CN111394514B - 一种同时检测24种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒及方法 - Google Patents

一种同时检测24种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时检测24种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒及方法。试剂盒包括反应液I～V、阳性对照品、内标、阴性对照品等。反应液I～III包括呼吸道病原菌检测引物、dN(U)TP、UDG、PCR缓冲体系、RNA酶抑制剂，反应液IV包括DNA聚合酶，反应液V包括反转录酶、DNA聚合酶，阳性性对照品包括甲型流感病毒、冠状病毒OC43假病毒及肺炎支原体重组质粒，内标包括不含靶标基因的外源性片段假病毒，阴性对照品包括人基因组DNA，荧光检测液包括链霉亲和素偶联的量子点，变性剂包括碱液，中性剂包括酸液，膜条包括含偶联特异性检测探针的尼龙膜。本发明能快速、灵敏、特性检测24种常见呼吸道感染病原菌，并能有效监控假阴性的出现。

Description

一种同时检测24种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒及 方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种同时检测24种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒及方法。
背景技术
呼吸道感染（Respiratorytract infection，RTI）是人类最常见的一类疾病，可以在任何性别、年龄和地域中发生，是全球范围内引起人群发病和死亡的最主要原因之一。呼吸道感染引起的临床症状和体征都较为相似，其临床表现主要为鼻炎、咽炎、喉炎、扁桃体炎等症状，严重的可引起气管炎、支气管炎及肺炎等，但不同病原体引起的感染，其治疗方法、疗效和病程也不尽相同。目前已证明，大部分呼吸道疾病是由细菌外的病原体引起，其中以呼吸道病毒最常见。
呼吸道感染分为上呼吸道感染与下呼吸道感染。上呼吸道感染分为病毒性（70-80%）、细菌性（占20-25%）。急性上呼吸道感染：以急性鼻咽炎为主要表现的普通感冒、急性鼻窦炎、扁桃体炎、喉炎、咽炎、会厌炎等。急性下呼吸道感染：急性气管支气管炎、细支气管炎、肺炎，其中肺炎是5 岁以下儿童死亡的最主要原因。普通感冒（俗称伤风）通常由鼻病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒等引起，表现为打喷嚏、流鼻涕、咽痛，少数有乏力、低热等症状。而流行感冒是由流感病毒引起，有小流行或爆发，高热、全身肌肉酸痛、结膜炎等症状。
急性呼吸道感染是广泛分布于成年人和儿童的感染性疾病之一，具有相当高的发病率和死亡率。大部分急性上呼吸道疾病和下呼吸道疾病主要是由呼吸道病毒引起的。传统认为，引起呼吸道疾病的主要病毒病原体有流感病毒A 型(FluA) 和B 型(FluB)、人鼻病毒(HRV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV1、PIV2、PIV3、PIV4)、腺病毒(Adv) 等。然而，近十年来，新的呼吸道病毒不断被发现，人偏肺病毒(HMPV)、冠状病毒(NL63、HKU1、OC43、229E)、博卡(HBoV) 病毒等也成为呼吸道疾病的重要病原，给人类的健康构成很大的威胁。由于这些病毒引起的感染症状和流行症状相似，仅靠临床症状及常规检测方法进行病毒病原的确定是非常不可靠的，因此，迫切需要一种高灵敏度、高特异性的方法可以同时检测传统的和新兴出现的呼吸道病原体，为临床诊断提供实验室依据，预防院内感染。
现有技术中公开检测的呼吸道病原菌的种类不全，只包括部分常见的病毒或细菌或支原体或衣原体等，本发明提供一种能同时检测24种常见呼吸道感染的病毒及非典型性微生物的量子点基因芯片，具有高通量、高灵敏度、高特异性等特点。
发明内容
本发明的目的是针对常见的呼吸道感染病毒及非典型性微生物感染引起的鼻炎、咽炎、喉炎、扁桃体炎、气管炎、支气管炎及肺炎，开发出一种能同时检测24种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒及方法，为临床诊断提供实验室依据，预防院内感染。
为解决上述的问题，本发明采用以下技术方案：
一种同时检测24种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒，包括反应液I、反应液II、反应液III、反应液IV、反应液V、阳性对照品、内标、阴性对照品、荧光检测液、变性剂、中性剂及膜条；其中，所述的膜条包括尼龙膜及偶联在尼龙膜上的特异性捕获探针；所述的荧光检测液包括用于标记捕获探针的表面偶联有链霉亲和素的量子点；变性剂包括0.01N-1.5N的氢氧化钠溶液；中性剂包括0.01N-1.5N盐酸溶液；所述的阳性对照品包括甲型流感病毒、冠状病毒OC43假病毒及肺炎支原体重组质粒，所述的内标包括不含靶标基因的外源性片段假病毒，所述的阴性对照品包括人基因组DNA；所述的反应液IV包括DNA聚合酶；所述的反应液V包括反转录酶、DNA聚合酶，所述的反应液I、反应液II、反应液III分别包含以下检测引物：
反应液I包含以下检测引物：
引物MPF：CGGGTTAAAGGATCTACC ，即SEQ ID NO:1；
引物MPR： GTAAAAGACCTTGGCCTTG，即SEQ ID NO:2；
引物LPF：CGTTCTTAACAAGTTTCAG，即SEQ ID NO:3；
引物LPR：TCCGATTTACCGGGTTTAAC，即SEQ ID NO:4；
引物BOCF: GTATTCAGTCAACACAGAGC，即SEQ ID NO:5；
引物BOCR：GTTCTCTAGTGTTATCCCATC，即SEQ ID NO:6；
引物ADVF: CGCAGTGGKCWTACATGCAC，即SEQ ID NO:7；
引物ADVR1：CGCGGTCCACGGGGATAA，即SEQ ID NO:8；
引物ADVR2：AATGTCAAAGAACGTGCTG，即SEQ ID NO:9；
引物BOPF：GATTGCCCCTGAAGGCGAACC，即SEQ ID NO:10；
引物BOPR：CTGCCCGACATGAAGGCGGT，即SEQ ID NO:11；
引物CPF：CACAGTCCAAACCTAAAG，即SEQ ID NO:12；
引物CPR：GTTTAAAACAGCTGTAGGTAG，即SEQ ID NO:13；
引物ICF：TATGGTTGGGATAAGGCTGG，即SEQ ID NO:14；
引物ICR：CGAGCTTAGTGATACTTGTG，即SEQ ID NO:15；
反应液II包含以下检测引物：
引物IVBF: TCTTCACTGTTTATTATTCC，即SEQ ID NO:16；
引物IVBR: AAGCCTTACTACACAGGAG，即SEQ ID NO:17；
引物IVAF: TTCTTGTATAGTTTAACTGC，即SEQ ID NO:18；
引物IVA R：CTTCTAACCGAGGTCGAAACGTA，即SEQ ID NO:19；
引物H1N1F: CATTTCTTTCCATTGCGAATGC，即SEQ ID NO:20；
引物H1N1R：ATGGGGAATTCACCATCCATCTA，即SEQ ID NO:21；
引物H3N2F：TGGGATTACAGCTTGTTGGC，即SEQ ID NO:22；
引物H3N2R：AACAAGTTCTGCTTGTATAAG，即SEQ ID NO:23；
引物MERSF：CAGGAGCAAGATGAACTCT，即SEQ ID NO:24；
引物MERSR：GAGTGAAGCGAAGATTCTACAC，即SEQ ID NO:25；
引物RSVAF：CACTGCACTTCTTGAGTTTAT，即SEQ ID NO:26；
引物RSVAR：GACGATGACCCTGCATCACT，即SEQ ID NO:27；
引物RSVBF：TACTAGGCATTTGAGCCAGC，即SEQ ID NO:28；
引物RSVBR：CATATTGTTAGTGATGCGGGATC，即SEQ ID NO:29；
引物RHVF：CCTTAAACCTGCAGCCATTG，即SEQ ID NO:30；
引物RHVR：CTATATATTGTCACCATAAGC，即SEQ ID NO:31；
反应液III包含以下检测引物：
引物PIV1F：GCTATTACAGAACATGATTTC，即SEQ ID NO:32；
引物PIV1R：GTGTTAGACTACCTTCATTATC，即SEQ ID NO:33；
引物PIV2F：ATGATGGTATTCTGGTGCAC，即SEQ ID NO:34；
引物PIV2R：GCTTTAAAGGATATGCATACTGG，即SEQ ID NO:35；
引物PIV3F：GCTGTGCCAACTTGTAGATCTTG，即SEQ ID NO:36；
引物PIV3R：CAATCAGGCATCTCATAGTCC，即SEQ ID NO:37；
引物NL63F：GTTCTGATTCTAACCAGTCTTCT，即SEQ ID NO:38；
引物NL63R: CCCATATTGTGATTAAAATCAC，即SEQ ID NO:39；
引物OC43F：ATCTACTTCGCGCACATCC，即SEQ ID NO:40；
引物OC43R：TTCTTTGGCAGTATGCTTAG，即SEQ ID NO:41；
引物HKU1F：CAAGGCTATTATGTTGAAGG，即SEQ ID NO:42；
引物HKU1R：TTATGCCTAATTTCCTTGGC，即SEQ ID NO:43；
引物229EF：CACACTTCAATCAAAAGCTCCCA，即SEQ ID NO:44；
引物229ER：GATTTAAGAGCCGCAGCGACTG，即SEQ ID NO:45；
引物hMPVF：GATGTCTTCCTGTGCTGAC，即SEQ ID NO:46；
引物hMPVR：TCAGAATGCAGGGTCAAC，即SEQ ID NO:47。
优选的，上述的用于24种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒中，所述的特异性捕获探针包含：
探针MPP: TAGCGGGTACCATTACCATGG，即SEQ ID NO:48；
探针LPP：CCAAGTGGTTTGCAATAC，即SEQ ID NO:49；
探针BOCP：CTAGAGATGGTACTAATTCAATC，即SEQ ID NO:50；
探针ADVCP: GACGCTGCGGTTTATCCC，即SEQ ID NO:51；
探针ADVBP：CCGCGCCACAGACACCTAC，即SEQ ID NO:52；
探针ADVEP：CTACTTCAGTCTGGGGAAC，即SEQ ID NO:53；
探针BOPP：ATACAGCCCGGCTGACGT，即SEQ ID NO:54；
探针CPP：CGTTGCTTTCCCCTTGCC，即SEQ ID NO:55；
探针IVBP：CTTCTAGCTCACTCAAAGAATTG，即SEQ ID NO:56；
探针IVAP：CTTAGTCAGAGGTGACAAGATTGG，即SEQ ID NO:57；
探针H1N1P：CACTTTGGGTCTTATTGCTATT，即SEQ ID NO:58；
探针H3N2P：GATTTGGTCCTTGTCCGTA，即SEQ ID NO:59；
探针MERSP：CATTGTACAAAGATGTTGATAATCC，即SEQ ID NO:60；
探针RSVAP：CATTAGCTAGTTCTTTTATAAG，即SEQ ID NO:61；
探针RSVBP：GACTGGAACATGGGCACCC，即SEQ ID NO:62；
探针RHVP；CGTAATGAGCAATTGCGG，即SEQ ID NO:63；
探针PIV1P：CCTATATCTGCACATCCTTGA，即SEQ ID NO:64；
探针PIV2P：GGAGAGGTCCATATTTAGGCG，即SEQ ID NO:65；
探针PIV3P：CAATTTTGGAACTGAGTTCAAGCCC，即SEQ ID NO:66；
探针NL63P: TAATAAGCCTCTTTCTCAACCCAG，即SEQ ID NO:67；
探针OC43P：CTGGCAATAGAACCCCTACCT，即SEQ ID NO:68；
探针HKU1P: GACATTCAGATTCTATAGTAAAACC，即SEQ ID NO:69；
探针229EP：CTCCTTCCCGTTCTCAGTCAAG，即SEQ ID NO:70；
探针hMPVP：TCTCCTCTTGTTTCACAGTC，即SEQ ID NO:71。
优选的，上述的用于24种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒中，所述的膜条上还含有三条用于监控样本核酸提取及扩增的内控探针：
IC1P: GGAGAAGCTGTGCTACGTCG，即SEQ ID NO:72；
IC2P：GCAGCTACAATCCAGCTACCA，即SEQ ID NO:73；
IC3P：TTTGCTAATCATGTTCATACC，即SEQ ID NO:74。
优选的，上述的用于同时检测24种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒中，所述捕获探针为寡核苷酸单链DNA ，所述寡核苷酸单链DNA的3’端或5’端标记有氨基，所述寡核苷酸单链DNA与氨基间连接有间臂，所述间臂为脂肪酸碳链和oligo dT（n）中的一种或两种的组合，所述脂肪酸碳链的主链长度为1～12，所述oligo dT（n）中n为1～30的整数。
优选的，上述的用于同时检测24种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒中，所述检测引物中的反向引物5’端修饰有生物素标记，所述检测引物与生物素之间连接有间臂，所述间臂为脂肪酸碳链和oligo dT（n）中的一种或两种的组合，所述脂肪酸碳链的主链长度为1～12，所述oligo dT（n）中n为1～30的整数。
优选的，上述的用于同时检测24种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒中，所述量子点的激发波长为200-500nm，所述量子点的发射波长为400-700nm，所述量子点的尺寸为1-200nm。
优选的，上述的用于同时检测24种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒中，所述量子点为CdSe/ZnS核壳量子点。
优选的，上述的用于同时检测24种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒中，所述的阳性对照品包括的假病毒为由外壳蛋白包裹甲型流感病毒、冠状病毒OC43检测区域的RNA串联片段形成的假病毒颗粒及肺炎支原体重组质粒。
所述的甲型流感病毒、冠状病毒OC43检测区域的RNA串联片段序列为（即SEQ IDNO:75）：
TGGCCCCATGGAACGTTATTTCTCTTTTGAGTTTCTTGTATAGTTTAACTGCTCTATCCATGTTGTTCGGGTCCCCATTTCCATTTAGGGCATTTTGGATAAAGCGTCTACGCTGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACGGTGAGCGTGAACACAAATCCTAAAATTCCCTTAGTCAGAGGTGACAAGATTGGTCTTGTCTTTAACCATTCCATGAGAGCCTCAAGATCTGTGTTCTTTCCTGCAAAGACACTTTCCAGTCTCTGTGCGATCTCGGCTTTGAGGGGGCCTGACGGGATGATAGAAAGAACGTACGTTTCGACCTCGGTTAGAAGACTCATTGGTACAGACACAACAGACGTTCTTTTAAAACAGCCGATGGCAACCAGCGTCAACTGCTGCCACGATGGTATTTTTACTATCTGGGAACCGGACCGCATGCTAAAGACCAGTATGGCACCGATATTAACGGAGTCTACTGGGTCGCTAGCAACCAGGCTGATGTCAATACCCCGGCTGACATTGTCGATCGGGACCCAAGTAGCGATGAGGCTATTCCGACTAGGTTTCCGCCTGGCACGGTACTCCCTCAGGGTTACTATATTGAAGGCTCAGGAAGGTCTGCTCCTAATTCCAGATCTACTTCGCGCACATCCAGCAGAGCCTCTAGTGCAGGATCGCGTAGTAGAGCCAATTCTGGCAATAGAACCCCTACCTCTGGTGTAACACCTGACATGGCTGATCAAATTGCTAGTCTTGTTCTGGCAAAACTTGGCAAGGATGCCACCAAACCTCAGCAAGTAACTAAGCATACTGCCAAAGAAGTCAGACAGAAAATTTTGAATAAACCCCGCCAG
所述的肺炎支原体重组质粒检测区域的核酸序列为（SEQ ID NO:76）：
CGCCAACATTGGCAACCTCACCTGGTTCGGGCAAGCGCTTTTGGTGTTTGGTGGCAATGGCCATGTTACCAAGTCGGCCCACACCGCGCCTTTGAGTATAGGTGTCTTTAGGGTGCGCTATAATGCAACTGGTACCAGTGCTACTGTAACTGGTTGACCATATGCCTTACTGTTCTCAGGCATGGTCAACAAACAAACTGACGGGTTAAAGGATCTACCCTTTAACAATAACCGCTGGTTTGAATATGTACCACGGATGGCAGTTGCTGGCGCTAAGTTCGTTGGTAGGGAACTCGTTTTAGCGGGTACCATTACCATGGGTGATACCGCTACCGTACCTCGCTTACTGTACGATGAACTTGAAAGCAACCTGAACTTAGTAGCGCAAGGCCAAGGTCTTTTACGCGAAGACTTGCAACTCTTCACACCCTACGGATGAGCCAATCGTCCGGATTTACCAATCGGGGCTTGAAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTCACAACGCACCCTACTACTTCCACAATAACCCCGAT
所述的外壳蛋白为噬菌体MS2成熟酶和噬菌体MS2衣壳蛋白组成。
优选的，上述的用于同时检测24种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒中，所述内标包括不含靶标基因的外源性片段假病毒，其核酸序列为（SEQ ID NO:77，即内标基因）：
TGGTAATCGCAAACGTAATCAGAAACCTTTGGAACCAAAGTTCTCTATTGCTTTGCCTCCAGAGCTCTCTGTTGTTGAGTTTGAGGATCGCTCTAATAACTCATCTCGTGCTAGCAGTCGTTCTTCAACTCGTAACAACTCACGAGACTCTTCTCGTAGCACTTCAAGACAACAGTCTCGCACTCGTTCTGATTCTAACCAGTCTTCTTCAGATCTTGTTGCTGCTGTTACTTTGGCTTTAAAGAACTTAGGTTTTGATAACCAGTCGAAGTCACCTAGTTCTTCTGGTACTTCCACTCCTAAGAAACCGCAGCTACAATCCAGCTACCAGGCTGATAAGCCTTCTCAGTTGAAGAAACCTCGTTGGAAGCGTGTTCCTACCAGAGAGGAAAATGTTATTCAGTGCTTTGGTCCTCGTGATTTTAATCACAATATGGGGGATTCAGATCTTGTTCAGAATGGTGTTGATCGGTTTTACTATTGTCCAATAGATGCTTATTCTGCTAGGGATATCCCTTATTCTGGGTCTGGATCCGATATTTGGGATTACAGCTTGTTGGCTTCTTTTGGTAGATACTGTGATTCTTCCTGATGATTGAGCATACAGGAAGGAGAAGCTGTGCTACGTCGCCCGGGTGGTGAACCCCCCAAATGTACAATTTGTCAAATTGTTCATTGTTTGGCATAGTCACGTTCAATGCTGGATATGTGTAGTTTAAGTGGGTCAACCAATTTAATCTACTAAAGAAACTACTACTAGATTTCCTTATACAAGCAGAACTTGTTCCGTTTTGTTTGACTCCAGTCCAATTGAAGCTTTCATTGTTAAACTCCAG
所述假病毒的外壳蛋白为噬菌体MS2成熟酶和噬菌体MS2衣壳蛋白组成。
优选的，本发明中，所述假病毒的制备方法的步骤如下：
1）采用MS2成熟酶编码基因（序列见GENBANK ID:V00642.1(130-1311)）及噬菌体衣壳蛋白编码基因（序列见GENBANK ID:V00642.1(1335-1772)）的扩增引物从MS2噬菌体基因组（序列见GENBANK ID:V00642.1）中扩增出相关基因的全长基因；
2）将噬菌体MS2成熟酶编码基因和噬菌体衣壳蛋白编码基因依次克隆进入表达载体pET32a，获得含有噬菌体MS2成熟酶编码基因和噬菌体衣壳蛋白编码基因的重组质粒。所述的表达载体为含IPTG诱导表达的启动子即可。
3）将所述的甲型流感病毒、冠状病毒OC43检测区域的RNA串联片段或内标基因克隆进去含有噬菌体MS2成熟酶编码基因和噬菌体衣壳蛋白编码基因的重组质粒，所述的甲型流感病毒、冠状病毒OC43检测区域的RNA串联片段或内标基因置于噬菌体MS2成熟酶编码基因和噬菌体衣壳蛋白编码基因的下游。
4）将克隆好的重组质粒转入表达宿主菌，宿主菌为大肠杆菌BL21（DE3）。
5）诱导培养所述的重组菌，即可得到假病毒颗粒或内标假病毒颗粒。
优选的，上述的用于同时检测24种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒中，所述反应液I组分的含量为（每人份）：
10*buffer 2.5ul，25mM MgCl2 2.5ul，20mM dN（U）TP 0.4ul， 2U/ul UDG 0.5ul，10μM核苷酸序列如SEQ ID No：1-15所示的引物各0.75μL， DEPC H2O 补足到20.5ul。
所述反应液II组分的含量为（每人份）：
10*buffer 2.5ul，25mM MgCl2 5ul，20mM dN（U）TP 1ul，40U/ul RNA酶抑制剂0.5ul， 2U/ul UDG 0.5ul，10μM核苷酸序列如SEQ ID No：16-31所示的引物各0.75μL，DEPC H2O 补足到20.5ul。
所述反应液III组分的含量为（每人份）：
10*buffer 2.5ul，25mM MgCl2 5ul，20mM dN（U）TP 1ul，40U/ul RNA酶抑制剂0.5ul， 2U/ul UDG 0.5ul，10μM核苷酸序列如SEQ ID No：32-47所示的引物各0.75μL，DEPC H2O 补足到20.5ul。
所述的反应液IV组分含量为（每人份）：5U/ul DNA聚合酶 0.25ul，DNA酶稀释液0.25ul。
所述的反应液V组分含量为（每人份）：200U/ul反转录酶 0.25ul，5U/ul DNA聚合酶0.25ul。
优选的，上述的用于同时检测24种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒的检测方法，其具体的检测步骤如下：
1）扩增检测液配制（每人份）：
扩增检测液I：20.5ul反应液I加入反应液IV0.5ul；扩增检测液II：20.5ul反应液II加入反应液V0.5ul；扩增检测液III：20.5ul反应液III加入反应液V0.5ul；
每份待检样本均需要同时扩增三管反应，每管扩增检测液均加入同一份核酸样本4ul，混匀；
2）置于实时荧光PCR仪中进行PCR扩增检测；
3）实时荧光PCR扩增程序设置如下：
首先阶段1：50℃处理15-30min，
阶段2：95℃处理3min，
阶段3： 95℃15s，56℃30-60s，72℃30s，进行45个循环。
优选的，上述的用于同时检测24种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒的检测方法，所检测的呼吸道病原菌为：
甲型流感病毒、甲流H1N1(2009)、甲流H3N2、乙型流感病毒、副流感病毒（1、2、3亚型）、人偏肺病毒、呼吸道合胞病毒（A、B型）、冠状病毒（229E、NL63、HKU1、OC43）、鼻病毒、博卡病毒、腺病毒（B、C、E型）、肺炎支原体、肺炎衣原体、中东呼吸综合征冠状病毒、嗜肺军团菌、百日咳博德特氏菌。
与现有技术相比，本发明有如下特点：
1）使用本发明试剂盒比现有的显色法基因芯片检测步骤少，检测时间明显缩短，同时比有机荧光基因芯片设备成本低（光源要求低），并且现有的荧光基因芯片的载体为玻璃，其制备工艺复杂，检测过程复杂繁琐，而且检测仪器需要费用高昂的激光扫描仪，不利于临床的推广。
2）本发明提供一种同时检测24种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒及方法，可同时检测甲型流感病毒、甲流H1N1(2009)、甲流H3N2、乙型流感病毒、副流感病毒（1、2、3亚型）、人偏肺病毒、呼吸道合胞病毒（A、B型）、冠状病毒（229E、NL63、HKU1、OC43）、鼻病毒、博卡病毒、腺病毒（B、C、E型）、肺炎支原体、肺炎衣原体、中东呼吸综合征冠状病毒、嗜肺军团菌、百日咳博德特氏菌并分型鉴定，避免由于抗病毒药物和抗生素的滥用，同时对混合感染或者是早期临床表现不明显患者早期诊断提供依据。
3）本发明同时采用三个独立竞争性内标从提取到扩增全程监控，防止每个反应管假阴性。
4）本发明的阳性对照品和内标全部采用假病毒，能增加RNA的稳定性，有效增加产品的效期。
5）本发明用于同时检测24种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒的检测可以使用简单的紫外成像仪器进荧光-信号的检测，最大程度地避免人为判读导致的误差。
6）检测灵敏度为500copies/ml。
附图说明
图1为反应液I扩增各个病原菌灵敏度检测结果。
图2为反应液II扩增各个病原菌灵敏度检测结果。
图3为反应液III扩增各个病原菌灵敏度检测结果。
图4为咽拭子临床样本检测结果。
具体实施方式
本发明最关键的构思在于：利用量子点材料的光学特性及基因芯片特性建立一种高通量、高灵敏度、高特异性的量子点核酸检测呼吸道病原菌的检测试剂盒，可同时检测常见的24种呼吸道感染病毒及非典型性微生物。
本发明的24种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒检测谱为：甲型流感病毒、甲流H1N1(2009)、甲流H3N2、乙型流感病毒、副流感病毒（1、2、3亚型）、人偏肺病毒、呼吸道合胞病毒（A、B型）、冠状病毒（229E、NL63、HKU1、OC43）、鼻病毒、博卡病毒、腺病毒（B、C、E型）、肺炎支原体、肺炎衣原体、中东呼吸综合征冠状病毒、嗜肺军团菌、百日咳博德特氏菌。
实施案例1：本发明用于呼吸道病原菌的量子点核酸检测的试剂盒制备和使用
一、量子点核酸检测原理：
将带有生物素标记核酸扩增产物与检测膜条上的探针进行分子杂交，再通过生物素与偶联链霉亲和素的量子点进行结合，检测膜条经荧光检测仪器观察各个位点有无光信号来判断该探针是否与该核酸产物杂交，从而确定样本中是否含有相关靶标核酸。
捕获探针为寡核苷酸单链DNA 3’端或5’端标记有氨基，且氨基与寡核苷酸单链DNA间有间臂，所述间臂为脂肪酸碳链或oligo dT（n）或二者的组合，所述脂肪酸碳链的长度为1～12个碳原子，所述oligo dT（n）n数量为1～30。
检测膜条的材质为尼龙膜，且经活化后的尼龙膜上点有一定浓度的捕获探针（1-50uM），以微阵列形式分布在尼龙膜上。
量子点为表面偶联有若干数量链霉亲和素的量子点（优选为CdSe/ZnS核壳量子点），具体偶联的链霉亲和素数量≥1。所述量子点的激发波长为200-500nm，所述量子点的发射波长为400-700nm。所述量子点的尺寸1-200nm。
所核酸扩增产物为5’端带有生物素标记，具体为核酸扩增的一条引物5’端被修饰有生物素标记，所述引物与生物素连接有间臂，所述间臂为脂肪酸碳链或oligo dT（n）或二者的组合，所述脂肪酸碳链的长度为1～12个碳原子，所述oligo dT（n）n数量为1～30。
核酸扩增方法为聚合酶链式反应（如PCR等）、恒温扩增（如TMA/RPA/LAMP等）。
量子点核酸检测流程：
1）首先使用若干对引物进行核酸扩增，并且某一基因扩增的一对引物中其中一条引物5’端修饰有生物素，所述引物与生物素连接有间臂，所述间臂为脂肪酸碳链或oligodT（n）或二者的组合，所述脂肪酸碳链的长度为1～12个碳原子，所述oligo dT（n）n数量为1～30。
2）核酸扩增后，将产物进行核酸变性处理，所述核酸变性方法为碱变性。
3）将变性后产物及检测膜条加入到预先预热至一定温度（40-55度）的杂交液中进行杂交，杂交时间为30min-2h。所述杂交液为2*SSC与0.1%SDS。
4）杂交结束后，将检测膜条转移至预先预热至一定温度（40-55度）的洗涤液中进行洗涤，洗涤时间为5-15min。所述洗涤液为0.5*SSC与0.1%SDS。
5）洗涤结束后，将洗涤液去除后，加入到一定温度的孵育液中进行孵育，孵育时间为5-30min，所述温度为20-37度，所述孵育液为2*SSC与0.1%SDS中加入浓度为0.01nM-5nMSA-QD量子点（激发波长为200-500nm，发射波长为400-700nm）。所述量子点的尺寸1-200nm。
6）孵育结束后，去掉孵育液，加入一定量的洗涤液进行洗涤，洗涤时间为5-15min。所述洗涤液为0.5*SSC与0.1%SDS。
7）洗涤结束后，将检测膜条置于荧光仪器中进行荧光检测。
二、24种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒引物及探针的设计
根据GENBANK数据库中甲型流感病毒、甲流H1N1(2009)、甲流H3N2、乙型流感病毒、副流感病毒（1、2、3亚型）、人偏肺病毒、呼吸道合胞病毒（A、B型）、冠状病毒（229E、NL63、HKU1、OC43）、鼻病毒、博卡病毒、腺病毒（B、C、E型）、肺炎支原体、肺炎衣原体、中东呼吸综合征冠状病毒、嗜肺军团菌、百日咳博德特氏菌公开的基因组序列，进行核酸序列比对，筛选保守区域用primer premier5.0设计检测探针及引物，所有扩增引物的Tm值尽可能相近；通过大量的试验测试筛选（单重扩增及多重组合扩增）灵敏度满足要求的引物。检测引物相关序列如下：
引物MPF：CGGGTTAAAGGATCTACC （SEQ ID NO:1）
引物MPR： GTAAAAGACCTTGGCCTTG（SEQ ID NO:2）
引物LPF：CGTTCTTAACAAGTTTCAG（SEQ ID NO:3）
引物LPR：TCCGATTTACCGGGTTTAAC（SEQ ID NO:4）
引物BOCF: GTATTCAGTCAACACAGAGC（SEQ ID NO:5）
引物BOCR：GTTCTCTAGTGTTATCCCATC（SEQ ID NO:6）
引物ADVF: CGCAGTGGKCWTACATGCAC（SEQ ID NO:7）
引物ADVR1：CGCGGTCCACGGGGATAA（SEQ ID NO:8）
引物ADVR2：AATGTCAAAGAACGTGCTG（SEQ ID NO:9）
引物BOPF：GATTGCCCCTGAAGGCGAACC（SEQ ID NO:10）
引物BOPR：CTGCCCGACATGAAGGCGGT（SEQ ID NO:11）
引物CPF：CACAGTCCAAACCTAAAG（SEQ ID NO:12）
引物CPR：GTTTAAAACAGCTGTAGGTAG（SEQ ID NO:13）
引物ICF：TATGGTTGGGATAAGGCTGG（SEQ ID NO:14）
引物ICR：CGAGCTTAGTGATACTTGTG（SEQ ID NO:15）
引物IVBF: TCTTCACTGTTTATTATTCC（SEQ ID NO:16）
引物IVBR: AAGCCTTACTACACAGGAG（SEQ ID NO:17）
引物IVAF: TTCTTGTATAGTTTAACTGC（SEQ ID NO:18）
引物IVA R：CTTCTAACCGAGGTCGAAACGTA（SEQ ID NO:19）
引物H1N1F: CATTTCTTTCCATTGCGAATGC（SEQ ID NO:20）
引物H1N1R：ATGGGGAATTCACCATCCATCTA（SEQ ID NO:21）
引物H3N2F：TGGGATTACAGCTTGTTGGC（SEQ ID NO:22）
引物H3N2R：AACAAGTTCTGCTTGTATAAG（SEQ ID NO:23）
引物MERSF：CAGGAGCAAGATGAACTCT（SEQ ID NO:24）
引物MERSR：GAGTGAAGCGAAGATTCTACAC（SEQ ID NO:25）
引物RSVAF：CACTGCACTTCTTGAGTTTAT（SEQ ID NO:26）
引物RSVAR：GACGATGACCCTGCATCACT（SEQ ID NO:27）
引物RSVBF：TACTAGGCATTTGAGCCAGC（SEQ ID NO:28）
引物RSVBR：CATATTGTTAGTGATGCGGGATC（SEQ ID NO:29）
引物RHVF：CCTTAAACCTGCAGCCATTG（SEQ ID NO:30）
引物RHVR：CTATATATTGTCACCATAAGC（SEQ ID NO:31）
引物PIV1F：GCTATTACAGAACATGATTTC（SEQ ID NO:32）
引物PIV1R：GTGTTAGACTACCTTCATTATC（SEQ ID NO:33）
引物PIV2F：ATGATGGTATTCTGGTGCAC（SEQ ID NO:34）
引物PIV2R：GCTTTAAAGGATATGCATACTGG（SEQ ID NO:35）
引物PIV3F：GCTGTGCCAACTTGTAGATCTTG（SEQ ID NO:36）
引物PIV3R：CAATCAGGCATCTCATAGTCC（SEQ ID NO:37）
引物NL63F：GTTCTGATTCTAACCAGTCTTCT（SEQ ID NO:38）
引物NL63R: CCCATATTGTGATTAAAATCAC（SEQ ID NO:39）
引物OC43F：ATCTACTTCGCGCACATCC（SEQ ID NO:40）
引物OC43R：TTCTTTGGCAGTATGCTTAG（SEQ ID NO:41）
引物HKU1F：CAAGGCTATTATGTTGAAGG（SEQ ID NO:42）
引物HKU1R：TTATGCCTAATTTCCTTGGC（SEQ ID NO:43）
引物229EF：CACACTTCAATCAAAAGCTCCCA（SEQ ID NO:44）
引物229ER：GATTTAAGAGCCGCAGCGACTG（SEQ ID NO:45）
引物hMPVF：GATGTCTTCCTGTGCTGAC（SEQ ID NO:46）
引物hMPVR：TCAGAATGCAGGGTCAAC（SEQ ID NO:47）
每条反向引物均被修饰有生物素标记，并且生物素与寡核苷酸链间有oligodT5。
三、扩增反应液体系的确认
通过大量的多重组合测试及体系优化测试，确定各个反应液体系的组成，具体情况如下：
反应液I的反应体系（1人份）如表1：
表1
10p/ul 引物SEQ ID No：1-15 0.75ul
10* buffer 2.5ul
25mM MgCl2 2.5ul
20mM dN（U）TP 0.4ul
2U/ul UDG 0.5ul
DEPC H2O Up to 20.5ul
反应液II的反应体系（1人份）如表2：
表2
40U/ul RNA酶抑制剂 0.5ul
10p/ul 引物SEQ ID No：16-31 0.5ul
10* buffer 2.5ul
25mM MgCl<sub>2</sub> 5ul
20mM dN（U）TP 1ul
2U/ul UDG 0.5ul
DEPC H2O Up to 20.5ul
反应液III的反应体系（1人份）如表3:
表3
40U/ul RNA酶抑制剂 0.5ul
10p/ul 引物SEQ ID No：32-47 0.5ul
10* buffer 2.5ul
25mM MgCl<sub>2</sub> 5ul
20mM dN（U）TP 1ul
2U/ul UDG 0.5ul
DEPC H2O Up to 20.5ul
反应液IV的反应体系（1人份）如表4:
表4
DNA聚合酶稀释液 0.25ul
5U/ul DNA聚合酶 0.25ul
反应液V的反应体系（1人份）如表5:
表5
200U/ul反转录酶 0.25ul
5U/ul DNA聚合酶 0.25ul
每个样本的检测需要同时进行三个反应体系扩增，每个扩增体系配制如下：
扩增检测液I：20.5ul反应液I加入反应液IV0.5ul；扩增检测液II：20.5ul反应液II加入反应液V0.5ul；扩增检测液III：20.5ul反应液III加入反应液V0.5ul；
每个扩增体系加入4ul提取的DNA/RNA模板，总体积25ul。
四、反应程序确定
经过大量的试验测试，本扩增程序能有效使各个反应体系中的引物最大程度得到有效扩增，并且使各个病原体检测灵敏度达到500copies/ml。具体程序如下表6：
表6
Figure DEST_PATH_IMAGE002
五、捕获探针的设计
在生物信息学网站NCBI数据库中查询并下载各个病原菌的核酸序列，经BLAST比对找出各个靶标特异性最高的区域，同时兼顾各个捕获探针能在同一杂交温度进行杂交测试设计探针，并经过大量的灵敏度试验测试及特异性测试，确定各个病原菌特异基因的探针序列，具体序列及编号如下：
探针MPP: TAGCGGGTACCATTACCATGG（SEQ ID NO:48）
探针LPP：CCAAGTGGTTTGCAATAC（SEQ ID NO:49）
探针BOCP：CTAGAGATGGTACTAATTCAATC（SEQ ID NO:50）
探针ADVCP: GACGCTGCGGTTTATCCC（SEQ ID NO:51）
探针ADVBP：CCGCGCCACAGACACCTAC（SEQ ID NO:52）
探针ADVEP：CTACTTCAGTCTGGGGAAC（SEQ ID NO:53）
探针BOPP：ATACAGCCCGGCTGACGT（SEQ ID NO:54）
探针CPP：CGTTGCTTTCCCCTTGCC（SEQ ID NO:55）
探针IVBP：CTTCTAGCTCACTCAAAGAATTG（SEQ ID NO:56）
探针IVAP：CTTAGTCAGAGGTGACAAGATTGG（SEQ ID NO:57）
探针H1N1P：CACTTTGGGTCTTATTGCTATT（SEQ ID NO:58）
探针H3N2P：GATTTGGTCCTTGTCCGTA（SEQ ID NO:59）
探针MERSP：CATTGTACAAAGATGTTGATAATCC（SEQ ID NO:.60）
探针RSVAP：CATTAGCTAGTTCTTTTATAAG（SEQ ID NO:61）
探针RSVBP：GACTGGAACATGGGCACCC（SEQ ID NO:62）
探针RHVP；CGTAATGAGCAATTGCGG（SEQ ID NO:63）
探针PIV1P：CCTATATCTGCACATCCTTGA（SEQ ID NO:64）
探针PIV2P：GGAGAGGTCCATATTTAGGCG（SEQ ID NO:65）
探针PIV3P：CAATTTTGGAACTGAGTTCAAGCCC（SEQ ID NO:66）
探针NL63P: TAATAAGCCTCTTTCTCAACCCAG（SEQ ID NO:67）
探针OC43P：CTGGCAATAGAACCCCTACCT（SEQ ID NO:68）
探针HKU1P: GACATTCAGATTCTATAGTAAAACC（SEQ ID NO:69）
探针229EP：CTCCTTCCCGTTCTCAGTCAAG（SEQ ID NO:70）
探针hMPVP：TCTCCTCTTGTTTCACAGTC（SEQ ID NO:71）
IC1P: GGAGAAGCTGTGCTACGTCG（SEQ ID NO:72）
IC2P：GCAGCTACAATCCAGCTACCA（SEQ ID NO:73）
IC3P：TTTGCTAATCATGTTCATACC（SEQ ID NO:74）
其中IC1P、IC2P、IC3P探针为三管扩增体系的内控探针，用于监控样本核酸提取及扩增反应出现的假阴性。
所述的各条探针的5’端标记有氨基，并且氨基与寡核苷酸链间有oligodT5。
六、膜条的制备
每条捕获探针由引物合成单位进行合成，然后采用稀释液稀释成所需的浓度，再通过氨基与羧基的缩合反应固定在尼龙膜上，制备成检测膜条。
检测膜条的布局图如下表7：
表7
Figure DEST_PATH_IMAGE004
膜条上位点对应的病原菌如表8：
表8
Figure DEST_PATH_IMAGE005
七、杂交条件的确定
PCR扩增完成后，将三管扩增产物混合后进行碱变性处理，然后进行杂交、洗涤、孵育、洗涤、荧光检测。在杂交步骤中，杂交温度对结果的判读有着很大的影响，杂交温度过低，会出现非特异捕获导致假阳性，杂交温度过高，会出现目的产物与捕获探针的结合率下降，最终到时灵敏度下降而导致误判阴性。后续的洗涤温度、孵育时间的长短、孵育液中SA-QD的浓度也会有对结果同样的影响。
杂交：
将变性后的PCR产物与检测膜条加入到预先孵育至48度的1ml杂交液中，48度轻摇杂交1.5h。同时将1ml洗涤液进行预热至48度。
所述的杂交液为2*SSC与0.1%SDS。所述的洗涤液为0.5*SSC与0.1%SDS。
洗涤：
取出检测膜条，转移至预先预热至48度的洗涤液中，轻摇洗涤5min。
孵育：
按照1ml杂交液加入浓度为1uM SA-QD配制孵育液。将检测膜条转移至孵育液中室温孵育轻摇30min。
洗涤：
取出检测膜条，转移至洗涤液中，室温轻摇洗涤5min。
实施例2
本发明用于24种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒的灵敏度验证：
按照实施例1中的反应体系分别按照21ul进行分装，并且向每个反应体系加入4ul的DNA/RNA，浓度为5000copies/ml，500copies/ml。
RT-PCR扩增程序按照实施例1中所述的程序进行PCR扩增，具体如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
量子点基因芯片检测流程按照实施例1中的试剂盒使用流程进行相关检测。三管反应检测结果分别参见图1、图2、图3。从荧光检测结果显示该试剂盒的检测靶标灵敏度均能达到500copies/ml。
实施案例3：咽拭子临床样本检测
按照临床微生物样本采集规范采集疑似呼吸道感染的咽拭子样本12例，并采用杭州千基生物科技有限公司生产的病毒核酸提取试剂盒进行核酸的提取，然后使用实施例1中的反应体系进行核酸样本检测，具体扩增流程及检测流程参照实施例1。具体检测结果如下：
样本编号 实施例检测结果 测序结果
1 ND ND
2 H1N1(2009) H1N1(2009)
3 H1N1(2009) H1N1(2009)
4 229E 229E
5 HKU1 HKU1
6 ND ND
7 ND ND
8 RSVB RSVB
9 H1N1(2009) H1N1(2009)
10 RSVA/ HKU1 RSVA/ HKU1
11 H1N1(2009) H1N1(2009)
12 ND ND
注：ND标识为检测到相关病原菌。
实施例检测样本同时采用一代测序进行分析，所有实施例检测结果与测序结果一致。
序列表
<110> 杭州千基生物科技有限公司
杭州博芯生物技术有限公司
<120> 一种同时检测24种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒及方法
<160> 77
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgggttaaag gatctacc 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtaaaagacc ttggccttg 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgttcttaac aagtttcag 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tccgatttac cgggtttaac 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtattcagtc aacacagagc 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gttctctagt gttatcccat c 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgcagtggkc wtacatgcac 20
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgcggtccac ggggataa 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aatgtcaaag aacgtgctg 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gattgcccct gaaggcgaac c 21
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<212> DNA
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ctgcccgaca tgaaggcggt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cacagtccaa acctaaag 18
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<211> 21
<212> DNA
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gtttaaaaca gctgtaggta g 21
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tatggttggg ataaggctgg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cgagcttagt gatacttgtg 20
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<211> 20
<212> DNA
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tcttcactgt ttattattcc 20
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ttcttgtata gtttaactgc 20
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<212> DNA
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<400> 19
cttctaaccg aggtcgaaac gta 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
catttctttc cattgcgaat gc 22
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<211> 23
<212> DNA
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<400> 21
atggggaatt caccatccat cta 23
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<212> DNA
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tgggattaca gcttgttggc 20
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<211> 21
<212> DNA
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caggagcaag atgaactct 19
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<212> DNA
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<400> 30
ccttaaacct gcagccattg 20
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<400> 31
ctatatattg tcaccataag c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gctattacag aacatgattt c 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gtgttagact accttcatta tc 22
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
atgatggtat tctggtgcac 20
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gctttaaagg atatgcatac tgg 23
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gctgtgccaa cttgtagatc ttg 23
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
caatcaggca tctcatagtc c 21
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gttctgattc taaccagtct tct 23
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
cccatattgt gattaaaatc ac 22
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
atctacttcg cgcacatcc 19
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ttctttggca gtatgcttag 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
caaggctatt atgttgaagg 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ttatgcctaa tttccttggc 20
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
cacacttcaa tcaaaagctc cca 23
<210> 45
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
gatttaagag ccgcagcgac tg 22
<210> 46
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gatgtcttcc tgtgctgac 19
<210> 47
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
tcagaatgca gggtcaac 18
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
tagcgggtac cattaccatg g 21
<210> 49
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
ccaagtggtt tgcaatac 18
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
ctagagatgg tactaattca atc 23
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
gacgctgcgg tttatccc 18
<210> 52
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ccgcgccaca gacacctac 19
<210> 53
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
ctacttcagt ctggggaac 19
<210> 54
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
atacagcccg gctgacgt 18
<210> 55
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
cgttgctttc cccttgcc 18
<210> 56
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
cttctagctc actcaaagaa ttg 23
<210> 57
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
cttagtcaga ggtgacaaga ttgg 24
<210> 58
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
cactttgggt cttattgcta tt 22
<210> 59
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
gatttggtcc ttgtccgta 19
<210> 60
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
cattgtacaa agatgttgat aatcc 25
<210> 61
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
cattagctag ttcttttata ag 22
<210> 62
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
gactggaaca tgggcaccc 19
<210> 63
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
cgtaatgagc aattgcgg 18
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
cctatatctg cacatccttg a 21
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
ggagaggtcc atatttaggc g 21
<210> 66
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
caattttgga actgagttca agccc 25
<210> 67
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
taataagcct ctttctcaac ccag 24
<210> 68
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
ctggcaatag aacccctacc t 21
<210> 69
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
gacattcaga ttctatagta aaacc 25
<210> 70
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
ctccttcccg ttctcagtca ag 22
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
tctcctcttg tttcacagtc 20
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
ggagaagctg tgctacgtcg 20
<210> 73
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
gcagctacaa tccagctacc a 21
<210> 74
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
tttgctaatc atgttcatac c 21
<210> 75
<211> 853
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
tggccccatg gaacgttatt tctcttttga gtttcttgta tagtttaact gctctatcca 60
tgttgttcgg gtccccattt ccatttaggg cattttggat aaagcgtcta cgctgcagtc 120
ctcgctcact gggcacggtg agcgtgaaca caaatcctaa aattccctta gtcagaggtg 180
acaagattgg tcttgtcttt aaccattcca tgagagcctc aagatctgtg ttctttcctg 240
caaagacact ttccagtctc tgtgcgatct cggctttgag ggggcctgac gggatgatag 300
aaagaacgta cgtttcgacc tcggttagaa gactcattgg tacagacaca acagacgttc 360
ttttaaaaca gccgatggca accagcgtca actgctgcca cgatggtatt tttactatct 420
gggaaccgga ccgcatgcta aagaccagta tggcaccgat attaacggag tctactgggt 480
cgctagcaac caggctgatg tcaatacccc ggctgacatt gtcgatcggg acccaagtag 540
cgatgaggct attccgacta ggtttccgcc tggcacggta ctccctcagg gttactatat 600
tgaaggctca ggaaggtctg ctcctaattc cagatctact tcgcgcacat ccagcagagc 660
ctctagtgca ggatcgcgta gtagagccaa ttctggcaat agaaccccta cctctggtgt 720
aacacctgac atggctgatc aaattgctag tcttgttctg gcaaaacttg gcaaggatgc 780
caccaaacct cagcaagtaa ctaagcatac tgccaaagaa gtcagacaga aaattttgaa 840
taaaccccgc cag 853
<210> 76
<211> 529
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
cgccaacatt ggcaacctca cctggttcgg gcaagcgctt ttggtgtttg gtggcaatgg 60
ccatgttacc aagtcggccc acaccgcgcc tttgagtata ggtgtcttta gggtgcgcta 120
taatgcaact ggtaccagtg ctactgtaac tggttgacca tatgccttac tgttctcagg 180
catggtcaac aaacaaactg acgggttaaa ggatctaccc tttaacaata accgctggtt 240
tgaatatgta ccacggatgg cagttgctgg cgctaagttc gttggtaggg aactcgtttt 300
agcgggtacc attaccatgg gtgataccgc taccgtacct cgcttactgt acgatgaact 360
tgaaagcaac ctgaacttag tagcgcaagg ccaaggtctt ttacgcgaag acttgcaact 420
cttcacaccc tacggatgag ccaatcgtcc ggatttacca atcggggctt gaagtagtag 480
tagtagtagt agtcacaacg caccctacta cttccacaat aaccccgat 529
<210> 77
<211> 836
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
tggtaatcgc aaacgtaatc agaaaccttt ggaaccaaag ttctctattg ctttgcctcc 60
agagctctct gttgttgagt ttgaggatcg ctctaataac tcatctcgtg ctagcagtcg 120
ttcttcaact cgtaacaact cacgagactc ttctcgtagc acttcaagac aacagtctcg 180
cactcgttct gattctaacc agtcttcttc agatcttgtt gctgctgtta ctttggcttt 240
aaagaactta ggttttgata accagtcgaa gtcacctagt tcttctggta cttccactcc 300
taagaaaccg cagctacaat ccagctacca ggctgataag ccttctcagt tgaagaaacc 360
tcgttggaag cgtgttccta ccagagagga aaatgttatt cagtgctttg gtcctcgtga 420
ttttaatcac aatatggggg attcagatct tgttcagaat ggtgttgatc ggttttacta 480
ttgtccaata gatgcttatt ctgctaggga tatcccttat tctgggtctg gatccgatat 540
ttgggattac agcttgttgg cttcttttgg tagatactgt gattcttcct gatgattgag 600
catacaggaa ggagaagctg tgctacgtcg cccgggtggt gaacccccca aatgtacaat 660
ttgtcaaatt gttcattgtt tggcatagtc acgttcaatg ctggatatgt gtagtttaag 720
tgggtcaacc aatttaatct actaaagaaa ctactactag atttccttat acaagcagaa 780
cttgttccgt tttgtttgac tccagtccaa ttgaagcttt cattgttaaa ctccag 836

Claims (8)

1.一种同时检测24种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒，其特征在于，包括反应液I、反应液II、反应液III、反应液IV、反应液V、阳性对照品、内标、阴性对照品、荧光检测液、变性剂、中性剂及膜条；其中，所述的膜条包括尼龙膜和偶联在尼龙膜上的特异性捕获探针；所述的荧光检测液包括用于标记捕获探针的表面偶联有链霉亲和素的量子点；变性剂包括0.01N-1.5N的氢氧化钠溶液；中性剂包括0.01N-1.5N盐酸溶液；所述的阳性对照品包括甲型流感病毒、冠状病毒OC43假病毒及肺炎支原体重组质粒，所述的内标包括不含靶标基因的外源性片段假病毒，所述的阴性对照品包括人基因组DNA；所述的反应液IV包括DNA聚合酶；所述的反应液V包括反转录酶、DNA聚合酶，所述的反应液I、反应液II、反应液III分别包含以下检测引物：
反应液I包含以下检测引物：
引物MPF：CGGGTTAAAGGATCTACC ，即SEQ ID NO:1；
引物MPR： GTAAAAGACCTTGGCCTTG，即SEQ ID NO:2；
引物LPF：CGTTCTTAACAAGTTTCAG，即SEQ ID NO:3；
引物LPR：TCCGATTTACCGGGTTTAAC，即SEQ ID NO:4；
引物BOCF: GTATTCAGTCAACACAGAGC，即SEQ ID NO:5；
引物BOCR：GTTCTCTAGTGTTATCCCATC，即SEQ ID NO:6；
引物ADVF: CGCAGTGGKCWTACATGCAC，即SEQ ID NO:7；
引物ADVR1：CGCGGTCCACGGGGATAA，即SEQ ID NO:8；
引物ADVR2：AATGTCAAAGAACGTGCTG，即SEQ ID NO:9；
引物BOPF：GATTGCCCCTGAAGGCGAACC，即SEQ ID NO:10；
引物BOPR：CTGCCCGACATGAAGGCGGT，即SEQ ID NO:11；
引物CPF：CACAGTCCAAACCTAAAG，即SEQ ID NO:12；
引物CPR：GTTTAAAACAGCTGTAGGTAG，即SEQ ID NO:13；
引物ICF：TATGGTTGGGATAAGGCTGG，即SEQ ID NO:14；
引物ICR：CGAGCTTAGTGATACTTGTG，即SEQ ID NO:15；
反应液II包含以下检测引物：
引物IVBF: TCTTCACTGTTTATTATTCC，即SEQ ID NO:16；
引物IVBR: AAGCCTTACTACACAGGAG，即SEQ ID NO:17；
引物IVAF: TTCTTGTATAGTTTAACTGC，即SEQ ID NO:18；
引物IVA R：CTTCTAACCGAGGTCGAAACGTA，即SEQ ID NO:19；
引物H1N1F: CATTTCTTTCCATTGCGAATGC，即SEQ ID NO:20；
引物H1N1R：ATGGGGAATTCACCATCCATCTA，即SEQ ID NO:21；
引物H3N2F：TGGGATTACAGCTTGTTGGC，即SEQ ID NO:22；
引物H3N2R：AACAAGTTCTGCTTGTATAAG，即SEQ ID NO:23；
引物MERSF：CAGGAGCAAGATGAACTCT，即SEQ ID NO:24；
引物MERSR：GAGTGAAGCGAAGATTCTACAC，即SEQ ID NO:25；
引物RSVAF：CACTGCACTTCTTGAGTTTAT，即SEQ ID NO:26；
引物RSVAR：GACGATGACCCTGCATCACT，即SEQ ID NO:27；
引物RSVBF：TACTAGGCATTTGAGCCAGC，即SEQ ID NO:28；
引物RSVBR：CATATTGTTAGTGATGCGGGATC，即SEQ ID NO:29；
引物RHVF：CCTTAAACCTGCAGCCATTG，即SEQ ID NO:30；
引物RHVR：CTATATATTGTCACCATAAGC，即SEQ ID NO:31；
反应液III包含以下检测引物：
引物PIV1F：GCTATTACAGAACATGATTTC，即SEQ ID NO:32；
引物PIV1R：GTGTTAGACTACCTTCATTATC，即SEQ ID NO:33；
引物PIV2F：ATGATGGTATTCTGGTGCAC，即SEQ ID NO:34；
引物PIV2R：GCTTTAAAGGATATGCATACTGG，即SEQ ID NO:35；
引物PIV3F：GCTGTGCCAACTTGTAGATCTTG，即SEQ ID NO:36；
引物PIV3R：CAATCAGGCATCTCATAGTCC，即SEQ ID NO:37；
引物NL63F：GTTCTGATTCTAACCAGTCTTCT，即SEQ ID NO:38；
引物NL63R: CCCATATTGTGATTAAAATCAC，即SEQ ID NO:39；
引物OC43F：ATCTACTTCGCGCACATCC，即SEQ ID NO:40；
引物OC43R：TTCTTTGGCAGTATGCTTAG，即SEQ ID NO:41；
引物HKU1F：CAAGGCTATTATGTTGAAGG，即SEQ ID NO:42；
引物HKU1R：TTATGCCTAATTTCCTTGGC，即SEQ ID NO:43；
引物229EF：CACACTTCAATCAAAAGCTCCCA，即SEQ ID NO:44；
引物229ER：GATTTAAGAGCCGCAGCGACTG，即SEQ ID NO:45；
引物hMPVF：GATGTCTTCCTGTGCTGAC，即SEQ ID NO:46；
引物hMPVR：TCAGAATGCAGGGTCAAC，即SEQ ID NO:47；
所述的特异性捕获探针包含：
探针MPP: TAGCGGGTACCATTACCATGG，即SEQ ID NO:48；
探针LPP：CCAAGTGGTTTGCAATAC，即SEQ ID NO:49；
探针BOCP：CTAGAGATGGTACTAATTCAATC，即SEQ ID NO:50；
探针ADVCP: GACGCTGCGGTTTATCCC，即SEQ ID NO:51；
探针ADVBP：CCGCGCCACAGACACCTAC，即SEQ ID NO:52；
探针ADVEP：CTACTTCAGTCTGGGGAAC，即SEQ ID NO:53；
探针BOPP：ATACAGCCCGGCTGACGT，即SEQ ID NO:54；
探针CPP：CGTTGCTTTCCCCTTGCC，即SEQ ID NO:55；
探针IVBP：CTTCTAGCTCACTCAAAGAATTG，即SEQ ID NO:56；
探针IVAP：CTTAGTCAGAGGTGACAAGATTGG，即SEQ ID NO:57；
探针H1N1P：CACTTTGGGTCTTATTGCTATT，即SEQ ID NO:58；
探针H3N2P：GATTTGGTCCTTGTCCGTA，即SEQ ID NO:59；
探针MERSP：CATTGTACAAAGATGTTGATAATCC，即SEQ ID NO:60；
探针RSVAP：CATTAGCTAGTTCTTTTATAAG，即SEQ ID NO:61；
探针RSVBP：GACTGGAACATGGGCACCC，即SEQ ID NO:62；
探针RHVP；CGTAATGAGCAATTGCGG，即SEQ ID NO:63；
探针PIV1P：CCTATATCTGCACATCCTTGA，即SEQ ID NO:64；
探针PIV2P：GGAGAGGTCCATATTTAGGCG，即SEQ ID NO:65；
探针PIV3P：CAATTTTGGAACTGAGTTCAAGCCC，即SEQ ID NO:66；
探针NL63P: TAATAAGCCTCTTTCTCAACCCAG，即SEQ ID NO:67；
探针OC43P：CTGGCAATAGAACCCCTACCT，即SEQ ID NO:68；
探针HKU1P: GACATTCAGATTCTATAGTAAAACC，即SEQ ID NO:69；
探针229EP：CTCCTTCCCGTTCTCAGTCAAG，即SEQ ID NO:70；
探针hMPVP：TCTCCTCTTGTTTCACAGTC，即SEQ ID NO:71；
所述的膜条上还含有三条用于监控样本核酸提取及扩增的内控探针：
IC1P: GGAGAAGCTGTGCTACGTCG，即SEQ ID NO:72；
IC2P：GCAGCTACAATCCAGCTACCA，即SEQ ID NO:73；
IC3P：TTTGCTAATCATGTTCATACC，即SEQ ID NO:74。
2.如权利要求1所述的一种同时检测24种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的捕获探针为寡核苷酸单链DNA ，所述寡核苷酸单链DNA的3’端或5’端标记有氨基，所述寡核苷酸单链DNA与氨基间连接有间臂，所述间臂为脂肪酸碳链和oligo dT（n）中的一种或两种的组合，所述脂肪酸碳链中主链长度为1～12个碳原子，所述oligo dT（n）中n为1～30的整数。
3.如权利要求1所述的一种同时检测24种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的检测引物中反向引物5’端修饰有生物素标记，检测引物与生物素之间连接有间臂，所述间臂为脂肪酸碳链和oligo dT（n）中的一种或两种的组合，所述脂肪酸碳链的主链长度为1～12个碳原子，所述oligo dT（n）中n为1～30的整数。
4.如权利要求1所述的一种同时检测24种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的量子点的激发波长为200-500nm，所述量子点的发射波长为400-700nm，所述量子点的尺寸为1-200nm。
5.如权利要求1所述的一种同时检测24种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒，其特征在于，所述量子点为CdSe/ZnS核壳量子点。
6.如权利要求1所述的一种同时检测24种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照品包括由外壳蛋白包裹甲型流感病毒、冠状病毒OC43检测区域的RNA串联片段形成的假病毒颗粒及肺炎支原体重组质粒：
所述的甲型流感病毒、冠状病毒OC43检测区域的RNA串联片段序列为SEQ ID NO:75，即：
TGGCCCCATGGAACGTTATTTCTCTTTTGAGTTTCTTGTATAGTTTAACTGCTCTATCCATGTTGTTCGGGTCCCCATTTCCATTTAGGGCATTTTGGATAAAGCGTCTACGCTGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACGGTGAGCGTGAACACAAATCCTAAAATTCCCTTAGTCAGAGGTGACAAGATTGGTCTTGTCTTTAACCATTCCATGAGAGCCTCAAGATCTGTGTTCTTTCCTGCAAAGACACTTTCCAGTCTCTGTGCGATCTCGGCTTTGAGGGGGCCTGACGGGATGATAGAAAGAACGTACGTTTCGACCTCGGTTAGAAGACTCATTGGTACAGACACAACAGACGTTCTTTTAAAACAGCCGATGGCAACCAGCGTCAACTGCTGCCACGATGGTATTTTTACTATCTGGGAACCGGACCGCATGCTAAAGACCAGTATGGCACCGATATTAACGGAGTCTACTGGGTCGCTAGCAACCAGGCTGATGTCAATACCCCGGCTGACATTGTCGATCGGGACCCAAGTAGCGATGAGGCTATTCCGACTAGGTTTCCGCCTGGCACGGTACTCCCTCAGGGTTACTATATTGAAGGCTCAGGAAGGTCTGCTCCTAATTCCAGATCTACTTCGCGCACATCCAGCAGAGCCTCTAGTGCAGGATCGCGTAGTAGAGCCAATTCTGGCAATAGAACCCCTACCTCTGGTGTAACACCTGACATGGCTGATCAAATTGCTAGTCTTGTTCTGGCAAAACTTGGCAAGGATGCCACCAAACCTCAGCAAGTAACTAAGCATACTGCCAAAGAAGTCAGACAGAAAATTTTGAATAAACCCCGCCAG
所述的肺炎支原体重组质粒的检测区域的核酸序列为SEQ ID NO:76，即：
CGCCAACATTGGCAACCTCACCTGGTTCGGGCAAGCGCTTTTGGTGTTTGGTGGCAATGGCCATGTTACCAAGTCGGCCCACACCGCGCCTTTGAGTATAGGTGTCTTTAGGGTGCGCTATAATGCAACTGGTACCAGTGCTACTGTAACTGGTTGACCATATGCCTTACTGTTCTCAGGCATGGTCAACAAACAAACTGACGGGTTAAAGGATCTACCCTTTAACAATAACCGCTGGTTTGAATATGTACCACGGATGGCAGTTGCTGGCGCTAAGTTCGTTGGTAGGGAACTCGTTTTAGCGGGTACCATTACCATGGGTGATACCGCTACCGTACCTCGCTTACTGTACGATGAACTTGAAAGCAACCTGAACTTAGTAGCGCAAGGCCAAGGTCTTTTACGCGAAGACTTGCAACTCTTCACACCCTACGGATGAGCCAATCGTCCGGATTTACCAATCGGGGCTTGAAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTCACAACGCACCCTACTACTTCCACAATAACCCCGAT
所述的外壳蛋白为噬菌体MS2成熟酶和噬菌体MS2衣壳蛋白组成。
7.如权利要求1所述的一种同时检测24种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒，其特征在于，所述内标包括不含靶标基因的外源性片段假病毒，内标基因核酸序列为SEQ IDNO:77，即：
TGGTAATCGCAAACGTAATCAGAAACCTTTGGAACCAAAGTTCTCTATTGCTTTGCCTCCAGAGCTCTCTGTTGTTGAGTTTGAGGATCGCTCTAATAACTCATCTCGTGCTAGCAGTCGTTCTTCAACTCGTAACAACTCACGAGACTCTTCTCGTAGCACTTCAAGACAACAGTCTCGCACTCGTTCTGATTCTAACCAGTCTTCTTCAGATCTTGTTGCTGCTGTTACTTTGGCTTTAAAGAACTTAGGTTTTGATAACCAGTCGAAGTCACCTAGTTCTTCTGGTACTTCCACTCCTAAGAAACCGCAGCTACAATCCAGCTACCAGGCTGATAAGCCTTCTCAGTTGAAGAAACCTCGTTGGAAGCGTGTTCCTACCAGAGAGGAAAATGTTATTCAGTGCTTTGGTCCTCGTGATTTTAATCACAATATGGGGGATTCAGATCTTGTTCAGAATGGTGTTGATCGGTTTTACTATTGTCCAATAGATGCTTATTCTGCTAGGGATATCCCTTATTCTGGGTCTGGATCCGATATTTGGGATTACAGCTTGTTGGCTTCTTTTGGTAGATACTGTGATTCTTCCTGATGATTGAGCATACAGGAAGGAGAAGCTGTGCTACGTCGCCCGGGTGGTGAACCCCCCAAATGTACAATTTGTCAAATTGTTCATTGTTTGGCATAGTCACGTTCAATGCTGGATATGTGTAGTTTAAGTGGGTCAACCAATTTAATCTACTAAAGAAACTACTACTAGATTTCCTTATACAAGCAGAACTTGTTCCGTTTTGTTTGACTCCAGTCCAATTGAAGCTTTCATTGTTAAACTCCAG
所述假病毒的外壳蛋白为噬菌体MS2成熟酶和噬菌体MS2衣壳蛋白组成。
8.如权利要求6或权利要求7所述的一种同时检测24种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒，其特征在于，假病毒的制备方法步骤为：
1）采用MS2成熟酶编码基因及噬菌体衣壳蛋白编码基因的扩增引物从MS2噬菌体基因组中扩增出相关基因的全长基因；MS2成熟酶编码基因序列见GENBANK ID:V00642.1第130-1311位，噬菌体衣壳蛋白编码基因序列见GENBANK ID:V00642.1第1335-1772位，MS2噬菌体基因组序列见GENBANK ID:V00642.1；
2）将噬菌体MS2成熟酶编码基因和噬菌体衣壳蛋白编码基因依次克隆进入表达载体pET32a，获得含有噬菌体MS2成熟酶编码基因和噬菌体衣壳蛋白编码基因的重组质粒；
3）将所述的甲型流感病毒、冠状病毒OC43检测区域的RNA串联片段或内标基因克隆进去含有噬菌体MS2成熟酶编码基因和噬菌体衣壳蛋白编码基因的重组质粒，所述的甲型流感病毒、冠状病毒OC43检测区域的RNA串联片段或内标基因置于噬菌体MS2成熟酶编码基因和噬菌体衣壳蛋白编码基因的下游；
4）将克隆好的重组质粒转入表达宿主菌，宿主菌为大肠杆菌BL21（DE3）；
5)诱导培养所述的重组菌，即可得到假病毒颗粒或内标假病毒颗粒。
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