CN1936019A - 用于多重实时核酸扩增检测的探针编码方法 - Google Patents
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Abstract
用于多重实时核酸扩增检测的探针编码方法，涉及一种核酸扩增检测，尤其是涉及一种用于多重实时核酸扩增的探针编码方法，提供一种使目前的多重实时核酸扩增可检测的靶序列数目明显多于目前仪器可检测的荧光染料数目的探针编码方法或探针组合方法。先将核酸扩增检测仪器检测的荧光染料作为荧光探针标记的基本元素，称荧光基本元素；荧光基本元素之间的相互组合标记靶序列的特异指示探针，互相组合是指组合编码、排列编码和指数编码。利用好荧光基本元素数目、循环阈值和各荧光基本元素相对强度这三个变量来产生出任意多个基因特异性荧光指纹图谱，以便在荧光基本元素数目有限的情况下仍能同时检测出许许多多不同核酸序列。适合于多种靶序列的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种核酸扩增检测，尤其是涉及一种用于多重实时核酸扩增的探针编码方法，该方法使多重实时核酸扩增检测的靶序列数目大大多于仪器可检测的荧光染料数目。
背景技术
实时聚合酶链式反应(Real-time PCR)在基因定量、基因分型和单核苷酸多态性(SNPs)检测等方面正得到越来越广泛的应用，实时PCR最突出的优点是扩增检测同步进行，其它依赖核酸扩增的检测技术，无论检测的通量和操作如何，其简便程度都不及实时PCR，这也是目前实时PCR在临床上得以普遍应用的根本原因。然而，实时PCR存在检测容量小的问题，即在一次反应中可同时检测的靶序列数目受仪器荧光检测通道数目的限制。目前最新的实时PCR仪器能同时检测5种不同荧光染料，按照传统的检测方式也至多能检测5种靶序列。这一问题严重制约了实时PCR在多位点依赖的基因分型中的应用。
实时PCR的简便性及其它诸多优点吸引人们不断努力去提高其检测容量。自Kramer小组(Vet，J.A.M.，et al，PNAS 96，6394-6399，1999)率先在四色荧光PCR仪器上实现四种靶序列的同时检测以来，多组分实时PCR检测技术已广泛应用。2000年Tyagi等(Tyagi，S.，et al，Nature Biotechnology 18，1191-1196，2000)发明波长迁移型分子信标，克服了单一光源无法同时检测多个荧光染料的困难，El Hajj等据此实现了5色探针检测结核杆菌的利富平耐药突变(El Hajj，H.H.，Journal of Clinical Microbiology 39，4131-4137，2001)。
撇开实时PCR仪器，Lee等(Lee，L.G.，et al，Biotechniques 27，342-349，1999)利用荧光光度计同步扫描7种荧光染料，实现了6种靶序列的同时检测。另有利用PCR扩增产物的熔点差异，在实时PCR扩增结束后，进行熔点曲线分析，以实现多个靶序列的同时检测和基因分型(Herrmann，M.G.，et al，Clinical Chemistry 50，982，2004；Elenitoba-Johnson，K.S.J.，et al，Nature Medicine 7，249-253，2001；Ririe，K.M.，et al，Analytical Biochemistry 245，154-160，1997)。但该方法的局限性在于PCR产物的熔点范围狭窄，很难容下5个以上靶序列的同时存在与区分，而且容易受到引物二聚体等非特异扩增的干扰。
发明内容
本发明的目的是针对多重实时核酸扩增检测容量小，即按传统的一种荧光基团标记一种探针的方法，在一次反应中可同时检测的靶序列数目受仪器荧光检测通道数目的限制的问题，提供一种使多重实时核酸扩增可检测的靶序列数目明显多于目前仪器可检测的荧光染料数目的探针编码方法或探针组合方法。
本发明的具体步骤为：
1、将核酸扩增检测仪器所能检测的不同荧光染料作为荧光探针标记的基本元素，称之为荧光基本元素；
2、以荧光基本元素之间的相互组合来复合或混合标记靶序列的特异指示探针，所说的互相组合是指组合编码、排列编码和指数编码。
所说的组合编码只考虑荧光基本元素种类的不同而忽略不同荧光基本元素间荧光强度的差异，可以将荧光基本元素按数学的组合规则组合成不同的荧光标记基团或探针。所说的排列编码即考虑荧光基本元素种类的不同又区分各荧光基本元素间的相对强弱，可按数学的排列规则组合成不同的荧光标记基团或探针。所说的指数编码同时考虑荧光基本元素种类的差别、各元素间荧光强度的相对强弱、及荧光强度大小差异的不同程度，可按数学上指数规则组合成不同的荧光标记基团或探针。
所说的以荧光基本元素之间的相互组合而不只是单一的荧光基本元素来复合或混合标记靶序列的特异指示探针；将所标记的探针加入到实时核酸扩增体系并对待测核酸序列进行扩增；协同利用实时核酸扩增曲线图谱中出现的荧光基本元素的种类、循环阈值(CT值)差别和各荧光基本元素相对强度差异这三个变量来区分、识别基因(信号)特异性荧光指纹图谱及其对应的靶序列，以便在荧光基本元素数目有限的情况下同时检测出多种不同核酸序列。所说的荧光基本元素包括但并不局限于ALEXA 350，FAM，HEX，TET，JOE，VIC，ROX，Texas Red，Cy5，Cy5.5，TAMRA等。
所说的荧光探针是指可用于实时核酸扩增检测的荧光探针，它们包括TaqManTM探针、TaqMan-MGBTM探针、分子信标探针(Molecular Beacons)、荧光能量共振转移探针(又称LightCyclerTM探针)、置换探针、蝎子引物(Scorpions)、Amplifier引物等。这些荧光探针可以分为依赖聚合酶5′→3′外切核酸活性的探针如TaqMan探针，以及不依赖聚合酶5′→3′外切核酸活性的探针，如包括分子信标探针和置换探针等。
所说核酸扩增检测为多色实时核酸扩增检测，或终点式的核酸扩增检测。
所说的荧光基本元素的种类是指在实时核酸扩增曲线图谱中有那些荧光基本元素出现；所说的循环阈值(CT值)差别是指所出现的各荧光基本元素之间出峰时间的差别；所说的荧光基本元素之间荧光强度大小差异程度是指每一荧光基本元素的大小水平，或荧光水平，或相对程度，或相对强度组合成不同的元素。可利用各种荧光基本元素出峰的相对时间、曲线形状、有无曲线增长拐点等来区分多种靶序列共存时那种序列存在并加以扩增检测。
本发明所提供的编码方法适合于多种靶序列的检测，尤其适合于检测样品中只可能含有多种靶序列中的至少一种(经常是一种或少数几种)的基因分型，特别是对于同一基因或基因家族中不同等位基因的基因分型。本发明所提供的编码方法特别适合针对特定靶基因进行基因分型，此时可以使用至少一对(经常是一对或少数几对)引物进行扩增，而用至少2个探针检测引物中间序列达到基因分型的目的。
所说的探针优选不依赖聚合酶5′→3′外切核酸活性的探针，如包括分子信标探针和置换探针等。
所说的实时核酸扩增检测为实时核酸扩增检测的基因分型，实时核酸扩增选自实时PCR、实时RT-PCR、Q-Beta扩增、实时核酸序列依赖的扩增中的一种。
当单色与多色探针共同编码多个等位基因时，纯合子与杂合子的区分是通过调整多色探针中各荧光基本元素所标记的探针比例来使多色探针在检测纯合子时，各色荧光曲线峰值基本持平。这样在单色与多色探针所检测的两个等位基因共存于一个杂合子时，单色探针中那一颜色荧光的峰值就会高于其它颜色荧光峰值。
所说的探针优选高特异性的、可以区分只有单个碱基差别的靶序列特异性荧光探针。这种探针适合于各种靶序列差异的识别，而且大量探针共存并不会造成彼此之间的干扰，只有与探针完全匹配的靶序列结合才可以引起探针荧光强度的增加。
总之，本发明的主旨就是要协同利用好荧光基本元素数目、循环阈值(CT值)和各荧光基本元素相对强度这三个变量来产生出任意多个基因(信号)特异性荧光指纹图谱，以便在荧光基本元素数目有限的情况下仍能同时检测出许许多多不同核酸序列。
由此可见，按照探针编码方法，无论采用组合编码、排列编码还是指数编码，都可得到远多于荧光基本元素的编码数，从而可以检测种类更多的靶序列。
可把用一种荧光染料(亦即一个荧光基本元素)标记的探针称作单色荧光探针或者单色探针。类似地，可把两个或两个以上荧光染料(亦即多个荧光基本元素)复合或混合标记的探针，称作复合多色荧光探针或多色探针(参见图1)。无论单色探针还是多色探针都是针对各自的靶序列设计，也就是说它们都可以检测各自的靶序列。单色探针或者多色探针的序列可以相同也可以不同，但多数情况下是相同的。
本发明适合于基于实时核酸扩增检测的基因分型，实时核酸扩增包括实时PCR、实时RT-PCR、实时核酸序列依赖的扩增(NASBA)等。本发明当然并不排除用于终点式的核酸扩增检测，但是，发明人认为，实时检测更能充分发挥本发明的优势。首先，实时检测方式属于动力学检测，即使大量探针共存造成背景信号增加，也不会对动力学检测特性造成明显影响。其次，实时核酸扩增检测如实时PCR检测的反应曲线的循环阈值(CT)由模板浓度决定，并具有极好的重现性，对于采用同一序列设计的多色探针而言，各个荧光染料所展示的扩增曲线应具有相同或者至少相近的CT值。另外，对于排列编码和指数编码的多色探针而言，判断结果所依据的是同一反应中多色探针显示的多个实时扩增曲线之间峰值的相对位置与强弱(荧光指纹图谱)。采用同一序列的多色探针，虽然荧光染料不同，所展示的与模板杂交的效率应相同，而且受外界影响的程度也相同，因此，同一序列的多色探针实时扩增曲线的最终荧光强度之比也将是相对固定的。这就使我们能够利用每一组合多色探针与其特异性序列杂交所产生的特异性荧光指纹图谱来区分PCR产物中有那种特异性序列存在并得以扩增。
本发明所述探针编码方法虽然侧重应用于核酸检测，但任何一个懂得基本常识与技术的业内人士都可按本发明的想法把它推广到其它荧光检测体系乃至非荧光编码体系，实现利用有限几个元素来编码无限多个特征标记物来。因此，该发明涵盖但不应局限在核酸检测领域。
由此可见，本发明与目前通用的用一种荧光基本元素来标记一种靶序列特异探针的方式相比，相互组合的方式可以标记更多的特异指示探针，从而可以检测更多的靶序列。
附图说明
图1为多色探针原理图。在图1中，FAM(空心圆)和ROX(实心圆)分别是两种荧光染料，编码分别是1000和0100，它们相互混合后，可以认为形成了一种新的染料类型，即混合染料，如图1中的FAM/ROX(空心和实心各半的圆)，编码是1100。类似地，如果同一种探针分别使用了两种染料作为标记，如图1中的探针分别标记了FAM(空心圆)和ROX(实心圆)，二者混合后，就相当于形成了一种标记混合染料的探针，此处是双色探针。该探针标记的是FAM/ROX((空心和实心各半的圆，编码是1100)。灰色圆表示置换探针的淬灭剂。
图2为8株(菌株1～8)蜡样芽孢杆菌标准菌株的实时PCR分型。在图2中，荧光检测同时在Cy5(实心圆球)、ROX(空心圆球)、HEX(实心三角)和FAM(空心三角)四个通道中进行。其横坐标为循环数(Cycle Number)，纵坐标为荧光值(Fluorescence)。
图3为HPV15个基因型的分型结果。在图3中，荧光检测同时在Cy5(实心圆球)、ROX(空心圆球)、HEX(实心三角)和FAM(空心三角)四个通道中进行。其横坐标为循环数(Cycle Number)，纵坐标为荧光值(Fluorescence)。
图4为HCV6个基因型的实时RT-PCR分型体系。在图4中，荧光检测同时在Cy5(实心圆球)、ROX(空心圆球)、HEX(实心三角)和FAM(空心三角)四个通道中进行。其横坐标为循环数(Cycle Number)，纵坐标为荧光值(Fluorescence)。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明，实际上以下的实施例只是说明本发明，但显然并不限于这些应用，业内人士完全可以按照本发明的原理推广应用于多个领域。
实施例1：探针编码方法用于蜡样芽孢杆菌的基因分型。
蜡样芽孢杆菌是一种食源性致病菌，可引起感染性腹泻，也是引发细菌性食物中毒最常见的一种条件致病菌。如何及时确定传染源，是控制和降低此类细菌食物中毒发生的关键。目前，蜡样芽孢杆菌食物中毒的溯源仍以传统的生化分型为主，但生化分型耗时较长，结果不稳定，缺乏重现性，且不能对所有菌株进行分型，因此无法及时溯源。
本实施例中用以分型的vrrA基因是炭疽芽孢杆菌的一个多态性位点，具有串联重复序列和高变区，由于蜡样芽孢杆菌和炭疽芽孢杆菌同属芽孢杆菌，故以vrrA基因作为分子遗传标记来研究蜡样芽孢杆菌的多态性，采用实时PCR技术和组合探针编码技术进行基因分型。
首先根据8个标准菌株的vrrA基因序列设计荧光双链置换探针，每个菌株均有一套特异性的探针，分别标记FAM，HEX，ROX，CY5四种荧光染料的不同组合，并根据二进制为其编码(见表1)。然后用一对文献报道的引物进行PCR扩增，产物为230bp，引物序列为：Sense：5′-ACTACCACCAATGGCACA-3′，Anti-sense：5′-GCTGCATGTATGGTTGAT-3′。
在同一PCR反应管中，加入所有探针，反应总体积为25μL，内含10X缓冲溶液2.5μL，3.0mM MgCl2，0.25 mM dNTP，1.0U Taq酶，20pmol上游引物，2.5pmol下游引物，探针各20pmol，5μL菌液模板。反应条件：95℃3min，第一个循环周期为94℃15s，52℃20s，72℃20s，共10个循环，第二个循环周期为94℃15s，52℃20s，72℃20s，28℃18s，共40个循环，荧光在第二个循环周期的28℃时采集。利用MX 3000P实时PCR仪进行检测。实验中为了提高探针的荧光效率和杂交效率，采用低熔点探针和不对称PCR方式进行；最后根据实时荧光PCR结果(荧光曲线图谱差别)，可以将8种标准菌株成功地区分成8种亚型(见图2)。
实施例2：人乳头瘤病毒(HPV)的基因分型。
HPV是一组高度特异的DNA病毒，病毒核酸为双链环状DNA，含有8000碱基对，属乳多空病毒科A亚组，直径约55nm。HPV对生殖道鳞状上皮有强嗜性，各种HPV基因结构大致相似，可分为3个部分：晚期区、早期区和调节区。HPV与多种疾病的发生有关，严重的可以致癌，如宫颈癌、皮肤癌等。根据HPV与肿瘤发生的关系，可将其分为高危型和低危型两类。本实施例以15种不同型别的HPV作为实验对象，根据其L1区的基因序列设计荧光双链置换探针，每种型都设计一套特异性的探针(表2)，标记FAM，HEX，ROX，CY5四种荧光染料的全部组合，并以二进制编码。用一对通用引物GP5+/GP6+进行PCR扩增，产物约150bp，引物序列为GP5+：5′-TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC-3′，GP6+：5′-GAAAAATAAACTGTAAATCATA-TTC-3′。在一个PCR管中，加入所有探针，反应总体积为25μL，内含50mM KCl，2.5mM MgCl2，0.25mM dNTP，1.0U Taq酶，上下游引物各0.2μM，每种探针0.2μM，5μL质粒模板。反应条件为：95℃3min，循环周期为94℃15s，45℃20s，72℃20s，共40个循环，在退火时采集荧光。用Rotor-Gene 3000实时PCR仪进行检测。最后根据实时荧光PCR结果(荧光曲线图谱的差别)，成功地区分开15种不同亚型的HPV病毒(见图3)。
实施例3：HCV具有高度的变异性，各型广泛分布于全世界范围内，同时特定地区的流行基因型也在其它地区发现，使HCV基因型分布复杂，加之HCV基因型分型手段的不断发展和完善，使基因型分布的报道也频繁出现。本实施例以中国的6种主要亚型：1b，2a，3a，1a，3b和6a为对象，按照探针编码原理进行分型。针对HCV的6个基因型，只需选择3种荧光染料，构成FAM、HEX、ROX、FAM+HEX、HEX+ROX、FAM+ROX六种组合。探针序列如表3。中国地区HCV常见6个基因型进行编码而区分开。
利用通用引物进行RT-PCR扩增，上游引物5′-CCCICGITTGGGTGTGCG-3′，下游引物：5′-GTTAGGGTATCGATGACITTAC-3′，其中I为次黄嘌啉核苷酸，该通用引物PCR扩增产物长度为256_bp。用通用引物在同一反应管中进行RT-PCR基因分型，反应总体积为30μL，内含50mM KCl，2.5mM MgCl2，0.25mM dNTP，1.0UTaq酶，12U M-MLV逆转录酶，20URNAsin，0.2μM上游引物，0.2μM下游引物，各个探针0.2μM，加入5uL经95℃，5min热裂解各基因型假病毒作为RNA模板。反应条件：42℃，40min，95℃3min，循环周期为95℃15s，50℃20s，72℃20s，共40个循环，荧光信号在50℃时采集。最后根据实时荧光PCR结果，可以成功地区分开6种不同的HCV亚型(见图4)。
实施例4：用于多重实时核酸扩增检测的探针组合编码方法。设有A元素和B元素，可以分别构成A、B和A+B三种组合；同样如设有A、B和C三元素，可以构成A、B、C、A+B、A+C、B+C、A+B+C共七种组合。因此，按照数学上的组合规则，对于N个荧光基本元素，共有CN 1+CN 2+…+CN N＝∑CN 1(i＝1～N)＝2N-1种组合方式，其中的任一个都可以标记一种靶序列特异探针，故可得到2N-1种不同标记的荧光探针。这样就可以检测2N-1种不同的靶序列。按这一方案，四色荧光PCR仪器(共可同时检测四种荧光基本元素)就可检测24-1＝15种靶序列，五色荧光PCR仪器(共可同时检测五种荧光基本元素)就可检测25-1＝31种基因型。
根据组合编码方法可以看出，目前的测定方式实际上仅仅用单一的荧光基本元素逐个进行探针标记，并没有考虑它们之间的组合，所编码的探针只能等于荧光基本元素的个数。因此，对于四色荧光PCR仪器(共可检测四种荧光基本元素)，就只能编码四个荧光探针，检测四种靶序列。同样，五色荧光PCR仪器(共可检测五种荧光基本元素)就只能同时检测五种靶序列。
实施例5：用于多重实时核酸扩增检测的探针排列编码方法。组合编码方法只考虑了荧光基本元素种类的不同组合情况而没有考虑各荧光基本元素之间相对强度是否相同，如果进一步考虑组合内部荧光基本元素的量上的差异，就可以用不同的荧光强弱组成不同的排列，比如，同样是由A+B构成的组合编码，可以根据他们之间荧光强度的高低不同区别为A＞B或A＜B两种情况(虽然A＝B代表第三种情况，但由于要使PCR反应中两种或两种以上荧光基本元素的强度相同非常难以控制，并且A＝B时AB与BA不能区分，不能以排列方式来表述，故将此种情况不在排列编码范围内预与考虑)，用这两种情况分别表示两种探针，就可以得到两种编码。同样由A+B+C组合的组合编码，可以根据荧光强度大小差异组成A＞B＞C、A＞C＞B、B＞A＞C、B＞C＞A、C＞A＞B、C＞B＞A等6种情况，可以得到6种编码。这种组合方式符合数学的排列规则，因此，对于N个荧光基本元素，就可以获得∑PN 1(i＝1～N)个不同的荧光基本元素的组合。其中的任一个都可以标记一种靶序列特异探针，这样就可以检测∑PN 1(i＝1～N)种不同的靶序列。按照排列编码，四色荧光PCR仪器可以同时检测P4 1+P4 2+P4 3+P4 4＝64种靶序列，五色荧光PCR仪器可以同时检测P5 1+P5 2+P5 3+P5 4+P5 5＝325种靶序列。
实施例6：用于多重实时核酸扩增检测的探针指数编码方法。不难看出，排列编码方法只考虑了荧光基本元素之间存在大小差异，并没有考虑大小差异的程度。如果我们把每一种荧光基本元素的大小分成若干个水平，称为荧光水平，并用x表示荧光水平数，假定不同荧光基团的x值相等，则对于N色荧光PCR仪器，可以设计出的探针数目为：PN 1+∑x iPN i(i＝2～N)个荧光探针(该公式将单色荧光探针水平数均计为1，这是考虑了荧光强度本身就是相对的这一性质)。按照这一规则，如果一个染料荧光水平数x＝10，那么，四色荧光PCR仪器可以同时检测P4 1+(102P4 2+103P4 3+104P4 4)＝265，204种基因型，由于理论上每一种荧光染料的荧光水平数可以任意多个，因此指数编码理论上可以设计出任意多个编码方案。
实施例7：本发明所说的荧光探针，是指可用于实时核酸扩增检测的荧光探针，它们包括TaqManTM探针、TaqMan-MGBTM探针、分子信标探针(Molecular Beacons)、荧光能量共振转移探针(又称LightCyclerTM探针)、置换探针、蝎子引物(Scorpions)、Amplifier引物等。这些荧光探针可以分为依赖聚合酶5′→3′外切核酸活性的探针如TaqMan探针，以及不依赖聚合酶5′→3′外切核酸活性的探针，如包括分子信标探针和置换探针等。
实施例8：本发明优选采用不依赖聚合酶5′→3′外切核酸活性的探针，如包括分子信标探针和置换探针等。因为这些探针可用于所有实时核酸扩增检测的模式，而且反应条件不受依赖核酸聚合酶5’→3’外切酶活性的限制。
实施例9：本发明优选采用高特异性的荧光探针，这类探针可以区分只有单个碱基差别的靶序列。适合各种靶序列差异的识别，而且大量探针共存并不会造成彼此之间的干扰。因为可以区分单个核苷酸差别的荧光探针，只有与探针完全匹配的靶序列结合才可以引起探针荧光强度的增加。
实施例10：本发明提供的编码方法适合多种靶序列的检测，尤其适合检测样品中只可能含有多种靶序列中的一种(或少数几种)的基因分型。特别是对于同一基因(或基因家族)中不同等位基因的基因分型，由于可以使用一对或少数几对引物进行扩增，用编码的荧光探针识别不同的引物间序列，就可以在同一管内混合所有的探针。采用一对或少数几对引物产生非特异扩增的机会较少，反应条件更容易优化，这对于大量探针存在的反应体系来说，意味着反应条件的优化可以集中于探针上，使检测体系的建立过程更为简单。
实施例11：本发明特别适合针对特定靶基因进行基因分型，此时可以使用一对或少数几对引物进行扩增，而用多个探针检测引物中间序列达到基因分型的目的。比如对于人乳头瘤病毒(HPV)的实时PCR分型，对于免疫缺陷病毒(HIV)的实时RT-PCR分型，对于丙型肝炎病毒的实时RT-PCR分型，对于细菌的16S核糖体RNA的实时PCR分型，或者针对某一种细菌的实时PCR分型，包括耐药突变分型等。
实施例12：本发明用于对特定靶基因进行基因分型时，对于可能出现的同一标本中有两种或者两种以上亚型混合共存的情况，可根据两种探针的实时PCR曲线的CT值、相对荧光强度以及扩增曲线的形状进行区分。对于FAM和HEX编码的双色探针(编码同一靶序列)而言，当反应中存在该双色探针的对应的靶序列时，仪器上FAM和HEX通道上显示的两条实时PCR曲线的CT差值(ΔCT)理论上应为零，并且二者的荧光强度比例一定。若同时出现FAM单色探针和HEX单色探针编码的两种不同靶序列，则出现二者的实时扩增曲线之ΔCT或者为正或者为负的情况，而且二者荧光强度之比也必不同于双色探针的情况。只有当双色探针检测的靶序列与两种单色探针所检测的靶序列的起始靶序列含量恰好相等(如杂合子中的两种不同等位基因，此时出现ΔCT＝0)，并且仪器检测的二者的荧光强度比恰好等于双色探针的荧光比时，才会造成二者不可分辨的结果，显然，后两种情况同时发生的概率极低。因为混合样品中亚型含量完全相等的可能性已经很小，荧光探针的荧光强度受多种因素影响，要使两个单色探针荧光强度之比恰好等于双色探针荧光比的可能性更小。正常的实时PCR扩增曲线属于典型的S型，不会发生突然增加的情况(即出现拐点)。然而，如果发生单色探针和双色探针分别识别的靶序列共存的情况，比如FAM和FAM/HEX分别识别的靶序列共存，FAM的扩增曲线实际上反映的是两扩增曲线之和，比如曲线的前半部分是单色探针FAM的情况，而后半部分则既有FAM单色探针荧光水平增长的情况又有FAM/HEX双色探针中FAM的增长情况，从而在曲线中出现增长拐点；无论这两种靶序列的浓度孰大，都会在FAM扩增曲线中出现拐点。只不过在单色探针检测的靶序列浓度较高时，FAM扩增曲线先出现而HEX扩增曲线随后出现并且FAM扩增曲线拐点必然出现在HEX曲线开始升高的附近，因为拐点的位置也是HEX增加的位置。反之，如果双色探针所检测的靶序列浓度较高则FAM与HEX扩增曲线首先同时出现，但FAM曲线随后会出现一个增长拐点而HEX曲线为典型的S型曲线，不出现拐点。
因此，对于出现两色扩增曲线的体系，就很容易根据曲线之间的关系和形状(荧光指纹图谱)进行判断。以反应中同时出现FAM和HEX扩增曲线为例，体系中的靶序列可能有5种情况：只存在双色探针FAM/HEX识别的靶序列，同时存在FAM单色探针和HEX单色探针识别的两种靶序列，同时存在FAM单色探针和双色探针FAM/HEX识别的两种靶序列，同时存在HEX单色探针和双色探针FAM/HEX识别的两种靶序列，同时存在FAM单色探针、HEX单色探针、双色探针FAM/HEX识别的三种靶序列。如果两条曲线属典型的S型扩增曲线，且ΔCT＝0，且两者的荧光强度比与双色探针的扩增曲线一致，就可以直接判断为只存在双色探针FAM/HEX识别的靶序列。如果是彼此分离的两条扩增曲线，且是典型的S型扩增曲线，就可以直接判断为同时存在FAM和HEX单色探针分别识别的两种靶序列。若两条扩增曲线中，FAM的扩增曲线出现新的增长拐点，则是同时存在FAM单色探针和双色探针FAM/HEX识别的两种靶序列。如果两条扩增曲线中，HEX的扩增曲线出现新的增长拐点，则可以判断为是同时存在HEX单色探针和双色探针FAM/HEX识别的两种靶序列。如果两条扩增曲线中FAM和HEX的扩增曲线均出现新的增长拐点，则可以判断为同时存在FAM单色探针、HEX单色探针、及双色探针FAM/HEX识别的三种靶序列。
当然，对于大容量基因分型情况，干扰的概率会增加。但只要我们充分利用好荧光基本元素数目、CT值、及各荧光基本元素的相对强度这三个变量，便可生成许许多多基因型特异性荧光指纹图谱。再通过充分掌握临床资料，适当改变探针标记策略等手段，就完全有可能排除共存亚型引起的干扰。
实施例13：当本发明用于检测一个样品中可能同时存在多个等位基因中的一种(纯合子)或两种(杂合子)的情况时，如果一个等位基因用了单色(如红色)探针来检测而另一个等位基因用了包含上述单色探针颜色的双色或多色探针来检测，则此时由于ΔCT＝0，对杂合子与纯合子的区分必需依靠荧光强度的变化。为了便于区分，此时有必要调整双色或多色探针中各色荧光基本元素所标记的探针比例，从而使双色或多色探针检测纯合子样品时各色荧光曲线的峰值基本相等；这样，当遇到单色(如红色)探针与双色(如红、绿)或多色(如红、绿、黄)探针所能检测的不同等位基因共存于一个杂合子时，红色探针虽与其它颜色的探针同时出峰，但其峰值必然会高于其它颜色的荧光峰值，从而把单色探针所检测的纯合子(只有一色荧光出现)及双色或多色探针所检测的纯合子(有两色或多色曲线同时出峰并且各曲线峰值基本持平)与单色—双色(多色)探针共同检测的杂合子(有两色或多色曲线同时出峰但某色曲线峰值会明显高于其它曲线峰值)区分开来。利用相同的原理，不同的多色探针所检测的纯合子与杂合子也同样能够区分开来。
核苷酸序列表
表1：vrrA基因分型中的探针序列及编码
| 菌株 | 探针 | 探针编码(代码) |
| 菌株1菌株2菌株3菌株4菌株5菌株6菌株7菌株8 | 5′-FAM-CCGCCCCAAT-PO4-3′5′-TTGGGGCGG-Dabcyl-3′5′-HEX-TTTCGCCACAATATC-PO4-3′5′-ATATTGTGGCG-Dabcyl-3′5′-ROX-CAGCACCAGCA-PO1-3′5′-GCTGGTGCTG-Dabcyl-3′5′-Cy5-CGCCGCAATATC-PO4-3′5′-ATATTGCGGCG-BHQ-3′5′-FAM-CCAACACCAATAC-PO4-3′5′-TATTGGTGTTGG-Dabcyl-3′5′-ROX-CAGCACCAGCA-PO4-3′5′-GCTGGTGCTG-Dabcyl-3′5′-FAM-CCAACACCAATAC-PO4-3′5′-TATTGGTGTTGG-Dabcyl-3′5′-Cy5-ACCGCCAATGA-PO4-3′5′-CATTGGCGGT-BHQ-3′5′-ROX-CGAGCCATTTATG-PO4-3′5′-ATAAATGGCTCG-Dabcyl-3′5′-CY5-CGCCGCAATATC-PO4-3′5′-ATATTGCGGCG-BHQl-3′5′-FAM-CCAACACCAATAC-PO4-3′5′-TATTGGTGTTGG-Dabcyl-3′5′-ROX-CAGCACCAGCA-PO4-3′5′-GCTGGTGCTG-Dabcyl-3′5′-Cy5-ACCGCCAATGA-PO4-3′5′-CATTGGCGGT-BHQl-3′ | FAM(1000)HEX(0100)ROX(0010)Cy5(0001)FAM+ROX(1010)FAM+Cy5(1001)ROX+Cy5(0011)FAM+ROX+Cy5(1011) |
表2 HPV亚型特异性探针及其编码
| 型别 | 探针序列 | 编码 |
| HPV18HPV6HPV16HPV11HPV35HPV31HPV33HPV52HPV58HPV42HPV43HPV44HPV39HPV45HPV40 | 5′-FAM-TCTCCTGTACCTGGG-PO4-3′5′-CAGGTACAGGAGA-DABCYL-3′5′-HEX-TTTCTTCCACATACACCA-PO4-3′5′-GTGTATGTGGAAGA-DABCYL-3′5′-ROX-TGCTGCCATATCTACT-PO4-3′5′-TAGATATGGCAGCA-DABCYL-3′5′-CY5-CTGTGTCTAAATCTGCT-PO4-3′5′-CAGATTTAGACACACAG-BHQ-3′5′-FAM，HEX-AATCTGTGTGTTCTGCT-PO43′5′-CAGAACACACAGA-DABCYL-3′5′-FAM，ROX-CAATTGCAAACAGTGAT-PO4-3′5′-CACTGTTTGCAATTG-DABCYL-3′5′-FAM，CY5-TGACTTTATGCACACA-PO4-3′5′-TGTGCATAAAGTCA-BHQ-3′5′-HEX，ROX-TTCTTTATGTGCTGAGGT-PO4-3′5′-CTCAGCACATAAAG-DABCYL-3′5′-HEX，CY5-AACACTGAAGTAACTAAGGA-PO4-3′5′-CTTAGTTACTTCAGTG-BHQ-3′5′-ROX，CY5-ACTGCAACATCTGGT-PO4-3′5′-CAGATGTTGCAGT-BHQ-3′5′-FAM，HEX，ROX-AAGACCCTACTGTGCC-PO4-3′5′-CACAGTAGGGTC-DABCYL-3′5′-FAM，HEX，CY5-AACCACTACACAGTCCC-PO4-3′5′-GACTGTGTAGTGG-BHQ-3′5′-FAM，ROX，CY5-CCTCTATAGAGTCTTCCA-PO4-3′5′-GAAGACTCTATAGAGG-BHQ-3′5′-HEX，ROX，CY5-CCCTAATTTAACATTATGTGCC-PO4-3′5′-CACATAATGTTAAATTAG-BHQ-3′5′-FAM，HEX，ROX，CY5-AAACACAGTCCCCCA-PO4-3′5′-GGGGACTGTGT-BHQ-3′ | FAM(1000)HEX(0100)ROX(0010)CY5(0001)FAM+HEX(1100)FAM+ROX(1010)FAM+CY5(1001)HEX+ROX(0110)HEX+CY5(0101)ROX+CY5(0011)FAM+HEX+OX(1110)FAM+HEX+CY5(1101)FAM+ROX+CY5(1011)HEX+ROX+CY5(0111)FAM+HEX+ROX+CY5(1111) |
表3：HCV亚型特异性探针及其编码
注：字符带边框的为与模板不匹配碱基，这样可以在杂交时减少碱基对荧光素HEX的淬灭作用。
Claims (18)
1、一种用于多重实时核酸扩增检测的探针编码方法，其特征在于其步骤为：
1)将核酸扩增检测仪器所能检测的不同荧光染料作为荧光探针标记的基本元素，称之为荧光基本元素；
2)以荧光基本元素之间的相互组合来复合或混合标记靶序列的特异指示探针。
2、如权利要求1所述的用于多重实时核酸扩增检测的探针编码方法，其特征在于以荧光基本元素之间的相互组合而不只是单一的荧光基本元素来复合或混合标记靶序列的特异指示探针；将所标记的探针加入到实时核酸扩增体系并对待测核酸序列进行扩增；协同利用实时核酸扩增曲线图谱中出现的荧光基本元素的种类、循环阈值差别和各荧光基本元素相对强度差异这三个变量来区分、识别基因特异性荧光指纹图谱及其对应的靶序列，以便在荧光基本元素数目有限的情况下同时检测出多种不同核酸序列。
3、如权利要求1所述的用于多重实时核酸扩增检测的探针编码方法，其特征在于所说的荧光基本元素包括但并不局限于ALEXA350，FAM，HEX，TET，JOE，VIC，ROX，Texas Red，Cy5，Cy5.5，TAMRA等。
4、如权利要求1所述的用于多重实时核酸扩增检测的探针编码方法，其特征在于所说的互相组合为组合编码，组合编码只考虑荧光基本元素种类的不同而忽略不同荧光基本元素间荧光强度的差异，可将荧光基本元素按数学的组合规则组合成不同的荧光标记基团或探针。
5、如权利要求1所述的用于多重实时核酸扩增检测的探针编码方法，其特征在于所说的互相组合为排列编码，排列编码即考虑荧光基本元素种类的不同又区分各荧光基本元素间的相对强弱，可按数学的排列规则组合成不同的荧光标记基团或探针。
6、如权利要求1所述的用于多重实时核酸扩增检测的探针编码方法，其特征在于所说的互相组合为指数编码，指数编码同时考虑荧光基本元素种类的差别、各元素间荧光强度的相对强弱及荧光强度大小差异的不同程度，可按数学上指数规则组合成不同的荧光标记基团或探针。
7、如权利要求1所述的用于多重实时核酸扩增检测的探针编码方法，其特征在于所说的荧光探针为可用于实时核酸扩增检测的荧光探针，它们选自TaqManTM探针、TaqMan-MGBTM探针、分子信标探针、荧光能量共振转移探针、置换探针、蝎子引物、Amplifier引物；所说荧光探针为依赖聚合酶5′→3′外切核酸活性的探针如TaqMan探针，或不依赖聚合酶5′→3′外切核酸活性的探针。
8、如权利要求7所述的用于多重实时核酸扩增检测的探针编码方法，其特征在于所说的不依赖聚合酶5′→3′外切核酸活性的探针选自分子信标探针和置换探针。
9、如权利要求1所述的用于多重实时核酸扩增检测的探针编码方法，其特征在于所说核酸扩增检测为多色实时核酸扩增检测，或终点式的核酸扩增检测。
10、如权利要求9所述的用于多重实时核酸扩增检测的探针编码方法，其特征在于所说的实时核酸扩增检测为实时核酸扩增检测的基因分型，实时核酸扩增选自实时PCR、实时RT-PCR、Q-Beta扩增、实时核酸序列依赖的扩增中的一种。
11、如权利要求1所述的用于多重实时核酸扩增检测的探针编码方法，其特征在于所说的荧光基本元素的种类是指在实时核酸扩增曲线图谱中有那些荧光基本元素出现；所说的循环阈值差别是指所出现的各荧光基本元素之间出峰时间的差别；所说的荧光基本元素之间荧光强度大小差异程度是指每一荧光基本元素的大小水平，或荧光水平，或相对程度，或相对强度组合成不同的元素。
12、如权利要求1所述的用于多重实时核酸扩增检测的探针编码方法，其特征在于利用各种荧光基本元素出峰的相对时间、曲线形状区分多种靶序列共存时那种序列存在并加以扩增检测。
13、如权利要求1所述的用于多重实时核酸扩增检测的探针编码方法应用于多种靶序列的检测。
14、如权利要求13所述的用于多重实时核酸扩增检测的探针编码方法应用于检测样品中只可能含有多种靶序列中的至少一种的基因分型。
15、如权利要求14所述的用于多重实时核酸扩增检测的探针编码方法应用于检测对于同一基因或基因家族中不同等位基因的基因分型。
16、如权利要求15所述的用于多重实时核酸扩增检测的探针编码方法应用于检测对针对特定靶基因进行基因分型，使用至少一对引物进行扩增，而用至少2个探针检测引物中间序列达到基因分型的目的。
17、如权利要求13所述的用于多重实时核酸扩增检测的探针编码方法，其特征在于在所说的多种靶序列的检测中，当单色与多色探针共同编码多个等位基因时，纯合子与杂合子的区分是通过调整多色探针中各荧光基本元素所标记的探针比例来使多色探针在检测纯合子时，各色荧光曲线峰值基本持平；当单色与多色探针所检测的两个等位基因共存于一个杂合子时，单色探针中那一颜色荧光的峰值就会高于其它颜色荧光峰值。
18、如权利要求16所述的用于多重实时核酸扩增检测的探针编码方法，其特征在于所说的探针选自高特异性的、可区分只有单个碱基差别的靶序列特异性荧光探针。
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