.turicensis)，丙二酸盐克罗诺杆菌(C.malonaticus)，尤尼沃斯克罗诺杆菌(C.universails)，穆汀斯克罗诺杆菌(C.muytjensii)，都柏林克罗诺杆菌(C.dublinensis)6个种的克罗诺杆菌证实对人体具有致病性，而康帝蒙克罗诺杆菌(C.condiment)，以及2014年最新归类的三种C.zurichensis，C.helveticus和C.pulveris等4种还未见能引起人体疾病的报道。克罗诺杆菌属的各个种菌株对化学物质的敏感性以及温度和抗生素方面存在较大的差异，而且各个菌的致病因子在特定情况下的表达也各不相同，从而导致的致病力也不尽相同。研究表明，阪崎克罗诺杆菌与丙二酸盐克罗诺杆菌是引起人类致病的主要菌株，具有更高的致病性。阪崎克罗诺杆菌对外界有害因子抵抗力强，分布广，是污染克罗诺杆菌的奶粉中分离出的主要菌株。因此在物种水平上对阪崎克罗诺杆菌进行快速和可靠的识别及检测在食品污染检测和溯源以及临床和流行病学上具有十分重要的作用。目前对克罗诺杆菌的快速检测主要存在以下三个方面问题：

1)现有检测方法落后于克罗诺杆菌属在分类学上的发展。

由于克罗诺杆菌属在分类上的不断发展，许多现有的检测方法，无法在菌种水平上对克罗诺杆菌属进行区分，例如将实际为穆汀斯克罗诺杆菌ATCC51329当做阪崎克罗诺杆菌进行鉴定。这给食品污染检测和溯源以及临床和流行病学上的快速定型提出了难题。

2)现有的分子学方法无法适应DNA同源性极高各个种的克罗诺杆菌的特异检测。

现有的阪崎克罗诺杆菌检测方法的主要难点在于阪崎克罗诺杆菌同其他克罗诺杆菌以及肠杆菌科的其他细菌特别是阴沟肠杆菌在形态特征，生理生化特征方面具有高度相似性，并有极高的DNA同源性。因此无论是FDA推荐对该菌的检测方法还是目前的各类基于核苷酸片段的检出方法均存在选择性差的缺点，易出现假阳性或假阴性结果。目前已被用于克罗诺杆菌属检测的基因有gluA、gyrB、dnaG、ompA、ropB以及zpx等。二鸟苷酸环化酶广泛存在于各种食源性致病菌中，相关的某些基因片段在许多细菌中都具有高度的保守性，如霍乱弧菌，沙门氏菌和大肠杆菌。而克罗诺杆菌属中参与编码二鸟苷酸环化酶的cgcA基因不仅具有属内的保守性，且具有种间的等位基因的特异性差异，另外还能与肠杆菌科其他细菌进行很好的区分。2012年cgcA基因首次被用于克罗诺杆菌属的快速分型研究中，但基于cgcA基因的克罗诺杆菌的核酸检测方法未见报道。

3)现有的检测方法无法适应快速、特异和高通量的要求。

现有的检测方法主要有基于生理生化实验的传统生化检测法和试剂盒法，基于分子生物学的PCR法、基因芯片、HRM等方法。分子生物学方法比传统的生理生化方法具有快速、高通量和快速的优点。其中基于荧光探针标记的荧光定量PCR方法，比普通PCR方法具有更高的检出限和低污染，比HRM法具有更高的特异性，比基因芯片技术具有更低廉的成本和可操作性。

本发明在分析已报道阪崎克罗诺杆菌及其他克罗诺杆菌基因组序列的基础上，基于cgcA基因分别设计引物及荧光探针实现阪崎克罗诺杆菌的特异性、快速检测。采用的荧光PCR技术是在普通PCR的基础上，在扩增反应体系中加入一对特异性引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，使用实时监测的荧光PCR检测仪来检测靶核苷酸序列的技术。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于阪崎克罗诺杆菌实时荧光定量PCR检测的引物、探针序列，使得能够快速简单地判断样品是否有阪崎克罗诺杆菌，可用于各种乳制品中致病菌的检测。为了降低对阪崎克罗诺杆菌的检测时间，提高阪崎克罗诺杆菌的阳性检出率,本研究运用基于TaqMam探针的荧光定量PCR技术，建立快速检测的方法。

本发明针对阪崎克罗诺杆菌基因组的保守序列设计了用于荧光定量PCR检测的引物及探针，建立了阪崎克罗诺杆菌荧光定量PCR检测技术，反应结束即可根据扩增曲线判定是否有阪崎克罗诺杆菌。

其中，上述反应条件可以是：95℃变性1min；以95℃5s，60℃40s扩增40个循环(收集荧光)。为了解决上述技术问题，本发明在分析已报道阪崎克罗诺杆菌及其他克罗诺杆菌基因组序列的基础上，基于cgcA基因分别设计引物及荧光探针，所述的引物由正向引物和反向引物组成，其核苷酸序列如下：

上游引物CSPF753序列为5‘GCAGGTGCTGCTGCGAG3’(SEQ ID NO:2)

下游引物CSPR890序列为5’GCAGATTGTCTTTGTCATACCCG3’(SEQ ID NO:3)

或者上述引物对的上游引物向5’端方向延伸10个碱基，向3’端方向延伸10个碱基，下游引物向3’端方向延伸10个碱基，向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的引物序列。

本发明设计的探针的核苷酸序列如下：

CSPB803:5‘TTGATCAGGTCGTCAGAATCTACGGGT3’(SEQ ID NO:4)

或者上述探针序列向3’端方向延伸10个碱基和向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列。

一种检测阪崎克罗诺杆菌的方法，包括如下步骤：

(1)将上述探针一端标记有报告荧光染料，另一端标记有猝灭荧光染料，得到标记有荧光素的探针；

(2)以待测样品的DNA为模板，利用权利要求1所述的上、下游引物以及上述标记有荧光素的探针进行实时荧光定量PCR反应，每个循环结束后采集数据；

(3)反应结束后根据扩增曲线判断是否有阪崎克罗诺杆菌。

所述报告荧光染料采用下列荧光基团中的任意一种：Fam、Hex、Tet、Joe、Vic、FITC、Cy3和Cy5；所述淬灭荧光染料采用下列荧光基团中的任意一种：Tamra、Rox、Dabcy1、BHQ1和BHQ2。

以25μl的反应体系计，所述实时荧光定量PCR反应的条件为：

组分	体积	终浓度
			10×PCR Buffer	1～3μl	0.4～1.2×
dNTPs(各2.5mM)	1～3μl	0.1～0.3mM
			上、下游引物引物(各10μM)	各1～2μl	0.4～0.8μM
标记有荧光素的探针(10μM)	0.2～0.8μl	0.08～0.32μM
			Taq酶(5U/μl)	0.2～0.8μl	1～4U
待测样品的DNA	3～5μl
			RNase Free dH2O	补至总体积25μl

所述实时荧光定量PCR反应条件是：95℃变性1min；以95℃5s，60℃40s扩增40个循环。

一种检测阪崎克罗诺杆菌的试剂盒，包括上述上、下游引物以及探针。

所述试剂盒还包括10×PCR Buffer、dNTPs和Taq酶。

以25μl的反应体系计，试剂盒的各组分如下：

本发明根据TaqMan技术，在常规PCR的基础上添加了一条标记有两个荧光染料基团的核苷酸探针，例如将报告荧光染料标记的探针的5’端，淬灭荧光染料标记在探针的3’端，两者构成能量转移结构，即报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭荧光染料吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告荧光染料信号增强。在扩增反应过程中，探针同模板上的目的扩增片段杂交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在扩增延伸阶段将探针切断，淬灭荧光染料的抑制作用消失，报告荧光染料信号增强，在扩增延伸阶段将探针切断，淬灭荧光染料的抑制作用消失，报告荧光染料信号增强，从而实现对阪崎克罗诺杆菌的检测。

当然，可以根据本发明给出的引物对或者其扩增产物序列设计其它类型的探针，以适用不同方法的荧光PCR检测。

本发明采用的荧光PCR技术是在普通PCR的基础上，在扩增反应体系中加入一对特异性引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，使用实时监测的荧光PCR检测仪来检测靶核苷酸序列的技术。除了具有普通PCR的优点外，它还具有以下优点：(1)特异性更强，灵敏度更高：由于多使用了一条可与模板互补配对的荧光探针，从而提高了特异性，并且由自动化仪器收集荧光信号，避免了人工判断的主观性，又可进一步提高灵敏度；(2)定量更准确可靠：全封闭反应，在线式实时监测荧光，无须PCR的对数期，摈弃普通PCR方法的受多因素干扰的终点分析法；(3)适用范围更广：理论上可检测任何阪崎克罗诺杆菌的核酸；(4)可实现单管双检或多检，还可设计针对性内标，监控抽提效率及排除抑制剂干扰；(5)不接触有毒试剂，操作安全。但是，荧光定量PCR对引物的要求相对于普通PCR而言，更为苛刻。

本发明根据阪崎克罗诺杆菌基因组序列设计的引物特异性好，用于荧光PCR检测的灵敏度高。本发明检测方法准确性强，灵敏度高，其能够快速简单地判断样品是否有阪崎克罗诺杆菌，为各种乳制品中阪崎克罗诺杆菌的鉴别诊断提供了科学依据。

附图说明

图1是实时荧光定量PCR技术阪崎克罗诺杆菌核酸检测的特异性实验的检测结果图；

图2是发明检测方法的灵敏度实验的检测结果图；

图3是婴幼儿配方奶粉中阪崎克罗诺杆菌增菌检测结果图。

具体实施方式

为更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。

实施例1

一种检测阪崎克罗诺杆菌的方法，按照以下步骤进行：

1.引物与探针的设计及合成

从NCBI数据库下载所有的阪崎克罗诺杆菌基因组序列，通过对序列的比较分析，选择无二级结构且高度保守的区段(SEQ ID NO:1)，其序列如下：CGCTGTACATTCGCCCCTTTGATGAAAGCGTGCTGAATAAAGATCTCTCAGACAGCCCGCTTTTTACCGCGCCAGGGCAGCGCCACCTGGCTGTCGGCGCTTGCGCGCTCGACGCGTTACCCGATTGTCGTGGTGGCGCGCGACCTGGCTTAAAAACAGTATTCCCGATTTGCTTATCAACGGTGCGCTGCTGACTGCCATTATCCTGATGGGCA

其中，斜体加粗分别为上下游引物序列，下划线加粗为探针序列。

利用生物软件Primer Express 3.0针对上述区段设计引物和Taqman探针。并通过NCBI数据库进行了Blast同源性比对验证，确保序列与其他物种无交叉。引物序列为：

上游引物：CSPF753：5‘GCAGGTGCTGCTGCGAG3’

下游引物：CSPR890:5’GCAGATTGTCTTTGTCATACCCG3’

探针序列：CSPB803:5‘TTGATCAGGTCGTCAGAATCTACGGGT3’,

该探针的5’端用报告荧光染料FAM标记，3’端用淬灭荧光染料BHQ2标记。

2. DNA的提取

将待检的阪崎克罗诺杆菌培养液用酚-氯仿法抽提基因组DNA。具体步骤如下：

2.1.将待检的阪崎克罗诺杆菌增菌液(约1ml)加入1.5ml的离心管中,12000r/min离心5分钟，去上清；

2.2.加入DNA裂解液700μl，充分混匀重悬，水浴煮沸5分钟；

2.3.加入等体积的酚-氯仿(V/V＝1：1)溶液，充分混匀后离心，13000r/min离心5分钟；

2.4.将上清液入另一个1.5ml的离心管中，加入等体积的氯仿，混匀，13000r/min离心5min；

2.5.将上清移入另一个1.5ml的离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，上下颠倒混匀，13000r/min离心5分钟；

2.6.弃上清后用70％乙醇冲洗，13000r/min离心5分钟，小心吸弃上清，倒置晾干；

2.7.在干燥后的离心管中加入50μl DNA溶解液充分混匀，作为DNA模板待用。

3. Real-t imePCR体系的建立和优化

3.1.引物浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，将阪崎克罗诺杆菌的引物浓度分别从0.1μmol/l至1.6μmol/l作倍比连续稀释，通过试验结果的分析比较，确定最佳引物终浓度为0.6μmol/l。

3.2. Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的优化通过比较Taq酶用量(以单位Unit计)的优化实验结果，选定2.5U作为试剂盒反应体系中Taq酶的用量。

3.3. dNTPs浓度的优化通过使用不同浓度的dNTPs进行检测，综合评估后选0.2mmol/l作为试剂盒反应体系中dNTPs的使用量。

3.4.探针浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，将阪崎克罗诺杆菌的探针浓度分别从0.1μmol/l至0.5μmol/l作倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定最佳探针终浓度为0.2μmol/l。

利用上述引物和探针进行反应体系的建立，最后确定采用的阪崎克罗诺杆菌实时荧光定量PCR反应体系为25μl体系，所需各组分及相应浓度见表1。

表1阪崎克罗诺杆菌实时荧光定量PCR反应中的各组分情况

组分	25μl体积	终浓度
			10×PCR Buffer	2.5μl	1×
dNTPs，各2.5mM	2μl	0.2mM
			上、下游引物，各10μM	各1.5μl	0.6μM
探针，10μM	0.5μl	0.2μM
			Taq酶，5U/μl	0.5μl	2.5U
待测样品的DNA	5μl
			RNase Free dH2O	11.5μl

注：a.使用的仪器不同，应将反应参数作适当调整。

b.根据检测样本来源不同，应适当调整模板加量。

4.实时荧光定量PCR反应条件

将样品管放入ABI公司7500荧光PCR仪后，设置如下条件进行反应：95℃变性3min；以95℃5s，60℃40s扩增40个循环(收集荧光)。反应结束后根据曲线判定结果。

利用实施例1中建立起的荧光定量PCR反应系对14株不同的菌进行检测(6株阪崎克罗诺杆菌和穆汀斯克罗诺杆菌，阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)，大肠杆菌(Escherichia Coli)、沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、志贺氏菌(Shigellaflexneri)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、猪链球菌(Streptococcus suis)各一株)

试验结果：检测结果如图1所示，图中1为ATCC 29544阪崎克罗诺杆菌标准菌株，2～6为中山出入境检验检疫局分离得到阪崎克罗诺杆菌，均出现相应的特异性荧光扩增曲线，呈阳性反应。图中7为1株穆汀斯克罗诺杆菌和图中8为1株阴沟肠杆菌则均没有荧光信号产生，判为阴性。另外大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌均没有荧光信号产生，判为阴性(图中未显示)。如图所示所有阪崎克罗诺杆菌均出现阳性“S”型扩增曲线，而其他菌株均无扩增为阴性。在选定的菌株范围内，设计的引物和探针特异性为100％。

实施例2

将提取的阪崎克罗诺杆菌ATCC 29544DNA用DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的水梯度稀释成4.6×10⁷、4.6×10⁶、4.6×10⁵、4.6×10⁴、4.6×10³、4.6×10²、4.6×10¹拷贝数/mL，利用实施例1中建立起的荧光定量PCR反应系进行相对灵敏度检测，检测结果如图2所示。

结果证实阪崎克罗诺杆菌检测的最低检测限均达到460个模板拷贝/ml。

实施例3

取婴幼儿配方奶粉，根据GB 4789.40-2010法测得其无阪崎克罗诺杆菌污染。吸取1ml浓度为10cfu/ml的菌悬液均匀混在25g婴幼儿配方奶粉中，静置10min，加入225ml BPW(缓冲蛋白胨水)增菌液，混合均匀后，37℃培养，分别在4h、6h、12h、18h、24h后各取1ml增菌液，4000r/min离心10min，小心挑去上层脂肪，12000r/min离心5min，弃上清液，按实施例1所示提取DNA。根据实施例1所建立PCR反应条件进行荧光PCR检测，并用DEPC水作为阴性对照。

结果如图3所示，用荧光定量PCR检测人工染菌剂量10cfu/25g匀浆的婴幼儿配方奶粉，在增菌8h后能检测出阳性，4h和6h未能检出，结果如图3所示。荧光定量PCR大大减少了阪崎克罗诺杆菌检测所需的时间，为阪崎克罗诺杆菌快速检测提供了新的技术手段。

Claims

1.一种用于检测阪崎克罗诺杆菌核苷酸片段的引物，其特征在于，所述的引物序列为：由上游引物序列5‘GGGATACGCAGGAGGTGGCA’和下游引物序列5’GATGCTGCCTGCCAGCAGG’组成的引物对；或者上述引物对的上游引物向5’端方向延伸10个碱基，向3’端方向延伸10个碱基，下游引物向3’端方向延伸10个碱基，向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的引物序列。

2.一种用于检测阪崎克罗诺杆菌核苷酸的探针，其特征在于，所述的探针序列为：5‘CATTTTAGCGCTTGATACTCCCCTGGGC’或者为上述探针序列向3’端方向延伸10个碱基和向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列。

3.一种检测阪崎克罗诺杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将权利要求2所述探针一端标记有报告荧光染料，另一端标记有猝灭荧光染料；

(3)反应结束后根据扩增曲线判断是否有阪崎克罗诺杆菌。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述报告荧光染料采用下列荧光基团中的任意一种：Fam、Hex、Tet、Joe、Vic、FITC、Cy3和Cy5；所述淬灭荧光染料采用下列荧光基团中的任意一种：Tamra、Rox、Dabcy1、BHQ1和BHQ2。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，以25μl的反应体系计，所述实时荧光定量PCR反应的条件为：在反应体系加入10×PCR Buffer，dNTPs，上、下游引物，标记有荧光素的探针，Taq酶和3～5μl的待测样品的DNA，并用RNase Free dH₂O补至总体积25μl，上述组分的终浓度如下：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，以25μl的反应体系计，所述实时荧光定量PCR反应的条件为：

7.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR反应条件是：95℃变性1min；以95℃5s，60℃40s扩增40个循环。

8.一种检测阪崎克罗诺杆菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1的上、下游引物、权利要求2中的探针、10×PCR Buffer、dNTPs和Taq酶。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，以25μl的反应体系计，各组分如下：

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，以25μl的反应体系计，各组分如下：