CN103773884B - 用于检测肺炎衣原体98KDa MOMP基因的引物组和探针及其应用 - Google Patents

用于检测肺炎衣原体98KDa MOMP基因的引物组和探针及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了用于检测肺炎衣原体98KDa？MOMP基因的引物组和探针及其应用。该引物组和探针由具有SEQ？ID？NO:1所示核苷酸序列的上游引物、具有SEQ？ID？NO:2所示核苷酸序列的下游引物和具有SEQ？ID？NO:3所示核苷酸序列的探针组成。本发明提供的引物组和探针能够特异性与肺炎衣原体98KDa？MOMP基因相结合，在采用实时荧光定量PCR检测肺炎衣原体98KDa基因时，显著提高了检测的特异性和灵敏度，能够应用于制备检测肺炎衣原体98KDa？MOMP基因的试剂。

Description

用于检测肺炎衣原体98KDa MOMP基因的引物组和探针及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及用于检测肺炎衣原体98KDaMOMP基因的引物组和探针及其应用。
背景技术
肺炎衣原体（Chlamydiapneumoniae，CP）是一种严格真核细胞内寄生的原核细胞微生物，与鹦鹉热嗜衣原体、流产嗜衣原体、豚鼠嗜衣原体、猫嗜衣原体、兽类嗜衣原体共同组成嗜衣原体属。首株肺炎衣原体是于1965年从台湾省一名儿童的眼部用鸡胚分离出的，暂名为TW-183T（小T示原型株），1983年又从西雅图一名患咽炎的大学生咽部分离出一株AR-39，因其一些生物学性状类似于鹦鹉热衣原体，所以当时被归于鹦鹉热衣原体种中TWAR组，后经深入研究，根据其独特的超微结构及基因和特异性抗原分析，于1989年被定为衣原体属中一个新种，定名为肺炎衣原体，后来根据2004年公布的伯杰氏细菌分类学手册，已被更名为肺炎嗜衣原体。
肺炎衣原体基因组大小约1.2Mbp、由21个Pmp基因、一个III型分泌毒力因子系统基因、3个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因和2个磷脂酶-D样蛋白基因组成。其染色体DNAG+Cmol%含量为40%，但与沙眼衣原体和鹦鹉热衣原体的同源性小于10%，限制性内切酶图谱极不相同。世界不同地区分离得到的肺炎衣原体不同株DNA的同源性可达94%以上，限制性内切酶图谱基本一致，标准株为TW-183和AR-39。肺炎衣原体只有一个血清型，代表株为TWAR。肺炎衣原体具有属特异性抗原和种特异性抗原，属特异性抗原主要有两个抗原决定簇表位，一个是肺炎衣原体LPS核心多糖的第三个KDO残基，一个是分子量为39.5KDa的主要外膜蛋白（MOMP），这两个抗原决定簇均对甲醇敏感，与其它衣原体种间存在交叉；肺炎衣原体的种特异性抗原为98KDa的主要外膜蛋白（MOMP），该抗原对丙酮敏感，并不与沙眼衣原体和鹦鹉热衣原体抗血清发生交叉反应。
肺炎衣原体的感染极为普遍，无显著的性别和地区差异，一年四季均可发生，主要引起人类的呼吸道感染和非典型性肺炎，与人口密度呈正相关，临床上多以隐性、持续性感染的形式存在，其反复迁延导致难以治疗的并发症。研究发现肺炎衣原体与哮喘、支气管炎、慢性阻塞性肺疾病、动脉粥样硬化、心肌梗塞、冠心病等心脑血管疾病的发生和发展密切相关。肺炎衣原体的感染率随着年龄的增加迅速上升，儿童感染率在20%左右，青壮年感染率可达50-60%，老年的感染率为70-80%。肺炎衣原体通过呼吸道分泌物进行人与人传播，在家庭、学校、军队以及其他人口集中的工作区域可存在小范围的流行。目前，肺炎衣原体已是继肺炎链球菌和流感嗜血杆菌之后引起社区获得性肺炎(communityacquiredpneumonia，CAP)的主要病原体，肺炎衣原体急性感染率占23%，肺炎病人仅占感染者的小部分，70-90%为亚临床表现。肺炎衣原体感染的潜伏期为15-23天，可引起上呼吸道感染，如鼻窦炎、中耳炎和咽炎，也可引起下呼吸道感染，如支气管炎和肺炎。呼吸道感染多数表现为咽痛、发热、咳嗽，病情通常较轻，有自限性。老年肺炎衣原体肺炎病人症状可能较为严重，有时甚至致死，尤其是在合并细菌性感染或存在慢性阻塞性肺疾病时，其致死几率大大增加。因此，肺炎衣原体感染早期诊断对于尽早发现和治疗肺炎衣原体感染性疾病非常重要。
目前对肺炎衣原体的实验室诊断方法主要有病原体分离培养技术、血清学诊断技术和核酸检测技术等方法。因为肺炎衣原体是一种极难培养的衣原体，其抵抗力较弱，对室温或冰冻敏感，难以从临床标本中分离培养成功，传代也比较困难，所以不适合采用病原体分离培养技术进行诊断。目前临床上常用的肺炎衣原体的检测方法主要是检测特异性抗体的方法。由于病原体进入机体进行复制、抗原刺激到产生抗体需要一定时间，导致这种方法仍不能满足早期病原体确诊的需要，进而不能满足进行早期积极治疗的临床需求。
实时荧光定量PCR技术是近些年来迅速发展起来的一种核酸检测技术。实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。因为实时荧光定量PCR技术的检测物为致病病原体基因核酸，所以能够准确检测处于疾病各个时期的病原体。目前实时荧光定量PCR所使用的荧光化学可以分为两种：荧光探针和荧光染料。由于Taqman探针具有特异性强、准确性高、对引物及试剂要求不高等优点，使该类型的荧光探针常用于实时荧光定量PCR。为了实现将实时荧光定量PCR技术应用于肺炎衣原体的检测，很有必要提供一种特异性高、准确性高的肺炎衣原体核酸检测试剂盒。
发明内容
有鉴于此，本发明的发明目的在于提供一种用于检测肺炎衣原体98KDaMOMP基因的引物组和探针及其应用。该引物组和探针能够特异性与肺炎衣原体98KDaMOMP基因相结合，在采用实时荧光定量PCR检测肺炎衣原体98KDaMOMP基因时，显著提高了检测的特异性和灵敏度，能够应用于制备检测肺炎衣原体98KDaMOMP基因的试剂。
为了实现本发明的发明目的，本发明采用如下的技术方案：
本发明提供了一种用于检测肺炎衣原体98KDaMOMP基因的引物组和探针，其由具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列的上游引物、具有SEQIDNO:2所示核苷酸序列的下游引物和具有SEQIDNO:3所示核苷酸序列的探针组成。
本发明提供的引物组和探针是根据肺炎衣原体的种特异性抗原所对应的基因的保守区域，即98KDaMOMP基因的保守区域，设计的。首先使用PrimerPremier5.0软件手动涉及出多组上游引物序列、下游引物序列和探针序列，之后将每组序列导入PrimerExprssV3软件中，分析引物和探针共同参与反应时的参数是否符合要求，最终获得三组引物和三条探针。通过引物和探针筛选试验，确定了最佳的引物组和探针的组合。实验数据证实，本发明提供的引物组和探针能够特异性与肺炎衣原体98KDaMOMP基因相结合，能够应用于检测肺炎衣原体98KDaMOMP基因。
优选地，本发明提供的引物组和探针中的探针为TaqMan探针。
更为优选地，本发明提供的引物组和探针中的TaqMan探针的5’端标记的荧光基团为6-FAM（6-羧基荧光素）、TET（四氯-6-羧基荧光素）、HEX（六氯-6-甲基荧光素）或JOE（2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素）。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的引物组和探针中TaqMan探针的5’端标记的荧光基团为6-FAM。
优选地，本发明提供的引物组和探针中的TaqMan探针的3’端标记的淬灭基团为MGB（MinerGrooveBinder）或BHQ1（BlackHoleQuencher1）。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的引物组和探针中的TaqMan探针的5’端标记6-FAM、3’端标记MGB。
本发明还提供了一种引物组和探针在制备检测肺炎衣原体98KDaMOMP基因的试剂中的应用，该引物组和探针由具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列的上游引物、具有SEQIDNO:2所示核苷酸序列的下游引物和具有SEQIDNO:3所示核苷酸序列的探针组成。
本发明还提供了一种检测肺炎衣原体98KDaMOMP基因的试剂盒，其包括引物组和探针，该引物组和探针由具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列的上游引物、具有SEQIDNO:2所示核苷酸序列的下游引物和具有SEQIDNO:3所示核苷酸序列的探针组成。
本发明提供的试剂盒中包括本发明提供的引物组和探针，实验数据表明，本发明提供的试剂盒能够显著提高肺炎衣原体检测的特异性和灵敏度，并且具有较低的检出限。本发明提供的试剂盒中还包括尿嘧啶DNA糖基化酶，实验数据表明本发明提供的试剂盒能够有效防止待测样品、检测试剂、扩增体系中肺炎衣原体核酸或其98KDaMOMP基因的污染，降低假阳性率。
优选地，本发明提供的试剂盒还包括dNTP/dUTP混合溶液、尿嘧啶DNA糖基化酶和TaqDNA聚合酶，其中该dNTP由dATP、dCTP和dGTP按照物质的量比为1:1:1组成。
由于肺炎衣原体的感染极为普遍，导致在肺炎衣原体核酸检测时容易造成待测生物样品、检测所用试剂、扩增体系被污染，进而使检测结果出现假阳性。本发明提供的试剂盒中的dNTP/dUTP混合溶液和尿嘧啶DNA糖基化酶，形成了dUTP-尿嘧啶DNA糖基化酶防污染体系。尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG酶，也称为UDG酶）的作用机理为：在PCR反应中以dUTP代替dTTP，扩增产物片段中的dT全部被dU取代，形成了含dU碱基的PCR扩增产物。UDG酶能选择性断裂单链和双链DNA中dU碱基的糖苷键，降解反应体系中含U的DNA，有效消除PCR产物的残留污染，大大降低扩增产物污染产生的假阳性，从而保证扩增的特异性和准确性。实验数据表明，本发明提供的试剂盒能够有效防止肺炎衣原体核酸及其扩增产物的污染，降低肺炎衣原体核酸检测时的假阳性率。
优选地，本发明提供的试剂盒中具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列的上游引物的浓度为50nmol/L～200nmol/L。
在本发明提供的一些实施例中，本发明提供的试剂盒中具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列的上游引物的浓度为100nmol/L。
优选地，本发明提供的试剂盒中具有SEQIDNO:2所示核苷酸序列的下游引物的浓度为50nmol/L～200nmol/L。
在本发明提供的一些实施例中，本发明提供的试剂盒中具有SEQIDNO:2所示核苷酸序列的下游引物的浓度为100nmol/L。
优选地，本发明提供的试剂盒中具有SEQIDNO:3所示核苷酸序列的探针的浓度为50nmol/L～200nmol/L。
在本发明提供的一些实施例中，本发明提供的试剂盒中具有SEQIDNO:3所示核苷酸序列的探针的浓度为50nmol/L。
优选地，本发明提供的试剂盒中dNTP/dUTP混合溶液的浓度为0.01μmol/L～300μmol/L；其中，dNTP由dATP、dCTP和dGTP按照物质的量比为1:1:1组成；dNTP与dUTP的物质的量比为3:2。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的试剂盒中dNTP/dUTP混合溶液的浓度为200μmol/L，其中dNTP由dATP、dCTP和dGTP按照物质的量比为1:1:1组成；dNTP与dUTP的物质的量比为3:2。
优选地，本发明提供的试剂盒中的尿嘧啶DNA糖基化酶和TaqDNA聚合酶的酶活力比为1:1～100。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的试剂盒中尿嘧啶DNA糖基化酶与TaqDNA聚合酶的酶活力比为1:10。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的试剂盒，由CPPCR反应液A、CPPCR反应液B、样本处理液、阳性对照和阴性对照组成；
其中CPPCR反应液A由如下组分组成：
阳性对照为CP重组质粒，CP重组质粒的浓度为104Copies/μL，溶液为TE；
阴性对照为TE溶液，由10mmol/L的Tris-Hcl和1mmol/L的EDTA组成，pH为8.0。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的试剂盒由CPPCR反应液A、CPPCR反应液B、样本处理液、阳性对照和阴性对照组成；
其中CPPCR反应液A由如下组分组成：
阳性对照为CP重组质粒，CP重组质粒的浓度为104Copies/μL，溶液为TE;
阴性对照为TE溶液，由10mmol/L的Tris-Hcl和1mmol/L的EDTA组成，pH为8.0。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的试剂盒由CPPCR反应液A、CPPCR反应液B、样本处理液、阳性对照和阴性对照组成，当采用本发明提供的试剂盒检测临床样本时，从样本的收集、核酸的提取、反应液的配制、程序的运行到得出结果，可以在4个小时内完成，有利于临床样本的快速检测。处理临床样本所需的主要试剂均来源于本发明提供的试剂盒中，操作流程少，简便易行，消耗费用低。而且本发明提供的试剂盒中含有dUTP-UDG酶防污染体系，在使用实时荧光定量PCR时，采用全封闭式的检测，能有效避免PCR产物对环境污染，更有利于肺炎衣原体核酸检测在检测肺炎衣原体中的应用和推广。
本发明还提供了一种非诊断目的的检测肺炎衣原体98KDaMOMP基因的方法，包括以下步骤：
步骤1：制备扩增体系，该扩增体系包括生物样品、具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列的上游引物、具有SEQIDNO:2所示核苷酸序列的下游引物、具有SEQIDNO:3所示核苷酸序列的TaqMan探针、TaqDNA聚合酶；
步骤2：具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列的上游引物、具有SEQIDNO:2所示核苷酸序列的下游引物和具有SEQIDNO:3所示核苷酸序列的TaqMan探针与肺炎衣原体98KDaMOMP基因片段结合；
步骤3：TaqDNA聚合酶以肺炎衣原体98KDaMOMP基因片段为模板，延伸核苷酸序列至具有SEQIDNO:3所示核苷酸序列的TaqMan探针结合部位，TaqDNA聚合酶水解具有SEQIDNO:3所示核苷酸序列的TaqMan探针的5’端核苷酸残基后，释放荧光报告基团，产生荧光；
步骤4：重复步骤2和步骤330次～40次，收集荧光；
步骤5：转化步骤4所得荧光为荧光信号，以循环数-荧光信号的变化量的对数作图得扩增曲线后，根据荧光阈值得Ct值；
步骤6：比较步骤5所得Ct值和对照品Ct值，判断生物样品中肺炎衣原体98KDaMOMP基因的含量。
优选地，本发明提供的非诊断目的的检测肺炎衣原体98KDaMOMP基因的方法中步骤1之后步骤2之前还包括：
用尿嘧啶DNA糖基化酶预处理步骤1中的扩增体系。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的非诊断目的的检测肺炎衣原体98KDaMOMP基因的方法，包括以下步骤：
步骤1：制备扩增体系，该扩增体系包括生物样品、具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列的上游引物、具有SEQIDNO:2所示核苷酸序列的下游引物、具有SEQIDNO:3所示核苷酸序列的TaqMan探针、TaqDNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基化酶；
步骤2：用尿嘧啶DNA糖基化酶预处理步骤1所得扩增体系；
步骤3：具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列的上游引物、具有SEQIDNO:2所示核苷酸序列的下游引物和具有SEQIDNO:3所示核苷酸序列的TaqMan探针与肺炎衣原体98KDaMOMP基因片段结合；
步骤4：TaqDNA聚合酶以肺炎衣原体98KDaMOMP基因片段为模板，延伸核苷酸序列至具有SEQIDNO:3所示核苷酸序列的TaqMan探针结合部位，TaqDNA聚合酶水解具有SEQIDNO:3所示核苷酸序列的TaqMan探针的5’端核苷酸残基后，释放荧光报告基团，产生荧光；
步骤5：重复步骤3和步骤430～40次，收集荧光；
步骤6：将步骤5所得荧光转化为荧光信号，以循环数-荧光信号的变化量的对数作图，得扩增曲线，根据荧光阈值，得Ct值；
步骤7：将步骤6所得Ct值和对照品Ct值相比较，判断生物样品中肺炎衣原体98KDaMOMP基因的含量。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的非诊断目的的检测肺炎衣原体98KDaMOMP基因的方法具体为采用实时荧光定量PCR检测肺炎衣原体98KDaMOMP基因。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的实时荧光定量PCR方法的反应程序为：
50℃2min；
95℃10min;
95℃15s之后64℃1min为一个循环，40个循环。
本发明提供了一种用于检测肺炎衣原体98KDaMOMP基因的引物组和探针及其应用。该引物组和探针由具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列的上游引物、具有SEQIDNO:2所示核苷酸序列的下游引物和具有SEQIDNO:3所示核苷酸序列的探针组成。实验结果表明，本发明提供的引物组和探针能够特异性与肺炎衣原体98KDaMOMP基因相结合，在采用实时荧光定量PCR检测肺炎衣原体98KDa基因时，显著提高了检测的特异性和灵敏度，能够应用于制备检测肺炎衣原体98KDaMOMP基因的试剂。
附图说明
图1示实施例1中第一组引物和探针扩增所得扩增曲线；
图2示实施例1中第二组引物和探针扩增所得扩增曲线；
图3示实施例1中第三组引物和探针扩增所得扩增曲线；
图4示实施例1中第四组引物和探针扩增所得扩增曲线；
图5示实施例1中第五组引物和探针扩增所得扩增曲线；
图6示实施例2中所得CP质粒的1%琼脂糖凝胶电泳，CP为CP质粒，M为DNA分子Marker；
图7示实施例2中所得CP质粒稀释效果检测所得扩增曲线，扩增曲线1的模板为107Copies/μLCP质粒；扩增曲线2的模板为106Copies/μLCP质粒；扩增曲线3的模板为105Copies/μLCP质粒；扩增曲线4的模板为104Copies/μLCP质粒；扩增曲线5的模板为103Copies/μLCP质粒；扩增曲线6的模板为102Copies/μLCP质粒；
图8示实施例9所得扩增曲线；
图9示实施例10所得扩增曲线；
图10示实施例11所得扩增曲线；
图11示实施例12中实验组1中扩增体系1所得扩增曲线；
图12示实施例12中实验组1中扩增体系2所得扩增曲线；
图13示实施例12中实验组1中扩增体系3所得扩增曲线；
图14示实施例12中实验组1中扩增体系4所得扩增曲线；
图15示实施例12中实验组1中扩增体系5所得扩增曲线；
图16示实施例12中实验组1中扩增体系6所得扩增曲线；
图17示实施例12中实验组1中扩增体系7所得扩增曲线；
图18示实施例12中实验组1中扩增体系8所得扩增曲线；
图19示实施例12中实验组1中扩增体系9所得扩增曲线；
图20示实施例12中实验组1中扩增体系10所得扩增曲线；
图21示实施例12中实验组2中扩增体系1’所得扩增曲线；
图22示实施例12中实验组2中扩增体系2’所得扩增曲线;
图23示实施例12中实验组2中扩增体系3’所得扩增曲线;
图24示实施例12中实验组2中扩增体系4’所得扩增曲线;
图25示实施例12中实验组2中扩增体系5’所得扩增曲线;
图26示实施例12中实验组2中扩增体系6’所得扩增曲线;
图27示实施例12中实验组2中扩增体系7’所得扩增曲线;
图28示实施例12中实验组2中扩增体系8’所得扩增曲线;
图29示实施例12中实验组2中扩增体系9’所得扩增曲线;
图30示实施例12中实验组2中扩增体系10’所得扩增曲线;
图31示实施例13实验组1所得扩增曲线；
图32示实施例13实验组2所得扩增曲线；
图33示实施例13实验组3所得的扩增曲线；
图34示实施例13对比组1所得扩增曲线；
图35示实施例13对比组2所得的扩增曲线；
图36示实施例13对比组3所得扩增曲线；
图37示实施例14实验组A所得扩增曲线，三条扩增曲线分别为实验组A三个平行所得的扩增曲线；
图38示实施例14实验组B所得扩增曲线，三条扩增曲线分别为实验组B三个平行所得的扩增曲线；
图39示实施例14对比组A所得扩增曲线，三条扩增曲线分别为对比组A三个平行所得的扩曲线；
图40示实施例14对比组B所得扩增曲线，三条扩增曲线分别为对比组B三个平行所得的扩曲线；
图41示实施例15中本发明实施例8制得的试剂盒所得扩增曲线；
图42示实施例15中对比试剂盒所得扩增曲线；
图43示实施例15中本发明实施例8制得的试剂盒再次检测所得扩增曲线；
图44示实施例15中对比试剂盒再次检测所得扩增曲线；
图45示实施例16中实验组和对照组的扩增曲线，扩增曲线1为对照组所得的扩增曲线；扩增曲线2为实验组所得的扩增曲线；
图46示实施例17中临床样品咽拭子的扩增曲线；
图47示实施例17中临床样品痰液的扩增曲线；
图48示实施例17中临床样品呼吸道吸液的扩增曲线。
具体实施方式
本发明公开了用于检测肺炎衣原体98KDaMOMP基因的引物组和探针及其应用。本领域技术人员可以参考本文内容，获得该引物组和探针实现其应用，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的制备方法已经通过较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的用于检测肺炎衣原体98KDaMOMP基因的引物组和探针及其应用中所用到的试剂和原料均可由市场购得。
为了使本技术领域的技术人员能够更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1引物和探针的筛选
1、引物、探针的设计：
利用NCBI数据库收集肺炎衣原体的98KDa主要外膜蛋白（MOMP）基因序列，使用生物软件BioEdit进行分析比对，找出其中保守性强且满足检测序列长度、以及其他引物、探针设计要求的保守区域，作为检测靶序列。根据引物探针设计的原则，使用PrimerPremier5.0软件人工手动设计基本满足要求的多组上下游引物和探针序列，然后分别将每组序列导入PrimerExprssV3软件中，分析引物和探针共同参与反应时的参数是否符合要求，如温度，GC%含量等参数，如不适合则需要重新设计引物或探针。通过多次引物探针设计和筛选，最终获得了具有较高特异性的三对引物和三条探针，委托英潍捷基公司合成符合要求的引物和探针序列，其中每条探针的5’端标记荧光基团6-FAM作为发光基团，3’端标记MGB作为淬灭基团。三对引物分别命名为引物组1、引物组2和引物组3；三条探针分别命名为CP-P、CP-p1和CP-p2。引物探针的序列见表1。
表1引物和探针的序列
2、引物探针筛选实验
采用引物探针筛选实验来进一步筛选出合适的引物和探针组合。实验方法为实时荧光定量PCR检测方法。考察指标为扩增曲线是否为典型的“S”型和荧光信号强度。实验设五组：第一组至第五组，分别为不同的引物和探针组合，引物和探针组合情况见表2。
表2不同组别引物和探针组合
组别 引物和探针组合
第一组 引物：引物组1；探针：CP-P
第二组 引物：引物组1；探针：CP-p1
第三组 引物：引物组2；探针：CP-P
第四组 引物：引物组2；探针：CP-p1
第五组 引物：引物组3；探针：CP-p2
实时荧光定量PCR检测方法流程：
（1）模板来源及处理
以CP质粒作为模板，该CP质粒中含有肺炎衣原体98KDaMOMP基因，肺炎衣原体98KDaMOMP基因为具有SEQIDNO:10所示的核苷酸序列。
该CP质粒的制备方法为：接种并扩大培养包含CP质粒的大肠杆菌甘油菌（该菌株购买于北京博迈德科技发展有限公司），使用质粒小量提取试剂盒（厂家:Axygen,货号：AP-MN-P-50）提取纯化其中的质粒DNA，核酸定量仪（厂家：Eppdorf，型号：BiophotometerPlus）定量并稀释质粒DNA。具体制备方法如下：
①在生物安全柜中，接种含有基因的大肠杆菌甘油菌20μL至5mL液体LB培养基中（含有1‰的氨苄抗生素），37℃，200转/min振荡培养过夜（不超过16小时）。
②收集菌液后使用质粒小量提取试剂盒提取和纯化质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳检测质粒提取效果，经检测，成功提取出了CP质粒。
③取5μL质粒DNA用灭菌超纯水10倍稀释后，使用核酸定量仪测定提取的质粒DNA浓度。
④根据双链DNA浓度与拷贝数计算公式计算出每毫升质粒DNA的拷贝数：
拷贝数（Copies/mL）=6.02×1023×C/（660×M）
其中：C—质粒DNA浓度（g/mL），M—质粒DNA的分子量。
将所得CP质粒进行稀释，调节浓度至104Copies/μL，以104Copies/μL的CP质粒作为模板。
（2）反应体系配制及反应参数
每个反应体系为30μL，每个反应的反应体系见表3，反应参数见表4；
表3实时荧光定量PCR反应体系
组分 终浓度
10×PCR Buffer 1×
MgCl2 4.8mmol/L
dNTP/dUTP Mixture 200μmol/L
BSA 1mg/mL
引物1 100nmol/L
引物2 100nmol/L
探针 50nmol/L
Taq DNA酶 0.033U/μL
UDG酶 0.0033U/μL
模板 2.0μL
灭菌超纯水 至30μL
表4实时荧光定量PCR反应参数
引物探针的筛选结果，见图1至图5。图1至图5分别为引物和探针组合第一组到第五组所对应的扩增曲线，分析、对比扩增曲线可知，所有组别都能收集到荧光信号，说明本发明提供的引物都能够特异性与肺炎衣原体98KDaMOMP基因结合；第一组所得的扩增曲线呈现典型的S型曲线，说明引物组1与探针CP-P作为组合应用于实时荧光定量PCR检测时，效果最好。故选择具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的CP-F作为上游引物、具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列的CP-R作为下游引物和具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列的CP-P作为探针用于肺炎衣原体98KDaMOMP基因的检测。
实施例2试剂盒的制备
本实施例的试剂盒由以下组分组成：样本处理液、CPPCR反应液A、CPPCR反应液B、CP阳性对照和CP阴性对照。为了避免交叉污染，上述组分分别在不同的工作区间进行配制，其中样本处理液、CPPCR反应液A、CPPCR反应液B和CP阴性对照在阴性区进行配制；CP阳性对照在阳性区进行配制。各个组分的制备方法如下：
样本处理液：样本处理液配制使用的试剂级别均为分析纯，称取所需重量后，加灭菌超纯水配制成一定的终浓度，所得的样本处理液中Tris-HCl(pH8.0)100mmol/L；EDTA(pH8.0)10mmol/L；NaCl1mol/L；NP-4010mg/mL（乙基苯基聚乙二醇）；SDS10mg/mL。
CPPCR反应液A：CPPCR反应液A由PCRBuffer，MgCl2，dNTPMixture（dATP、dCTP、dGTP和dTTP混合溶液），BSA，上游引物CP-F，下游引物CP-R和探针CP-P组成。其中10×PCRBuffer、MgCl2和dNTPMixture均购买于宝生物工程（大连）有限公司；BSA购买于Sigma；上游引物CP-F具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，由英潍捷基公司合成；下游引物CP-R具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，英潍捷基公司合成；探针CP-P具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，其5’端标记荧光基团6-FAM作为发光基团，3’端标记MGB作为淬灭基团，英潍捷基公司合成。根据需求取所需量，加灭菌超纯水混合均匀后，即得。所得CPPCR反应液A中PCRBuffer为1×工作浓度；MgCl2为10mmol/L；dNTPMixture200μmol/L；BSA10mg/mL；上游引物CP-F200nmol/L；下游引物CP-R200nmol/L；探针CP-P200nmol/L，所得CPPCR反应液A低温保存。
CPPCR反应液B：CPPCR反应液B由TaqDNA聚合酶组成。其中TaqDNA聚合酶购买自宝生物工程（大连）有限公司，其酶活力为5U/μL。根据实际需求，取一定体积分装，TaqDNA聚合酶为5U/μL，所得CPPCR反应液B低温保存。
CP阴性对照：由Tris-Hcl和EDTA组成，其中Tris-Hcl的浓度为10mmol/L，EDTA的浓度为1mmol/L，调节pH为8.0。
CP阳性对照：CP质粒，该质粒中含有肺炎衣原体98KDaMOMP基因，浓度为104Copies/μL。该CP质粒的制备方法为：
接种并扩大培养包含CP质粒的大肠杆菌甘油菌（该菌株购买于北京博迈德科技发展有限公司），使用质粒小量提取试剂盒（厂家:Axygen,货号：AP-MN-P-50）提取纯化其中的质粒DNA，核酸定量仪（厂家：Eppdorf，型号：BiophotometerPlus）定量并稀释质粒DNA。具体制备方法如下：
①在生物安全柜中，接种含有基因的大肠杆菌甘油菌20μL至5mL液体LB培养基中（含有1‰的氨苄抗生素），37℃，200转/mim振荡培养过夜（不超过16小时）。
②收集菌液后使用质粒小量提取试剂盒提取和纯化质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳检测质粒提取效果。
③取5μL质粒DNA用灭菌超纯水10倍稀释后，使用核酸定量仪测定提取的质粒DNA浓度。
④根据双链DNA浓度与拷贝数计算公式计算出每毫升质粒DNA的拷贝数：
拷贝数（Copies/mL）=6.02×1023×C/（660×M）
其中：C—质粒DNA浓度（g/mL），M—质粒DNA的分子量。
⑤根据计算的质粒DNA拷贝数，取一定体积的原始浓度质粒DNA用TE溶液稀释至体积为50μL、科学计数法系数为1的同数量级浓度质粒，然后依次取10μL上一数量级的质粒溶液梯度稀释至10Copies/μL，每个浓度体积均为100μL，质粒拷贝数及稀释液体积见表5。
表5本实施例制得的CP质粒DNA梯度稀释表
质粒鉴定方法：通过三种方法对质粒进行鉴定，具体为：
①琼脂糖凝胶电泳：配制1%的琼脂糖凝胶，上样5μL对提取的CP质粒进行电泳检测，参数条件为120V电压，电泳10min后取出琼脂糖凝胶使用凝胶成像系统进行显示，检测结果如图6所示。通过电泳可知提取的质粒大小位于2000-3000bp之间，与理论值2700-3000bp相吻合。
②基因测序：取提取的质粒20μL送至英潍捷基公司，委托其进行质粒测序，所用引物为M13通用引物，测序结果使用Bioedit软件与肺炎衣原体基因原始序列进行对比分析，结果显示构建的CP质粒中含有检测序列，即含有肺炎衣原体98KDaMOMP基因，肺炎衣原体98KDaMOMP基因具有SEQIDNO:10所示的核苷酸序列。
③质粒稀释效果检测：取上述制备的CP质粒10-107Copies/μL7个浓度的质粒用作模板，用肺炎衣原体试剂盒进行荧光PCR反应，检测肺炎衣原体质粒稀释的效果。检测结果如图7所示，由图中扩增曲线可知，浓度为10Copies/μL的CP质粒未见扩增曲线，其余各浓度质粒扩增曲线呈现明显的S型，且具有很强的梯度效果，表明质粒的稀释效果较好。
按照市场需求，将所得样本处理液、CPPCR反应液A、CPPCR反应液B、CP阳性对照和CP阴性对照分装至包装材料中，贴内标签，低温保存。
实施例3试剂盒的制备
本实施例的试剂盒由以下组分组成：样本处理液、CPPCR反应液A、CPPCR反应液B、CP阳性对照和CP阴性对照。为了避免交叉污染，上述组分分别在不同的工作区间进行配制，其中样本处理液、CPPCR反应液A、CPPCR反应液B和CP阴性对照在阴性区进行配制；CP阳性对照在阳性区进行配制。各个组分的制备方法如下：
样本处理液：样本处理液配制使用的试剂级别均为分析纯，称取所需重量后，加灭菌超纯水配制成一定的终浓度，所得的样本处理液中Tris-HCl(pH8.0)100mmol/L；EDTA(pH8.0)10mmol/L；NaCl1mmol/L；NP-4010mg/mL；SDS10mg/mL。
CPPCR反应液A：CPPCR反应液A由PCRBuffer，MgCl2，dNTPMixture（dATP、dCTP、dGTP和dTTP混合溶液），BSA，上游引物CP-F，下游引物CP-R和探针CP-P组成。其中10×PCRBuffer、MgCl2和dNTPMixture均购买于宝生物工程（大连）有限公司；BSA购买于Sigma；上游引物CP-F具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，由英潍捷基公司合成；下游引物CP-R具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，英潍捷基公司合成；探针CP-P具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，其5’端标记荧光基团6-FAM作为发光基团，3’端标记MGB作为淬灭基团，英潍捷基公司合成。根据需求取所需量，加灭菌超纯水混合均匀后，即得。所得CPPCR反应液A中PCRBuffer为1×工作浓度；MgCl2为10mmol/L；dNTPMixture200μmol/L；BSA10mg/mL；上游引物CP-F50nmol/L；下游引物CP-R50nmol/L；探针CP-P50nmol/L，所得CPPCR反应液A低温保存。
CPPCR反应液B：CPPCR反应液B由TaqDNA聚合酶组成。其中TaqDNA聚合酶购买自宝生物工程（大连）有限公司，其酶活力为5U/μL。根据实际需求，取用一定体积分装，TaqDNA聚合酶为5U/μL，所得CPPCR反应液B低温保存。
CP阴性对照：由Tris-Hcl和EDTA组成，其中Tris-Hcl的浓度为10mmol/L，EDTA的浓度为1mmol/L，调节pH为8.0。
CP阳性对照：CP质粒，浓度为104Copies/μL。制备方法如实施例2所提供的CP质粒的制备方法。
按照市场需求，将所得样本处理液、CPPCR反应液A、CPPCR反应液B、CP阳性对照和CP阴性对照分装至包装材料中，贴内标签，低温保存。
实施例4试剂盒的制备
本实施例的试剂盒由以下组分组成：样本处理液、CPPCR反应液A、CPPCR反应液B、CP阳性对照和CP阴性对照。为了避免交叉污染，上述组分分别在不同的工作区间进行配制，其中样本处理液、CPPCR反应液A、CPPCR反应液B和CP阴性对照在阴性区进行配制；CP阳性对照在阳性区进行配制。各个组分的制备方法如下：
样本处理液：样本处理液配制使用的试剂级别均为分析纯，称取所需重量后，加灭菌超纯水配制成一定的终浓度，所得的样本处理液中Tris-HCl(pH8.0)100mmol/L；EDTA(pH8.0)10mmol/L；NaCl1mmol/L；NP-4010mg/mL；SDS10mg/mL。
CPPCR反应液A：CPPCR反应液A由PCRBuffer，MgCl2，dNTPMixture（dATP、dCTP、dGTP和dTTP混合溶液），BSA，上游引物CP-F，下游引物CP-R和探针CP-P组成。其中10×PCRBuffer、MgCl2和dNTPMixture均购买于宝生物工程（大连）有限公司；BSA购买于Sigma；上游引物CP-F具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，由英潍捷基公司合成；下游引物CP-R具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，英潍捷基公司合成；探针CP-P具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，其5’端标记荧光基团6-FAM作为发光基团，3’端标记MGB作为淬灭基团，英潍捷基公司合成。根据需求取所需量，加灭菌超纯水混合均匀后，即得。所得CPPCR反应液A中PCRBuffer为1×工作浓度；MgCl2为10mmol/L；dNTPMixture200μmol/L；BSA10mg/mL；上游引物CP-F100nmol/L；下游引物CP-R100nmol/L；探针CP-P100nmol/L，所得CPPCR反应液A低温保存。
CPPCR反应液B：CPPCR反应液B由TaqDNA聚合酶组成。其中TaqDNA聚合酶购买自宝生物工程（大连）有限公司，该TaqDNA聚合酶的酶活力为5U/μL。根据实际需求，取用一定体积分装，TaqDNA聚合酶为5U/μL，所得CPPCR反应液B低温保存。
CP阴性对照：由Tris-Hcl和EDTA组成，其中Tris-Hcl的浓度为10mmol/L，EDTA的浓度为1mmol/L，调节pH为8.0。
CP阳性对照：CP质粒，浓度为104Copies/μL。制备方法如实施例2所提供的CP质粒的制备方法。
按照市场需求，将所得样本处理液、CPPCR反应液A、CPPCR反应液B、CP阳性对照和CP阴性对照分装至包装材料中，贴内标签，低温保存。
实施例5试剂盒的制备
本实施例提供的试剂盒由以下组分组成：样本处理液、CPPCR反应液A、CPPCR反应液B、CP阳性对照和CP阴性对照。为了避免污染，上述组分分别在不同的工作区间进行配制，其中样本处理液、CPPCR反应液A、CPPCR反应液B和CP阴性对照在阴性区进行配制；CP阳性对照在阳性区进行配制。各个组分的制备方法如下：
样本处理液：样本处理液配制所使用的试剂级别均为分析纯，称取所需重量后，加灭菌超纯水配制成一定的终浓度，即得。所得样本处理液中Tris-HCl(pH8.0)1mmol/L；EDTA(pH8.0)0.1mmol/L；NaCl0.01mol/L；NP-40（乙基苯基聚乙二醇）0.1mg/mL；SDS0.1mg/mL。
CPPCR反应液A：CPPCR反应液A由PCRBuffer，MgCl2，dNTP/dUTPMixture（dATP、dCTP、dGTP和dUTP混合溶液，dNTP由dATP、dCTP和dGTP按照物质的量比为1:1:1组成；dNTP与dUTP的物质的量比为3:2。），BSA，上游引物CP-F，下游引物CP-R和探针CP-P组成。其中10×PCRBuffer、MgCl2和dNTP/dUTPMixture均购买于宝生物工程（大连）有限公司；BSA购买于Sigma；上游引物CP-F具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，由英潍捷基公司合成；下游引物CP-R具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，英潍捷基公司合成；探针CP-P具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，其5’端标记荧光基团6-FAM作为发光基团，3’端标记BHQ1作为淬灭基团，英潍捷基公司合成。根据需求取所需量，加灭菌超纯水混合均匀后，即得。所得CPPCR反应液A中PCRBuffer为1×工作浓度；MgCl2为0.1mmol/L；dNTP/dUTPMixture0.01μmol/L；BSA0.1mg/mL；上游引物CP-F50nmol/L；下游引物CP-R50nmol/L；探针CP-P100nmol/L，所得CPPCR反应液A低温保存。
CPPCR反应液B：CPPCR反应液B由TaqDNA聚合酶、UDG酶组成。其中TaqDNA聚合酶5U/μL，购买自宝生物工程（大连）有限公司；UDG酶5U/μL，购买自NewEnglandBiolabs公司。根据实际需求，用灭菌超纯水分别将TaqDNA聚合酶稀释5倍，UDG酶稀释5倍，然后两者按照体积比为1:1进行混合，即得；所得CPPCR反应液B中TaqDNA聚合酶为0.5U/μL；UDG酶为0.5U/μL，所得CPPCR反应液B低温保存。
CP阴性对照：由Tris-Hcl和EDTA组成，其中Tris-Hcl的浓度为10mmol/L，EDTA的浓度为1mmol/L，调节pH为8.0。
CP阳性对照：CP质粒，含有肺炎衣原体98KDaMOMP基因的质粒，浓度为104Copies/μL。CP质粒的制备方法如实施例2提供的CP质粒的制备方法。
按照市场需求，将所得样本处理液、CPPCR反应液A、CPPCR反应液B、CP阳性对照和CP阴性对照分装至包装材料中，贴内标签，低温保存。
实施例6试剂盒的制备
本实施例的试剂盒由以下组分组成：样本处理液、CPPCR反应液A、CPPCR反应液B、CP阳性对照和CP阴性对照。为了避免交叉污染，上述组分分别在不同的工作区间进行配制，其中样本处理液、CPPCR反应液A、CPPCR反应液B和CP阴性对照在阴性区进行配制；CP阳性对照在阳性区进行配制。各个组分的制备方法如下：
样本处理液：样本处理液配制使用的试剂级别均为分析纯，称取所需重量后，加灭菌超纯水配制成一定的终浓度，所得的样本处理液中Tris-HCl(pH8.0)100mmol/L；EDTA(pH8.0)10mmol/L；NaCl1mol/L；NP-4010mg/mL；SDS10mg/mL。
CPPCR反应液A：CPPCR反应液A由PCRBuffer，MgCl2，dNTP/dUTPMixture（dATP、dCTP、dGTP和dUTP混合溶液），BSA，上游引物CP-F，下游引物CP-R和探针CP-P组成。其中10×PCRBuffer、MgCl2和dNTP/dUTPMixture均购买于宝生物工程（大连）有限公司；BSA购买于Sigma；上游引物CP-F具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，由英潍捷基公司合成；下游引物CP-R具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，英潍捷基公司合成；探针CP-P具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，其5’端标记荧光基团6-FAM作为发光基团，3’端标记MGB作为淬灭基团，英潍捷基公司合成。根据需求取所需量，加灭菌超纯水混合均匀后，即得。所得CPPCR反应液A中PCRBuffer为1×工作浓度；MgCl2为10mmol/L；dNTP/dUTPMixture300μmol/L；BSA10mg/mL；上游引物CP-F200nmol/L；下游引物CP-R200nmol/L；探针CP-P200nmol/L，所得CPPCR反应液A低温保存。
CPPCR反应液B：CPPCR反应液B由TaqDNA聚合酶、UDG酶组成。其中TaqDNA聚合酶5U/μL，购买自宝生物工程（大连）有限公司；UDG酶5U/μL，购买自NewEnglandBiolabs公司。根据实际需求，先将UDG酶用灭菌超纯水稀释10倍，然后按照体积比10:1取TaqDNA聚合酶原液与UDG酶稀释液进行混合，即得。所得CPPCR反应液B中TaqDNA聚合酶的酶活力为4.5U/μL，UDG酶的酶活力为0.045U/μL，所得CPPCR反应液B低温保存。
CP阴性对照：由Tris-Hcl和EDTA组成，其中Tris-Hcl的浓度为10mmol/L，EDTA的浓度为1mmol/L，调节pH为8.0。
CP阳性对照：CP质粒，浓度为104Copies/μL。制备方法如实施例2所提供的CP质粒的制备方法。
按照市场需求，将所得样本处理液、CPPCR反应液A、CPPCR反应液B、CP阳性对照和CP阴性对照分装至包装材料中，贴内标签，低温保存。
实施例7试剂盒的制备
本实施例的试剂盒由以下组分组成：样本处理液、CPPCR反应液A、CPPCR反应液B、CP阳性对照和CP阴性对照。为了避免交叉污染，上述组分分别在不同的工作区间进行配制，其中样本处理液、CPPCR反应液A、CPPCR反应液B和CP阴性对照在阴性区进行配制；CP阳性对照在阳性区进行配制。各个组分的制备方法如下：
样本处理液：样本处理液配制使用的试剂级别均为分析纯，称取所需重量后，加灭菌超纯水配制成一定的终浓度，其中Tris-HCl(pH8.0)10mmol/L；EDTA(pH8.0)1mmol/L；NaCl0.15mol/L；NP-401mg/mL；SDS1mg/mL。
CPPCR反应液A：CPPCR反应液A由PCRBuffer，MgCl2，dNTP/dUTPMixture（dATP、dCTP、dGTP和dUTP混合溶液），BSA，上游引物CP-F，下游引物CP-R和探针CP-P组成。其中10×PCRBuffer、MgCl2和dNTP/dUTPMixture均购买于宝生物工程（大连）有限公司；BSA购买于Sigma；上游引物CP-F具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，由英潍捷基公司合成；下游引物CP-R具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，英潍捷基公司合成；探针CP-P具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，其5’端标记荧光基团6-FAM作为发光基团，3’端标记MGB作为淬灭基团，英潍捷基公司合成。根据需求取所需量，加灭菌超纯水混合均匀后即得，所得CPPCR反应液A中PCRBuffer为1×工作浓度；MgCl2为4.8mmol/L；dNTP/dUTPMixture200μmol/L；BSA1mg/mL；上游引物CP-F100nmol/L；下游引物CP-R100nmol/L；探针CP-P100nmol/L，所得CPPCR反应液A低温保存。
CPPCR反应液B：CPPCR反应液B由TaqDNA聚合酶、UDG酶组成。其中TaqDNA聚合酶5U/μL，购买自宝生物工程（大连）有限公司；UDG酶5U/μL，购买自NewEnglandBiolabs公司。根据实际需求，用灭菌超纯水分别将TaqDNA聚合酶稀释2.5倍、UDG酶稀释25倍，然后两者按照体积比为1:1进行混合，即得；所得CPPCR反应液B中TaqDNA聚合酶为1U/μL；UDG酶为0.1U/μL，所得CPPCR反应液B低温保存。
CP阴性对照：由Tris-Hcl和EDTA组成，其中Tris-Hcl的浓度为10mmol/L，EDTA的浓度为1mmol/L，调节pH为8.0。
CP阳性对照：CP质粒，浓度为104Copies/μL。制备方法如实施例2所提供的CP质粒的制备方法。
按照市场需求，将所得样本处理液、CPPCR反应液A、CPPCR反应液B、CP阳性对照和CP阴性对照分装至包装材料中，贴内标签，低温保存。
实施例8试剂盒的制备
本实施例的试剂盒由以下组分组成：样本处理液、CPPCR反应液A、CPPCR反应液B、CP阳性对照和CP阴性对照。为了避免交叉污染，上述组分分别在不同的工作区间进行配制，其中样本处理液、CPPCR反应液A、CPPCR反应液B和CP阴性对照在阴性区进行配制；CP阳性对照在阳性区进行配制。各个组分的制备方法如下：
样本处理液：样本处理液配制使用的试剂级别均为分析纯，称取所需重量后，加灭菌超纯水配制成一定的终浓度，其中Tris-HCl(pH8.0)10mmol/L；EDTA(pH8.0)1mmol/L；NaCl0.15mol/L；NP-401mg/mL；SDS1mg/mL。
CPPCR反应液A：CPPCR反应液A由PCRBuffer，MgCl2，dNTP/dUTPMixture（dATP、dCTP、dGTP和dUTP混合溶液），BSA，上游引物CP-F，下游引物CP-R和探针CP-P组成。其中10×PCRBuffer、MgCl2和dNTP/dUTPMixture均购买于宝生物工程（大连）有限公司；BSA购买于Sigma；上游引物CP-F具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，由英潍捷基公司合成；下游引物CP-R具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，英潍捷基公司合成；探针CP-P具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，其5’端标记荧光基团6-FAM作为发光基团，3’端标记MGB作为淬灭基团，英潍捷基公司合成。根据需求取所需量，加灭菌超纯水混合均匀后即得，所得CPPCR反应液A中PCRBuffer为1×工作浓度；MgCl2为4.8mmol/L；dNTP/dUTPMixture200μmol/L；BSA1mg/mL；上游引物CP-F100nmol/L；下游引物CP-R100nmol/L；探针CP-P50nmol/L，所得CPPCR反应液A低温保存。
CPPCR反应液B：CPPCR反应液B由TaqDNA聚合酶、UDG酶组成。其中TaqDNA聚合酶的酶活力为5U/μL，购买自宝生物工程（大连）有限公司；UDG酶的酶活力为5U/μL，购买自NewEnglandBiolabs公司。根据实际需求，取TaqDNA聚合酶与UDG酶按照体积比10:1进行混合，即得，其中TaqDNA聚合酶的酶活力为4.5U/μL；UDG酶的酶活力为0.45U/μL，所得CPPCR反应液B低温保存。
CP阴性对照：由Tris-Hcl和EDTA组成，其中Tris-Hcl的浓度为10mmol/L，EDTA的浓度为1mmol/L，调节pH为8.0。
CP阳性对照：CP质粒，浓度为104Copies/μL。制备方法如实施例2所提供的CP质粒的制备方法。
按照市场需求，将所得样本处理液、CPPCR反应液A、CPPCR反应液B、CP阳性对照和CP阴性对照分装至包装材料中，贴内标签，低温保存。
实施例9试剂盒的使用
取实施例2制得的试剂盒，考察本发明提供的试剂盒在检测肺炎衣原体98KDaMOMP基因中的应用。
本发明提供的试剂盒适用于实时荧光定量PCR，该试剂盒适用于实时荧光定量PCR，使用时，以试剂盒中所带的CP阴性对照和CP阳性对照作为质控，根据扩增曲线定性判定检测结果。
质控结果判定必须符合下述条件：
CP阴性对照：阴性无扩增，结果为阴性。
CP阳性对照：结果为阳性，且在FAM荧光通道下的Ct值为25＜Ct≤29。
以上两项需在一次试验中同时满足，否则，本次实验无效，全部实验应重新进行。
样本检测结果判定：
FAM荧光通道下CP的结果判断：根据仪器的要求设置好基线和阈值后，仪器会自动分析并计算出每个样本的Ct值，其中扩增曲线呈现典型的“S”型且Ct≤37，则判断结果为CP阳性；无Ct值或Ct值为40，则判断结果为CP阴性；如37＜Ct值＜40之间，建议此样本重做，若重新检查Ct值＜40则判断为CP阳性，否则判断为CP阴性。
以实施例2提供的CP质粒的制备方法制备获得104Copies/μLCP质粒为模板，按照30μL的体系配制PCR反应混合液：其中CPPCR反应液A27.78μL，CPPCR反应液B0.22μL，模板2μL。按照下列反应条件进行反应：95℃10分钟1个循环；95℃15秒钟，64℃1分钟，40个循环，64℃收集FAM荧光信号，得出扩增曲线。所得扩增曲线见图8。该扩增曲线呈现标准的S型，且Ct≤37，检测结果为阳性，说明本发明实施例2提供的试剂盒能够检测出肺炎衣原体98KDaMOMP基因，可应用于肺炎衣原体核酸的检测。
实施例10试剂盒的使用
取实施例3制得的试剂盒，考察本发明提供的试剂盒在检测肺炎衣原体98KDaMOMP基因中的应用。
本发明提供的试剂盒适用于实时荧光定量PCR，该试剂盒适用于实时荧光定量PCR，使用时，以试剂盒中所带的CP阴性对照和CP阳性对照作为质控，根据扩增曲线定性判定检测结果。
质控结果判定和样本检测结果判定与实施例9的质控结果判定和样本检测结果判定相同。
以实施例3提供的CP质粒的制备方法制备获得104Copies/μLCP质粒为模板，按照30μL的体系配制PCR反应混合液：其中CPPCR反应液A27.78μL，CPPCR反应液B0.22μL，模板2μL。按照下列反应条件进行反应：95℃10分钟1个循环；95℃15秒钟，64℃1分钟，40个循环，64℃收集FAM荧光信号，得出扩增曲线。所得扩增曲线见图9。该扩增曲线呈现标准的S型，且Ct≤37，检测结果为阳性，说明本发明实施例3提供的试剂盒能够检测出肺炎衣原体98KDaMOMP基因，可应用于肺炎衣原体核酸的检测。
实施例11试剂盒的使用
取实施例4制得的试剂盒，考察本发明提供的试剂盒在检测肺炎衣原体98KDaMOMP基因中的应用。
本发明提供的试剂盒适用于实时荧光定量PCR，该试剂盒适用于实时荧光定量PCR，使用时，以试剂盒中所带的CP阴性对照和CP阳性对照作为质控，根据扩增曲线定性判定检测结果。
质控结果判定和样本检测结果判定与实施例9的质控结果判定和样本检测结果判断相同。
以实施例4提供的CP质粒的制备方法制备获得104Copies/μLCP质粒为模板，按照30μL的体系配制PCR反应混合液：其中CPPCR反应液A27.78μL，CPPCR反应液B0.22μL，模板2μL。按照下列反应条件进行反应：95℃10分钟1个循环；95℃15秒钟，64℃1分钟，40个循环，64℃收集FAM荧光信号，得出扩增曲线。所得扩增曲线见图10。该扩增曲线呈现标准的S型，且Ct≤37，检测结果为阳性，说明本发明实施例4提供的试剂盒能够检测出肺炎衣原体98KDaMOMP基因，可应用于肺炎衣原体核酸的检测。
实施例12试剂盒的使用和重现性验证实验
取实施例8制得的试剂盒，考察本发明提供的试剂盒在检测肺炎衣原体核酸中的应用，以及考察该试剂盒的重现性。
本发明提供的试剂盒适用于实时荧光定量PCR，该试剂盒适用于实时荧光定量PCR，使用时，以试剂盒中所带的CP阴性对照和CP阳性对照作为质控，根据扩增曲线定性判定检测结果。
质控结果必须符合下述条件：
CP阴性对照：阴性无扩增，结果为阴性。
CP阳性对照：结果为阳性，且在FAM荧光通道下的Ct值为25＜Ct≤29。
以上两项需在一次试验中同时满足，否则，本次实验无效，全部实验应重新进行。
样本检测结果判定：
FAM荧光通道下CP的结果判断：根据仪器的要求设置好基线和阈值后，仪器会自动分析并计算出每个样本的Ct值，其中扩增曲线呈现典型的“S”型且Ct≤37，则判断结果为CP阳性；无Ct值或Ct值为40，则判断结果为CP阴性；如37＜Ct值＜40之间，建议此样本重做，若重新检查Ct值＜40则判断为CP阳性，否则判断为CP阴性。
实验设两组，实验组1和实验组2，实验组1以104Copies/μLCP质粒作为模板；实验组2以102Copies/μLCP质粒作为模板。
（1）模板的来源
104Copies/μLCP质粒和102Copies/μLCP质粒按照实施例2提供的CP质粒的制备方法制备获得。
（2）反应体系配制及反应参数
实验组1设置10个扩增体系，分别标记为扩增体系1、扩增体系2、扩增体系3、扩增体系4、扩增体系5、扩增体系6、扩增体系7、扩增体系8、扩增体系9和扩增体系10，每个扩增体系都以2μL的104Copies/μLCP质粒为模板。实验组2也设置10个扩增体系，分别标记为扩增体系1’、扩增体系2’、扩增体系3’、扩增体系4’、扩增体系5’、扩增体系6’、扩增体系7’、扩增体系8’、扩增体系9’和扩增体系10’；每个扩增体系都以2μL的102Copies/μLCP质粒为模板。按照每个反应30μL的体系配制PCR反应混合液（每个反应中CPPCR反应液A27.78μL，CPPCR反应液B0.22μL），具体配制方法为：检测所需反应混合液体积为[27.78×（n+2）+0.22×(n+2)]μL，n为检测样本数，2为CP阴、阳对照；将反应混合液混合均匀并短暂离心后，分装至PCR反应管中，每管28μL；最后将反应管转至样本处理区，按照实验设置分别在每个PCR反应管中加入104Copies/μLCP质粒或102Copies/μLCP质粒，加入量为2μL，各重复10次，此时此处的n为20，另外两个扩增体系分别为CP阳性对照和CP阴性对照。
按照下列反应条件进行反应：50℃2分钟1个循环；95℃10分钟1个循环；95℃15秒钟，64℃1分钟，40个循环，64℃收集FAM荧光信号，得出扩增曲线。
（3）反应结果分析
实验组1的不同扩增体系所对应的扩增曲线见图11至图20，对比每一个扩增体系的扩增曲线可知，实验组1中所有扩增曲线都呈现标准的“S”型，且各个扩增体系的Ct值相似，平均值为27，各组别之间差异不显著。实验组2的的不同扩增体系所对应的扩增曲线见图21至图30，对比该组内每一个扩增体系的扩增曲线可知，实验组2中所有扩增曲线也都呈现标准的“S”型，且各个扩增体系的Ct值相似，平均值为35，各组别之间差异不显著。对比实验组1和实验组2的Ct值的平均值，可知实验组1中肺炎衣原体98KDaMOMP基因的含量大于实验组2中肺炎衣原体98KDaMOMP基因的含量，与实验组1样本浓度大于实验组2样本浓度的实际情况相一致。以上结果说明了实施例8提供的试剂盒具有良好的重现性，能够应用于检测肺炎衣原体98KDaMOMP基因，进而应用于肺炎衣原体核酸的检测。
采用相同的实验方法考察本发明实施例2至实施例7制备的试剂盒在检测肺炎衣原体核酸时的灵敏度和重现性，获得了相似的实验结果，说明本发明实施例2至实施例7制得的试剂盒具有良好的重现性，能够应用于检测肺炎衣原体核酸。
实施例13试剂盒特异性分析
取实施例8制得的试剂盒考察本发明提供的试剂盒的特异性，科研使用的同类试剂盒作为对比。该科研使用的同类试剂盒的信息为：试剂盒名称：肺炎衣原体（CP）核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）；试剂盒组成：DNA提取液1mL1支，PCR反应液20管，阴性参考品（100μL/管）1管，临界阳性参考品（50μL/管）1管。
对比试剂盒组成：
具体方法和操作如下：
（1）模板来源及处理
模板包括肺炎支原体MP标准株、结核分枝杆菌TB标准株、嗜肺军团菌LP标准株的纯培养物，均购自美国ATCC，菌株号分别为ATCC15531、ATCC25177、ATCC33152。使用麦氏比浊法测定上述菌株培养物的浓度，然后稀释至模板浓度1000个/mL，使用各自试剂盒中的样本处理液或DNA提取液，对培养物进行处理，提取DNA用于反应体系中的模板。
（2）反应体系配制及反应参数
①实施例8制得的试剂盒
取实施例8制得的试剂盒中的CP反应液A和CP反应液B，按照每个体系30μL配制PCR反应混合液，其中CP反应液A27.78μL,CP反应液B0.22μL，模板2μL。实验分三组，分别标记为实验组1、实验组2和实验组3，其中实验组1模板为肺炎支原体MP标准株的DNA提取物；实验组2模板为结核分枝杆菌TB标准株的DNA提取物；实验组3为嗜肺军团菌LP标准株的DNA提取物。
按照下列反应条件进行实时荧光定量PCR反应：50℃2分钟1个循环；95℃10分钟1个循环；95℃15秒钟，64℃1分钟，40个循环，64℃收集6-FAM荧光信号。以试剂盒中所带的CP阴性对照和CP阳性对照作为质控，根据扩增曲线定性判定结果。
②对比试剂盒
按照试剂盒中说明书内容进行体系配制和反应参数设置，加入处理后的DNA模板2μL，上机进行实时荧光定量PCR反应。对比实验分三组，分别标记为对比组1、对比组2和对比组3，其中对比组1模板为肺炎支原体MP标准株的DNA提取物；对比组2模板为结核分枝杆菌TB标准株的DNA提取物；对比组3模板为嗜肺军团菌LP标准株的DNA提取物。
（3）反应结果分析
不同组别的实时荧光定量PCR反应所得扩增曲线见图31至图36。其中图31至图33分别为实验组1至实验组3所得的扩增曲线，图34至图36分别为对比组1至对比组3所得的扩增曲线。由图31至图33可知，实施例8制得的试剂盒对三种特异性病原体DNA提取物均未检出，表明试剂盒具有很好的特异性，而对比试剂盒对特异性病原体肺炎支原体MP标准株DNA提取物产生一定的响应，处于该试剂盒的灰区，有待进一步验证，这说明对比试剂盒在不同特异性病原体之间存在一定的交叉。上述结果表明实施例8制得的试剂盒具有很高的特异性。
采用相同的实验方法对实施例2至实施例7制得的试剂盒进行特异性检测，得到类似的结果，说明实施例2至实施例7制得的试剂盒也具有很高的特异性。
实施例14试剂盒检出限测试实验
取实施例8制得的试剂盒考察本发明提供的试剂盒的检出限，科研使用的同类试剂盒作为对比。该科研使用的同类试剂盒的信息为：试剂盒名称：肺炎衣原体（CP）核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）；试剂盒组成：DNA提取液1mL1支，PCR反应液20管，阴性参考品（100μL/管）1管，临界阳性参考品（50μL/管）1管，该试剂盒的组成与实施例13记载的试剂盒的组成相同。
具体方法和操作如下：
（1）模板来源及处理
模板来源为肺炎衣原体标准株纯培养物，购自美国ATCC，菌株号为VR-2282。使用麦氏比浊法测定肺炎衣原体培养物的浓度，然后稀释至1×10个/mL（对比试剂盒的检出限）和0.5×10个/mL两个模板浓度，分别标记为CP培养物1和CP培养物2，使用各自试剂盒中的样本处理液或DNA提取液，对培养物进行处理，提取DNA用于反应体系中的模板。
（2）反应体系配制及反应参数
①实施例8制得的试剂盒
取实施例8制得的试剂盒中的CP反应液A和CP反应液B，按照每个体系30μL配制PCR反应混合液，其中CP反应液A27.78μL,CP反应液B0.22μL，模板2μL。实验分为两组，分别标记为实验组A、实验组B，其中实验组A模板为CP培养物1提取物，实验组B为CP培养物2提取物，每组三个平行。按照下列反应条件进行实时荧光定量PCR反应：50℃2分钟1个循环；95℃10分钟1个循环；95℃15秒钟，64℃1分钟，40个循环，64℃收集FAM荧光信号。以试剂盒中所带的CP阴性对照和CP阳性对照作为质控，根据扩增曲线判定结果。
②对比试剂盒
按照试剂盒中说明书内容进行体系配制和反应参数设置，加入处理后的DNA模板2μL，上机进行实时荧光定量PCR反应。对比实验分两组，分别标记为对比组A和对比组B，其中对比组A模板为CP培养物1提取物，对比组B为CP培养物2提取物，每组三个平行。
（3）反应结果分析
本实施例所得的不同组别的实时荧光定量PCR反应所得扩增曲线见图37至图40。图37为实验组A所得的扩增曲线，图38为实验组B所得的扩增曲线；图39为对比组A所得的扩增曲线，图40为对比组B所得的扩增曲线。从图37和图39可知，1×10个/mL模板浓度进行检测时，两种试剂盒均能很好的检出，显阳性；而对0.5×10个/mL模板进行检测时，本专发明提供的试剂盒的Ct值均小于37，根据试剂盒结果判定标准，本样品结果属于弱阳性样本，而对比商业科研试剂盒的检测循环数Ct值处于试剂盒检测范围的灰区38<Ct<40，也就是不能确定样本的阴、阳性，需要对样本重新检测再次判断。上述结果表明本发明实施例8制得的试剂盒具有很高的灵敏度，能够检测出较低浓度的模板，即本发明具有较低的检出限。
采用相同的实验方法对实施例2至实施例7制得的试剂盒进行检出限测试，得到类似的结果，说明实施例2至实施例7制得的试剂盒也具有较低的检出限。
实施例15试剂盒灵敏性实验
取实施例8制得的试剂盒考察本发明提供的试剂盒的灵敏性，商品化科研使用的同类试剂盒作为对比。该商品化科研使用的同类试剂盒的信息为：试剂盒名称：肺炎衣原体（CP）核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）；试剂盒组成：DNA提取液1mL1支，PCR反应液20管，阴性参考品（100μL/管）1管，临界阳性参考品（50μL/管）1管，该试剂盒的组成与实施例13记载的试剂盒的组成相同。
具体方法和操作如下：
（1）模板来源及处理
模板来源为肺炎衣原体标准株纯培养物，购自美国ATCC，菌株号为VR-2282。使用麦氏比浊法测定CP培养物的浓度，然后稀释至模板浓度0.5×10个/mL，使用各自试剂盒中的样本处理液或DNA提取液，对培养物进行处理，提取DNA用于反应体系中的模板。
（2）反应体系配制及反应参数
①实施例8制得的试剂盒
取实施例8制得的试剂盒中的CP反应液A和CP反应液B，按照每个体系30μL配制PCR反应混合液，其中CP反应液A27.78μL,CP反应液B0.22μL，模板2μL。按照下列反应条件进行实时荧光定量PCR反应：50℃2分钟1个循环；95℃10分钟1个循环；95℃15秒钟，64℃1分钟，40个循环，64℃收集FAM荧光信号。以试剂盒中所带的CP阴性对照和CP阳性对照作为质控，根据扩增曲线定性判定结果。
②对比试剂盒
按照试剂盒中说明书内容进行体系配制和反应参数设置，加入处理后的DNA模板2μL，上机进行实时荧光定量PCR反应。
（3）反应结果分析
对相同浓度的模板进行检测，不同组别的扩增曲线见图41、图42。图41为本发明实施例8制得的试剂盒对模板的扩增曲线；图42为对比试剂盒对模板的扩增曲线。由扩增曲线可知，实施例8制得的试剂盒的检测循环数Ct值为35，根据试剂盒结果判定标准，本样品结果属于弱阳性样本，而对比试剂盒的检测循环数Ct值为39，处于该试剂盒检测范围的灰区38<Ct<40，也就是不能确定样本的阴、阳性，需要对样本重新检测再次判断。本发明实施例8制得的试剂盒的再次检测结果与第一次相同，呈弱阳性，见图43；对比试剂盒再次测试结果见图44，对比试剂盒仍然不能确定样本的阴、阳性。上述结果表明本试剂盒具有很高的灵敏度。
采用相同的实验方法对实施例2至实施例7制得的试剂盒进行灵敏度测试，得到类似的结果，说明实施例2至实施例7制得的试剂盒也具有较高的灵敏度。
实施例16试剂盒防污染效果实验
取实施例8制得的试剂盒考察本发明提供的试剂盒的防污染能力。实验设计两组，实验组和对照组，其中，实验组以含有dU的扩增产物作为模板（扩增产物为dG、dC、dA和dU组成的核苷酸序列），对照组以不含dU的PCR扩增产物为模板（扩增产物为dA、dT、dG和dC组成的核苷酸序列）。
（1）模板来源
含dU的PCR扩增产物和不含dU的PCR扩增产物通过PCR扩增而获得。
含dU的扩增产物的制备方法：PCR体系：模板为本发明实施例2所提供的CP质粒，2μL；上游引物具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，终浓度为100nmol/L；下游引物具有SEQIDNO:2所示核苷酸序列，终浓度为100nmol/L；dATP、dGTP、dCTP和dUTP的摩尔比为1:1:1:1的混合溶液，终浓度为200μmol/L；10×PCRBuffer的终浓度为1×PCRBuffer；MgCl2，4.8mmol/L；BSA，1mg/mL；TaqDNA酶，1.0U；加水至30μL。PCR扩增条件为：95℃，10分钟，1个循环；95℃15秒钟，64℃，1分钟，40个循环；凝胶电泳，回收目的片段，即得。
不含dU的扩增产物的制备方法：PCR体系：模板为本发明实施例2所提供的CP质粒，2μL；上游引物具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，终浓度为100nmol/L；下游引物具有SEQIDNO:2所示核苷酸序列，终浓度为100nmol/L；dATP、dGTP、dCTP和dTTP的摩尔比为1:1:1:1的混合溶液，终浓度为200μmol/L；10×PCRBuffer的终浓度为1×PCRBuffer；MgCl2，4.8mmol/L；BSA，1mg/mL；TaqDNA酶，1.0U；加水至30μL。PCR扩增条件为：95℃，10分钟，1个循环；95℃15秒钟，64℃，1分钟，40个循环；凝胶电泳，回收目的片段，即得。
（2）反应体系配制及反应参数
实验组和对照组除了添加的模板不同外，其他组分相同，配制方法相同。取实施例8制得的试剂盒中的CP反应液A和CP反应液B，按照每个体系30μL配制PCR反应混合液，其中CP反应液A27.78μL,CP反应液B0.22μL，模板2μL。按照下列反应条件进行反应：50℃2分钟1个循环；95℃10分钟1个循环；95℃15秒钟，64℃1分钟，40个循环，64℃收集FAM荧光信号，得扩增曲线。
（3）结果分析
实验组和对照组的扩增曲线见图45。从图中可以得出：以含dU的扩增产物为模板的实验组无扩增，而以不含dU的扩增产物为模板的对照组有扩增。说明本发明实施例8制得的试剂盒能够有效降解扩增体系中含dU的序列，将其应用于检测肺炎衣原体核酸时，通过dUTP-UDG酶进行预处理，能够有效消除试剂或扩增体系中肺炎衣原体核酸PCR扩增产物的污染，提高试剂盒的防污染能力，降低了假阳性率。
采用相同的方法，考察本发明实施例5至实施例7制得的试剂盒的防污染能力，取得了类似的结果，说明实施例5至实施例7制得的试剂盒也能够有效消除试剂或扩增体系中肺炎衣原体核酸PCR扩增产物的污染，提高试剂盒的防污染能力，降低了假阳性率。
实施例17试剂盒应用于临床样本检测
取本发明实施例8制得的试剂盒，应用于临床样本的检测。
1.临床样本类型：咽拭子、呼吸道抽吸液和痰液。
2.临床样本收集
(1)咽拭子：
让患者仰头张口，用压舌板压舌，用无菌棉拭子在咽部涂抹数次取分泌物，放入干燥无菌样本管或含采样液的试管中，棉拭子接触手的部分应及时折断或剪断去掉，然后盖紧试管，密封立即送检。最佳采集时间为发病后3天内，一般不超过7天。
(2)呼吸道抽吸液：
将负压收集器头部从鼻孔或气管插口处插入气管（约30cm深处），注入5ml生理盐水，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的粘液，并用采样液涮洗收集器1次，洗液收集于无菌容器送检。
(3)痰液：
肺部感染时应采取痰标本，以清晨第一口痰为最佳。采取标本的时间一般在发病的第一日采集，最迟不得超过3日，清水反复漱口后用力咳痰，从呼吸道深部咳出新鲜痰液于无菌容器送检。
3.临床样本储存与运输
采集样本应立即送检，如当天不能检测时在2～8℃保存不应超过24小时，-20℃以下保存不超过3个月。应该避免反复冻融，冻存样本解冻后应充分混匀。采用冰壶加冰或泡沫箱密封进行运输。
4.临床样本检测前处理
(1)咽拭子：向样本管中加入1mL无菌生理盐水充分摇匀，挤干棉拭子，吸取全部液体至1.5mL灭菌离心管，或是取出全部收集液，12000rpm离心5min，弃上清液留沉淀。
(2)痰液或呼吸道抽吸液：向样本中加入4倍体积4%的NaOH溶液摇匀，室温放置30min左右，使其充分液化，用吸嘴混匀后吸取1mL液体至1.5mL灭菌离心管中，12000rpm离心5min，弃上清液留沉淀。
(3)取上述咽拭子沉淀、痰液沉淀、呼吸道抽吸液沉淀、分别加入50μL样本处理液，振荡混匀。100℃干浴或沸水浴10min，12000转/min离心10min备用。建议已处理的DNA样品于当天进行PCR检测，当天不能检测的样品应置于-20℃保存。
5.反应体系配制及反应参数
临床样品咽拭子、痰液和呼吸道抽吸液均来自同一名肺炎患者，该患者临床病症症状为：发热、咳嗽1周、咳痰、痰中带血，并伴有胸痛、呼吸困难；临床鉴定为肺炎患者。按照上述方法进行处理，作为反应体系的模板，备用。各个反应体系除了模板不同外，其他组分相同，配制方法相同。具体配制方法为：取实施例8制得的试剂盒中的CP反应液A和CP反应液B，按照每个体系30μL配制PCR反应混合液，其中CP反应液A27.78μL，CP反应液B0.22μL，模板2μL。按照下列反应条件进行反应：50℃2分钟1个循环；95℃10分钟1个循环；95℃15秒钟，64℃1分钟，40个循环，64℃收集FAM荧光信号，得扩增曲线。
6.结果分析
临床样本咽拭子的扩增曲线见图46；临床样本痰液的扩增曲线见图47；呼吸道抽吸液的扩增曲线见图48。从图中可以得出，三个样品检测结果均为阳性，与检测样本都含有肺炎衣原体的实际情况相符，且三者的Ct值与临床样品中所含有的肺炎衣原体核酸的量成正比与样品中（针对本实施例所收集到的样品，相同的处理条件下，此处所用到的临床样品中含肺炎衣原体的浓度大小为：咽拭子>痰液>呼吸道抽吸液），即采用本发明实施例8制得的试剂盒检测临床样本时，根据扩增曲线和Ct值能够准确检测出待测样品中肺炎衣原体，且Ct值的大小能够在一定程度上反映出待测临床样本中肺炎衣原体的含量。所以，本发明实施例8制得的试剂盒能够应用于临床样本检测。
采用相同的实验方法将本发明实施例2至实施例7制得的试剂盒应用于临床生物样本的检测，获得类似的结果，说明本发明实施例2至实施例7的制得的试剂盒能够应用于临床样本检测。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.用于检测肺炎衣原体98KDaMOMP基因的寡核苷酸组，其特征在于，由SEQIDNO:1所示核苷酸序列的上游引物、SEQIDNO:2所示核苷酸序列的下游引物和SEQIDNO:3所示核苷酸序列的探针组成。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸组，其特征在于，所述探针为TaqMan探针。
3.如权利要求1或2所述的寡核苷酸组在制备检测肺炎衣原体98KDaMOMP基因的试剂中的应用。
4.一种检测肺炎衣原体98KDaMOMP基因的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1或2所述的寡核苷酸组。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，其还包括dNTP/dUTP混合溶液、尿嘧啶DNA糖基化酶和TaqDNA聚合酶，其中所述dNTP由dATP、dCTP和dGTP按照物质的量比为1:1:1组成。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述SEQIDNO:1所示核苷酸序列的上游引物的浓度为50nmol/L～200nmol/L。
7.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述SEQIDNO:2所示核苷酸序列的下游引物的浓度为50nmol/L～200nmol/L。
8.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述SEQIDNO:3所示核苷酸序列的探针的浓度为50nmol/L～200nmol/L。
9.一种非诊断目的的检测肺炎衣原体98KDaMOMP基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：制备扩增体系，所述扩增体系包括生物样品、SEQIDNO:1所示核苷酸序列的上游引物、SEQIDNO:2所示核苷酸序列的下游引物、SEQIDNO:3所示核苷酸序列的TaqMan探针、TaqDNA聚合酶；
步骤2：所述SEQIDNO:1所示核苷酸序列的上游引物、所述SEQIDNO:2所示核苷酸序列的下游引物和所述SEQIDNO:3所示核苷酸序列的TaqMan探针与肺炎衣原体98KDaMOMP基因片段结合；
步骤3：所述TaqDNA聚合酶以所述肺炎衣原体98KDaMOMP基因片段为模板，延伸核苷酸序列至所述SEQIDNO:3所示核苷酸序列的TaqMan探针结合部位，所述TaqDNA聚合酶水解所述SEQIDNO:3所示核苷酸序列的TaqMan探针的5’端核苷酸残基后，释放荧光报告基团，产生荧光；
步骤4：重复所述步骤2和所述步骤3，重复30次～40次，收集所述荧光；
步骤5：转化所述荧光为荧光信号，以循环数-荧光信号的变化量的对数作图得扩增曲线后，根据荧光阈值得Ct值；
步骤6：比较所述Ct值和对照品Ct值，判断所述生物样品中肺炎衣原体98KDaMOMP基因的含量。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤1之后步骤2之前还包括：
用尿嘧啶DNA糖基化酶预处理所述扩增体系。
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