CN104169439B - 使用核酸探针和珠粒亚组检测呼吸道病原体的组合物和方法 - Google Patents

使用核酸探针和珠粒亚组检测呼吸道病原体的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本公开内容教导了检测和鉴定多种呼吸道病原体的多重核酸扩增测定。

Description

使用核酸探针和珠粒亚组检测呼吸道病原体的组合物和方法
提交信息
本申请与2011年10月4日提交的标题″An Assay″的澳大利亚临时专利申请No.2011904105(将其完整内容通过引用并入本文)相关并且要求其优先权。
领域
本公开内容对于检测和鉴定多种呼吸道病原体的多重核酸扩增测定是有指导意义的。
背景
在说明书的结尾处按字母顺序地收集本发明人在本说明书中提及的出版物的书目内容。
本说明书中对任何在先出版物(或源自其的信息)或对已知的任何事物的提及不被并且不应当被当作是确认或承认或以任何形式暗示该在先出版物(或源自其的信息)或已知的事物形成本说明书所致力的领域中的公知常识的部分。
澳大利亚肺基金会已报导上呼吸道感染在澳大利亚每年导致约3-4百万例对全科医生(GP)的门诊，在直接费用上花费纳税人超过1.5亿澳元，在间接费用上花费要多得多。下呼吸道感染在澳大利亚每年导致近300万例对GP的门诊。因呼吸道感染而引起的住院数目进一步使社会和经济影响复杂化。例如，社区获得性肺炎与澳大利亚每年约12％的年龄超过65岁的住院患者的总体死亡率相关。如果存在共病疾病(例如，慢性阻塞性肺疾病、充血性心力衰竭、糖尿病)，则该死亡率增加至约20％。此外，高达30,000例的哮喘入院和高达40,000例的慢性阻塞性肺疾病入院由病毒感染促成，涉及哮喘和慢性阻塞性肺疾病所有住院例的50至80％。因此，澳大利亚的直接和间接费用 负担据估计超过每年5亿澳元。
与呼吸道感染相关的病原体可分类为细菌(包括百日咳博德特菌)、真菌和病毒。甲型或乙型流感病毒几乎每个冬季引发疾病流行。季节性接种(flu shots)可预防甲型和乙型流感疾病，但对丙型流感无保护作用。呼吸道合胞病毒(RSV)是婴儿和幼儿中急性下呼吸道感染的首要病因，大部分住院病例发生在1岁以内的婴儿。在世界范围内，RSV被认为与160,000-600,000例死亡的年死亡率相关。处于患严重RSV病增加风险中的人包括早产婴儿和具有先天性心脏病、神经肌肉病、结构性气道畸形和免疫缺陷的婴儿。人副流感病毒(HPIV)是仅次于RSV的作为幼儿下呼吸道疾病的常见病因。HPIV还可引发具有重复感染的严重下呼吸道疾病，包括肺炎、支气管炎和毛细支气管炎，特别是在老年患者中和具有受损免疫系统的患者中。
尽管世界范围内呼吸道疾病的严重性，但治疗在性质上主要是支持性的。支气管扩张剂，皮质类固醇和白三烯受体拮抗剂(例如孟鲁司特)的使用普遍未能显示明确的临床益处，并且抗病毒药物例如利巴韦林仅显示模糊的临床益处。目前治疗和预防呼吸道感染的方法包括用于治疗流感的第二代单克隆抗体和高效抗病毒化合物例如奥司他韦(达菲[注射商标])和扎那米韦(Relenza[注射商标])。疫苗组合物也在开发中。然而，现有治疗方案的功效主要取决于鉴定所述呼吸道病原体。不幸地，鉴于大量可能的呼吸道病原体和相应菌株，使用标准诊断剂鉴定样品中的具体呼吸道病原体非常耗时，费用昂贵并且频繁导致不正确或不确定的诊断。典型诊断病毒学实验室使用病毒培养、免疫荧光染色和聚合酶链式反应(PCR)来筛查呼吸道病毒。然而，现有技术具有明显的限制。例如，病毒培养非常耗时，并且缺乏对检测、特别是在运输过程中不稳定的和/或具有苛刻生长要求的病毒的检测所必需的灵敏度。免疫荧光染色是不灵敏的，通常导致假阴性结果，目前的PCR测定通常缺乏有效地处理大量含多个靶的样品的高通量检测能力。
存在对开发以高水平的快速和灵敏度筛查多个呼吸道病原体的测 定的需要。
发明概述
本文中提供了对样品筛选多种呼吸道病原体以检测特定病原体的方法，该方法包括：
(a)从样品分离核酸，所述核酸推定包含来自一种或多种呼吸道病原体的核酸；
(b)对所述核酸进行扩增，其中含水引物对指导来自呼吸道病原体的核酸的区域的扩增，引物对的数目基于期望被筛查的病原体的数目来选择，并且其中引物对的至少一个成员包含在扩增后被掺入到所得扩增子内的第一光学可检测标记；其中通过与寡核苷酸探针杂交来捕获扩增子，所述寡核苷酸探针与扩增子的区域互补并被固定至珠粒盘(beadset)中的珠粒，珠粒盘具有成亚组的珠粒，每一个亚组在珠粒尺寸和任选地第二光学可检测标记的强度上是均匀的，从而基于尺寸和/或第二可检测标记强度产生异质珠粒盘，其中亚组的数目对应于待筛查的呼吸道病原体的数目；
(c)基于第一可检测标记的强度测定扩增子已结合于哪个珠粒，并且，当扩增子结合于多个亚组的珠粒时，基于珠粒尺寸和任选地基于第二光学可检测标记的强度区分所述多个亚组的珠粒；
其中扩增子对特定亚组的珠粒的结合表示特定呼吸道病原体存在于所述样品中。
在一个实施方案中，扩增是固相扩增。
在一个实施方案中，通过包含第一光学可检测标记的引物的延伸起始的扩增子用作用于包含第二光学可检测标记的寡核苷酸(半巢式引物)的杂交和延伸的模板，其中将寡核苷酸固定于珠粒盘中的珠粒上。
进一步教导了对样品筛查多种呼吸道病原体以检测特定病原体的方法，所述方法包括：
(a)从样品分离核酸，所述核酸推定包含来自一种或多种呼吸道病原体的核酸；
(b)对所述核酸进行固相扩增；其中含水引物对指导来自呼吸道病原体的核酸中区域的扩增，引物对中的数目基于期望被筛查的病原体的数目来选择，并且其中引物对中的至少一个成员包含在扩增后被掺入到所得扩增子内的第一光学可检测标记，其中通过延伸包含第一光学可检测标记的引物起始的所得扩增子用作模板用于包含第二光学可检测标记的寡核苷酸(半巢式引物)的杂交和延伸，其中所述寡核苷酸被固定于珠粒盘中的珠粒上，珠粒盘具有成亚组的珠粒，每一个亚组在珠粒尺寸和任选地第二光学可检测标记的强度上是均质的，从而基于尺寸和/或第二可检测标记的强度产生异质的珠粒盘，其中亚组的数目对应于待筛查的呼吸道病原体的数目；
(c)基于第一可检测标记的强度测定扩增子已结合于哪个珠粒，并且，当扩增子结合于多个亚组的珠粒时，基于珠粒尺寸和任选地基于第二光学上可检测标记的强度区分多个亚组的珠粒；
其中扩增子对特定亚组的珠粒的结合表示特定呼吸道病原体存在于所述样品中。
在一个实施方案中，所述方法包括基于第二光学可检测标记的强度区分多个亚组的珠粒。
在一个实施方案中，呼吸道病原体选自甲型流感病毒、乙型流感病毒、甲型流感病毒H1N1、甲型流感病毒H5N1、呼吸道合胞病毒A亚型、呼吸道合胞病毒B亚型、人副流感病毒1型、人副流感病毒2型、人副流感病毒3型、人副流感病毒4型、人类偏肺病毒(metapneumovirus)、人腺病毒B亚型、人腺病毒C亚型、人腺病毒E亚型、人肠道病毒、人鼻病毒、百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、肺炎衣原体(Chlamydophila pneumoniae)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)和来自如下属的其它微生物：链球菌属(Streptococcus)、嗜血菌属(Haemophilus)、莫拉克斯氏菌属(Moraxella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、克雷伯菌属(Klebsiella)、狭长平胞属(Stenotrophomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、支原体属(Mycoplasma)、军团病杆菌属(Legionella)、 衣原体属(Chlamydophila)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、考克斯体属(Coxiella)、诺卡尔菌属(Nocardia)、肺囊虫(Pneumocystis)、诺卡尔菌属(Nocardia)和曲霉菌属(Aspergillus)。
在一个实施方案中，来自呼吸道病原体的核酸选自编码甲型流感病毒基质蛋白的区段7的基因、编码乙型流感病毒血凝素的区段4的基因、编码甲型流感病毒的2009H1N1大流行病毒株的区段4的基因、编码甲型流感病毒的HSN1大流行病毒株的区段4的基因、呼吸道合胞病毒(甲型和乙型)的聚合酶基因、编码人副流感病毒1、2和3型的血凝素-神经氨酸酶糖蛋白的基因、人副流感病毒4型的磷蛋白基因、编码人类偏肺病毒的基质蛋白的M2区域的基因、编码B、C和E型腺病毒的Hexon区、人鼻病毒/肠道病毒的5＇UTR区、百日咳博德特菌的插入元件(IS)481的基因、编码肺炎衣原体(Chlamidophila pneumoniae)的主要外膜蛋白的基因和编码肺炎支原体的P1Cytadhesin的基因。
在一个实施方案中，所述引物对包括选自SEQ ID NO：1至16以及SEQ ID NO：33和35的正向引物和选自SEQ ID NO：17至32以及SEQ ID NO：34和36中的对应反向引物。
在一个实施方案中，所述寡核苷酸探针/半巢式引物选自SEQ ID NO：37至52。在一个实施方案中，所述寡核苷酸探针是选自SEQ ID NO：53和54的对照寡核苷酸探针。
在一个实施方案中，所述方法包括使用包含选自SEQ ID NO：33和35的正向引物和选自SEQ ID NO：34和36的对应反向引物的引物对扩增对照核酸序列。
在一个实施方案中，所述方法包括使所述核酸经历利用包含SEQ ID NO：1至16的正向引物和SEQ ID NO：17至32的对应反向引物的16个引物对的扩增条件，其中所述寡核苷酸探针/巢式引物选自SEQ ID NO：37至52。
在一个实施方案中，所述方法包括使用包含正向引物和反向引物的引物对以及选自SEQ ID NO：74至126的对应探针来扩增核酸序列。
在一个实施方案中，所述方法包括将所述核酸经历利用包含正向引物和反应引物的引物对以及选自SEQ ID NO：74至126的对应探针的固相扩增条件，并且其中所述引物是半巢式引物。
在一个实施方案中，所述第一和第二光学可检测标记是选自下述中的荧光团：羟基香豆素、氨基香豆素、甲氧基香豆素、瀑布蓝、萤光黄、NBD、藻红蛋白(PE)、PerCP、别藻蓝蛋白、烟酸己可碱33342、DAPl、SYTOX蓝、烟酸己可碱33258、色霉素A3、光辉霉素、YOYO-I、SYTOX绿、SYTOX橙、7-AAD、吖啶橙、TOTO-1、To-PRO-I、噻唑橙、TOTO-3、TO-PRO-3、LDS751、Alexa Fluor染料包括Alexa Fluro-350、-430、-488、-532、-546、-555、-556、-594、-633、-647、-660、-680、-700和-750；BoDipy染料，包括BoDipy630/650和BoDipy650/665；CY染料，特别地Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7；6-FAM(荧光素)；PE-Cy5、PE-Cy7、荧光素dT；六氯荧光素(Hex)；6-羧基-4’，5’-二氯-2’，T-二甲氧基荧光素(JOE)；Oregon绿染料，包括488-X和514；罗丹明染料，包括X-罗丹明、丽丝胺罗丹明B、罗丹明绿、罗丹明红和ROX；TRITC3四甲基罗丹明(TMR)；羧基四甲基罗丹明(TAMRA)；四氯荧光素(TET)；Red6B5FluorX、BODIPY-FL和德克萨斯红。
在一个实施方案中，所述第一光学可检测标记是AlexaFluor-647。
在一个实施方案中，所述第二光学可检测标记是硼-二吡咯亚甲基(BoDipy)-TMR。在一个实施方案中，第二光学可检测标记附着于所述寡核苷酸探针上。在一个实施方案中，所述第二光学可检测标记通过所述寡核苷酸探针的内部胸苷残基的氨基C6修饰而附着于所述寡核苷酸探针上。
在一个实施方案中，寡核苷酸探针是半巢式寡核苷酸。在一个实施方案中，寡核苷酸探针通过硫氢基或甲基丙烯酰(methacryl)连键共价附着于珠粒上。
在一个实施方案中，每一个亚组内的珠粒的尺寸选自直径3.0μm、 3.5μm、3.8μm、4.3μm、5.0μm、5.2μm和5.7μm。
本文中还教导了包括两个或更多个寡核苷酸引物对的试剂盒，所述寡核苷酸引物对选自SEQ ID NO：1和17、2和18、3和19、4和20、5和21、6和22、7和23、8和24、9和25、10和26、11和27、12和28、13和29、14和30、15和31以及16和32，以及分别地选自SEQ ID NO：37至52的对应探针。
本文中另外教导了包括两个或更多个寡核苷酸引物对以及表8中所列的对应引物探针(SEQ ID NO：74至126)的试剂盒。
核苷酸和氨基酸序列通过序列标识号(SEQ ID NO)来提及。序列表附在说明书的结尾并通过引用并入本文。SEQ ID NO在数字上对应于序列标识符<400>1(SEQ ID NO：1)、<400>2(SEQ ID NO：2)等。在本说明书中通篇使用的序列标识符的概述提供于表1中。这些序列的列表提供于表2中。
表1
序列标识符的概述
表2
序列概述
附图概述
图1A至D显示对照构建体插入物序列及其标识符。
图2是显示通过特异性RT-PCR对RNA模板的身份进行确认的照片示意。
图3是显示导致所有靶DNA模板的有效扩增的引物浓度的照片示意。
图4是导致RNA和DNA模板的有效扩增的引物条件的照片示意。
图5A和B是显示在本底人染色体DNA不存在或存在的情况下RT-PCR扩增结果的照片示意。
图6是显示一般引物设计方法的概括的图示。
发明详述
在整个本说明书中，除非上下文另有要求，否则单词″包含″或变型例如″包括″或″含有″将被理解为意指包括所述元件或整体或方法步骤或者元素或整体或方法步骤的组在内，但不排除任何元素或整体或方法步骤或者元素或整体或方法步骤的组。
如本说明书中所用，除非上下文中明确另外明确地指出，否则单数形式″一个/一种(a)″、″一个/一种(an)″和″所指物(the)″包括单数和复数方面。因此，例如，对″一种(a)呼吸道病原体″的引用包括单种呼吸道病原体，以及两种或更多种不同的呼吸道病原体；对″一种(an)试剂″的引用包括单种试剂，以及两种或更多种试剂；对″所述公开内容″的引用包括单个或多个由本公开内容教导的方面。本文中教导的方面由术语“发明”包括。所有这样的方面在权利要求的范围内均能实施。
本公开内容教导样品中多种呼吸道病原体的检测和区分。
在本文中提供了对样品筛查多种呼吸道病原体以检测特定病原体的方法，所述方法包括：
(a)从样品分离核酸，所述核酸推定包含来自一种或多种呼吸道病原体的核酸；
(b)使核酸经历扩增，其中含水引物对指导来自呼吸道病原体的核酸的区域的扩增，引物对的数目基于期望被筛查的病原体的数目来选择，并且其中引物对的至少一个成员包含在扩增后被掺入所得扩增子的第一光学可检测标记；其中通过与寡核苷酸探针杂交捕获扩增子，所述寡核苷酸探针与扩增子的区域互补并被固定于珠粒盘中的珠粒上，所述珠粒盘具有成亚组的珠粒，每一个亚组在珠粒尺寸和任选地第二光学可检测标记的强度上是均质的，从而基于尺寸和/或第二可检测标记的强度产生异质珠粒盘，其中亚组的数目对应于待筛查的呼吸道病原体的数目；
(c)基于第一可检测标记的强度测定扩增子已结合于哪个珠粒，并 且，当扩增子结合于多个亚组的珠粒时，基于珠粒尺寸和任选地基于第二光学可检测标记的强度区分所述多个亚组的珠粒；
其中扩增子对特定亚组的珠粒的结合表示特定呼吸道病原体存在于所述样品中。
在一个实施方案中，扩增是固相扩增。
在一个实施方案中，通过包含第一光学可检测标记的引物的延伸起始的扩增子用作模板用于包含第二光学可检测标记的寡核苷酸(半巢式引物)的杂交和延伸，其中将所述寡核苷酸固定于珠粒盘中的珠粒上。
还提供了对样品筛选多种呼吸道病原体以检测特定病原体的方法，所述方法包括：
(a)从样品分离核酸，所述核酸推定包含来自一种或多种呼吸道病原体的核酸；
(b)对所述核酸进行固相扩增；其中含水引物对指导来自呼吸道病原体的核酸的区域的扩增，引物对的数目基于期望被筛查的病原体的数目来选择，并且其中引物对的至少一个成员包含在扩增后被掺入所得扩增子内的第一光学可检测标记，其中通过延伸包含第一光学可检测标记的引物启动的所得扩增子用作模板用于包含第二光学可检测标记的寡核苷酸(半巢式引物)的杂交和延伸，其中将所述寡核苷酸固定于珠粒盘中的珠粒上，所述珠粒盘具有成亚组的珠粒，每一个亚组在珠粒尺寸和任选地第二光学可检测标记的强度上是均质的，从而基于尺寸和/或第二可检测标记的强度产生异质珠粒盘，其中亚组的数目对应于待筛查的呼吸道病原体的数目；
(c)基于第一可检测标记的强度测定扩增子已结合于哪个珠粒，并且，当扩增子结合于多个亚组的珠粒时，基于珠粒尺寸和任选地基于第二光学可检测标记的强度区分多个亚组的珠粒；
其中扩增子对特定亚组的珠粒的结合表示特定呼吸道病原体存在于所述样品中。
术语″病原体″是指能够感染或定殖宿主的微生物或病毒。宿主可以是单细胞或包含多个细胞的受试者。因此，″宿主″包括受试者。示例性病原体包括病毒、细菌、真菌和真核微生物。″呼吸道病原体″是指能够感染或定殖宿主的呼吸道的病原体，在本文中也称为定殖病原体(colonizing pathogen)、土著病原体(indigenous pathogen)、共生病原体(commensal pathogen)或共生生物(commensal organism)。本领域技术人员应理解，病原体可存在于未受感染的健康受试者中。在正常的健康状态中，这些病原体不引起感染，而受试者不产生呼吸道症状。然而，在触发(例如，健康状况不佳、应激)后，病原体变成慢性/急性呼吸道感染的致病病原体。
呼吸道病原体对于本领域技术人员而言是已知的。实例包括但不限于甲型流感病毒、乙型流感病毒、甲型流感病毒H1N1、甲型流感病毒H5N1、呼吸道合胞病毒A亚型、呼吸道合胞病毒B亚型、人副流感病毒1型、人副流感病毒2型、人副流感病毒3型、人副流感病毒4型、人类偏肺病毒、人腺病毒B亚型、人腺病毒C亚型、人腺病毒E亚型、人肠道病毒、人鼻病毒、百日咳博德特菌、肺炎衣原体和肺炎支原体及其菌株。还包括来自链球菌属、嗜血菌属、莫拉克斯氏菌属、假单胞菌属、克雷伯菌属、狭长平胞属、不动杆菌属、葡萄球菌属、支原体属、军团病杆菌属、衣原体属、分枝杆菌属、考克斯体属、诺卡尔菌属、肺囊虫属、诺卡尔菌属和曲霉属的微生物，包括上文中所列的微生物。
本文中还教导了检测和/或区分样品中呼吸道病原体的一个或多个特定菌株的方法。本文中对“菌株”的引用包括分析物的物种或分类单位的任何变种。呼吸道病原体的“菌株”的实例包括该病原体的亚种、具有不同水平的毒力的变种、当感染或定殖宿主时显示不同预后的病原体的变种、病原体的生物化学变种等。
如本文中所用，术语″样品″可与术语″分析物″互换使用，意指推定包含一种或多种呼吸道病原体的任何物质。实例包括来自受试者的生物样品，包括但不限于血液、血清、血浆、唾液、粪便、尿、淋巴、羊水、脑脊液、组织液、精液、渗出液、脓、呼吸液和粘液以及来自局部疡的拭子、癌症和损伤以及组织或细胞样品例如细胞刮取物(cell scrapes)、活检组织等。
本文中公开的方法涉及的样品还包括工业样品例如空气、水和土壤等。样品还可包括冰、岩石、热液喷口(hydrothermal vents)和空气；卫生保健环境，包括医院、医院设备、外科设备、卫生保健人员衣服等；"工业"环境包括制造设施、制药设施、酿酒厂、葡萄酒酿造厂等；以及"实验室"环境，包括发酵罐、培养物、实验台、仪器等。
如本文中所用，术语"受试者"是指可易于被呼吸道病原体感染或定殖的任何生物。受试者的实例包括但不限于动物、植物、真菌和细菌(其可被噬菌体感染)。受试者包括宿主细胞或许多宿主细胞。如本文中所用，术语"动物"包括哺乳动物，包括灵长类动物例如低等灵长类动物和高等灵长类动物(包括人)。然而，术语"动物"还特别地包括家畜类例如牛、马、绵羊、猪、山羊和驴以及实验动物。实验室测试动物的实例包括小鼠、大鼠、兔、豚鼠和仓鼠。兔和啮齿类动物，例如大鼠和小鼠，提供了方便的测试系统或动物模型，灵长类动物和低等灵长类动物亦如此。还涉及非哺乳动物例如禽类、斑马鱼、两栖动物(包括甘蔗蟾蜍)和果蝇物种例如黑腹果蝇。受试者还可以是非动物例如植物。
在一个实施方案中，受试者是人。
动物特别地家畜类的呼吸道感染可引起重大经济损失。例如，牛呼吸系统疾病(BRD)(其包括上呼吸道感染、白喉和肺炎)已造成超过60-70％的饲育场牛的疾病和死亡。病毒和细菌因子可引发BRD，并且可极难控制。当动物在多数情况下从疾病恢复时，它们通常呈现一定程度的长期损伤。例如，研究已显示在屠宰时显示肺损伤体征的所有牛中30-50％是过去的呼吸系统疾病造成的。为了在该情况下控制呼吸道疾病，许多家畜管理人员主动诊断，通过隔离处理暴发流行，利用抗生素和/或抗病毒药剂治疗感染的动物。然而，这些补救努力通常非常昂贵并且通常不能治愈疾病。此外，治疗的成功常常依赖于疾病发作前动物的呼吸系统健康状况和鉴定起作用的呼吸道病原体。因此，本文中公开的方法可应用于家畜工业以鉴定感染动物或动物群体中的呼吸道病原体，从而允许更好地诊断以及执行更有效的治疗方案。
除了影响动物如何对治疗发生反应外，因先前的呼吸系统疾病引起的病理损伤可不利地影响饲育场内动物的行为；例如，已显示具有更大呼吸系统损伤的饲育场牛比具有较轻呼吸系统损伤的动物体重增加更小。此外，来源于具有更大损伤的牛的肉通常质量低于来源于具有更轻损伤的牛的肉。
在一个实施方案中，受试者是家畜动物。在一个相关实施方案中，呼吸道病原体选自饲育场病毒，包括但不限于牛疱疹病毒1(BHV-1或IBR)，副流感病毒3(P13)，牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛呼吸道合胞病毒(BRSV)以及饲育场细菌或细菌样生物，包括但不限于溶血曼海姆菌(Mannheimia haemolytica)、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)、支原体属的某些种和衣原体属。
术语″核酸″、″核苷酸″和″多核苷酸″在本文中可互换使用，包括RNA、cDNA、基因组DNA、合成形式以及混合型聚合物、有义链和反义链，并且可化学合成或生物化学修饰或可包含非天然或衍生的核苷酸碱基，这对于本领域技术人员来说将是容易理解的。这样的修饰包括例如标记、甲基化、利用类似物(例如吗啉环)对一个或多个天然存在的核苷酸的置换、核苷酸间修饰例如不带电荷的连接(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯、氨基甲酸酯等)、带电荷的连接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、接枝部分(例如多肽)、嵌合剂(例如吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷化剂和修饰连接(例如α-异头核酸等)。还包括在其通过氢键键合和其它化学相互作用结合指定序列的能力方面模拟多核苷酸的合成分子。这样的分子在本领域是已知的，包括例如其中肽连键取代分子主链中的磷酸连键的那些分子。
可使用本领域技术人员已知的任何方法从受试者样品分离核酸。 核酸的分离应被理解为意指通常已与与其天然相关或在其天然状态相联系的其它组分分离的核酸。在一个实施方案中，分离的核酸为至少50％地不含，或至少75％地不含，或至少90％地不含与其天然关联合的其它组分。所表达的分离的程度可与相对干扰物质的纯度相关。
DNA可使用本领域技术人员已知的任何简便方法从样品分离而来。例如，在推定于人细胞中表达的病毒的情况下，可将胍或功能上等同的试剂用于裂解细胞。在一些实施方案中，使用有限量的DNA结合剂(例如但不限于硅土)从样品纯化DNA。通过使用有限量的DNA结合剂，可从不同样品分离同样量的DNA，因为在每一种情况下回收的DNA的量等于可被该有限量的DNA结合剂结合的DNA的最大量。随后使用任何方便的方法从DNA结合剂回收或洗脱结合于DNA结合剂的DNA。
取决于对于本领域技术人员来说是显然的环境，例如当目标呼吸道病原体为RNA病毒时，分离RNA。如果RNA被分离，则可扩增RNA，或可使用本领域技术人员已知的方法将RNA反转录成eDNA以用于随后的扩增和分析。在一个实施方案中，从感染的宿主细胞分离病毒RNA或对应的DNA。
本文中教导的方法包括使用特异性引物来扩增样品中的核酸序列，所述核酸序列在目标分类单位的成员间是高度保守的。示意性地，扩增区域具有如下一般结构：
CF-X-CR，其中：
CF为在靶分类单位的成员间保守的、并且为“正向”(F)引物的结合部位的核苷酸序列；
X为核苷酸序列，其部分包含在所述靶分类单位的成员间保守的区域；和
CR为在靶分类单位的成员间保守的、并且为对应的″反向″(R)引物的结合部位的核苷酸序列。
从引物位置例如本文中描述的引物位置的扩增有效地产生标记的核酸链(扩增子)，随后将所述扩增子在与固室于珠粒的寡核苷酸捕获 探针杂交后加载至固相载体上。在一个实施方案中，在固定于珠粒的半巢式探针寡核苷酸杂交和延伸后将被标记的扩增子加载至固相载体上。
在一个实施方案中，引物对被设计来扩增来自甲型流感病毒的核酸的区域。例如，引物对可被设计来扩增编码甲型流感病毒基质蛋白区段7的基因的区域。在一个实施方案中，所述引物对包含5＇AmMC6/CGAGGTCGAAACGTAYGTTCTYTCTAT(SEQ ID NO：1；正向引物；F)和GCCATTCCATGAGAGCCTCRAGATC(SEQ ID NO：17；反向引物；R)。
在一个实施方案中，引物对被设计来扩增来自乙型流感病毒的核酸的区域。例如，引物对可被设计来扩增编码乙型流感病毒血凝素区段4的基因的区域。在一个实施方案中，所述引物对包含5’AmMC6/TACGGTGGATTAAACAAAAGCAAGCC(SEQ ID NO：2；正向引物；F)和CAGGAGGTCTATATTTGGTTCCATTGGC(SEQ ID NO：18；反向引物；R)。
在一个实施方案中，引物对被设计来扩增来自甲型流感病毒2009H1N1大流行毒株的核酸的区域。例如，引物对可被设计来扩增编码甲型流感病毒2009H1N1大流行毒株区段4的基因的区域。在一个实施方案中，所述引物对包含5’AmMC6/CCCAAGACAAGTTCATGGCCCAATCA(SEQ ID NO：3；正向引物；F)和GCTTTTTGCTCCAGCATGAGGACAT(SEQ ID NO：19；反向引物；R)。
在一个实施方案中，引物对被设计来扩增来自甲型流感病毒H5N1大流行毒株的核酸的区域。例如，引物对可被设计来扩增编码甲型流感病毒H5N1大流行毒株区段4的基因的区域。在一个实施方案中，所述引物对包含5’AmMC6/GCTCTGCGATCTAGATGGAGTGAAGCC(SEQID NO：4；正向引物；F)和 YCTTCTCCACTATGTAAGACCATTCCGG(SEQ ID NO：20；反向引物；R)。
在一个实施方案中，引物对被设计来扩增来自呼吸道合胞病毒(甲型和乙型)的核酸的区域。例如，引物对可被设计来扩增呼吸道合胞病毒(甲型和乙型)的聚合酶基因的区域。在一个实施方案中，所述引物对包含5’AmMC6/ACAGTCAGTAGTAGACCATGTGAATTC(SEQ IDNO：5；正向引物；F)和RTCRATATCTTCATCACCATACTTTTCTGTTA(SEQ ID NO：21；反向引物；R)。
在一个实施方案中，引物对被设计来扩增来自人副流感病毒1型的核酸的区域。例如，引物对可被设计来扩增编码人副流感病毒1型的血凝素-神经氨酸酶糖蛋白的基因的区域。在一个实施方案中，所述引物对包含5’AmMC6/TGGTGATGCAATATATGCGTATTCATC(SEQ IDNO：6；正向引物；F)和CCGGGTTTAAATCAGGATACATATCTG(SEQ ID NO：22；反向引物；R)。
在一个实施方案中，引物对被设计来扩增来自人副流感病毒2型的核酸的区域。例如，引物对可被设计来扩增编码人副流感病毒2型的血凝素-神经氨酸酶糖蛋白的基因的区域。在一个实施方案中，所述引物对包含5’AmMC6/CYCGTCCTGGAGTCATGCCATGCAA(SEQ IDNO：7；正向引物；F)和CRTTAAGCGGCCACACATCTGCGT(SEQ ID NO：23；反向引物；R)。
在一个实施方案中，引物对被设计来扩增来自人副流感病毒3型的核酸的区域。例如，引物对可被设计来扩增编码人副流感病毒3型的血凝素-神经氨酸酶糖蛋白的基因的区域。在一个实施方案中，所述引物对包含5’AmMC6/CAAGTTGGCAYAGCAAGTTACAATTAGGA(SEQID NO：8；正向引物；F)和GTCCCCATGGACATTCATTGTTTCCTGGT(SEQ ID NO：24；反向引物；R)。
在一个实施方案中，引物对被设计来扩增来自人副流感病毒4型的核酸的区域。例如，引物对可被设计来扩增人副流感病毒4型的磷蛋白基因的区域。在一个实施方案中，所述引物对包含5’AmMC6/GTTGATCAAGACAATACAATTACACTTGA(SEQ ID NO：9；正向引物；F)和TAAGTGCATCTATACGAACRCCTGCTC(SEQ ID NO：25；反向引物；R)。
在一个实施方案中，引物对被设计来扩增来自人类偏肺病毒的核酸的区域。例如，引物对可被设计来扩增编码人类偏肺病毒基质蛋白的M2区域的基因的区域。在一个实施方案中，所述引物对包含5’AmMC6/GACAAATCATMATGTCTCGYAARGCTCC(SEQ ID NO：10；正向引物；F)和CTATCWGGCCAACTCCAGTAATTGTG(SEQ ID NO：26；反向引物；R)。
在一个实施方案中，引物对被设计来扩增来自B型和/或E型腺病毒的核酸的区域。例如，引物对可被设计来扩增编码B型和E型腺病毒Hexon区域的基因的区域。在一个实施方案中，引物对包含TGCCSCARTGGKCDTACATGCACATC(SEQ ID NO：11；正向引物；F)和5＇AmMC6/GCRCGGGCRAACTGCACCAG(SEQ ID NO：27；反向引物；R)。
在一个实施方案中，引物对被设计来扩增来自C型腺病毒的核酸的区域。例如，引物对可被设计来扩增编码C型腺病毒Hexon区的基因的区域。在一个实施方案中，所述引物对包含5＇Phos/TGCCSCARTGGKCDTACATGCACATC(SEQ ID NO：12；正向引物；F)和5＇AmMC6/GCRCGGGCRAACTGCACCAG(SEQ ID NO：28；反向引物；R)。
在一个实施方案中，引物对被设计来扩增来自人鼻病毒/肠道病毒的核酸的区域。例如，引物对可被设计来扩增人鼻病毒/肠道病毒的5’UTR区域。在一个实施方案中，所述引物对包含5’AmMC6/GAAACACGGACACCCAAAGTAGT(SEQ ID NO：13；正向引物；F)和ACTCACTATAGGAGCCTGCGTGGCKGCC(SEQ ID NO：29；反向引物；R)。
在一个实施方案中，引物对被设计来扩增来自百日咳博德特菌的核酸的区域。例如，引物对可被设计来扩增百日咳博德特菌的插入元件(IS)481的区域。在一个实施方案中，所述引物对包含CCGGCCGGATGAACACCCATAAGCA(SEQ ID NO：14；正向引物；F)和5＇AmMC6/GGGCCGCTTCAGGCACACAAACTTG(SEQ ID NO：30；反向引物；R)。
在一个实施方案中，引物对被设计来扩增来自肺炎衣原体的核酸的区域。例如，引物对可被设计来扩增编码肺炎衣原体主要外膜蛋白的基因的区域。在一个实施方案中，所述引物对包含CATGAATGGCAAGTAGGAGCCTCTC(SEQ ID NO：15；正向引物；F)和5＇AmMC6/AGTTTTGGCTGAGCAATGCGGATGT(SEQ ID NO：31；反向引物；R)。
在一个实施方案中，引物对被设计来扩增来自肺炎支原体的核酸的区域。例如，引物对可被设计来扩增编码肺炎支原体P1细胞粘附蛋白(Cytadhesin)的基因的区域。在一个实施方案中，所述引物对包含GAACCGAAGCGGCTTTGACCGCATC(SEQ ID NO：16；正向引物；F)和5＇AmMC6/GCGTGGGCGTTTGCGGGTTTAACTT(SEQ ID NO：32；反向引物；R)。
本公开内容教导了对照序列的扩增。在一个实施方案中，对照序列可包括生物样品所源自的受试者的基因组的区域。然而，本文中公开的方法不以任何方式限定于这些具体的对照序列，而且还涉及对于本领域技术人员来说是显而易见的其它对照序列，包括人工产生的包含来源于呼吸道病原体基因组的序列的核酸构建体。此外，还可进行 本文中公开的方法而无需扩增对照序列。当进行对照序列的扩增时，产生的扩增子在本文中也称为“对照扩增子”。
在一个实施方案中，引物对被设计来扩增MYL3基因的区域。例如，所述引物对可包含GCACCCAGACAATACACACAGGTGT(SEQ ID NO：33；正向引物；F)和5＇AmMC6/GGCGGAAGTCAGCATGTGTCTG(SEQ ID NO：34；反向引物；R)。
在一个实施方案中，对照序列包括确定完整RNA已从样品成功分离的基因序列。例如，引物对可被设计来扩增基质MS-2基因的区域。在一个实施方案中，引物对包含GCACGCTCCTGCTACAGCCTCTTCC(SEQ ID NO：35；正向引物；F)和5＇AmMC6/CTTTTGCAGGACTTCGGTCGACGCC(SEQ ID NO：36；反向引物；R)。
其它引物引物对和探针是表8中所列的引物对和探针(SEQ ID NO：74至126)。
分离的DNA可使用本领域技术人员已知的任何DNA扩增方案来扩增。许多用于扩增DNA的示例性方法(绝不以任何方式限定本文中公开的方法)示于″DNA Amplification：Current Technologies and Applications″(Demidov和Broude Eds.(2004)HorizonBioscience)中。分离的RNA可使用本领域已知的任何RNA法来扩增，并且已开发了许多RNA扩增技术。这些技术的两个主要类型是：(i)利用热循环的技术例如RT-PCR，和(ii)等温测定，例如基于核酸序列的扩增(NASBA)(Compton(1991)Nature350：91-92；Kievits等人(1991)JVirol.Methods 35：273-286)和转录介导的扩增(TMA)[Hill(1996)J.Clin.LigandAssay7P：43-51]。等温测定可基于：(i)它们是拷贝和扩增靶序列，例如TMA、NASBA和自主序列复制(self-sustained sequence replication)(3SR)[Guatelli等人(1990)Proc.NatlAcad.ScI USA57：1874-1878；Chadwick等人(1998)J.Virol.Methods70：59-70；关于综述参见Chan和Fox(1999)Rev.Med.Microbiol.70：185-196]；还是(ii) 它们产生可被进一步扩增的靶依赖性信号，例如侵入检测技术(Lyamichev等人(1999)Nat.Biotechnol.77：292-296；Ryan等人(1999)MoI.Diagn.4：135-144)来进行细分。然而，应当理解，本文中公开的方法还涉及对于本领域技术人员来说是显然的任何RNA扩增法。此外，应理解，本文中公开的方法还涉及使用逆转录酶或其功能等同物将RNA转化成随后可进行扩增的DNA。
在本文中教导的方法中，引物对的至少一个成员包含可检测的标记，在本文中称为″第一可检测标记″或″第一光学可检测标记″，包括但不限于发射荧光、磷光和/或白炽光的分子、原子或离子。
在一个实施方案中，第一光学可检测标记是″荧光标记物″或″荧光团″。许多不同的荧光标记物对于本领域技术人员来说是熟悉的，荧光标记物的选择绝不限制本文中公开的方法。示例性荧光标记物包括可使用选自下列光源的光源来激发的任何荧光标记物：
(i)氩离子激光：包括蓝色488运行线(run line)，其适合于在绿色至红色区域发荧光的许多染料和荧光染料的激发。发射一系列波长(458nm、488nm、496nm、515nm等等)的可调谐氩激光也是可获得的；
(ii)二极管激光：具有635nm的发射波长。现可获得的其它二极管激光在532nm运行。有趣地，该波长最佳地激发碘化丙锭(PI)。PI染色被广泛用于DNA分析，活/死亡计数以及倍性测定。发射约476nm的光的蓝色二极管激光也是可获得的；
(iii)HeNe气激光：在红色633nm线(line)运行；
(iv)HeCd激光：在325nm运行；
(v)100W汞弧灯：用于激发UV染料如烟酸己可碱和DAPI的最高效光源。
示例性荧光团(在本文中也称为荧光染料)包括但不限于羟基香豆素，氨基香豆素，甲氧基香豆素、瀑布蓝、萤光黄、NBD、藻红蛋白(PE)、PerCP、别藻蓝蛋白、烟酸己可碱33342、DAPl、SYTOX蓝、烟酸己可碱33258、色霉素A3、光辉霉素、YOYO-I、SYTOX 绿、SYTOX橙、7-AAD、吖啶橙、TOTO-I、To-PRO-I、噻唑桔、TOTO-3、TO-PRO-3、LDS751、Alexa Fluor染料(包括Alexa Fluro-350、-430、-488、-532、-546、-555、-556、-594、-633、-647、-660、-680、-700和-750)；BoDipy染料，包括BoDipy630/650和BoDipy650/665；CY染料，特别地Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7；6-FAM(荧光素)；PE-Cy5、PE-Cy7、荧光素dT；六氯荧光素(Hex)；6-羧基-4’，5’-二氯-2’，T-二甲氧基荧光素(JOE)；俄勒冈绿染料，包括488-X和514；罗丹明染料，包括X-罗丹明、丽丝胺罗丹明B、罗丹明绿、罗丹明红和ROX；TRITC、四甲基罗丹明(TMR)；羧基四甲基罗丹明(TAMRA)；四氯荧光素(TET)；Red6B、FluorX、BODIPY-FL和德克萨斯红。在一些实施方案中，第一可检测标记是AlexaFluor-647。
在一个实施方案中，第一引物对的至少一个成员被可检测的标记进行标记，并且第二引物对的至少一个成员被不同的可检测标记进行标记，以便允许区分一组多个扩增子内的扩增子。
引物对的至少一个成员可使用本领域技术人员已知的任何方便的方法来进行标记。示例性方法包括合成前和合成后法。合成前标记法包括标记PCR引物，随后将其用于通过PCR扩增扩增子，从而将其掺入扩增子。在该方法中，标记通常连接于适合用于扩增扩增子的引物的5＇末端，尽管也可包括在引物内的其它位置上的标记，例如3＇标记或非末端标记。
还可在标记与被标记的引物之间使用化学接头。示例性接头序列可由本领域技术人员来容易地确定，并且可能包括接头例如C6、C7和C12氨基改性剂以及包含硫氢基的接头。如可容易地确定的，引物可包含接头和标记，或仅包括接头(可在更晚阶段连接所述标记)。
本文中教导的方法因其具有两个或更多个亚组的珠粒而可用于对样品筛查多种呼吸道病原体，每一个亚组的珠粒与另一个亚组的珠粒在基于珠粒尺寸和任选地固定在珠粒上的可检测标记的强度的物理化学方面是可区分的。因此，任一个亚组内的珠粒可具有共同的光学可 检测标记和/或共同的尺寸。任一个亚组内的珠粒还可具有共的寡核苷酸探针。因此，可使用多个亚组的珠粒(在本文中称为珠粒盘)检测多种呼吸道病原体。
在一个实施方案中，珠粒包括″微粒″。如对于本领域技术人员来说显然的，几乎任何材料(同质的或异质的)均可用于微粒。本文中涉及的微粒还可包括超过一种物质，这样可包含贝壳、合金或者有机和/或无机物质的混合物。可使用的有用材料包括选自二氧化硅(例如：石英或玻璃)、胶乳、钛、二氧化锡、钇、铝和其它二元金属氧化物(例如ZnO)、钙钛矿和其它压电金属氧化物(例如BaTiO3)、ZnS、蔗糖、琼脂糖以及其它聚合物珠粒的材料。在一些实施方案中，微粒包括二氧化硅。
如本文中所用，术语″物理化学上可区分的″是指在珠粒尺寸、特定可检测标记的存在或不存在和/或可检测标记的强度中任一种的可测量的差异。
预期用于本文中公开的方法的珠粒可以以任何方便的规则或不规则三维形状进行生产。然而，实现上通常合成小球或球样颗粒。这样的球或球样颗粒在本文中也称为″珠粒″。因此，在一个相关实施方案中，″微粒″大体上是球状的或球样的或包括″微球体″。
虽然珠粒可称为″微球体″，但珠粒的实际尺寸取决于许多因素，并且珠粒实际上可以包括或可以不包括在微米范围内的量度。例如，珠粒包括约300nm至约30μm的直径(或在非球样颗粒中等同的量度)，包括300nm、350nm、400nm、450nm、500nm、550nm、600nm、650nm、700nm、750nm、800nm、850nm、900nm、950nm、1.0μm、1.1μm、1.2μm、1.3μm、1.4μm、1.5μm、1.6μm、1.7μm、1.8μm、1.9μm、2.0μm、2.1μm、2.2μm、2.3μm、2.4μm、2.5μm、2.6μm、2.7μm、2.8μm、2.9μm、3.0μm、3.1μm、3.2μm、3.3μm、3.4μm、3.5μm、3.6μm、3.7μm、3.8μm、3.9μm、4.0μm、4.1μm、4.2μm、4.3μm、4.4μm、4.5μm、4.6μm、4.7μm、4.8μm、4.9μm、5.0μm、5.1μm、5.2μm、5.3μm、5.4μm、5.5μm、5.6μm、5.7μm、5.8μm、5.9μm、6.0μm、6.lμm、6.2μm、6.3μm、6.4μm、 6.5μm、6.6μm、6.7μm、6.8μm、6.9μm、7.0μm、7.1μm、7.2μm、7.3μm、7.4μm、7.5μm、7.6μm、7.7μm、7.8μm、7.9μm、8.0μm、8.1μm、8.2μm、8.3μm、8.4μm、8.5μm、8.6μm、8.7μm、8.8μm、8.9μm、9.0μm、9.1μm、9.2μm、9.3μm、9.4μm、9.5μm、9.6μm、9.7μm、9.8μm、9.9μm、10μm、l1μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm、25μm、26μm、27μm、28μm、29μm和30μm。在一些实施方案中，珠粒包括3μm至6μm的直径(或在非球样颗粒中等同的量度)。
在一个实施方案中，珠粒是由Genera Biosystems，Victoria，Australia产生的AmpaSand珠粒。然而，本文中描述的方法不应当被视为以任何方式特别地限定这些珠粒的用途。
珠粒可基于可检测标记(在本文中称为″第二可检测标记″或″第二光学可检测标记″)的存在或不存在来进行区分，包括但不限于发射荧光、磷光和/或白炽光的任何分子、原子或离子。方便的光学可检测标记包括在紫外(约350nm至约3nm的波长范围)、可见(约350nm至约800nm的波长范围)、近红外(NIR)(约800nm至约1500nm的波长范围)和/或红外(IR)(约1500nm至约10μm的波长范围)范围内发射的那些标记。然而，由于检测的容易性，在一些实施方案中，光学可检测标记在可见光波长范围内是可检测的。
光学可检测标记可包括一个或多个选自下述的标记：荧光团、半导颗粒、磷光体颗粒、掺杂颗粒(doped particle)和纳晶或量子点。在一个相关实施方案中，第二光学可检测标记是荧光团。
存在许多本领域可获得的可按照本文中公开的方法用作荧光团的荧光染料。决定其使用潜能的荧光染料或其它荧光团重要性质是荧光团的发射波长，所述波长通常匹配光源的可获得的波长。然而，许多不同的荧光染料和其它荧光团对于本领域技术人员来说是熟悉的，并且荧光标记物的选择绝不限制本文中描述的方法。可用于标记底物的特别方便的荧光染料包括上文中关于PCR扩增子的标记论述的荧光染料。然而，当选择荧光标记时，固定于珠粒的荧光标记(第二可检测 标记)的发射光谱应当与用于引物对中至少一个成员的可检测标记(第一可检测标记)的发射光谱不同。
荧光标记珠粒和微球体的方法对于本领域技术人员来说是熟悉的，包括内部染色和外部染色(表面标记)。这两个技术产生具有通常比较独特的性质的珠粒，每一个有益于不同的应用。内部染色产生具有通常比较狭窄的荧光发射的极其稳定的颗粒。这些珠粒通常显示对光致漂白有更大抗性。由于荧光团在珠粒内部，因此表面基团可获得用于将配体(蛋白质、抗体、核酸等)缀合于珠粒的表面。为此原因，内部标记的珠粒通常用于分析物检测和免疫测定应用。表面标记包括荧光团至珠粒表面的缀合。因为荧光团在珠粒表面上，因此它们能够与它们的环境相互作用，正如染色的细胞表面上的荧光团一样。结果是在许多不同条件下，例如在污染物存在或pH变化的情况下，显示与染色的细胞样品一样的激发和发射性质的珠粒标准。表面标记的珠粒的″环境反应″性质使得它们理想地适合于模拟生物样品。外部标记的珠粒通常在许多利用荧光检测的应用中用作对照和标准。然而，本文中公开的方法涵盖珠粒与荧光标记通过任何方式的结合。
还可将第二光学可检测标记掺入固定化的寡核苷酸探针，而非为本身与珠粒直接结合的标记。例如，珠粒包括固定的″标签″或寡核苷酸探针。标签可具有内部胺基(NH2)，随后通过用染料的琥珀酰亚胺酯缀合来修饰所述胺基。在一些实施方案中，第二可检测标记是BoDipy-TMR。
通过将标记的寡核苷酸探针与未标记的寡核苷酸探针或标记混合，随后将该混合物缀合于珠粒，可产生具有不同水平的荧光标记物、从而第二可检测标记强度的珠粒类别。
第二可检测标记可以以一系列浓度或强度应用于珠粒，从而提供可基于其而在“在生物化学上可区分”特定珠粒的另一个基础。例如，如果特定光学上可检测的信号的最大可检测强度被当作100％，则可将标记用于一系列珠粒以提供0％、2％、4％、6％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、 90％、100％的强度。
在一些实施方案中，珠粒盘包括6个亚组的直径(或在非球样颗粒中等同的量度)为3.0μm、3.5μm、3.8μm、5.0μm、5.2μm和5.7μm的珠粒，并且其中珠粒的6个亚组的每一个亚组还包括3个亚组(次级亚组)，所述次级亚组包括1)缀合于未标记的寡核苷酸探针的珠粒(TO：FLO＝0；无TMR)，2)分别缀合于以1∶50-200的比率混合的标记：未标记的寡核苷酸探针(TO：FLO＝50-200；中等TMR)的珠粒，和3)分别缀合于以1∶1.5-2的比率混合的标记：未标记寡核苷酸探针(TO：FLO＝1.5-2；高TMR)的珠粒。
提及“固定于”珠粒的寡核苷酸探针时是指连接于珠粒或以其它方式与珠粒缔合的寡核苷酸。可利用本领域技术人员已知的任何方便的方法将寡核苷酸探针连接于珠粒或以其它方式与珠粒缔合。例如，可在寡核苷酸探针的产生过程中将所述寡核苷酸探针封装在珠粒中或可在产生后将所述寡核苷酸探针连接于它们的表面。用于将寡核苷酸探针与珠粒缔合的方法将取决于使用的材料，这可由本领域技术人员来容易地确定。此外，可在寡核苷酸探针连接之前在珠粒上进行其它处理，包括硅烷化(利用硅烷对基底的涂覆)，以增加探针对珠粒的结合。
可用任何化合物涂覆珠粒，所述化合物可共价地连接于珠粒的表面或以其它方式吸附至其表面，此外寡核苷酸探针还可具有用于连接寡核苷酸探针的化学部分，例如硫氢基、胺基或羧基。具有这些特征的化合物的实例包括具有氨基末端的硅烷例如氨基-丙基三甲氧基硅烷或氨基-丙基三乙氧基硅烷。除硅烷以外，非共价地连接于玻璃表面和通过静电吸附多核苷酸的磷酸基团的化合物例如多聚L赖氨酸也在本文中公开的方法的范围内。因此，其它化合物，包括适合于将寡核苷酸探针连接于珠粒的表面的其它硅烷可由本领域技术人员来容易地鉴定并且本文中公开的方法不受化合物的选择限制。
例如，可通过物理吸附或化学连接将寡核苷酸探针连接于珠粒。此外，还可用促进或增强寡核苷酸探针至珠粒表面的吸附或结合的试剂例如氨基-硅烷涂覆珠粒。然而，执行该功能的其它试剂可由本领域 技术人员来容易地鉴定。
例如，可由Genera Biosystems，Victoria，Australia的通用锚固系统(UniversalAnchoring System)(UAS)来将寡核苷酸探针附着至珠粒。简而言之，该系统包括使用“桥”核酸分子将基质上的核酸″标签″序列与靶序列连接。″桥″序列与标签序列部分互补，以便桥序列可结合标签和靶序列，并且将它们保持对齐以便可以使用连接酶连接标签与靶序列。UAS也可商购获得。然而，本文中公开的方法不应当被认为以任何方式限定于将核酸分子连接于基底的该特定方法。
可使用本领域技术人员已知的任何方法来确定结合是否已在扩增子与寡核苷酸探针之间发生，所述方法允许将结合的被标记扩增子定位至固定于在物理化学上可区分的珠粒的寡核苷酸探针。在一个实施方案中，使用流式细胞术。然而，本文中公开的方法绝不限定于特定的流式细胞术法或装置。
通过使用流式细胞术，可通过物体的光散射来测定给定的珠粒的尺寸。例如，可将流式细胞术用于区分直径(或在非球类颗粒中等同的量度)约3.0μm、3.5μm、3.8μm、5.0μm、5.2μm和5.7μm的珠粒。
除了尺寸检测以外，流式细胞仪通常具有一个或多个激光器和用于检测荧光的检测器。存在许多可用于流式细胞术的荧光团，如本文中描述的。决定其用于流式细胞术测定的潜能的荧光团的关键性质是激发波长；即，其必需匹配光源的可获得的波长。流式细胞仪还可用于基于荧光的强度(即，第二可检测标记的强度)区分珠粒的亚组。例如，本发明人已确定流式细胞术能够区分利用相当于无TMR、中等TMR和高TMR的第二光学可检测标记水平所标记的珠粒。
在另一个方面，提供了用于对样品筛查多种呼吸道病原体以检测特定病原体的珠粒盘，其中所述珠粒盘包含多个亚组的珠粒，其中：
(a)每一个亚组的珠粒在尺寸方面是同质的；
(b)将每一个亚组内的珠粒偶联至能够结合呼吸道病原体基因组的分析物特异性区域的核酸寡核苷酸探针；和
(c)任选地，珠粒盘包括珠粒亚组，其利用可检测标记进行了标记， 每一个珠粒的亚组具有不同的可检测标记强度，由此产生基于可检测标记的强度的珠粒异质混合物；
其中亚组珠粒身份、从而呼吸道病原体的类型和/或株系可基于珠粒尺寸和/或可检测标记的强度鉴定。
珠粒盘可包括2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个亚组的珠粒，每一个亚组包含与在利用引物对扩增后产生的扩增子的区域互补的寡核苷酸探针。在一个实施方案中，寡核苷酸探针包含选自SEQ ID NO：37至54的核酸。对这些序列特异性寡核苷酸探针的引用包括与这些序列具有至少90％的同一性或能够在低严格条件下与其或它们的互补形式杂交的核酸分子。提及至少90％包括90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和100％.
珠粒盘中珠粒亚组的数目通常对应于待筛查的分析物的数目(即，呼吸道病原体的类型和/或菌株)。珠粒盘还可包括一个或多个用于检测对照序列的额外亚组，如本文中描述的。
术语″寡核苷酸探针″在本文中用于指固定于珠粒(即，连接于珠粒或以其它方式与珠粒缔合)的多核苷酸。每一个寡核苷酸探针包含含有与按照本文中描述的方法产生的扩增子的区域互补的序列的多核苷酸。寡核苷酸探针还可包含与对照序列互补的序列，如本文中描述的。
因此，寡核苷酸探针的珠粒盘可包含：
[B1-CX1，B2-CX2，B3-cX3，.Bn-cXn，By-cY，Bz-cZ]
其中：
B1、Bn、By、Bz是各自在物理化学上可区分的珠粒；
cXn是固定于珠粒的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与对于呼吸道病原体的特定类型和/或菌株是特异性的特定核酸序列(即，类型和/或菌株特异性序列)互补的核苷酸序列；
n为待使用珠粒盘检测的呼吸道病原体或受试病原体的特定菌株的数目；
cY为珠粒盘的任选成员，其为固定于珠粒的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与在病原体或病原体的菌株间保守的序列互补的核苷酸 序列；
cZ为珠粒盘的任选成员，其为为固定于珠粒的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与从多细胞受试者扩增的对照序列互补的核苷酸序列。在一些实施方案中，对照序列是人基因组DNA序列。在一些实施方案中，对照序列来源于人MYL3基因。
可在它们产生过程中将寡核苷酸探针连接于珠粒或以其它方式与所述珠粒缔合，或可在产生后将所述寡核苷酸探针连接于它们的表面。用于将多核苷酸与珠粒缔合的选择方法将取决于使用的材料，这可由本领域技术人员来容易地确定。此外，可在连接多核苷酸之前对珠粒进行其它处理，包括硅烷化(用硅烷涂覆基底)，以增强所述多核苷酸对珠粒的结合。
如本文中所用，短语″结合于或以其它方式与……缔合″是指籍以将分子与珠粒缔合的任何方法。可籍以介导这样的缔合的示例性模式包括但不限于：共价结合、氢键合、范德瓦尔斯力、离子键合、金属键合、极性键合和配位(共价)键合等。
还可将分子(包括寡核苷酸探针)通过试剂连接于微球样颗粒，所述试剂促进或增强寡核苷酸探针至珠粒表面的吸附或结合，这样的试剂在本文中称为″接头″。例如，可通过包含硫氢基、胺基或羧基的接头将多核苷酸与微球样颗粒结合。适当的接头的实例包括具有氨基末端的硅烷例如氨基-丙基三甲氧基硅烷或氨基-丙基三乙氧基硅烷。除了硅烷以外，还包括非共价地连接于表面例如玻璃并且通过静电吸附多核苷酸的磷酸基团的化合物例如多聚L赖氨酸。因此，适合于促进寡核苷酸探针至珠粒表面的结合或缔合的其它分子，包括其它硅烷，可由本领域技术人员容易地鉴定，并且本文中公开的方法不受接头的选择限制。
″互补″被理解为寡核苷酸探针应当在低严格条件下与根据本文中描述的方法产生的扩增子杂交。优选地，固定的寡核苷酸探针应当在中等严格条件下与扩增子杂交，最优选地，固定的寡核苷酸探针应当在高严格条件下与扩增子杂交。
在一个实施方案中，当引物对为SEQ ID NO：1和17时，所述互补的寡核苷酸探针是5＇ThioMC6-D/AAT/iAmMC6T/GAATTCGGATCCAGTCTCTGCGCGATCTCGGCTTTGAG(SEQ ID NO：37)。
在一个实施方案中，当引物对为SEQ ID NO：2和18时，所述互补的寡核苷酸探针为5＇ThioMC6-D/AAT/iAmMC6T/GAATTCGGATCCGGTGTTTTCACCCATATTGGGCAATT(SEQ ID NO：38)。
在一个实施方案中，当引物对为SEQ ID NO：3和19时，所述互补的寡核苷酸探针为5＇ThioMC6-D/AAT/iAmMC6T/GAATTCGGATCCCATGCTGCCGTTACACCTTTGTTCG(SEQ ID NO：39)。
在一个实施方案中，当引物对为SEQ ID NO：4和20时，所述互补的寡核苷酸探针为5＇ThioMC6-D/AAT/iAmMC6T/GAATTCGGATCCCCGAGGAGCCAT CCAGCTACACTAC(SEQ ID NO：40)。
在一个实施方案中，当引物对为SEQ ID NO：5和21时，所述互补的寡核苷酸探针为5＇ThioMC6-D/AAT/iAmMC6T/GAATTCGGATCCGTTCTATAAGCTGGTATTGATGCAGG(SEQ ID NO：41)。
在一个实施方案中，当引物对为SEQ ID NO：6和22时，所述互补的寡核苷酸探针为5＇ThioMC6-D/AAT/iAmMC6T/GAATTCGGATCCCCTATATCTGCACATCCTTGAGTGATT(SEQ ID NO：42)。
在一个实施方案中，当引物对为SEQ ID NO：7和23时，所述互补的寡核苷酸探针为5＇ThioMC6-D/AAT/iAmMC6T/GAATTCGGATCCACCCCTGTGATGCAATTAGCAGGGCA(SEQ ID NO：43)。
在一个实施方案中，当引物对为SEQ ID NO：8和24时，所述互 补的寡核苷酸探针为5＇ThioMC6-D/AAT/iAmMC6T/GAATTCGGATCCAGCACATTATGCCATGTCCATTTTATCC(SEQ ID NO：44)。
在一个实施方案中，当引物对为SEQ ID NO：9和25时，所述互补的寡核苷酸探针为5＇ThioMC6-D/AAT/iAmMC6T/GAATTCGGATCCGGTTCCAGAYAAWATGGGTCTTGCTA(SEQ ID NO：45)。
在一个实施方案中，当引物对为SEQ ID NO：10和26时，所述互补的寡核苷酸探针为5＇ThioMC6-D/AAT/iAmMC6T/GAATTCGGATCCTTGCCCCGYACTTCATATTTGCA(SEQ ID NO：46)。
在一个实施方案中，当引物对为SEQ ID NO：11和27时，所述互补的寡核苷酸探针为5＇ThioMC6-D/AAT/iAmMC6T/GAATTCGGATCCGCTTCGGAGTACCTGAGTCCGGGT(SEQ ID NO：47)。
在一个实施方案中，当引物对为SEQ ID NO：12和28时，所述互补的寡核苷酸探针为5＇ThioMC6-D/AAT/iAmMC6T/GAATTCGGATCCTCGGGCCAGGACGCCTCGGAGTAC(SEQ ID NO：48)。
在一个实施方案中，当引物对为SEQ ID NO：13和29时，所述互补的寡核苷酸探针为5＇ThioMC6-D/AAT/iAmMC6T/GAATTCGGATCCTCCTCCGGCCCCTGAATGYGGCTAA(SEQ ID NO：49)。
在一个实施方案中，当引物对为SEQ ID NO：14和30时，所述互补的寡核苷酸探针为5＇ThioMC6-D/AAT/iAmMC6T/GAATTCGGATCCTGCCCGATTGACCTTCCTACGTCGA(SEQ ID NO：50)。
在一个实施方案中，当引物对为SEQ ID NO：15和31时，所述互补的寡核苷酸探针为 5＇ThioMC6-D/AAT/iAmMC6T/GAATTCGGATCCTGGTCTCGAGCAACTTTTGATGCTG(SEQ ID NO：51)。
在一个实施方案中，当引物对为SEQ ID NO：16和32时，所述互补的寡核苷酸探针为5＇ThioMC6-D/AAT/iAmMC6T/GAATTCGGATCCGGGCGCGCCTTATACGACCTCGATT(SEQ ID NO：52)。
在一个实施方案中，当引物对为SEQ ID NO：33和34时，所述互补的寡核苷酸探针为5＇Acryd/AAT/iAmMC6T/AAAGGGAGGACAGCTATGGACCAAACACAGACACAGAGAGACCCACAGACA(SEQID NO：53)。
在一个实施方案中，当引物对为SEQ ID NO：35和36时，所述互补的寡核苷酸探针为5＇ThioMC6-D/AAT/iAmMC6T/GAATTCGGATCCGAAGTGCCGCAGAACGTTGCGAACC(SEQ ID NO：54)。
在一个实施方案中，引物对和对应探针选自表8中所列的引物对和探针(SEQ IDNO：74至126)。在一个实施方案中，选择2个或更多个引物对以及对应探针。″2个或更多个″包括约2至约18个，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个。
低、中等和高严格条件对于本领域技术人员来说是已知的。例如，低严格条件包括至少约0至至少约15％v/v的甲酰胺(包括1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％11％、12％、13％和14％v/v的甲酰胺)以及至少约1M至至少约2M的盐(针对杂交)，和至少约1M至至少约2M的盐(针对洗涤条件)。中等严格条件可包括例如至少约16％v/v至至少约30％v/v的甲酰胺，包括16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、24％、26％、27％、28％、29％和30％v/v的甲酰胺，以及至少约0.5M至至少约0.9M的盐(针对杂交)，和至少约0.5M至至少约0.9M的盐(针对洗涤条件)。高严格条件可包括例如至少约31％v/v至至少约50％v/v的甲酰胺和至少约0.01M至至少约0.15M的盐(针对杂交)，和至少约0.01M至至少 约0.15M的盐(针对洗涤条件)。杂交和洗涤步骤的温度可改变，并且可用更高的温度替代甲酰胺和/或提供可选择的严格条件。
在一个实施方案中，用第二可检测标记对珠粒亚组的寡核苷酸探针进行标记，这允许本文中公开的方法区分多种呼吸道病原体或一类呼吸道病原体中的多个成员。通常方便地使用可基于它们各自的荧光波长容易地与第一可检测标记相区分的第二可检测标记。
可使用方便的方法，包括上文中针对菌株特异性扩增子的标记举例说明的方法，如本文中所述用可检测标记对寡核苷酸探针进行标记。例如，可在标记与被标记的寡核苷酸探针之间使用化学接头。示例性接头序列可由本领域技术人员容易地确定，并且可能包括接头例如C6、C7和C12氨基修饰子以及包含硫氢基的接头。如将容易地确定的，引物可包含接头和标记，或单独接头，可在更晚阶段将标记连接其上。在一些实施方案中，接头是C6氨基酸修饰。
在一个实施方案中，使用的标记是荧光团(在本文中也称为荧光染料)，其选自：羟基香豆素，氨基香豆素，甲氧基香豆素、瀑布蓝、萤光黄、NBD、藻红蛋白(PE)、PerCP、别藻蓝蛋白、烟酸己可碱33342、DAPl、SYTOX蓝、烟酸己可碱33258、色霉素A3、光辉霉素、YOYO-I、SYTOX绿、SYTOX橙、7-AAD、吖啶橙、TOTO-I、To-PRO-I、噻唑桔、TOTO-3、TO-PRO-3、LDS751、Alexa Fluor染料(包括Alexa Fluro-350、-430、-488、-532、-546、-555、-556、-594、-633、-647、-660、-680、-700和-750)；BoDipy染料，包括BoDipy630/650、BoDipy650/665和BoDipy-TMR；CY染料，特别地Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7；6-FAM(荧光素)；PE-Cy5、PE-Cy7、荧光素dT；六氯荧光素(Hex)；6-羧基-4’，5’-二氯-2’，T-二甲氧基荧光素(JOE)；俄勒冈绿染料，包括488-X和514；罗丹明染料，包括X-罗丹明、丽丝胺罗丹明B、罗丹明绿、罗丹明红和ROX；TRITC、四甲基罗丹明(TMR)；羧基四甲基罗丹明(TAMRA)；四氯荧光素(TET)；Red6B、FluorX、BODIPY-FL和德克萨斯红。在一些实施方案中，第二可检测标记为BoDipy-TMR。
在一个实施方案中，寡核苷酸探针用超过一种可检测标记来标记，这进一步允许区分珠粒盘内的珠粒。
在一个实施方案中，可控制连接于珠粒盘内珠粒或以其它方式与所述珠粒缔合的标记寡核苷酸探针的量以产生具有预定的或需要的第二可检测标记强度的珠粒，如上文中描述的。这样的方法对于本领域技术人员来说是已知的。例如，可将标记寡核苷酸探针与未标记寡核苷酸探针的混合物与珠粒接触，其中标记与未标记寡核苷酸探针的比率确定连接于珠粒盘内珠粒或以其它方式与其缔合的标记寡核苷酸探针的量，从而确定每一个珠粒上第二可检测标记的强度。可以例如使用下文中显示的两个顺序公式来制备标记与未标记寡核苷酸探针的混合物：
1)H＝G*C*((E/D)-1)/F
其中H＝需要的未标记寡核苷酸(寡核苷酸探针)母液的体积(μL)
G＝需要的标记寡核苷酸的体积(μL)
C＝标记寡核苷酸的浓度
E＝期望的TO：FLO比率
D＝标记寡核苷酸母液的TO：FLO比率
F＝未标记寡核苷酸母液的浓度
2)水(μL)＝(0.01*((G*C)+(H*F)))-(G+H)
其中G＝需要的标记寡核苷酸的体积(μL)
C＝标记寡核苷酸的浓度
H＝需要的未标记寡核苷酸母液的体积(μL)[来源于1)]
F＝未标记寡核苷酸母液的浓度
因此，珠粒盘的珠粒B1...Bn，By，Bz可以是在物理化学上可区分的珠粒。术语″在物理化学上可区分的″是指允许一种珠粒(例如B1)与 另一种珠粒(例如B2)相区别的任何物理或化学特征。因此，在物理化学上可区分的珠粒允许区分多种呼吸道病原体或其菌株。根据本文中公开的方法，珠粒盘的珠粒可基于尺寸和/或第二可检测标记的强度来区分。在一些实施方案中，术语″在物理化学上可区分的″是指珠粒尺寸、特定光学可检测标记的存在或不存在和/或光学可检测标记的强度中任一方面的可测量的差异。
在一个实施方案中，珠粒盘内的珠粒可基于尺寸、第二可检测标记的强度水平、荧光团的类型和固定于其上的寡核苷酸探针的序列来区分。
本公开内容还教导了按照本文中公开的方法使用的诊断试剂盒，包括诊断人受试者的呼吸道感染，测定样品中呼吸道病原体的存在和/或评估人受试者发生呼吸道感染的风险。
在一个实施方案中，试剂盒包括包含珠粒亚组的珠粒盘，其中每一个珠粒盘内的珠粒包含固定于在物理化学上可区分的珠粒亚组上的寡核苷酸探针，其中所述寡核苷酸探针与呼吸道病原体的核苷酸序列互补。任选地，试剂盒可包含能够结合呼吸道病原体的不同菌株间保守的序列以产生扩增子的引物对，所述扩增子包含特定呼吸道病原体菌株的独特核苷酸序列，其中产生的扩增子推定与固定于试剂盒的珠粒上的寡核苷酸探针互补。
在一个实施方案中，试剂盒包含至少两个包含选自SEQ ID NO：1至16以及SEQ IDNO：33和35的正向引物和选自SEQ ID NO：17至32以及SEQ ID NO：34和36的对应反向引物的引物对，和至少两个选自SEQ ID NO：37至54的互补寡核苷酸探针。
本说明书还提供了通过本文中公开的方法检测的分析物。
本文中还提供了包括可用于本文中公开的方法的标记或预标记珠粒的试剂盒。在一个实施方案中，本文中教导了包括两个或更多个选自SEQ ID NO：1和17、2和18、3和19、4和20、5和21、6和22、7和23、8和24、9和25、10和26、11和27、12和28、13和29、14和30、15和31以及16和32的寡核苷酸引物对和选自SEQ ID NO：37至52的对应探针。在一个实施方案中，本文中教导了包括两个或更多个寡核苷酸引物对和表8中所列的对应引物探针(SEQ IDNO：74至126)的试剂盒。″两个或更多个″或″至少2个″包括2至约18个，包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个。
本文中教导的方面通过下列非限定性实施例来进一步描述。
实施例1
引物设计
关于多重引物设计的一般考虑包括：
·高于58℃的芯片解链温度(T°m)(当可能时)
·40-65％的GC百分比含量(当可能时)
·避免超过3个连续G或C的运行
·扩增子长度最小化(当可能时少于150bp)
在RNA靶的情况下，AlexaFluor-标记的(5’氨基修饰的)引物是负责在RT-PCR过程中从RNA模板引发cDNA合成的引物。探针寡核苷酸经合成具有5’硫氢基(Thio)或acrydite(AmM)修饰，以使得能够偶联至二氧化硅珠粒，对探针寡核苷酸进行内部氨基修饰以允许用荧光染料(BoDipy-TMR)标记。在于所有分析的菌株间高度保守的区域上设计扩增引物对(正向和反向)，特别强调的是在3’末端使保守性最大化和使简并性最小化。
甲型流感病毒
靶扩增子的供选方案：区段7(MP)
靶基因：区段7(MP)
分析的序列的数目：16026
对照构建体：RTI-C2
注释：通过流感病毒引物设计资源(Influenza Primer Design Resource)(IPDR)获得人宿主的甲型流感病毒的序列。将总共16026个甲型流感病毒基质蛋白(MP)的序列用于产生共有序列，随后将所述共有序列用于产生载体NTI中的共有序列文件。在于所有菌株间高度保守的区域上设计引物，特别强调的是在3’末端使保守性最大化和使简并性最小化。
引物/探针1：淘汰的
使用引物/探针1进行的靶扩增的效率对于实际诊断目的来说被认为太大。重复测试证实了在不存在甲型流感病毒输入模板的样品中零星地观察到阳性InfA信号。由于这些假阳性结果的无规则性，少量甲型流感病毒对工作空间环境的局部污染被接受为可能的原因。因此，重新设计正向引物(alt Am-InfAF)以便扩增子长度增加并且扩增效率减小(参见下文中引物/探针2)：
引物/探针2：淘汰的
alt Am-InfA F(引物/探针2)的使用导致甲型流感病毒靶DNA的高灵敏性检测。然而，在这些扩增条件下连续获得假阳性结果。因此，设计和合成允许甲型流感病毒扩增的另一组引物/探针-引物/探针3-下文中。
引物/探针3：
甲型流感病毒引物/探针3的滴定获得了允许检测400个拷贝和甚至100个拷贝的合成甲型流感病毒构建体的扩增/标记条件。此外，在3个独立的实验(牵涉总共26个指定的水对照和23个指定的HeLa/MS2对照)中未观察到假阳性。此外，在这些条件下，已显示这些引物高效地检测InfA/H1N1的HealthScope阳性对照。
乙型流感病毒
靶扩增子的供选方案：区段1(PB2)和区段4(HA)
靶基因：区段4(HA)
分析的序列的数目：2980
对照构建体：RTI-C3
引物/探针1：淘汰的
在多重情形的背景中，对乙型流感病毒对照构建体和确认的乙型流感病毒阳性临床样本的检测总体不佳。虽然主扩增似乎是高效的(如通过PCR产物的凝胶电泳后条带强度判断的)，但在λ外切核酸酶消化后通过杂交或通过固相扩增法加载至珠粒上似乎效率非常低。因此，设计另外一组引物/探针来允许使用另外的探针序列(参见下文中的引物/探针2)。
引物/探针2：
甲型流感病毒(H1N12009)
靶扩增子的供选方案：区段4(HA)
靶基因：流感病毒的2009H1N1大流行毒株的区段4(HA)
分析的序列的数目：4839
对照构建体：RTI-C4
注释：选择的引物/探针被设计来区分2009大流行猪流感病毒与其它猪(和人)HI亚型病毒。
甲型流感病毒(H5N1)
靶扩增子的供选方案：区段4(HA)
靶基因：流感病毒的H5N1大流行毒株的区段4(HA)
分析的序列的数目：2757
对照构建体：RTI-C5
呼吸道合胞病毒(甲型和乙型)
靶扩增子的供选方案：聚合酶；糖蛋白/融合物；核蛋白
靶基因：聚合酶基因
分析的序列的数目：14
对照构建体：RTI-C18和RTI-C19
注释：高度保守的核蛋白和聚合酶基因特别适合用于检测RSV-A和RSV-B。然而，靶向核蛋白基因的初始引物(引物/探针1)(对照构建体RTI-C6和RTI-C7)的低效扩增导致重新设计靶向聚合酶基因的引物/探针(对照构建体RTI-C18和RTI-C19；参见下文中引物/探针2)。
引物/探针1：核蛋白-淘汰的
引物/探针2：聚合酶
人副流感病毒1型(HPIV-1)
靶扩增子的供选方案：HN
靶基因：HN
分析的序列的数目：30
对照构建体：RTI-C8
注释：虽然使用下文中的引物/探针1序列从合成模板产生主扩增产物似乎是高度有效的(如通过凝胶电泳判断的)，但加载至珠粒上和从而固相检测是不佳的。因此，设计和合成另一组引物/探针(引物/探针2)。在最优化引物浓度后，使用新的引物/探针组未显著增强固相检测的灵敏度。然而，在两个引物组的直接序列比较后，最终使用引物/探针2，表明引物/探针2可能检测更高比例的合成的HN数据库序列。
引物/探针1：淘汰的
引物/探针2：
人副流感病毒2型(HPIV-2)
靶扩增子的供选方案：HN
靶基因：HN
分析的序列的数目：13
对照构建体：RTI-C9
注释：使用EMBL-EBI软件比对总共18个序列，鉴定了对于18个序列中有13个有数据表明是高度保守的区域。根据所得的共有序列，鉴定了下列引物/探针序列。
人副流感病毒3型(HPIV-3)
靶扩增子的供选方案：HN
靶基因：HN
分析的序列的数目：5个完整基因组序列和18个HN序列
对照构建体：RTI-C10
人副流感病毒4型(HPIV-4)
靶扩增子的供选方案：磷蛋白(P)基因
靶基因：P基因
分析的序列的数目：40
对照构建体：RTI-C11
注释：使用EMBL-EBI软件进行的4a(22)和4b(18)磷蛋白基因的40个序列与NCBI数据库中的唯一完整基因组序列(HPIV4b；登录号EU627591)的比对得到了可用于设计引物/探针的共有序列。
*基于EU627591
人类偏肺病毒(hMPV)
靶扩增子的供选方案：核蛋白(N)、基质蛋白(M)
靶基因：基质蛋白的M2区域
分析的序列的数目：74
对照构建体：RTI-C12
注释：最初使用EMBL-EBI的软件从12个完整基因组序列的比对得到M2基因的共有序列，根据该共有序列设计引物/探针。随后针对基质蛋白的Contig4和所有hMPV基质蛋白序列与hMPV参照序列(NC_004148)装配的NC_004148装配体检查这些引物。
腺病毒(B、C和E型)(AdV)
靶扩增子的供选方案：Hexon
靶基因：Hexon
分析的序列的数目：247个Hexon序列和15个完整基因组序列对照构建体：RTI-C13
*针对载体NTI计算的
鼻病毒/肠道病毒(RhV)
靶扩增子的供选方案：5’UTR(非翻译区)
靶扩增子：5’UTR
分析的序列的数目：962个5’UTR序列和138个完整基因组序列对照构建体：RTI-C14
百日咳博德特菌(Bper)
靶扩增子的供选方案：IS481；ptx
靶基因：区段4(HA)
分析的序列的数目：2980
对照构建体：RTI-C15
肺炎衣原体(Cpn)
靶扩增子的供选方案：MOMP
靶基因：MOMP
分析的序列的数目：19
对照构建体：RTI-C16
注释：引物/探针位于主要外膜蛋白(MOMP)的高度保守区域内。
肺炎支原体(Mpneu)
靶扩增子的供选方案：P1细胞粘附蛋白(Cytadhesin)，16s rRNA和ATP酶
靶基因：P1细胞粘附蛋白
分析的序列的数目：212
对照构建体：RTI-C17
注释：共有序列最终来源于来自P1细胞粘附蛋白基因的高度保守区域的5个序列。
MS-2噬菌体(MS-2)
靶扩增子供选方案：基质蛋白
靶基因：基质蛋白
分析的序列的数目：2个完整基因组
对照构建体：RTI-C1
注释：将MS-2对照用于确定已使用推荐的核酸纯化法成功地提取完整RNA。在向核酸提取/纯化法内添加裂解溶液后立即将纯化的MS2RNA添加至反应管。
人
靶扩增子的供选方案：MYL3，β-肌动蛋白
靶基因：MYL3
分析的序列的数目：1
对照：不含RNA酶的HeLa基因组制剂(Qiagen)
注释：该内部对照的目的是建立适当的样本量和完整性。MYL3基因是主要在心脏组织中表达的单拷贝基因。相反地，β-肌动蛋白基因具有多个拷贝和假基因，并且在所有组织中高度表达。
*针对载体NTI计算的
实施例2
未标记寡核苷酸的制备
从Integrated DNA TechnoIogies(IDT)订购所有脱盐的寡核苷酸。在3轮乙醇沉淀后，将引物溶解于水中以便获得约400μM的理论浓度(基于由IDT提供的数据表)。
从IDT订购脱盐的未标记探针寡核苷酸，在3轮乙醇沉淀后，将其溶解于水中以便获得约400μM的理论浓度(基于由IDT提供的数据表)。将未标记的寡核苷酸母液于-20℃贮存。
实施例3
利用Bodipy-TMR和AlexaFluor647的寡核苷酸标记
在0.1M碳酸盐缓冲液pH9.0存在的情况下，利用15倍摩尔浓度过量的适当染料(Invitrogen)的琥珀酰亚胺酯过夜标记合成的、在内部胸苷核苷酸的C6位置上具有胺基修饰的引物和探针寡核苷酸。随后将寡核苷酸经历3轮乙醇沉淀以除去未缀合的染料，并利用未标记(但另外地相同的)寡核苷酸调整以获得期望的标记寡核苷酸对未标记寡核苷酸的比率。使用下列公式调整标记寡核苷酸的终浓度和TO：FLO：
V0＝V2×C2×((TF1/TF0)-1)/C0
Vw＝(1/Ct×((V2×C2)+(V0×C0)))-(V2+V0)
其中：
V0 需要添加的未标记寡核苷酸
V2 用于调整的标记寡核苷酸的体积
C2 待用于调整的标记寡核苷酸的浓度
TF1 靶TO：FLO
TF0 初始TO：FLO
C0 未标记寡核苷酸的浓度
Vw 需要添加的水的体积
Ct 靶浓度
一般而言，对于被标记的引物寡核苷酸，标记对未标记寡核苷酸的比率为1∶1.8。对于被设计来缀合于高TMR和中等TMR珠粒的标记探针寡核苷酸而言，标记对未标记寡核苷酸的比率分别为1∶2和1∶100。将TO：FLO经调整的标记引物寡核苷酸于-20℃贮存。
实施例4
珠粒硅烷化、探针偶联和珠料混合
每个RT-PCR反应使用5μL体积的以该方式制备的珠粒混合物。将二氧化硅珠粒(Bangs Laboratories Inc.)在水中洗涤3次，随后在室 温用1.55M HNO3处理颗粒化珠粒30min。随后将珠粒于水中洗涤5次，于异丙醇中洗涤3次。在圆底烧瓶中，随后使约1×109个珠粒(于95mL异丙醇中)沸腾，添加0.5mL水和5mL新打开的3-巯基丙基三甲氧基硅烷(3MPTS；Sigma)。在回流的情况下进行硅烷化23-25h，随后将珠粒在异丙醇中洗涤3次，在真空浓缩器中于45℃干燥40min。随后将干燥珠粒在105℃热固化16-24h，随后在氩气下于室温贮存。为了进行探针寡核苷酸偶联，称取硅烷化珠粒的重量，将其重悬浮于调整至pH4.75的0.1M MES缓冲液(Sigma Aldrich)中，随后在1％w/v过硫酸铵(APS)存在的情况下，通过5’-Acrydite(Trade Mark)修饰偶联至探针寡核苷酸(IDT)，随后进行洗涤，然后重悬浮于获取缓冲液(Acquisition Buffer)(10mM Tris-Cl，0.5mM EDTA，0.0125％w/vNaN3，0.01％v/v Triton X-100)。随后在Z1Coulter Particle计数器(Beckman Coulter)中计数单种珠粒溶液，将其调整至2.1×107个珠粒/mL，随后以等摩尔浓度比率混合，并调整至1.26×107个珠粒/mL的终浓度。具体地，通过将等比例的每一种(18)偶联的珠粒群体以2.1×107个珠粒/mL混合，随后添加等于混合珠粒的2/3体积的获取缓冲液来进行珠粒混合。参见表3。
例如：混合10μL的每一种珠粒
18×10μL单种珠粒＝180μL
添加2/3×180μL＝120μL的获取缓冲液
终体积＝180μL+120μL＝300μL珠粒混合物
每个RT-PCR反应使用5μL体积的以该方式制备的珠粒混合物。还应指出，补始实验包括将混合珠粒重悬浮于与获取缓冲液相似但具有减少量的Triton X-100(0.001％v/vTriton X-100)的缓冲液中。随后的实验数据(nv3pg8)显示当将珠粒在获取缓冲液或具有减少量的Triton X-100(0.001％v/v Triton X-100)的获取缓冲液中混合时获得等同的结果。因此，为了方便起见和制造过程更加与目前的方案更加一致，最终在获取缓冲液中装配珠粒混合物。
一旦决定了引物对，则设计对照构建体。对照构建体以100ug的冻干形式获自GenScript，其中将约500bp的合成产生的DNA插入物平端克隆进入内部载体pUC57的多接头内。一般地，利用下列关键特征设计合成产生的DNA插入物：
1)用于高效体外转录的5’T7和T3启动子；
2)靶扩增子+>20bp的序列或侧翼序列；
3)具有>20bp的侧翼序列的可选用扩增子(例如HealthScope或其它文献)；
4)用于模板线性化以允许转录终止(确保在病原体序列中不存在内部Not I位点)的3’Not I限制位点。
实施例5
对照构建体的设计和构建
对于RNA病毒，必需特别小心以确保在插入物的RNA转录后，产生正确(基因组)有义RNA。
为了记录目的，在载体-NTI中设计和保存所有对照构建体。将载体图解的硬拷贝归档。提交给GenScript的序列示于图1中。应当指出，由于呼吸道合胞病毒的必需引物/探针重新设计的原因，针对该病原体设计和合成另外的对照构建体。包含RSV聚合酶基因的部分的对照构建体RTI-C18和RTI-C19是被终RSV引物/探针靶向的那些模板。
按照制造商的说明书，使用Ambion Megascript试剂盒来进行使用合成对照构建体模板的体外转录。简而言之，将冻干DNA样品溶解于不含RNA酶的水中至约1μg/μl，利用限制性内切酶Not I在37℃于1×NEBuffer3+BSA中线性化10μgDNA样品，进行2小时。随后在65℃将反应加热灭活20min，按照制造商的说明书使用Qiagen gel extraction试剂盒纯化核酸。随后将洗脱至100μl不含核酸酶的水中的DNA经历乙醇沉淀，将终DNA沉淀溶解于12μl不含核酸酶的水中。随后使用分光光度计定量每一个DNA样品的等分试样。
在热循环仪中对1μg新鲜制备的DNA模板进行体外转录，使所述转录在37℃下进行3h30min。随后添加1μL Turbo DNA酶，将反应物在37℃进一步温育15min以除去所有痕量的输入DNA模板。按照制造商的说明书使用RNeasy试剂盒回收RNA，将其洗脱在50μL的RNA贮存液(Ambion)中。使用分光光度计以一式三份定量RNA，通过变性琼脂糖凝胶电泳确认RNA完整性和浓度。利用被设计来扩增特异性内部序列的引物通过PCR确认被转录的RNA的身份(参见图2)。
一般而言，将RNA贮存液的等分于RNA贮存溶液(Ambion)中稀释至1×109个拷贝/μL，并于-20℃贮存直至需要。对已知量的从1×109个拷贝/μL贮存管新鲜稀释的RNA常规地进行测定的最优化。
在于-20℃贮存1个月后未观察到明显的RNA原液(于RNA贮存缓冲液中贮存的)降解，如通过变性琼脂糖凝胶电泳和分光光度法测定的。
实施例6
固相RT-PCR
基本上按照制造商的说明书(Qiagen)建立一步RT-PCR。简而言之，将10μL的包含1×反应缓冲液、dNTP、寡核苷酸(关于寡核苷酸序列参见主体文本)的主要混合物和酶混合物添加至5μL的预涂板的珠粒。随后添加样品(10μL)，将板密封，以300×g旋转1min。随后将托盘在50℃温育20min，在95℃温育15min，随后如下进行循环(45个循环)：在95℃进行30秒，在60℃进行30秒以及在72℃进行1min。在起始杂交之前包括最终延伸步骤：在72℃进行2min，所这杂交包括在90℃进行30秒的初始温育，随后以每15秒1℃逐步降低温育温度进行65个循环，从而达到25℃的终温度。
实施例7
数据获取和分析
在固相RT-PCR循环后，将平板以1000×g旋转1min，随后将沉淀珠粒在120μL的Sheath缓冲液(8mM NaCl，0.0001％v/v Triton X-100)中洗涤5次，在将洗涤缓冲液添加至沉淀珠粒之间以300×g旋转1min。或者，在Hydrospeed platewasher(Tecan)中进行板洗涤，从而允许在温和抽吸与分配的循环之间存在5min的珠粒沉降时间。最终将珠粒重悬浮于80μL至120μL的Sheath缓冲液中，随后在FACSArray流式细胞仪(BD Biosciences)上进行分析。随后使用FCS Express(De Novo软件)或定制的分析软件(Genera Biosystems)分析报告为FCS2.0文件的数据。
实施例8
PCR最优化
退火温度I：侧翼引物(不存在内部探针寡核苷酸)
最初在Qiagen RT-PCR缓冲液中使用梯度PCR和HotStar Taq测定允许靶模板的有效PCR扩增的引物对的退火温度。对10000个拷贝的靶模板(10μL，1000个拷贝/μL)进行PCR。为了确保评估广泛的退火温度，使用从52至70℃的退火温度的梯度。这相当于横跨用于本实验的Eppendorf Mastercycler Ep S每一行内的孔的51.8℃、52.2℃、53.3℃、55.0℃、57.1℃、59.5℃、61.9℃、64.3℃、66.5℃、68.2℃、69.5℃和70.0℃的温度。如下进行PCR：在95℃进行15min，随后进行40个循环：在95℃进行30秒，在梯度52-70℃进行30秒，在72℃进行30秒，最终延伸10min。
在所有情况下，将5μL的PCR产物在2.5％TAE琼脂糖凝胶上电泳(在150V下电泳)，于SYBR-安全染料(Invitrogen)中以终2×浓度染色20min后，在UV透射仪上显现DNA。随后测定每一个引物组的导致高效PCR扩增(如通过条带强度判断的)的退火温度，并示于下文表4中：
表4
第一代引物的退火温度
*对于与用于终测定的引物对不同的早期引物对获得的结果。
与芯片预测一致，允许靶模板最大扩增的退火温度通常很高(>59℃)并且从59.5℃变化至70℃。60℃的退火温度允许高效扩增所有靶，从而被初步选择为用于测定的固相RT-PCR组成部分的退火温度。应当重申的是数据中的一些来源于未用于最终测定的第一代引物对。
多重PCR：DNA模板；无背景DNA
最初利用包含0.6μM(终)浓度的每一种引物(如由制造商推荐与Qiagen One-stepRT-PCR试剂盒一起使用的)的引物混合物进行使用DNA模板的PCR反应(在反转录不存在的情况下)。在这些条件下，所有靶被扩增，如通过在100V下通过15％w/v TBE预制凝胶(Biorad)进行PAGE电泳4h后显现条带判断的。对于RSV-A、hMPV和RhV可重现地显示了较差的扩增。其中对引物混合物中引物对浓度进行了调整的随后实验鉴定了有助于所有靶分析物的高效扩增的引物混合物(参见图3)。
多重RT-PCR：RNA模板+/-背景DNA
通过使用在DNA模板实验中建立的引物浓度，对10000个拷贝的RNA靶的初始RT-PCR显示了多种靶分析物(包括MS20、RSV-A、Para3、Para4、hMPV、AdV和RhV)的无效扩增。调整RT步骤的持续时间(20min对30min)和温度(40℃对45℃对50℃对55℃对60℃)的最优化实验并未引起更高效的靶模板扩增，如通过PAGE分析判断的。因此，制造商推荐的在50℃进行20min用于所有随后的反转录步骤。
其中对引物混合物中的引物对浓度进行调整以及针对MS2和RSV对引物/探针组合进行重新设计的实验鉴定了有助于除RhV外的所有靶分析物的可见扩增(通过聚丙烯酰胺凝胶电泳)的引物混合物(参见图4)。
无RNA酶背景HeLa染色体DNA的随后添加(至约2500个细胞等同物/反应的终浓度)未显示改变扩增结果，如通过PAGE分析判断的(参见下图5)。
实施例9
不对称RT-PCR
为了最优化在固相RT-PCR过程中PCR产物至珠粒上的加载，小心地滴定引物以将一定水平的不对称性引入靶分析物的扩增。具体地，对于每一个分析物，将未标记引物(与探针寡核苷酸的链同义的)系列减少至当与标记引物相比较时超过50倍摩尔浓度的缺乏。所得的不对称扩增结果预期使得过量的新生链(可用于随后成功的利用探针寡核苷酸的引发)积累。事实上，在大多数情况下，随着未标记引物的量减少，观察到更加高效的至珠粒上的加载。然而，提供PCR产物至关联珠粒上最佳加载的未标记引物：标记引物的摩尔比分别地在1∶1至1∶6的范围内(参见下文表5)。
表5
指导靶分析物的RT-PCR扩增后高效的基于珠粒的检测的引物浓度
*AlexaFluor647-标记引物
实施例10
分析物检测灵敏度
在扩增和检测已知量的合成对照构建体后，使用建立的RTIplots阈值确定初步分析物检测敏感度。使用1×Sheath缓冲液进行洗涤(X6)。对下列拷贝的合成构建体成功地进行了明确的估计(参见表6)：
表6
确认的分析物检测灵敏度
分析物 检测的拷贝
甲型流感病毒 400
乙型流感病毒 400
H1N1 400
H5N1 2000
RSV(A&B) 2000
副流感病毒1型 2000
副流感病毒2型 2000
副流感病毒3型 5000
副流感病毒4型 2000
hMPV 2000
AdV 2000
RhV 10000
百日咳博德特氏菌 400
肺炎衣原体 2000
肺炎支原体 400
实施例11
RSV-A对RSV-B的检测灵敏度
分析RSV(RSV-A和RSV-B)检测灵敏度的初步数据包括使用C18与C19对照构建体的等摩尔浓度混合物(关于序列参见图1)作为靶模板。因此，为了获得RSV-A和RSV-B的独立检测敏感度数据，使用根据本发明的多重测定独立地评估已知拷贝的任一构建体。该测定允许在使用RTIplots软件(对于RSV，使用400的阈值设置)分析后，成功地检测125个拷贝的RSV-A构建体(C18)和250个拷贝的RSV-B构建体(C19)。
实施例12
临床数据
以盲法方式对富集的一组72个归档样品(表7)进行测定的初步评价，对于所述样品记录了通过从细胞培养物分离病毒产生的数据。将样品作为核酸或作为在测定前需要再提取的临床样本于-80℃贮存。该研究的发现的概述示于图6中。应当指出，来自3个样品的病毒培养物数据表明了共感染；从而样品的总数(72)相当于62个分析物阳性样品+13个分析物阴性样品-3并减去了(以除去共感染的样品)。
简而言之，数据表明测定与分析物阳性样品的细胞培养物数据(不包括来自分析的不确定的RTIplex结果)有95％的一致性。此外，在13个对于其不能分离病毒和/或在培养后不能鉴定病毒的样品中，所述测定能够检测这些样品中的7个(54％)内的病原体。此外，从这72个临床样本，该测定检测到总共24个先前未能通过细胞培养技术报导的分析物。这些另外鉴定的分析物中有许多分析物已通过基于PCR的方法(在Department of MolecularMicrobiology，Royal Women’s Hospital，Melbourne，Victoria，Australia进行的)得到确认。
表7
对归档的临床样本的细胞培养数据分析
NT＝未测试的
MM＝Department of Molecular Microbiology,Royal Womens Hosptial,Melbourne,Victoria，Australia
IND＝不确定的
Na＝不适用的
Hu IC＝人内部对照
实施例13
用于测定法的寡核苷酸引物和探针
表8提供了用于呼吸道病原体的测定法和试剂盒的引物和捕获探针列表。至少两个引物对和对应的探针被用于试剂盒中。″至少两个″意指2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个。
本领域技术人员将理解，除本文中明确描述的方面外，本文中描述的方法的方面易于变化和变动。应理解，这些方面包括所有这样的变化和变动。这些方面还包括本说明书中单个地或一起地提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中任意两个或更多个的任意和全部组合。
参考书目
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Claims (35)

1.一种对样品筛查多种呼吸道病原体以检测特定病原体的方法，其中所述样品是工业样品，或者是冰、岩石、热液喷口和空气；或者是来自卫生保健环境、工业环境或实验室环境的样品，
所述方法包括：
(a)从所述样品分离核酸，所述核酸推定包含来自一种或多种呼吸道病原体的核酸；
(b)对所述核酸进行固相扩增，其中所述扩增采用包含SEQ ID NO：1的正向引物和SEQID NO：17的对应反向引物的含水引物对，以及固定在珠粒盘中的珠粒上的SEQ ID NO：37所示的相应寡核苷酸探针；其中所述含水引物对指导来自呼吸道病原体的核酸的区域的扩增，并且其中所述含水引物对的至少一个成员包含在扩增后被掺入所得扩增子内的第一光学可检测标记；其中
通过与固定至珠粒盘中的珠粒上、与扩增子的区域互补的所述寡核苷酸探针杂交来捕获所述扩增子；
所述珠粒盘具有珠粒亚组，每一个亚组在珠粒尺寸和任选地第二光学可检测标记的强度上是均质的，从而基于尺寸和/或第二光学可检测标记的强度产生异质珠粒盘，并且其中亚组的数目对应于待筛查的呼吸道病原体的数目；
(c)基于所述第一光学可检测标记的强度确定扩增子已结合于哪个珠粒，并且当扩增子结合于多个亚组的珠粒时，基于珠粒尺寸和任选地基于第二光学可检测标记的强度区分所述多个亚组的珠粒；
其中扩增子对特定亚组的珠粒的结合指示样品中存在特定呼吸道病原体。
2.权利要求1的方法，其中扩增中还采用包含选自SEQ ID NO：2至16或33或35中的正向引物和选自SEQ ID NO：18至32或34或36中的对应反向引物的含水引物对，以及选自SEQ IDNO：38至54的相应寡核苷酸探针；或者扩增中还采用选自表8所列的SEQ ID NO：74至141所示序列中2个或更多个序列的引物对和对应探针；其中所述引物对指导来自呼吸道病原体的核酸的区域的扩增，引物对的数目基于期望被筛选的病原体数目来选择，并且其中所述引物对的至少一个成员包含在扩增后被掺入所得扩增子内的第一光学可检测标记。
3.权利要求1的方法，其中由包含第一光学可检测标记的引物的延伸起始的扩增子用作模板，用于包含第二光学可检测标记的寡核苷酸的杂交和延伸，其中将所述寡核苷酸固定于珠粒盘中的珠粒上。
4.权利要求2的方法，其中包括基于第二光学可检测标记的强度区分多个亚组的珠粒。
5.权利要求1的方法，其中所述第一和第二光学可检测标记是荧光团，所述荧光团选自羟基香豆素、氨基香豆素、甲氧基香豆素、瀑布蓝、萤光黄、NBD、藻红蛋白、PerCP、别藻蓝蛋白、烟酸己可碱33342、DAPl、SYTOX蓝、烟酸己可碱33258、色霉素A3、光辉霉素、YOYO-I、SYTOX绿、SYTOX橙、7-AAD、吖啶橙、TOTO-1、To-PRO-I、噻唑桔、TOTO-3、TO-PRO-3、LDS 751、Alexa Fluor染料、BoDipy染料、CY染料、6-FAM、PE-Cy5、PE-Cy7、荧光素dT、六氯荧光素、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,T-二甲氧基荧光素、Oregon绿染料、罗丹明染料、TRITC3四甲基罗丹明、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、四氯荧光素(TET)、Red 6B5FluorX、BODIPY-FL和德克萨斯红。
6.权利要求5的方法，其中所述Alexa Fluor染料选自Alexa Fluro-350、-430、-488、-532、-546、-555、-556、-594、-633、-647、-660、-680、-700和-750，所述BoDipy染料选自BoDipy 630/650和BoDipy 650/665，所述Cy染料选自Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy 5.5和Cy7，所述Oregon绿染料选自488-X和514，以及所述罗丹明染料选自X-罗丹明、丽丝胺罗丹明B、罗丹明绿、罗丹明红和ROX。
7.权利要求6的方法，其中所述第一光学可检测标记为AlexaFluor-647。
8.权利要求5－7中任一项的方法，其中所述第二光学可检测标记是BoDipy-TMR。
9.权利要求8的方法，其中所述第二光学可检测标记连接于寡核苷酸探针。
10.权利要求9的方法，其中所述第二光学可检测标记通过寡核苷酸探针的内部胸苷残基的氨基C6修饰连接于所述寡核苷酸探针。
11.权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸探针是半巢式寡核苷酸。
12.权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸探针通过硫氢基或甲基丙烯酰连键共价连接于珠粒。
13.权利要求1的方法，其中每一个亚组内的珠粒的尺寸选自直径3.0μm、3.5μm、3.8μm、4.1μm、5.0μm、5.2μm和5.7μm。
14.权利要求1的方法，其中所述来自卫生保健环境的样品是获自医院设备或卫生保健人员衣服，或者所述来自工业环境的样品是获自制造设施、制药设施或酿酒厂，或者所述来自实验室环境的样品是获自实验室培养物或实验室仪器。
15.权利要求1的方法，其中所述来自卫生保健环境的样品是获自外科设备，或者所述来自工业环境的样品是获自葡萄酒酿造厂，或者所述来自实验室环境的样品是获自发酵罐。
16.权利要求1的方法，其中所述来自实验室环境的样品是获自实验室实验台。
17.包含SEQ ID NO：1的正向引物和SEQ ID NO：17的对应反向引物的引物对以及SEQID NO：37的寡核苷酸探针的组合在制备用于对样品筛查呼吸道病原体以检测特定病原体的制剂中的用途，其中所述筛查包括：
(a)从所述样品分离核酸，所述核酸推定包含来自一种或多种呼吸道病原体的核酸；
(b)对所述核酸进行固相扩增，其中所述扩增采用包含SEQ ID NO：1的正向引物和SEQID NO：17的对应反向引物的含水引物对以及固定至珠粒盘中的珠粒上的SEQ ID NO：37所示相应寡核苷酸探针；其中含水引物对指导来自呼吸道病原体的核酸的区域的扩增，并且其中所述引物对的至少一个成员包含在扩增后被掺入所得扩增子内的第一光学可检测标记；其中
通过与和扩增子的区域互补的所述寡核苷酸探针杂交来捕获所述扩增子；
所述珠粒盘具有珠粒亚组，每一个亚组在珠粒尺寸和任选地第二光学可检测标记的强度上是均质的，从而基于尺寸和/或第二光学可检测标记的强度产生异质珠粒盘，并且其中亚组的数目对应于待筛查的呼吸道病原体的数目；
(c)基于所述第一光学可检测标记的强度确定扩增子已结合于哪个珠粒，并且当扩增子结合于多个亚组的珠粒时，基于珠粒尺寸和任选地基于第二光学可检测标记的强度区分所述多个亚组的珠粒；
其中扩增子对特定亚组的珠粒的结合指示样品中存在特定呼吸道病原体。
18.权利要求17的用途，其中还组合了选自SEQ ID NO：2至16或33或35中的正向引物和选自SEQ ID NO：18至32或34或36中的对应反向引物的含水引物对以及固定至珠粒盘中的珠粒上的选自SEQ ID NO：38至54的寡核苷酸探针的组，或者组合了选自表8所列的SEQ IDNO：74至141所示序列中2个或更多个序列的引物对和对应探针的组合，所述制剂可用于对样品筛查多种呼吸道病原体以检测特定病原体，其中所述筛查包括：
在步骤(b)的固相扩增中还采用包含选自SEQ ID NO：2至16或33或35中的正向引物和选自SEQ ID NO：18至32或34或36中的对应反向引物的含水引物对以及选自SEQ ID NO：38至54的寡核苷酸探针，或者还采用选自表8所列的SEQ ID NO：74至141所示序列中2个或更多个序列的引物对和对应探针，对所述核酸进行固相扩增；其中含水引物对指导来自呼吸道病原体的核酸的区域的扩增，引物对的数目基于期望被筛查的病原体的数目来选择，并且其中所述含水引物对的至少一个成员包含在扩增后被掺入所得扩增子内的第一光学可检测标记；其中
通过与固定至珠粒盘中的珠粒上的、与扩增子的区域互补的所述寡核苷酸探针杂交来捕获所述扩增子；
所述珠粒盘具有珠粒亚组，每一个亚组在珠粒尺寸和任选地第二光学可检测标记的强度上是均质的，从而基于尺寸和/或第二光学可检测标记的强度产生异质珠粒盘，并且其中亚组的数目对应于待筛查的呼吸道病原体的数目；
步骤(c)中，基于所述第一光学可检测标记的强度确定扩增子已结合于哪个珠粒，并且当扩增子结合于多个亚组的珠粒时，基于珠粒尺寸和任选地基于第二光学可检测标记的强度区分所述多个亚组的珠粒；
其中扩增子对特定亚组的珠粒的结合指示样品中存在特定呼吸道病原体。
19.权利要求17的用途，其中由包含第一光学可检测标记的引物的延伸起始的扩增子用作模板，用于包含第二光学可检测标记的寡核苷酸的杂交和延伸，其中将所述寡核苷酸固定于珠粒盘中的珠粒。
20.权利要求17的用途，其中包括基于第二光学可检测标记的强度区分多个亚组的珠粒。
21.权利要求17的用途，其中所述第一和第二光学可检测标记是荧光团，所述荧光团选自羟基香豆素、氨基香豆素、甲氧基香豆素、瀑布蓝、萤光黄、NBD、藻红蛋白、PerCP、别藻蓝蛋白、烟酸己可碱33342、DAPl、SYTOX蓝、烟酸己可碱33258、色霉素A3、光辉霉素、YOYO-I、SYTOX绿、SYTOX橙、7-AAD、吖啶橙、TOTO-1、To-PRO-I、噻唑桔、TOTO-3、TO-PRO-3、LDS 751、Alexa Fluor染料、BoDipy染料、CY染料、6-FAM、PE-Cy5、PE-Cy7、荧光素dT；六氯荧光素、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,T-二甲氧基荧光素、Oregon绿染料、罗丹明染料、TRITC3四甲基罗丹明、羧基四甲基罗丹明、四氯荧光素、Red 6B5FluorX、BODIPY-FL和德克萨斯红。
22.权利要求21的用途，其中所述Alexa Fluor染料选自Alexa Fluro-350、-430、-488、-532、-546、-555、-556、-594、-633、-647、-660、-680、-700和-750，所述BoDipy染料选自BoDipy 630/650和BoDipy 650/665，所述Cy染料选自Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy 5.5和Cy7，所述Oregon绿染料选自488-X和514，以及所述罗丹明染料选自X-罗丹明、丽丝胺罗丹明B、罗丹明绿、罗丹明红和ROX。
23.权利要求22的用途，其中所述第一光学可检测标记为AlexaFluor-647。
24.权利要求21－23中任一项的用途，其中所述第二光学可检测标记是BoDipy-TMR。
25.权利要求24的用途，其中所述第二光学可检测标记连接于寡核苷酸探针。
26.权利要求25的用途，其中所述第二光学可检测标记通过寡核苷酸探针的内部胸苷残基的氨基C6修饰连接于所述寡核苷酸探针。
27.权利要求17的用途，其中所述寡核苷酸探针是半巢式寡核苷酸。
28.权利要求17的用途，其中所述寡核苷酸探针通过硫氢基或甲基丙烯酰连键共价连接于珠粒。
29.权利要求17的用途，其中每一个亚组内的珠粒的尺寸选自直径3.0μm、3.5μm、3.8μm、4.1μm、5.0μm、5.2μm和5.7μm。
30.权利要求17的用途，其中所述样品选自下述组中：生物样品，工业样品，或者来自卫生保健环境、工业环境或实验室环境的样品。
31.权利要求30的用途，其中所述来自卫生保健环境的样品获自医院，或者所述来自工业环境的样品是获自制造设施、制药设施或酿酒厂，或者所述来自实验室环境的样品是获自实验室培养物或实验室仪器。
32.权利要求30的用途，其中所述来自工业环境的样品是获自葡萄酒酿造厂，或者所述来自实验室环境的样品是获自发酵罐。
33.权利要求30的用途，其中所述来自实验室环境的样品是获自实验室实验台。
34.权利要求31的用途，其中所述获自医院的样品是来自医院设备或卫生保健人员衣服。
35.权利要求31的用途，其中所述获自医院的样品是来自外科设备。
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