CN106222293B - 荧光定量pcr引物探针和试剂盒及检测三种芽孢杆菌的方法 - Google Patents

荧光定量pcr引物探针和试剂盒及检测三种芽孢杆菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种荧光定量PCR引物探针组和试剂盒及检测三种芽孢杆菌的方法，包括具有SEQ ID NO.1‑6所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.7‑9所示核苷酸序列的探针。本发明还提供了一种荧光定量PCR检测三种芽孢杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的荧光定量PCR引物探针组和Hotstar DNA聚合酶。通过上述技术方案本发明显著地提高了对三种芽孢杆菌同时进行检测的敏感性、特异性和简便性。

Description

荧光定量PCR引物探针和试剂盒及检测三种芽孢杆菌的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及荧光定量PCR引物探针组和试剂盒及检测三种芽孢杆菌的方法。
背景技术
芽孢杆菌属是一类重要的食源性致病菌，非常容易引起食品和化妆品的污染，进而感染人类引起发病。芽孢杆菌属中的蜡样芽孢杆菌组对食品安全污染防控意义重大，其中炭疽芽孢杆菌是最重要的致病菌，能够引起严重的肺炭疽病、肠炭疽病、皮肤炭疽病等，且病人具有强烈的传染性。除了接触感染之外，通过进食被该菌污染的肉类也可以引起发病。蜡样芽孢杆菌是该组第二位的致病菌，其引起的食物中毒具有普遍性的特点，主要是因为蜡样芽孢杆菌广泛存在于自然界的土壤、灰尘、污水、动植物体中，容易在生产、加工和烹饪以及剩饭存放诸多环节进入食品，引起食物中毒。其中米饭是蜡样芽孢杆菌最容易繁殖的食物，全世界范围内诸多的食物中毒事件都是由此类食物引发的。苏云金芽孢杆菌是一种昆虫病原菌，但随着生物农药的应用普遍，陆续进入人类的食物中，在食物中毒原因判断过程中容易引起误导，所以，确定炭疽芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌需要排除苏云金芽孢杆菌的干扰。
针对三种细菌的标准实验室检测方法，《炭疽诊断标准》(WS283-2008)通过镜检革兰氏阳性大杆菌、分离培养细菌以及血清抗体4倍增高等手段诊断炭疽感染；美国FDA、国际化标准组织ISO和国内标准均要求采用分离、培养、计数和生化鉴定的方法对蜡样芽孢杆菌进行检测。苏云金芽孢杆菌与其他芽孢杆菌鉴定的主要依据是，苏云金芽孢杆菌在特定条件下产生伴孢晶体。其他的检测方法包括分别对三种细菌进行等温PCR、荧光定量PCR、免疫层析等技术手段的分析。
芽孢杆菌污染的检测是食品安全监测和食物中毒事件分析过程中的重要工作之一，炭疽芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌是芽孢杆菌污染中最具有代表性和防控意义的致病菌，而苏云金芽孢杆菌是风险评估中需要排除的干扰因素。因此，同时筛查和检测炭疽芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌在食品安全风险评估中具有重要的意义。
目前检测三种细菌的荧光定量PCR方法、等温扩增PCR方法、液相芯片技术等只是针对单一目标的检测鉴定技术，操作时需要逐个目标开展检测，耗费人力、试剂和时间，并且需要对每一次检测做好质量控制，保证三个检测结果的均一性。以免疫层析技术为代表的快速检测技术，则存在检测敏感度不够，工艺复杂，无法对多个目标在同一反应体系内检测等不足之处。现在还没有针对蜡样芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌三种细菌采用多重荧光定量PCR同时鉴定其种属的报道。
发明内容
本发明的目的是解决蜡样芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌三种细菌同时检测与鉴定的问题，提供一种检测蜡样芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的荧光定量PCR引物探针组和试剂盒，同时准确鉴定蜡样芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌，建立一种基于荧光定量PCR平台的三重PCR检测方法。
为达到以上目的，本发明提供多重PCR检测三种芽孢杆菌用引物探针组，其中，包括具有SEQ ID NO.1-6所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.7-9所示核苷酸序列的探针。
其中，所述引物探针组还包括具有SEQ ID NO.10-11所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.12所示核苷酸序列的探针。
本发明还提供了一种三重荧光定量PCR检测三种芽孢杆菌的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
(1)提取待测样本的总DNA；
(2)以所述总DNA为模板，并使用本发明所述的引物探针组，进行三重荧光定量PCR反应；
(3)收集检测通道荧光信号，得到检测结果；
在空白对照、阳性对照和阳性内对照成立的情况下，在每个荧光检测通道中：
a)若样本有S型扩增，且CT值小于35，则判定样本为阳性；
b)若样本有S型扩增，且CT值小于40并大于等于35，则判定为不确定样本，需重新提取核酸后进行复检；若复检的样本仍有S型扩增，且CT值小于40，则判定样本为阳性，否则为阴性；
c)若样本无明显S型扩增曲线，但报告有CT值，则判定为非特异性扩增。
本发明的一个方面还提供了一种三重荧光定量PCR检测三种芽孢杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的引物探针组。
本发明建立的蜡样芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌三重荧光定量PCR检测引物探针组、方法和试剂盒能够实现食品中重要芽孢杆菌种的快速筛查与鉴别，避免血清学、病原培养学等方法的繁琐操作，达到如下的检测效果：
(一)多重检测
本发明所建立的检测方法能够在一次PCR反应中同时筛查蜡样芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌，快速简便的获得致病相关芽孢杆菌属的病原种类，节省时间、人力和试剂成本。
(二)灵敏度高
本发明基于荧光定量PCR检测平台建立了三重PCR检测方法，创造性的采用了两种不同的退火延伸温度，这与一般荧光定量PCR技术要求不同。本发明采用先低后高的退火延伸温度，保证扩增反应特异性的同时提高了富集模板的效率，最终产生明显的灵敏度升高效果，最低可以实现每个反应检测目标<10个拷贝。
(三)特异性高
本发明所建立的检测方法的特异性主要体现在一整套引物探针的特异性，所有引物都经过blast比对分析，具有高度的保守性和特异性，不仅在本发明中检测目标能够相互区分，而且还能与其他种属相近、生存环境相同的细菌区别开，这包括蕈状芽孢杆菌、韦氏芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、霍乱弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、嗜水气单胞菌等，证明检测方法具有高度的特异性，能够将非检测目标准确分辨出来。
(四)预防假阴性结果
体系中添加的阳性内对照，可以有效的提示假阴性检测结果。
本发明为食品中蜡样芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的快速筛查提供了完备的解决方案，能实现食品安全日常监测、食物中毒事件发生后和疫情暴发后的常见致病性芽孢菌的筛查，为食品安全风险评估和食物中毒事件的合理恰当处置提供可靠的实验室依据。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为试剂盒荧光定量PCR检测实际样本的扩增曲线。模板为三种芽孢杆菌的混合模板。扩增曲线编号1的为蜡样芽孢杆菌(FAM)、编号2为炭疽芽孢杆菌(HEX)、编号3为苏云金芽胞杆菌(CY5)、编号4为阳性内对照(ROX)。
图2为荧光定量PCR多重引物探针特异性的验证，其中模板为14种无关病原体、蜡样芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、苏云金芽胞杆菌三种阳性对照及阳性内对照质粒。结果显示，除了阳性内对照以及三个目标的阳性对照有扩增外，无其他扩增信号。扩增曲线编号1的为蜡样芽孢杆菌阳性对照(FAM)、编号2为炭疽芽孢杆菌阳性对照(HEX)、编号3为苏云金芽胞杆菌阳性对照(CY5)、编号4为阳性内对照(ROX)。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明的一种实施方式提供了一种多重PCR检测三种芽孢杆菌用引物探针组，包括具有SEQ ID NO.1-6所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.7-9所示核苷酸序列的探针。
其中，所述三种芽孢杆菌为蜡样芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。
本发明的引物探针组选择特异性的检测基因或保守序列，蜡样芽孢杆菌选择DNA解旋酶B基因(gyrB)，炭疽芽孢杆菌选择λ前噬菌体3型保守区(PL3)，苏云金芽孢杆菌选择δ-毒素基因(cry)。
针对目标序列设计3个检测目标的引物探针。设计过程中充分考虑不同目标基因的引物探针在一个反应体系内共扩增的问题，因此，引物探针设计时要综合的考虑到Tm值一致性、GC含量均一化，同时尽可能避免出现发夹结构、引物二聚体等情况，以保证后期不同引物探针同时扩增的概率。最终获得本发明提供的一套特异的引物探针序列(详见表1)。
表1蜡样芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌多重PCR引物探针汇总表
*注：Y＝C/T；R＝A/G；W＝A/T；S＝C/G
检测蜡样芽孢杆菌DNA解旋酶B基因的上下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.7所示；其中探针的5’端有发光基团FAM，3’端有淬灭基团BHQ1。
检测炭疽芽孢杆菌λ前噬菌体3型保守区的上下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.8所示；其中探针的5’端有发光基团HEX，3’端有淬灭基团BHQ1。
检测苏云金芽孢杆菌δ-毒素基因的上下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9所示；其中探针的5’端有发光基团CY5，3’端有淬灭基团BHQ3。
检测阳性内对照质粒模板pET28a的上下游引物和探针的核苷酸序列分别由SEQID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示；其中探针的5’端有发光基团Rox，3’端有淬灭基团BHQ2。
在本发明的一种实施方式中，涉及一种三重荧光定量PCR检测三种芽孢杆菌的检测方法，包括，(1)提取待测样本的总DNA；(2)以所述总DNA为模板，并使用本发明所述的多重PCR引物探针组，进行三重荧光定量PCR反应；(3)收集FAM、HEX和CY5检测通道荧光信号，得到检测结果；在空白对照、阳性对照和阳性内对照成立的情况下，在每个荧光检测通道中：
a)若样本有S型扩增，且CT值小于35，则判定样本为阳性；
b)若样本有S型扩增，且CT值小于40并大于等于35，则判定为不确定样本，需重新提取核酸后进行复检；若复检的样本仍有S型扩增，且CT值小于40，则判定样本为阳性，否则为阴性；
c)若样本无明显S型扩增曲线，但报告有CT值，则判定为非特异性扩增。
三重PCR引物探针浓度及反应体系配置如下：
Hotstar DNA聚合酶1-2U，5×PCR buffer(Tris-HCl 100mM(pH8.3)，KCl 100mM，Tween-20 0.2％，pET28a 0.0003-0.01ng，)5μl，10mM dNTP 0.5～1.25μl，25mM MgCl2 2～4μl，10×引物探针混合物2.5μl，DNA模板2μl，超纯水补至25μl。其中，反应体系中每条引物的最终使用浓度各自为0.3-0.6μM，每条探针的最终使用浓度各自为0.1-0.3μM。
为提高PCR反应的灵敏度，本发明采取两种不同的退火延伸温度，这与公认设置不同，并且具有良好的效果。多重PCR反应的反应条件如下：
a：95℃10min；
b：95℃15-60s，
c：50-60℃15-60s，b-c循环10-15个反应；
d：95℃15-60s，
e：60-70℃15-60s，d-e循环25-30个反应。
本发明还提供了一种含有前述三重荧光定量PCR检测引物探针组的试剂盒。
优选的，所述试剂盒中还含有阳性内对照质粒模板pET28a。
优选的，所述试剂盒还包括5×反应体系缓冲液、Hotstar DNA聚合酶、10×引物探针混合物、阳性对照和超纯水。
以下，通过实施例进一步详细说明本发明。以下实施例中，蜡样芽孢杆菌购自中国医学菌种保藏中心，编号为63303；炭疽芽孢杆菌购自中国医学菌种保藏中心，编号为63001；苏云金芽孢杆菌购自中国医学菌种保藏中心，编号为63002。
实施例1蜡样芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌三重荧光定量PCR检测试剂盒的组建：
试剂盒由5×反应体系缓冲液、Hotstar DNA聚合酶、10×引物探针混合物、阳性对照、超纯水构成，其具体组分如下：5×PCR buffer(Tris-HCl 100Mm(pH 8.3)，KCl 100mM，Tween-20 0.2％，pET28a 0.0003ng，5mM dNTP，20mM MgCl2)；25×Hotstar DNA聚合酶(2U/μL)；10×引物探针混合物(如表1所示，包含阳性内对照(pET28a质粒模板)在内的每条引物的浓度为3μM，每条探针的浓度为2μM)；阳性对照(蜡样芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的混合模板，每种均为106CFU/ml)。
试剂盒检测的反应体系为25μL，其配置如下：5×PCR Buffer 5μL；25×DNA聚合酶1μL；10×引物混合物2.5μL；模板2μL，超纯水14.5μL。
实施例2试剂盒的操作和结果判断
1、基因组的提取
取食品样本的增菌液1mL，13000rpm离心5分钟后弃上清，加蛋白酶K 55℃消化1小时，使用煮沸法或者商品化试剂盒提取待检目标菌DNA作为检测样本。
2、反应体系的配制
取200μL的PCR管配置25μL的反应体系，其配置如下5×PCR Buffer 5μL；25×DNA聚合酶1μL；10×引物混合物2.5μL；模板2μL，超纯水14.5μL。
3、PCR反应
将PCR管放入CFX96型荧光定量PCR仪中，按照如下程序进行PCR反应：95℃10min；95℃15s，55℃30s，循环10个反应；95℃15s，60℃30s，循环30个反应，扩增结果如图1所示。
4、结果判断
1)调整阈值：仪器根据前15个循环反应背景值，自动调整判定阈值。
2)质量控制：空白对照、阳性对照和阳性内对照成立，否则视实验无效。
3)每个荧光检测通道的判断与解释：a)若样本有S型扩增，且CT值小于35，则判定样本为阳性；b)若样本有S型扩增，且CT值小于40并大于等于35，则判定为不确定样本，需重新提取核酸后进行复检；若复检的样本仍有S型扩增，且CT值小于40，则判定样本为阳性，否则为阴性；c)若样本无明显S型扩增曲线，但报告有CT值，则判定为非特异性扩增；可能为探针降解所释放的非特异性荧光信号。具体判定方式参照表2。
表2蜡样芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌检测结果判定表
实施例3试剂盒的保存期试验
以105CFU/mL蜡样芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的混合模板为评估用检测样本，在第0天时，分装成9份冻存于-70℃冰箱中。将组建完毕的试剂盒放置于-20℃保存，分别取0、10、15、30、60、90、120、150、180和360天的试剂盒进行保存期试验。保存期检测结果如表3所示：
表3保存期试验结果
保存期 检测三种目标菌的有效性
第0天 3个均有效
第10天 3个均有效
第15天 3个均有效
第30天 3个均有效
第60天 3个均有效
第90天 3个均有效
第120天 3个均有效
第150天 3个均有效
第180天 3个均有效
第360天 3个均有效
由表3可知，试剂盒保存在-20℃冰箱，在不同保存期检测三个目标菌均有效，实验结果表明该试剂盒的保存期至少为6个月。
实施例4试剂盒的特异性试验
选择蕈状芽孢杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为32012)、韦氏芽孢杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为32011)、枯草芽孢杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为32041)、大肠埃希氏菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为43317)、阪崎肠杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为21665)、志贺氏菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为51054)、金黄色葡萄球菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为26003)、沙门氏菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为50001)、副溶血性弧菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为21617)、单核细胞增生性李斯特氏菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为54002)、霍乱弧菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为1109)、空肠弯曲菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为1159)、结肠弯曲菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为1169)、嗜水气单胞菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为44016)这些与检测目标菌种属相近，存在环境相似的细菌作为待检细菌。
应用本发明试剂盒检测这些待检细菌，阴性对照、阳性对照和阳性内对照均为成立，证明检测系统成立；待检细菌均未出现非特异性的荧光信号，表明本发明试剂盒能够有效区分非目标细菌，具有较好的特异性(结果如图2所示)。
实施例5试剂盒的最低检出限试验
评估用检测样本：选择蜡样芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌代表菌株，将3个菌株的菌悬液分别调整至108CFU/mL，分别提取三种目标菌基因组DNA。将3个模板分别梯度稀释成相当于107CFU/mL，106CFU/mL，105CFU/mL，104CFU/mL，103CFU/mL，102CFU/mL，10CFU/mL的检测样本。
使用本发明试剂盒分别检测蜡样芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌不同稀释度的模板。根据实施例2进行操作和结果判断，试剂盒检测3个目标菌的最低检出限试验结果如表4所示：
表4试剂盒检测蜡样芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌最低检出限试验结果
从表4看出，试剂盒检测三种目标菌的最低检出限均达到102CFU/mL，试剂盒总体的最低检出限为每个反应检测1拷贝的目标分子。
对比例1
按照与实施例1相同的方法组装对比试剂盒1-3。对比例的引物探针汇总表见表5。
表5对比引物序列表
区别仅在于，将SEQ ID NO.1、2和7所示的引物探针替换为SEQ ID NO.13-15所示的引物和探针获得对比试剂盒1。
将SEQ ID NO.3、4和8所示的引物替换为SEQ ID NO.16-18所示的引物和探针获得对比试剂盒2。
将SEQ ID NO.5、6和9所示的引物替换为SEQ ID NO.19-21所示的引物和探针获得对比试剂盒3。
按照与实施例4和5相同的方法进行特异性和最低检出限试验，结果显示对比试剂盒1、2和3在检测最低检出限、覆盖度及特异性方面均差于实施例1中组建的试剂盒。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.多重PCR检测三种芽孢杆菌用引物探针组，其特征在于，包括由SEQ ID NO.1-6所示核苷酸序列组成的引物，以及，由SEQ ID NO.7-9所示核苷酸序列组成的探针。
2.根据权利要求1所述的引物探针组，其中，还包括由SEQ ID NO.10-11所示核苷酸序列组成的引物，以及，由SEQ ID NO.12所示核苷酸序列组成的探针。
3.一种用于非诊断目的的三重荧光定量PCR检测三种芽孢杆菌的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
（1）提取待测样本的总DNA；
（2）以所述总DNA为模板，并使用权利要求1或2所述的引物探针组，进行三重荧光定量PCR反应；
（3）收集检测通道荧光信号，得到检测结果；
在空白对照、阳性对照和阳性内对照成立的情况下，在每个荧光检测通道中：
a）若样本有S型扩增，且CT值小于35，则判定样本为阳性；
b）若样本有S型扩增，且CT值小于40并大于等于35，则判定为不确定样本，需重新提取核酸后进行复检；若复检的样本仍有S型扩增，且CT值小于40，则判定样本为阳性，否则为阴性；
c）若样本无明显S型扩增曲线，但报告有CT值，则判定为非特异性扩增；所述三种芽孢杆菌为蜡样芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其中，每条引物的最终使用浓度各自为0.3-0.6μM，每条探针的最终使用浓度各自为0.1-0.3μM。
5.根据权利要求3或4所述的检测方法，其中，三重荧光定量PCR反应的条件包括如下步骤：
a：95℃ 10min；
b：95℃ 15-60s，
c：50-60℃ 15-60s，b-c循环10-15个反应；
d：95℃ 15-60s，
e：60-70℃ 15-60s，d-e循环25-30个反应。
6.三重荧光定量PCR检测三种芽孢杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物探针组。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包括5×反应体系缓冲液、HotstarDNA聚合酶、10×引物探针混合物、阳性对照和超纯水。
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