TW202140799A - SARS-CoV-2之偵測的檢驗 - Google Patents
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Abstract
本發明是關於包含臨床樣品的樣品中檢測SARS-CoV-2存在的方法,且是關於對此種檢驗有用的寡核苷酸、試劑和套組。詳細而言,本發明是關於對SARS-CoV-2的偵測而言是快速、準確和具有特異性的檢驗。
Description
本發明是關於包含臨床樣品的樣品中檢驗SARS-CoV-2存在的方法,且是關於對此種檢驗有用的寡核苷酸、試劑和套組。詳細而言,本發明是關於對SARS-CoV-2而言快速、準確和具有特異性的檢驗。
I.
SARS-CoV-2
嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2
)是一種新鑑定出的冠狀病毒(此病毒先前暫時命名為「2019年新型冠狀病毒」或「2019-nCoV」)。透過人和人之間的飛沫或直接接觸傳播而散佈SARS-CoV-2感染,且據估計感染的平均潛伏期為6.4天,而基本繁殖數為2.24-3.58(即流行病倍增時間為6-8天)(Fang, Y.et al
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冠狀病毒(Coronavirus,CoV)屬於冠狀病毒科(Coronaviridae
)的正冠狀病毒亞科(Orthocoronavirinae
),屬於網巢病毒目(Nidovirale
)。 冠狀病毒科的病毒是有套膜的單股RNA病毒,其擁有長度為26至32千個鹼基的正意義(positive-sense)RNA基因組。已鑑定出冠狀病毒的四個屬,即α冠狀病毒(αCoV)、β冠狀病毒(βCoV)、δ冠狀病毒(δCoV)和γ冠狀病毒(γCoV)(Chan, J.F.et al
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在2019年之前,僅已知六種冠狀病毒對人類具有致病性。這些物種中有四種與輕度的臨床症狀相關,但有兩種冠狀病毒,嚴重急性呼吸道症候群(Severe Acute Respiratory Syndrome,SARS)冠狀病毒(SARS-CoV
)(Marra, M.A.et al
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)(Mackay, I.M. (2015) “MERS Coronavirus: Diagnostics, Epidemiology And Transmission
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SARS-CoV-2與兩種衍生自蝙蝠的類嚴重急性呼吸道症候群的冠狀病毒bat-SL-CoVZC45和bat-SL-CoVZXC21密切相關(88%),而與SARS-CoV(79%) 和MERS-CoV(50%)較不相關(Xie, C.et al
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已從至少170個分離株中對SARS-CoV-2基因組進行了定序。 參考序列為GenBank NC_045512 (Wang, C.et al
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病毒的多個分離株(MN988668和NC_045512,其從中國武漢分離,和MN938384.1、MN975262.1、MN985325.1、MN988713.1、MN994467.1、MN994468.1和MN997409.1 )的序列比較顯示超過99.99%的相似度(Sah, R.et al
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. (2020) “Genomic Characterization Of The 2019 Novel Human-Pathogenic Corona Virus Isolated From A Patient With Atypical Pneumonia After Visiting Wuhan
,” Emerg Microbes Infect 9:221-236; Chan, J.F.et al
. (2020) “Improved Molecular Diagnosis Of COVID-19 By The Novel, Highly Sensitive And Specific COVID-19-RdRp/Hel Real-Time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay Validated In Vitro And With Clinical Specimens
,” J Clin. Microbiol. JCM.00310-20. doi: 10.1128/JCM.00310-20)。基於其與相關冠狀病毒的同源性,SARS-CoV-2預期會編碼12個開放閱讀框(open reading frame,ORF
)編碼區(ORF1ab
、S
(棘蛋白)、3
、E
(套膜蛋白)、M
(基質) 、7
、8
、9
、10b
、N
、13
和14
。圖1中顯示這些編碼區的排列。兩個ORF編碼區對本發明特別重要:ORF1ab和S基因(Lu, R.et al
. (2020) “Genomic Characterisation And Epidemiology Of 2019 Novel Coronavirus: Implications For Virus Origins And Receptor Binding
,” Lancet 395(10224):565-574)。A. ORF1ab
ORF1ab由21290個核苷酸所構成且編碼一個長度為7096個胺基酸的開放閱讀框(GenBank NC_045512的SARS-CoV-2的ORF1ab的正意義(「有義(sense)」)股序列為SEQ ID NO:16的核苷酸序列)。經由-1核醣體框移(ribosomal frameshift),編碼的蛋白質是由4401個胺基酸殘基的第一片段(pp1a)和2695個胺基酸殘基的第二片段(pp1ab)所構成的聚蛋白(polyprotein,pp) (Chen, Y,et al
. (2020) “Emerging Coronaviruses: Genome Structure, Replication, And Pathogenesis
,” J. Med. Virol. 92:418-423; Lu, R.et al
. (2020) “Genomic Characterisation And Epidemiology Of 2019 Novel Coronavirus: Implications For Virus Origins And Receptor Binding
,” Lancet 395(10224):565-574)。兩個片段均包含相同的180個胺基酸長的前導序列(leader sequence)。聚蛋白包含多種非結構蛋白(non-structural protein,nsp
):638個胺基酸長的nsp2
蛋白、1945個胺基酸長的nsp3
蛋白、500個胺基酸長的nsp4
蛋白、306個胺基酸長的nsp5
蛋白、290個胺基酸長的nsp6
蛋白、83個胺基酸長的nsp7
蛋白、198個胺基酸長的nsp8
蛋白、113個胺基酸長的nsp9
單股結合蛋白、139個胺基酸長的nsp10
蛋白、923個胺基酸長的nsp12
RNA依賴性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp
)、601個胺基酸長的nsp13
解旋酶、527個胺基酸長的nsp14a2
3’→5’核酸外切酶、346個胺基酸長的nsp15
核糖核酸內切酶、和298個胺基酸長的nsp16
2’-O-核糖-甲基轉移酶(Chen, Y,et al
. (2020) “Emerging Coronaviruses: Genome Structure, Replication, And Pathogenesis
,” J. Med. Virol. 92:418-423; Lu, R.et al
. (2020) “Genomic Characterisation And Epidemiology Of 2019 Novel Coronavirus: Implications For Virus Origins And Receptor Binding
,” Lancet 395(10224):565-574)。B. S 基因
S基因編碼SARS-CoV-2棘蛋白(GenBank NC_045512的SARS-CoV-2的S基因正意義(有義「sense」)股序列是SEQ ID NO: 17的核苷酸序列)。SARS-CoV的S蛋白在功能上被切割成兩個次單元:S1 結構域
和S2 結構域
(He, Y.et al
. (2004) “Receptor-Binding Domain Of SARS-CoV Spike Protein Induces Highly Potent Neutralizing Antibodies: Implication For Developing Subunit Vaccine
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. (2004) “Receptor-Binding Domain Of SARS-CoV Spike Protein Induces Highly Potent Neutralizing Antibodies: Implication For Developing Subunit Vaccine
, Biochem. Biophys. Res. Commun. 324:773-781)。SARS-CoV-2的S基因可具有相似的功能。 因此,冠狀病毒的棘蛋白被認為對判斷宿主向性(host tropism)和傳播能力至關重要(Lu, G.et al
. (2015) “Bat-To-Human: Spike Features Determining ‘Host Jump’ Of Coronaviruses SARS-CoV, MERS-CoV, And Beyond
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. (2016) “MERS-CoV Spike Protein: Targets For Vaccines And Therapeutics
,” Antiviral. Res. 133:165-177)。就這方面而言,SARS-CoV-2棘蛋白的S2結構域顯示出與bat-SL-CoVZC45和bat-SL-CoVZXC21有高度序列相似度(93%),但SARS-CoV-2 S1結構域顯示出與這些衍生自蝙蝠的病毒有較低程度的相似度(68%)(Lu, R.et al
. (2020) “Genomic Characterisation And Epidemiology Of 2019 Novel Coronavirus: Implications For Virus Origins And Receptor Binding
,” Lancet 395(10224):565-574)。因此,SARS-CoV-2可能會結合至與其相關衍生自蝙蝠的病毒所結合的受體不同的受體。 有人提出SARS-CoV-2可作為細胞受體結合至血管收縮素轉化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2
)。(Lu, R.et al
. (2020) “Genomic Characterisation And Epidemiology Of 2019 Novel Coronavirus: Implications For Virus Origins And Receptor Binding
,” Lancet 395(10224):565-574)。II. 偵測 SARS-CoV-2 的檢驗
SARS-CoV-2最早於2019年底被鑑定出來,且被認為是以前不存在的獨特病毒。 SARS-CoV-2的第一個診斷測試使用即時反轉錄PCR (rRT-PCR
)檢驗,其採用SARS-CoV-2 E、N和nsp12(RNA依賴性RNA聚合酶;RdRp)基因的探針和引子(「SARS-CoV-2-RdRp-P2
」檢驗)(Corman, V.M.et al
. (2020) “Detection Of 2019 Novel Coronavirus (2019-nCoV) By Real-Time RT-PCR
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在此種檢驗中所採用的探針是在寡核苷酸的5’端標記有螢光團,且在寡核苷酸的3’端與淬滅劑複合的「TaqMan
」寡核苷酸探針。「TaqMan
」探針原理是,當雙標記探針與互補目標序列雜交,其依靠Taq聚合酶的5’→3’核酸外切酶活性(Peake, I. (1989) “The Polymerase Chain Reaction
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在Corman, V.M.等人(2020)的SARS-CoV-2-RdRp-P2檢驗中,RdRp探針2以及E和N基因的探針被描述為對SARS-CoV-2有特異性,而RdRp探針2被描述為除SARS-CoV-2之外,還偵測bat-SARS相關的冠狀病毒和SARS-CoV的「PanSarbeco探針」。據稱此檢驗使用E基因和nsp12 (RdRp)基因引子和探針能提供最佳結果(95%偵測率每25 μL反應分別為5.2和3.8拷貝)。 對於E基因檢驗,重複測試的檢測極限(limit of detection,LoD
)為每25 μL反應3.9拷貝(156拷貝/mL),而對於nsp12(RdRp)檢驗為每25 μL反應3.6拷貝(144拷貝/mL)。 報導指出此檢驗對SARS-CoV-2有特異性,只需不到60分鐘即可完成。
美國疾病控制與預防中心(Center for Disease Control and Prevention,CDC)研發出一種基於rRT-PCR的檢驗程序,其針對SARS-CoV-2 N基因 (Won, J.et al
. (2020) “Development Of A Laboratory-Safe And Low-Cost Detection Protocol For SARS-CoV-2 Of The Coronavirus Disease 2019 (COVID-19)
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Pfefferle, S.等人(2020) (“Evaluation Of A Quantitative RT-PCR Assay For The Detection Of The Emerging Coronavirus SARS-CoV-2 Using A High Throughput System
,” Eurosurveill. 25(9) doi: 10.2807/1560-7917.ES.2020.25.9.2000152)揭露了針對E基因的客製化引子/探針組的用途。用2’-O-甲基鹼基修飾所採用的引子的倒數第二個鹼基,以防止形成引子二聚體。ZEN雙淬滅探針(IDT)用於降低背景螢光。在95%偵測率,LoD為689.3拷貝/mL,其中每個反應275.72拷貝。報導指出此檢驗對SARS-CoV-2有特異性且需要不到60分鐘的時間。
Chan, J.F.等人(2020) (“Improved Molecular Diagnosis Of COVID-19 By The Novel, Highly Sensitive And Specific COVID-19-RdRp/Hel Real-Time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay Validated In Vitro And With Clinical Specimens
,” J. Clin. Microbiol. JCM.00310-20. doi: 10.1128/JCM.00310-20) 探索了保守和/或大量表現的SARS-CoV-2基因作為冠狀病毒RT-PCR檢驗的較佳目標的用途。此種基因包含結構性S和N基因,以及非結構性RdRp基因和ORF1ab。Chan, J.F.等人(2020)描述了三種針對SARS- CoV-2的RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)/解旋酶(Hel)、棘(S)和核蛋白殼(nucleocapsid)(N)基因的即時反轉錄酶PCR(rRT-PCR)檢驗的發展,且將此種檢驗與Corman, V.M.et al
的RdRp-P2檢驗進行比較。SARS-CoV-2-RdRp/Hel檢驗、SARS-CoV-2-S檢驗和SARS-CoV-2-N檢驗的LoD為1.8 TCID50
/ml,而SARS-CoV-2-RdRp-P2檢驗為18 TCID50
/ml。TCID50
是組織培養感染劑量的中位數。
對經由咽拭子(pharyngeal swab)從對象自身收集的檢體,設計了針對E、N、S和RdRp基因之基於rt-PCR的檢驗程序。此檢驗需要基於Trizol的RNA純化,且透過使用SYBR Green作為偵測螢光的RT-PCR檢驗,來完成偵測。報導指出此檢驗大約需要4個小時完成(Won, J.et al
. (2020) (“Development Of A Laboratory-Safe And Low-Cost Detection Protocol For SARS-CoV-2 Of The Coronavirus Disease 2019 (COVID-19)
,” Exp. Neurobiol. 29(2) doi: 10.5607/en20009)。
儘管先前的rRT-PCR檢驗,例如Corman V.M.等人的SARS-CoV-2-RdRp-P2檢驗,能夠偵測到SARS-CoV-2,但研究人員發現它們有嚴重缺陷。在使用中,已經發現這種先前的檢驗需要費力的分批手動處理,且不允許隨機獲取個別樣品(Cordes, A.K.et al
. (2020) “Rapid Random Access Detection Of The Novel SARS-Coronavirus-2 (SARS-CoV-2, Previously 2019-nCoV) Using An Open Access Protocol For The Panther Fusion
,” J. Clin. Virol. 125:104305 doi: 10.1016/j.jcv.2020.104305)。另外,需要長時間的周轉時間(turnaround time)和複雜的操作。這些因素導致此種檢驗通常需要超過2-3個小時才能產生結果。由於這些因素的緣故,需要通過認證的實驗室來處理此種檢驗。需要昂貴的設備和訓練有素的技術人員來執行這種先前的rRT-PCR檢驗,這阻礙了在現場或在移動位置使用這種檢驗。因此,研究人員發現先前的這種檢驗在需要使用快速且簡單地診斷和對控制疫情進行的病患篩檢的適用性有限 (Li, Z.et al
. (2020) “Development and Clinical Application of A Rapid IgM-IgG Combined Antibody Test for SARS-CoV-2 Infection Diagnosis
,” J. Med. Virol. doi: 10.1002/jmv.25727)。
更重要的是,已發現先前的rRT-PCR檢驗,例如Corman V.M.等人的SARS-CoV-2-RdRp-P2檢驗,對SARS-CoV-2 缺乏特異性
(與SARS-CoV或其他病原體交叉反應)(Chan, J.F.et al
. (2020) “Improved Molecular Diagnosis Of COVID-19 By The Novel, Highly Sensitive And Specific COVID-19-RdRp/Hel Real-Time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay Validated In Vitro And With Clinical Specimens
,” J. Clin. Microbiol. JCM.00310-20)且提供為數眾多的偽陰性結果
(Li, Z.et al
. (2020) “Development and Clinical Application of A Rapid IgM-IgG Combined Antibody Test for SARS-CoV-2 Infection Diagnosis
,” J. Med. Virol. doi: 10.1002/jmv.25727)。
例如,對4880名臨床確診有COVID-19的病人進行回溯性分析。從病人的呼吸道獲得的樣品經過SARS-CoV-2開放閱讀框1ab (ORF1ab)和核蛋白殻蛋白(N)基因的rRT-PCR擴增。使用定量rRT-PCR(qRT-PCR)測試,來評估病人的鼻拭子和咽拭子的COVID-19。使用rRT-PCR測試,只有38.42%的實際COVID-19病人(4880中的1875個)被鑑定為陽性。在測試為陽性的那些人中,39.80%藉由SARS-CoV-2 N基因的探針判斷為陽性,而40.98%藉由SARS-CoV-2 ORF1ab的探針判斷為陽性(Liu, R.et al
. (2020) “Positive Rate Of RT-PCR Detection Of SARS-CoV-2 Infection In 4880 Cases From One Hospital In Wuhan, China, From Jan To Feb 2020
,” Clinica Chimica Acta 505:172-175)。
Chan, J.F.等人(2020)(“Improved Molecular Diagnosis Of COVID-19 By The Novel, Highly Sensitive And Specific COVID-19-RdRp/Hel Real-Time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay Validated In Vitro And With Clinical Specimens
,” J. Clin. Microbiol. JCM.00310-20. doi: 10.1128/JCM.00310-20)的研究發現,在來自實驗室確診的15位COVID-19病人的273個檢體中,SARS-CoV-2-RdRp/Hel和RdRp-P2檢驗皆陽性的比例僅28%。SARS-CoV-2-RdRp/Hel檢驗更為敏感,但仍僅43.6%的病人確認患有SARS-CoV-2感染。
在不同研究中,從患有COVID-19的205位病人的1070個臨床樣品中提取RNA。然後使用即時反轉錄PCR (rRT-PCR)來擴增SARS-CoV-2 ORF1ab,以確認COVID-19的診斷(Wang, W.et al
. (2020) (“Detection of SARS-CoV-2 in Different Types of Clinical Specimens
,” JAMA doi: 10.1001/jama.2020.3786)。報導指出支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid)檢體展現出最高的陽性率(15個中有14個;93%),其次是痰(104個中有72個;72%)、鼻拭子(8個中有5個; 63%)、纖維支氣管鏡刷洗切片(fibrobronchoscope brush biopsy)(13個中有6個;46%)、咽拭子(398個中有126;32%)、糞便(153個中有44個;29%)和血液(307個中有3個;1%)。測試的72個尿液檢體均未顯示陽性結果。因此,例如,來自此類實際COVID-19病人的咽拭子中,68%的受測試者未能準確診斷出SARS-CoV-2感染。Zhang, W.等人(2020) (“Molecular And Serological Investigation Of 2019-nCoV Infected Patients: Implication Of Multiple Shedding Routes
,” Emerg. Microbes Infect. 9(1):386-389)亦揭露在COVID-19病人的糞便中存在SARS-CoV-2,然而,其rRT-PCR檢驗結果顯示,在感染後期,肛門拭子陽性率要高於口腔拭子陽性率,這表明病毒的脫落和感染的能力是透過口腔-糞便途徑傳播的。Tang, A.等人(2020) (“Detection of Novel Coronavirus by RT-PCR in Stool Specimen from Asymptomatic Child, China
,” Emerg Infect Dis. 26(6). doi: 10.3201/eid2606.200301)提供了類似的教示。此文件揭露了針對ORF1ab和核蛋白N基因的RT-PCR檢驗無法偵測出鼻咽拭子和痰樣品中的SARS-CoV-2,但是能夠檢測出糞便樣品中的病毒。
在對患有COVID-19的個體的進一步研究中,還發現SARS-CoV-2的重複檢驗報導出陰性結果(Wu, X.et al
. (2020) (“Co-infection with SARS-CoV-2 and Influenza A Virus in Patient with Pneumonia, China
,” 26(6):pages 1-7)。此出版物教示了SARS-CoV-2的現有檢驗法缺乏足夠的靈敏度,因此導致偽陰性診斷。
鑑於使用先前的rRT-PCR檢驗法,例如Corman V.M.等人的SARS-CoV-2-RdRp-P2檢驗法所遇到的缺陷,已探討了其他檢驗SARS-CoV-2的方法。Li, Z. 等人 (2020)
(“Development and Clinical Application of A Rapid IgM-IgG Combined Antibody Test for SARS-CoV-2 Infection Diagnosis
,” J. Med. Virol. doi: 10.1002/jmv.25727)教示即時檢測側流式免疫檢驗法(point-of-care lateral flow immunoassay)可用於同時偵測人類血液中的抗SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體,從而避免了Corman, V.M.等人的RdRp-P2檢驗法的問題。然而,免疫檢驗法可能無法區分患有COVID-19的個體和先前感染過SARS-CoV-2但已康復的個體。
總體而言,儘管已有先前所作的所有努力,但仍需要一種快速且準確檢驗SARS-CoV-2存在的方法。本發明是關於此目標和其他目標。
本發明是關於於包含臨床樣品的樣品中檢驗SARS-CoV-2存在的方法,且是關於於此類檢驗中有用的寡核苷酸、試劑和套組。詳細而言,本發明是關於對SARS-CoV-2的偵測而言是快速、準確和有特異性的檢驗。
詳細而言,本發明提供了具有5’端和3’端的寡核苷酸,其中寡核苷酸具有由以下核苷酸序列所組成、實質上由以下核苷酸序列所組成、或包含以下核苷酸序列的核苷酸序列:SEQ ID NO: 1 、 SEQ ID NO: 2 、 SEQ ID NO: 3 、 SEQ ID NO: 4 、 SEQ ID NO: 5 、 SEQ ID NO: 6 、 SEQ ID NO: 7 、 SEQ ID NO: 8 、 SEQ ID NO: 9 、 SEQ ID NO: 10 、 SEQ ID NO: 11 或 SEQ ID NO: 12
。
本發明還提供了具有5’端和3’端的寡核苷酸,其中寡核苷酸具有由以下核苷酸序列所組成的核苷酸序列:SEQ ID NO: 1 、 SEQ ID NO: 2 、 SEQ ID NO: 3 、 SEQ ID NO: 4 、 SEQ ID NO: 5 、 SEQ ID NO: 6 、 SEQ ID NO: 7 、 SEQ ID NO: 8 、 SEQ ID NO: 9 、 SEQ ID NO: 10 、 SEQ ID NO: 11 或 SEQ ID NO: 12
。
本發明還提供上述寡核苷酸,其中寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列所組成的核苷酸序列。
本發明還提供上述寡核苷酸,其中寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列所組成的核苷酸序列。
本發明還提供上述寡核苷酸,其中寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 3
的核苷酸序列所組成的核苷酸序列。
本發明還提供上述寡核苷酸,其中寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 4
的核苷酸序列所組成的核苷酸序列。
本發明還提供上述寡核苷酸,其中寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 5
的核苷酸序列所組成的核苷酸序列。
本發明還提供上述寡核苷酸,其中寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 6
的核苷酸序列所組成的核苷酸序列。
本發明還提供上述寡核苷酸,其中寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 7
的核苷酸序列所組成的核苷酸序列。
本發明還提供上述寡核苷酸,其中寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 8
的核苷酸序列所組成的核苷酸序列。
本發明還提供上述寡核苷酸,其中寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 9
的核苷酸序列所組成的核苷酸序列。
本發明還提供上述寡核苷酸,其中寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列所組成的核苷酸序列。
本發明還提供上述寡核苷酸,其中寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 11
的核苷酸序列所組成的核苷酸序列。
本發明還提供上述寡核苷酸,其中寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列所組成的核苷酸序列。
本發明還提供上述寡核苷酸,其中寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 9
的核苷酸序列或SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列所組成的核苷酸序列,其中寡核苷酸具有以螢光團標記的5’端和與螢光團的螢光淬滅劑複合的3’端。
本發明還提供上述寡核苷酸,其中寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 11
的核苷酸序列或SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列所組成的核苷酸序列,其中寡核苷酸具有以螢光團標記的5’端和與螢光團的螢光淬滅劑複合的3’端。
本發明還提供了上述寡核苷酸的實施例,其中螢光團的激發波長在約352-690 nm的範圍內,而發射波長在約447-705 nm的範圍內。
本發明還提供了此種上述寡核苷酸的實施例,其中螢光團是JOE
或FAM
。
本發明還提供了一種於臨床樣品中偵測SARS-CoV-2存在的方法,其中此方法包含:
(I) 在以下所述存在的情況下,體外(in vitro
)培養臨床樣品:
(1) 反轉錄酶和具有5’→3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶;和
(2) 正向ORF1ab引子,其具有由SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列的核苷酸序列;
(3) 反向ORF1ab引子,其具有由SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列的核苷酸序列;
(4) ORF1ab探針,此ORF1ab探針是具有由SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸,其中ORF1ab探針寡核苷酸具有以螢光團標記的5’端和與螢光團的螢光淬滅劑複合的3’端;且
其中在足以允許以下條件的反應中進行培養步驟:
(a) 如果臨床樣品中存在SARS-CoV-2,則正向和反向ORF1ab引子得以介導SARS-CoV-2的ORF1ab的區域的聚合酶連鎖反應擴增,從而產生擴增的ORF1ab寡核苷酸分子;
(b) ORF1ab探針得以與擴增的ORF1ab寡核苷酸分子雜交;
(c) 5’→3’核酸外切酶活性得以水解雜交的ORF1ab探針,從而使ORF1ab探針的螢光團與ORF1ab探針的淬滅劑分離,使螢光訊號變成可偵測的;以及
(II) 藉由判斷螢光團的螢光訊號是否變成可偵測的,來判斷臨床樣品中是否存在SARS-CoV-2。
本發明還提供了上述方法的實施例,其中螢光團的激發波長在約352-690 nm的範圍內,而發射波長在約447-705 nm的範圍內。
本發明還提供了此種上述方法的實施例,其中螢光團是JOE
或FAM
。
本發明還提供了一種於臨床樣品中偵測SARS-CoV-2存在的方法,其中此方法包含:
(I) 在以下所述存在的情況下,體外(in vitro
)培養臨床樣品:
(1) 反轉錄酶和具有5’→3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶;和
(2) 正向S基因引子,其具有由SEQ ID NO: 5
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 5
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 5
的核苷酸序列的核苷酸序列;
(3) 反向S基因引子,其具有由SEQ ID NO: 6
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 6
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 6
的核苷酸序列的核苷酸序列;
(4) S基因探針,此S基因探針是具有由SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸,其中S基因探針寡核苷酸具有以螢光團標記的5’端和與螢光團的螢光淬滅劑複合的3’端;且
其中在足以允許以下條件的反應中進行培養步驟:
(a) 如果臨床樣品中存在SARS-CoV-2,則正向和反向S基因引子得以介導SARS-CoV-2的S基因的區域的聚合酶連鎖反應擴增,從而產生擴增的S基因寡核苷酸分子;
(b) S基因探針得以與擴增的S基因寡核苷酸分子雜交;
(c) 5’→3’核酸外切酶活性得以水解雜交的S基因探針,從而使其螢光團與淬滅劑分離,使螢光訊號變成可偵測的;以及
(II) 藉由判斷螢光團的螢光訊號是否變成可偵測的,來判斷臨床樣品中是否存在SARS-CoV-2。
本發明還提供上述方法的實施例,其中螢光團的激發波長在約352-690 nm的範圍內,而發射波長在約447-705 nm的範圍內。
本發明還提供了上述寡核苷酸的實施例,其中螢光團是JOE
或FAM
。
本發明還提供了一種於臨床樣品中偵測SARS-CoV-2存在的方法,其中此方法包含:
(I) 在以下所述存在的情況下,體外(in vitro
)培養臨床樣品:
(1) 反轉錄酶和具有5’→3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶;和
(2) 正向S基因引子,其具有由SEQ ID NO: 5
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 5
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 5
的核苷酸序列的核苷酸序列;
(3) 反向S基因引子,其具有由SEQ ID NO: 6
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 6
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 6
的核苷酸序列的核苷酸序列;
(4) S基因探針,此S基因探針是具有由SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸,其中S基因探針寡核苷酸具有以螢光團標記的5’端和與螢光團的螢光淬滅劑複合的3’端;和
(5) 正向ORF1ab引子,其具有由SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列的核苷酸序列;
(6) 反向ORF1ab引子,其具有由SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列的核苷酸序列;
(7) ORF1ab探針,此ORF1ab探針是具有由SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸,其中ORF1ab探針寡核苷酸具有以螢光團標記的5’端和與螢光團的螢光淬滅劑複合的3’端;其中ORF1ab探針的螢光團的螢光和S基因探針的螢光團的螢光是可區分的;且
其中在足以允許以下條件的反應中進行培養步驟:
(a) 如果臨床樣品中存在SARS-CoV-2,則正向和反向S基因引子得以介導SARS-CoV-2的S基因的區域的聚合酶連鎖反應擴增,從而產生擴增的S基因寡核苷酸分子;
(b) S基因探針得以與擴增的S基因寡核苷酸分子雜交;
(c) 5’→3’核酸外切酶活性得以水解雜交的S基因探針,從而使其螢光團與淬滅劑分離,使螢光訊號變成可偵測的;以及
(II) 藉由判斷螢光團的螢光訊號是否變成可偵測的,來判斷臨床樣品中是否存在SARS-CoV-2。
本發明還提供此種方法的實施例,其中ORF1ab探針的螢光團和S基因探針的螢光團的激發波長在約352-690 nm的範圍內,而發射波長在約447-705 nm的範圍內。
本發明還提供了此種方法的實施例,其中ORF1ab探針和S基因探針的螢光團中的一者是JOE
而此種螢光團的另一者是FAM
。
本發明還提供了一種於臨床樣品中偵測SARS-CoV-2存在的套組,其中此套組包含:
(I) 含有試劑的容器,其中此試劑包含:
(1) 正向ORF1ab引子,其具有由SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列的核苷酸序列;
(2) 反向ORF1ab引子,其具有由SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列的核苷酸序列;
(3) ORF1ab探針,此ORF1ab探針是具有由SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸,其中ORF1ab探針寡核苷酸具有以螢光團標記的5’端和與螢光團的螢光淬滅劑複合的3’端;和
(II) 使用此種試劑來判斷臨床樣品中是否存在SARS-CoV-2的說明書。
本發明還提供此種套組的實施例,其中ORF1ab探針的螢光團的激發波長在約352-690 nm的範圍內,而發射波長在約447-705 nm的範圍內。
本發明還提供了此種套組的實施例,其中ORF1ab探針的螢光團是JOE
或FAM
。
本發明還提供了於臨床樣品中偵測SARS-CoV-2存在的套組,其中此套組包含:
(I) 含有試劑的容器,其中此試劑包含:
(1) 正向S基因引子,其具有由SEQ ID NO: 5
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 5
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 5
的核苷酸序列的核苷酸序列;
(2) 反向S基因引子,其具有由SEQ ID NO: 6
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 6
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 6
的核苷酸序列的核苷酸序列;
(3) S基因探針,此S基因探針是具有由SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸,其中S基因探針寡核苷酸具有以螢光團標記的5’端和與螢光團的螢光淬滅劑複合的3’端;和
(II) 使用此種試劑來判斷臨床樣品中是否存在SARS-CoV-2的說明書。
本發明還提供此種套組的實施例,其中S基因探針的螢光團的激發波長在約352-690 nm的範圍內,而發射波長在約447-705 nm的範圍內。
本發明還提供此種套組的實施例,其中S基因探針的螢光團是JOE
或FAM
。
本發明還提供了一種於臨床樣品中偵測SARS-CoV-2存在的套組,其中此套組包含:
(I) 用於偵測SARS-CoV-2的ORF1ab的試劑,其中SARS-CoV-2的ORF1ab的偵測試劑包含:
(1) 正向ORF1ab引子,其具有由SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列的核苷酸序列;
(2) 反向ORF1ab引子,其具有由SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列的核苷酸序列;和
(3) ORF1ab探針,此ORF1ab探針是具有由SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸,其中ORF1ab探針寡核苷酸具有以螢光團標記的5’端和與螢光團的螢光淬滅劑複合的3’端;且
(II) 使用此種偵測試劑來偵測臨床樣品中是否存在SARS-CoV-2的說明書。
本發明還提供此種套組的實施例,其中ORF1ab探針的螢光團的激發波長在約352-690 nm的範圍內,而發射波長在約447-705 nm的範圍內。本發明還提供了此種套組的實施例,其中ORF1ab的螢光團是JOE
或FAM
。
本發明還提供了一種於臨床樣品中偵測SARS-CoV-2存在的套組,其中此套組包含:
(I) 用於偵測SARS-CoV-2的S基因的試劑,其中SARS-CoV-2的S基因的偵測試劑包含:
(1) 正向S基因引子,其具有由SEQ ID NO: 5
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 5
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 5
的核苷酸序列的核苷酸序列;
(2) 反向S基因引子,其具有由SEQ ID NO: 6
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 6
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 6
的核苷酸序列的核苷酸序列;
(3) S基因探針,此S基因探針是具有由SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸,其中S基因探針寡核苷酸具有以螢光團標記的5’端和與螢光團的螢光淬滅劑複合的3’端;和
(II) 使用此種偵測試劑來偵測臨床樣品中是否存在SARS-CoV-2的說明書。
本發明還提供此種套組的實施例,其中S基因探針的螢光團的激發波長在約352-690 nm的範圍內,而發射波長在約447-705 nm的範圍內。本發明還提供了此種套組的實施例,其中ORF1ab的螢光團是JOE
或FAM
。
本發明還提供了一種於臨床樣品中偵測SARS-CoV-2存在的套組,其中此套組包含:
(I) (A) 用於偵測SARS-CoV-2的ORF1ab的試劑,其中SARS-CoV-2的ORF1ab的偵測試劑包含:
(1) 正向ORF1ab引子,其具有由SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列的核苷酸序列;
(2) 反向ORF1ab引子,其具有由SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列的核苷酸序列;和
(3) ORF1ab探針,此ORF1ab探針是具由SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸,其中ORF1ab探針寡核苷酸具有以螢光團標記的5’端和與螢光團的螢光淬滅劑複合的3’端;和
(B) 用於偵測SARS-CoV-2的S基因的試劑,其中SARS-CoV-2的S基因的偵測試劑包含:
(1) 正向S基因引子,其具有由SEQ ID NO: 5
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 5
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 5
的核苷酸序列的核苷酸序列;
(2) 反向S基因引子,其具有由SEQ ID NO: 6
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 6
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 6
的核苷酸序列的核苷酸序列;和
(3) S基因探針,此S基因探針是具有由SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸,其中S基因探針寡核苷酸具有以螢光團標記的5’端和與螢光團的螢光淬滅劑複合的3’端;其中S基因探針的螢光團的螢光和ORF1ab探針的螢光團的螢光是可區分的;以及
(II) 使用此種試劑來偵測臨床樣品中是否存在SARS-CoV-2的說明書。
本發明還提供此種套組的實施例,其中ORF1ab探針的螢光團和S基因探針的螢光團的激發波長在約352-690 nm的範圍內,而發射波長在約447-705 nm的範圍內。
本發明還提供此種套組的實施例,其中ORF1ab探針和S基因探針的螢光團中的一者是JOE ,
而此種螢光團的另一者是FAM
。
本發明是關於包含臨床樣品的樣品中檢驗SARS-CoV-2存在的方法,且是關於對此類檢驗中有用的寡核苷酸、試劑和套組。詳細而言,本發明是關於對SARS-CoV-2的偵測而言是快速、準確和有特異性的檢驗。
如本文所使用地,如果可在允許偵測到SARS-CoV-2而又不會對人類DNA或其他病原體,尤其是其他冠狀病毒病原體的DNA(或cDNA)展現出交叉反應性的條件下進行,則偵測SARS-CoV-2的檢驗被認為對SARS-CoV-2有「特異性
」。詳細而言,如果可在允許偵測到SARS-CoV-2而又不會對A型流感(Influenza A)、B型流感(Influenza B)、呼吸道融合病毒(Respiratory Syncytial Virus)、A型鏈球菌(Group AStreptococcus
)(化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes
))、I型副流感(Parainfluenza I)、III型副流感(Parainfluenza III)、副流感嗜血桿菌(Haemophilus parainfluenzae
)、腸病毒(Enterovirus)或腺病毒(Adenovirus)、或SARS-CoV、MERS-CoV或衍生自蝙蝠的嚴重急性類呼吸道症候群冠狀病毒,例如bat-SL-CoVZC45或bat-SL-CoVZXC21的DNA(或cDNA)展現出交叉反應性的條件下進行,則偵測SARS-CoV-2的檢驗被認為對SARS-CoV-2有特異性。更佳地,如果可在允許偵測到SARS-CoV-2而又不會對腺病毒1 (Adenovirus 1)、百日咳嗜血桿菌(Bordetella pertussis
)、肺炎披衣菌(Chlamydophila pneumoniae
)、冠狀病毒229E (Coronavirus 229E)、冠狀病毒NL63 (Coronavirus NL63)、冠狀病毒OC43 (Coronavirus OC43)、腸病毒68 (Enterovirus 68)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae
)、人類間質肺炎病毒(Human metapneumovirus)(hMPV-9)、A型流感H3N2 (Influenza A H3N2)(香港8/68)、B型流感(Influenza B)(普吉島(Phuket)3073/2013))、嗜肺性退伍軍人桿菌(Legionella pneumophilia
)、MERS冠狀病毒(MERS-Coronavirus)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis
)、1型副流感(Parainfluenza Type 1)、2型副流感(Parainfluenza Type 2)、3型副流感(Parainfluenza Type 3)、4A型副流感(Parainfluenza Type 4A)、鼻病毒B14(Rhinovirus B14)、RSV A Long、RSV B Washington、SARS冠狀病毒(SARS-Coronavirus)、SARS冠狀病毒HKU39849、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae
)、化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes
)、人類白血球(human leukocyte)或匯集人類鼻液(pooled human nasal fluid)的DNA(或cDNA)展現出交叉反應性的條件下進行,則用於偵測SARS-CoV-2的檢驗被認為對SARS-CoV-2有特異性。
如本文所使用地,如果能夠偵測到400拷貝/ml的SARS-CoV-2病毒劑量其中LoD至少為80%,且能夠偵測到SARS-CoV-2病毒劑量為500拷貝/ml其中LoD至少為90%,則偵測SARS-CoV-2的檢驗被認為對SARS-CoV-2是「準確的
」。
如本文所使用地,如果能夠在檢驗開始後的2小時內、更佳90分鐘內、最佳在1小時內判斷SARS-CoV-2存在或不存在,則偵測SARS-CoV-2的檢驗被認為對SARS-CoV-2是「快速的
」。III. 偵測 SARS-CoV-2 的較佳檢驗法 A. 較佳的檢驗格式
本發明提供了一種於臨床樣品中偵測SARS-CoV-2存在的檢驗法。此種偵測可在原位(in situ
)或體外(in vitro
)完成,但是較佳在體外進行。可評估的臨床樣品包含任何可含有SARS-CoV-2的樣品,且包含血液樣品、支氣管肺泡灌洗液樣品、糞便樣品、纖維支氣管鏡刷洗切片樣品、鼻拭子樣品、鼻咽拭子樣品、咽拭子樣品、痰樣品和尿液樣品。然而,較佳地,所採用的臨床樣品將是鼻拭子樣品、鼻咽拭子樣品、咽拭子樣品或痰樣品,且最佳地,所採用的臨床樣品將是鼻咽拭子樣品。在一實施例中,將預處理樣品以提取樣品中可能存在的RNA。 或者,且更佳地,將在沒事前提取RNA的情況下評估樣品。
本發明較佳地使用即時反轉錄酶聚合酶鏈反應(real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction,rRT-PCR
)檢驗,來偵測臨床樣品中SARS-CoV-2的存在。rRT-PCR檢驗法是眾所皆知的,且已廣泛應用於診斷病毒學中(請參閱例如,Pang, J.et al
. (2020) “Potential Rapid Diagnostics, Vaccine and Therapeutics for 2019 Novel Coronavirus (2019-nCoV): A Systematic Review
,” J. Clin. Med. 26;9(3)E623 doi: 10.3390/jcm9030623; Kralik, P.et al
. (2017) “A Basic Guide to Real-Time PCR in Microbial Diagnostics: Definitions, Parameters, and Everything
,” Front. Microbiol. 8:108. doi: 10.3389/fmicb.2017.00108)。
為了更容易地描述本發明的rRT-PCR檢驗法,可將此種檢驗法設想為涉及多個反應步驟:
(1) 可能存在於待評估SARS-CoV-2存在的臨床樣品中的SARS-CoV-2 RNA的反轉錄;
(2) 由此種反轉錄產生的SARS-CoV-2 cDNA透過PCR介導的擴增;
(3) SARS-CoV-2特異性探針與此種擴增產物的雜交;
(4) 雜交的SARS-CoV-2特異性探針的雙股依賴性5’→3’核酸外切酶切割;和
(5) 未淬滅的探針螢光團的偵測,其意味所評估的臨床樣品中含有SARS-CoV-2。
應該理解的是,這些步驟可分開進行(例如,在二或更多個反應室中,或在不同的時間添加不同步驟的試劑等)。然而,較佳的是,這些步驟將在同一反應室內進行,且在檢驗開始時,將本發明的rRT-PCR檢驗所需的所有試劑提供給反應室。還應理解的是,儘管聚合酶鏈反應(PCR
)(請參閱例如,Ghannam, M,G,et al
. (2020) “Biochemistry, Polymerase Chain Reaction (PCR)
,” StatPearls Publishing, Treasure Is.; pp.1-4; Lorenz, T.C. (2012) “Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting And Optimization Strategies
,” J. Vis. Exp. 2012 May 22;(63):e3998; pp. 1-15)是擴增反轉錄所產生的SARS-CoV-2 cDNA的較佳方法,但可替代地使用其他DNA擴增技術。
因此,在一較佳實施例中,本發明的rRT-PCR檢驗法包含在DNA聚合酶、反轉錄酶、一或多對SARS-CoV-2特異性引子、一或多個SARS-CoV-2特異性探針(通常,用於每個區域的至少一個探針以所使用的一對引子擴增)、去氧核苷酸三磷酸(deoxynucleotide triphosphate,dNTP)和緩衝液的存在下,培養臨床樣品。將培養條件循環,以允許SARS-CoV-2 RNA的反轉錄、SARS-CoV-2 cDNA的擴增、SARS-CoV-2特異性探針與此種cDNA的雜交、雜交的SARS-CoV-2特異性探針的切割和未淬滅的探針螢光團的偵測。
本發明的rRT-PCR檢驗法採用至少一組之與DNA分子的第一股的多核苷酸部分雜交的至少一個「正向」引子、及與此種DNA分子的第二(和互補)股的多核苷酸部分雜交的至少一個「反向」引子。
較佳地,此種正向和反向引子將允許擴增編碼SARS-CoV-2的非結構聚蛋白的ORF1ab區域和/或編碼病毒棘表面醣蛋白且是宿主細胞靶向所需的S基因的區域;SARS-CoV-2棘表面醣蛋白是特異性表徵冠狀病毒為SARS-CoV-2的關鍵蛋白(Chen, Y.et al
. (2020) “Structure Analysis Of The Receptor Binding Of 2019-Ncov
,” Biochem. Biophys. Res. Commun. 525:135-140; Masters, P.S. (2006) “The Molecular Biology Of Coronaviruses
,” Adv. Virus Res. 66:193-292)。單獨擴增這些目標中的任一者就足以特異性判斷臨床樣品中SARS-CoV-2的存在。然而,較佳藉由擴增這個兩個目標來檢驗SARS-CoV-2。
較佳地使用能夠與藉由上述SARS-CoV-2特異性引子擴增的寡核苷酸內存在的寡核苷酸區域雜交的探針,來偵測此種擴增分子的存在。可使用任何合適的方法來完成此種偵測,例如分子信標(beacon)探針、蝎型蝎型引子探針、TaqMan探針等(Navarro, E.et al
. (2015) “Real-Time PCR Detection Chemistry
,” Clin. Chim. Acta 439:231-250)。所有這些方法都採用標記螢光團且與此螢光團的螢光淬滅劑複合的寡核苷酸。
各式各樣的螢光團和淬滅劑是已知且是市售可得的(例如,Biosearch Technologies, Gene Link),且可根據本發明的方法使用。較佳的螢光團包含螢光團Biosearch Blue
、Alexa488
、FAM
、Oregon Green
、Rhodamine Green-X
、NBD-X
、TET
、Alexa430
、BODIPY R6G-X
、CAL Fluor Gold 540
、JOE
、Yakima Yellow
、Alexa 532
、VIC
、HEX
和CAL Fluor Orange 560
(它們的激發波長在約352-538 nm範圍內,而發射波長在約447-559 nm範圍內,且可用淬滅劑BHQ1
,將其螢光淬滅)、或螢光團RBG
、Alexa555
、BODIPY 564/570
、BODIPY TMR-X
、Quasar 570
、Cy3
、Alexa 546
、NED
、TAMRA
、Rhodamine Red-X
、BODIPY 581/591
、Redmond Red
、CAL Fluor Red 590
、Cy3.5
、ROX
、Alexa 568
、CAL Fluor Red 610
、BODIPY TR-X
、Texas Red
、CAL Fluor Red 635
、Pulsar 650
、Cy5
、Quasar 670
、CY5.5
、Alexa 594
、BODIPY 630/650-X
或Quasar 705
(它們的激發波長在約524-690 nm範圍內,而發射波長在約557-705 nm範圍內,且可用淬滅劑BHQ2
,將其螢光淬滅)。本發明的較佳SARS-CoV-2特異性TaqMan探針在其5’端用螢光團2’,7’-二甲氧基-4’,5’-二氯-6-羧基螢光素(2’,7’-dimethoxy-4’,5’-dichloro-6-carboxyfluorescein)(「JOE
」)或螢光團5(6)-羧基螢光素(5(6)-carboxyfluorescein)(「FAM
」)標記。JOE
是一種在黃光範圍內發射的二苯并哌喃(xanthene)螢光團(吸收波長為520 nm;發射波長為548 nm)。FAM
是吸收波長為495 nm,且發射波長為517 nm的羧基螢光素分子;它通常以兩種異構體(5-FAM和6-FAM)的混合物形式提供。Quasar 670
與花青染料(cyanine dye)相似且吸收波長為647 nm,而發射波長為670 nm。
黑洞淬滅劑1 (black hole quencher 1,「BHQ1
」)是用於FAM
和JOE
螢光團的較佳淬滅劑。BHQ1
淬滅480-580 nm的螢光訊號,而在534 nm具有最大吸收。
黑洞淬滅劑2 (black hole quencher 1,「BHQ2
」)是用於Quasar 670
的較佳淬滅劑。BHQ2
淬滅560-670 nm的螢光訊號,而在579 nm具有最大吸收。
JOE
、FAM
、Quasar 670
、BHQ1
和BHQ2
為市售廣泛可得的 (例如Sigma Aldrich;Biosearch Technologies等等) 且使用眾所皆知的方法與寡核苷酸耦合 (請參閱例如,Zearfoss, N.R.et al
. (2012) “End-Labeling Oligonucleotides with Chemical Tags After Synthesis
,” Meth. Mol. Biol. 941:181-193)。可以商業方式(例如ThermoFisher Scientific)獲得已標記有期望的螢光團且與期望的淬滅劑複合之任何期望的標記序列的寡核苷酸探針。
如上所討論,TaqMan探針的淬滅劑與探針的螢光團的接近導致螢光訊號的淬滅。當探針與互補目標序列雜交時,在雙股依賴性5’→3’核酸外切酶(例如Taq聚合酶的5’→3’核酸外切酶活性)存在下培養探針會切割探針,從而自淬滅劑中分離螢光團,且允許產生可偵測的螢光訊號。在Holland, P.M.et al
. (1991) (“Detection Of Specific Polymerase Chain Reaction Product By Utilizing The 5'→3' Exonuclease Activity Of Thermus Aquaticus DNA Polymerase,
” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88(16):7276-7280), by Navarro, E.et al
. (2015) (“Real-Time PCR Detection Chemistry
,” Clin. Chim. Acta 439:231-250)和Gasparic, B.M.et al
. (2010) (“Comparison Of Nine Different Real-Time PCR Chemistries For Qualitative And Quantitative Applications In GMO Detection
,” Anal. Bioanal. Chem. 396(6):2023-2029)中回顧了「TaqMan」探針的化學原理和設計。
分子信標探針可替代地用來偵測根據本發明擴增的SARS-CoV-2寡核苷酸。分子信標探針也用螢光團標記,且與淬滅劑複合。然而,在此種探針中,僅在淬滅劑與螢光團直接相鄰時,才會發生螢光團的螢光淬滅。因此,分子信標探針被設計為在溶液中游離時採用髮夾結構(從而使螢光染料和淬滅劑彼此緊密靠近)。當分子信標探針與目標雜交時,螢光團與淬滅劑分離,且螢光團的螢光變得可偵測的。與TaqMan探針不同,分子信標探針被設計為在擴增反應過程中保持完整,且必須在每個循環中重新結合至目標,以進行訊號測量。Han, S.X.et al
. (2013) (“Molecular Beacons: A Novel Optical Diagnostic Tool
,” Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 61(2):139-148), by Navarro, E.et al
. (2015) (“Real-Time PCR Detection Chemistry
,” Clin. Chim. Acta 439:231-250), by Goel, G.et al
. (2005) (“Molecular Beacon: A Multitask Probe
,” J. Appl. Microbiol. 99(3):435-442) and by Zheng, J.et al
. (2015) (“Rationally Designed Molecular Beacons For Bioanalytical And Biomedical Applications
,” Chem. Soc. Rev. 44(10):3036-3055)對分子信標探針的化學原理和設計進行了回顧。
蝎型引子探針(Whitcombe, D.et al
. (1999) “Detection Of PCR Products Using Self-Probing Amplicons And Fluorescence
,” Nat. Biotechnol. 17(8):804-807)可替代地用來偵測根據本發明擴增的SARS-CoV-2寡核苷酸。蝎型引子探針亦設計為在溶液中游離時採用髮夾結構,且在其5’端標記螢光團,並在其3’端與淬滅劑複合。蝎型引子探針與分子信標探針的差異在於,它們的3’端透過六聚乙二醇(hexathylene glycol,HEG)阻斷劑連接至其5’端。此種連接防止聚合酶介導的蝎型引子探針的3’端的延伸。然而,在蝎型引子探針結合至目標DNA後,聚合酶從其3’端複製核苷酸序列。在下一個變性步驟中,蝎型引子探針的特定序列結合至新擴增的DNA的同一股內的互補區。此雜交打開了髮夾結構,因此使分子螢光團與其淬滅劑分離,且允許偵測到螢光。
在一較佳實施例中,本發明的探針是TaqMan探針。如上所述,此種探針在其5’端標記有螢光團,且在其3’端與此螢光團的螢光淬滅劑複合。 為了同時偵測SARS-CoV-2的兩個多核苷酸部分的擴增,使用了具有不同的螢光團(具有不同的和可區分的發射波長)的兩種TaqMan探針;所使用的淬滅劑可相同或不同。在本發明的一實施例中,ORF1ab探針的5’端標記有螢光團JOE
,且此探針的3’端與淬滅劑BHQ1
複合,而S基因探針的5’端標記有螢光團FAM
,且此探針的3’端與淬滅劑BHQ1
複合。在另一實施例中,ORF1ab探針的5’端標記有螢光團FAM
,而S基因探針的5’端標記有螢光團JOE
。 使用兩種這樣的螢光團允許兩種探針皆用在相同的檢驗中。
下文所述的較佳引子和探針被設計為特異性偵測SARS-CoV-2。每個目標自身都已顯示出能靈敏地和特異性偵測SARS-CoV-2,而不會偵測到其他冠狀病毒或與它們發生交叉反應。本發明包含核苷酸序列由這樣的較佳引子和探針所組成、實質上由這樣的較佳引子和探針所組成、或包含這樣的較佳引子和探針的寡核苷酸。在本說明書的範圍內的還有核苷酸序列是這樣的較佳引子和探針的「變異體」的寡核苷酸。如本文所用地,若保留了此種寡核苷酸的功能(例如,作為特異性引子或探針),則寡核苷酸是另一寡核苷酸的「變異體
」,但是:
(1) 缺少此種引子或探針的核苷酸中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸,或
(2) 缺少此種引子或探針的10個3’端核苷酸中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個,或
(3) 缺少此種引子或探針的10個5’端核苷酸中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個,或
(4) 具有與此種引子或探針的序列不同的序列,其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超過10個額外核苷酸,或
(5) 具有與此種引子或探針的序列不同的序列,其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超過10個取代核苷酸代替此種引子或探針中存在的核苷酸,或
(6) 擁有此種(1)-(5)的組合。B. 較佳的 SARS-CoV-2 特異性引子 1. 較佳的 ORF1ab 引子
第一組引子包含「正向 ORF1ab 引子
」和「反向 ORF1ab 引子
」,其序列適合用來擴增SARS-CoV-2 ORF1ab的區域。儘管根據本發明,可使用任何能夠介導此種擴增的正向和反向ORF1ab引子,但較佳地使用具有獨特優勢的正向和反向 ORF1ab 引子
。本發明較佳的正向 ORF1ab 引子
包含以下序列、實質上由以下序列所組成或由以下序列(SEQ ID NO: 1
)所組成:atggtagagttgatggtcaa,其對應至SARS-CoV-2 ORF1ab的有義股的核苷酸第19991-20010位的核苷酸序列。本發明較佳的反向 ORF1ab 引子
包含以下序列、實質上由以下序列所組成或由以下序列(SEQ ID NO: 2
)所組成:taagactagcttgtttggga,其對應至SARS-CoV-2 ORF1ab的反義股的核苷酸第20088-20107位的核苷酸序列。因此,這些引子擴增了具有SARS-CoV-2ORF1ab的核苷酸第19991-20107位序列的雙股多核苷酸。此種較佳的「正向ORF1ab引子」和較佳的「反向ORF1ab引子」具有用於偵測SARS-CoV-2的獨特屬性。
SARS-CoV-2 ORF1ab的「有義」股的核苷酸第19991-20107位的序列為SEQ ID NO: 3
;互補(「反意義」)股的序列為SEQ ID NO: 4
:SEQ ID NO: 3 :
atggtagagt tgatggtcaa gtagacttat ttagaaatgc ccgtaatggt gttcttatta cagaaggtag tgttaaaggt ttacaaccat ctgtaggtcc caaacaagct agtcttaSEQ ID NO: 4 :
taagactagc ttgtttggga cctacagatg gttgtaaacc tttaacacta ccttctgtaa taagaacacc attacgggca tttctaaata agtctacttg accatcaact ctaccat
雖然較佳使用由SEQ ID NO: 1
和SEQ ID NO: 2
的序列所組成的引子,來偵測ORF1ab的存在,但是本發明考慮了包含或實質上由SEQ ID NO: 1
的序列所組成、或包含或實質上由SEQ ID NO: 2
的序列所組成的其他引子(因為它們擁有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個額外核苷酸殘基,但保留了與具有SEQ ID NO: 3
或SEQ ID NO: 4
的核苷酸序列的DNA分子特異性雜交的能力,且更佳地保留了與具有SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列的互補的核苷酸序列或SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列的互補的核苷酸序列的DNA分子特異性雜交的能力),或可根據本發明的原理和目的,來使用保留了與具有SEQ ID NO: 3
或SEQ ID NO: 4
的核苷酸序列的DNA分子特異性雜交的能力,且更佳地保留了與具有SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列互補的核苷酸序列或SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列互補的核苷酸序列的DNA分子特異性雜交的能力的此種引子的「變異體」。此種「變異體 ORF1ab 引子
」可為例如:
(1) 缺少SEQ ID NO: 1
或SEQ ID NO: 2
中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸,或
(2) 缺少SEQ ID NO: 1
或SEQ ID NO: 2
的序列中的10個3’端核苷酸中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個,或
(3) 缺少SEQ ID NO: 1
或SEQ ID NO: 2
的序列中的10個5’端核苷酸中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個,或
(4) 具有與SEQ ID NO: 1
或SEQ ID NO: 2
的序列不同的序列,其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超過10個額外核苷酸,或
(5) 具有與SEQ ID NO: 1
或SEQ ID NO: 2
的序列不同的序列,其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超過10個取代核苷酸代替SEQ ID NO: 1
或SEQ ID NO: 2
中存在的核苷酸,或
(6) 擁有此種(1)-(5)的組合。
本發明較佳的正向 ORF1ab 引子
(SEQ ID NO: 1
)和反向 ORF1ab 引子
(SEQ ID NO: 2
)和這些引子在SARS-CoV-2的rRT-PCR檢驗中擴增的SARS-CoV-2 ORF1ab的區域的比對和相對方向如圖 2
中所示。2. 較佳的 S 基因引子
第二組引子包含「正向 S 基因引子
」和「反向 S 基因引子
」,其序列適合用於擴增SARS-CoV-2 S基因的區域。儘管可根據本發明,來使用能夠介導此種擴增的任何正向和反向S基因引子,但較佳使用擁有獨特優勢的正向和反向 S 基因引子
。本發明較佳的正向 S 基因引子
包含、實質上由或由序列(SEQ ID NO: 5)ctaaccaggttgctgttctt所組成,其對應至SARS- CoV-2 S基因的有義股的核苷酸第23376-23395位的核苷酸序列。較佳的反向 S 基因引子
包含、實質上由或由序列(SEQ ID NO: 6
)cctgtagaataaacacgcca所組成,其對應至SARS-CoV-2S基因的反義股的核苷酸第23459-23478位的核苷酸序列。 因此,這些引子擴增具有SARS-CoV-2 S基因的核苷酸第23376-23478位的序列的雙股多核苷酸。
SARS-CoV-2 S基因的「有義」股的核苷酸第23376-23478位的序列為SEQ ID NO: 7
;互補(「反義」)股的序列為SEQ ID NO: 8
:SEQ ID NO: 7
:ctaaccaggt tgctgttctt tatcaggatg ttaactgcac agaagtccct gttgctattc atgcagatca acttactcct acttggcgtg tttattctac aggSEQ ID NO: 8
:cctgtagaat aaacacgcca agtaggagta agttgatctg catgaatagc aacagggact tctgtgcagt taacatcctg ataaagaaca gcaacctggt tag
雖然較佳使用由SEQ ID NO: 5
和SEQ ID NO: 6
的序列所組成的引子,來偵測S基因的存在,但是本發明考慮了包含或實質上由SEQ ID NO: 5
的序列所組成、或包含或實質上由SEQ ID NO: 6
的序列所組成的其他引子(因為它們擁有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個額外核苷酸殘基,但保留了與具有SEQ ID NO: 7
或SEQ ID NO: 8
的核苷酸序列的DNA分子特異性雜交的能力,且更佳地保留了與具有SEQ ID NO: 5
的核苷酸序列的互補的核苷酸序列或SEQ ID NO: 6
的核苷酸序列的互補的核苷酸序列的DNA分子特異性雜交的能力),或可根據本發明的原理和目的,來使用保留了與具有SEQ ID NO: 7
或SEQ ID NO: 8
的核苷酸序列的DNA分子特異性雜交的能力,且更佳地保留了與具有SEQ ID NO: 5
的核苷酸序列互補的核苷酸序列或SEQ ID NO: 6
的核苷酸序列互補的核苷酸序列的DNA分子特異性雜交的能力的此種引子的「變異體」。此種「變異體 S 基因引子
」可為例如:
(1) 缺少SEQ ID NO: 5
或SEQ ID NO: 6
中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸,或
(2) 缺少SEQ ID NO: 5
或SEQ ID NO: 6
的序列中的10個3’端核苷酸中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個,或
(3) 缺少SEQ ID NO: 5
或SEQ ID NO: 6
的序列的中10個5’端核苷酸中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個,或
(4) 具有與SEQ ID NO: 5
或SEQ ID NO: 6
的序列不同的序列,其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超過10個額外核苷酸,或
(5) 具有與SEQ ID NO: 5
或SEQ ID NO: 6
的序列不同的序列,其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超過10個取代核苷酸代替SEQ ID NO: 5
或SEQ ID NO: 6
中存在的核苷酸,或
(6) 擁有此種(1)-(5)的組合。
本發明的正向 S 基因引子
(SEQ ID NO: 5
)和反向 S 基因引子
(SEQ ID NO: 6
)和這些引子在SARS-CoV-2的rRT-PCR檢驗中擴增的SARS-CoV-2 S基因的區域的比對和相對方向如圖 3
中所示。C. 較佳的 SARS-CoV-2 特異性探針 1. 較佳的 ORF1ab 探針
用於偵測由上述較佳的ORF1ab引子(SEQ ID NO: 1
和SEQ ID NO: 2
)所擴增的ORF1ab的區域的較佳探針包含、實質上由或由核苷酸序列(SEQ ID NO: 9
) tgcccgtaatggtgttcttattacaga所組成(較佳「ORF1ab 探針
」)。或者,可使用包含、實質上由或由互補核苷酸序列(SEQ ID NO: 10
) tctgtaataagaacaccattacgggca所組成的寡核苷酸。本發明較佳的ORF1ab探針的比對和相對位置顯示於圖 2
中。
雖然較佳使用由SEQ ID NO: 9
的核苷酸序列所組成的探針或由SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列所組成的探針,來偵測ORF1ab的存在,但是本發明考慮了包含或實質上由SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列所組成的其他探針(因為它們擁有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個額外核苷酸殘基,但保留了與具有SEQ ID NO: 3
或SEQ ID NO: 4
的核苷酸序列的DNA分子特異性雜交的能力,且更佳地保留了與具有SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列的DNA分子特異性雜交的能力),或可根據本發明的原理和目的,來使用保留了與具有SEQ ID NO: 3
或SEQ ID NO: 4
的核苷酸序列的DNA分子特異性雜交的能力,且更佳地保留了與具有SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列的DNA分子特異性雜交的能力的此種探針的「變異體」。此種「變異體 ORF1ab 探針
」可為例如:
(1) 缺少SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的核苷酸中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個,或
(2) 缺少SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的序列中的10個3’端核苷酸中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個,或
(3) 缺少SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的序列中的10個5’端核苷酸中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個,或
(4) 具有與SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的序列不同的序列,其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超過10個額外核苷酸,或
(5) 具有與SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的序列不同的序列,其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超過10個取代核苷酸代替SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
中存在的核苷酸,或
(6) 擁有此種(1)-(5)的組合。2. 較佳的 S 基因探針
用於偵測由上述較佳的S基因引子(SEQ ID NO: 5
和SEQ ID NO: 6
)所擴增的S基因的區域的較佳探針包含、實質上由或由序列(SEQ ID NO: 11
) tgcacagaagtccctgttgct所組成(較佳「S 基因探針
」)。或者,可使用包含、實質上由或由互補核苷酸序列(SEQ ID NO: 12
) agcaacagggacttctgtgca所組成的寡核苷酸。本發明的S基因探針的比對和相對位置顯示於圖 3
中。
雖然較佳使用由SEQ ID NO: 11
的核苷酸序列所組成的探針或由SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列所組成的探針,來偵測S基因的存在,但是本發明考慮了包含或實質上由SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列所組成的其他探針(因為它們擁有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個額外核苷酸殘基,但保留了與具有SEQ ID NO: 7
或SEQ ID NO: 8
的核苷酸序列的DNA分子特異性雜交的能力,且更佳地保留了與具有SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列的DNA分子特異性雜交的能力),或可根據本發明的原理和目的,來使用保留了與具有SEQ ID NO: 7
或SEQ ID NO: 8
的核苷酸序列的DNA分子特異性雜交的能力,且更佳地保留了與具有SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列的DNA分子特異性雜交的能力的此種探針的「變異體」。此種「變異體 S 基因探針
」可為例如:
(1) 缺少SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的核苷酸中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個,或
(2) 缺少SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
的序列中的10個3’端核苷酸中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個,或
(3) 缺少SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
的序列中的10個5’端核苷酸中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個,或
(4) 具有與SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
的序列不同的序列,其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超過10個額外核苷酸,或
(5) 具有與SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
的序列不同的序列,其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超過10個取代核苷酸代替SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
中存在的核苷酸,或
(6) 擁有此種(1)-(5)的組合。D. 本發明較佳的引子和探針的獨特屬性
本發明的檢驗法擁有區分此種檢驗法與現有技術的檢驗法的特定獨特屬性。本發明的一特徵係關於至少兩個SARS-CoV-2目標區域作為rRT-PCR檢驗法中偵測的基礎。因此,本發明的rRT-PCR檢驗法較佳地採用至少兩組正向和反向引子,以能夠特異性地且同時擴增SARS-CoV-2 RNA的兩個多核苷酸區域。在較佳的實施例中,此兩組引子中的一組引子具有能夠特異性擴增ORF1ab的區域的序列,且此兩組引子中的第二組引子具有能夠特異性地擴增S基因的區域的序列。
使用兩個擴增目標增加了本發明的檢驗法的準確性,因為它們有助於確保,即使從臨床分離株中消除了一個目標(例如藉由自發性突變),此種檢驗法仍會繼續偵測SARS-CoV-2。使用兩個擴增目標亦增加了檢驗法的靈敏度,因為例如由於加工或處理問題,特定目標的擴增可能無法提供可偵測濃度的擴增產物。藉由具有兩個目標,本發明的檢驗法更有可能避免這種「偽陰性」結果。
選擇ORF1ab和S基因作為目標是本發明的檢驗法的另一特徵。這些基因特別是SARS-CoV-2的特徵,而SARS-CoV-2 S基因的目標區域(即其S1域)確實與其他冠狀病毒的S基因的同源性相對較低(僅68%)( 相較之下,SARS-CoV-2的ORF1a與SARS-CoV的ORF1a具有約90%的同源性; SARS-CoV-2的ORF1b與SARS-CoV的ORF1b具有約86%的同源性) (Lu, R.et al
. (2020) “Genomic Characterisation And Epidemiology Of 2019 Novel Coronavirus: Implications For Virus Origins And Receptor Binding
,” The Lancet 395(10224):565-574)。因此,本發明的檢驗法更有可能將不會不準確地擴增非SARS-CoV-2病原體的序列。因此,本發明的檢驗法更有可能避免「偽陽性」結果。
本發明的檢驗法使用對SARS-CoV-2獨有的探針,且在未偵測到非SARS-CoV-2病原體的條件下偵測SARS-CoV-2。在又一屬性(attribute)中,本發明的檢驗法採用被設計為在相同的反應參數和溫度下介導相同程度的擴增之非常快速的系統引子。
PCR引子的解鏈溫度(melting temperature,Tm
)決定了它們從互補寡核苷酸變性的動力學及與互補寡核苷酸黏著(anneal)的動力學(請參閱SantaLucia, J. (1998)A Unified View Of Polymer, Dumbbell, And Oligonucleotide DNA Nearest-Neighbor Thermodynamics
,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 95:1460-1465; von Ahsen, N.et al
. (1999) “Application Of A Thermodynamic Nearest-Neighbor Model To Estimate Nucleic Acid Stability And Optimize Probe Design: Prediction Of Melting Points Of Multiple Mutations Of Apolipoprotein B-3500 And Factor V With A Hybridization Probe Genotyping Assay On The Lightcycler
,” Clin. Chem. 45(12):2094-2101)。展現出「實質上相同的解鏈溫度
」(即± 2 °C、更佳為± 1 °C、再更佳為± 0.5 °C、最佳為± 0.1 °C,如使用SantaLucia, J. (1998)的方法所計算出)的引子對最大化了它們所擴增的產物的總產量、及此種產物的產生速率。
顯著地,本發明的較佳的正向和反向ORF1ab引子展現出此種實質上相同的解鏈溫度,其為本發明的另一區別。較佳的正向ORF1ab引子的鹼基堆積Tm
為58.2 °C,而較佳的反向ORF1ab引子的鹼基堆積Tm
為58.1 °C。因此,本發明的較佳的正向和反向ORF1ab引子的使用用於最大化擴增的ORF1ab產物的總產量和此種產物的產生速率。
本發明的較佳的正向和反向S基因引子亦展現出實質上相同的解鏈溫度,其為本發明的另一區別。較佳的正向S基因引子的鹼基堆積Tm
為60 °C,而較佳的反向S基因引子的鹼基堆積Tm
為59.9 °C。因此,本發明的較佳的正向和反向S基因引子的使用用於最大化擴增的S基因產物的總產量和此種產物的產生速率。
顯著地,本發明的正向和反向ORF1ab引子的解鏈溫度實質上與本發明的較佳的正向和反向S基因引子的解鏈溫度相似。因此,這兩組較佳的引子非常匹配,這是本發明的另一區別。它們的組合使用用來使擴增的ORF1ab和S基因產物的總產量相等,它們的長度相似(117個核苷酸比上103個核苷酸)。所採用的引子組之實質上相似的解鏈溫度和兩種擴增產物的相似長度是本發明的另一區別。
在設計rRT-PCR檢驗法時,理想的是所採用的TaqMan探針的Tm
比所採用擴增引子高5-10 °C。所採用的ORF1ab探針的鹼基堆積Tm
為66.2 °C,與本發明的較佳的ORF1ab引子的Tm
相差8 °C。所採用的S基因探針的匹配鹼基堆積Tm
為66.6 °C,與本發明的較佳的S基因引子的Tm
相差6.6 °C。因此,本發明的每個較佳的TaqMan探針展現出期望的Tm
,且本發明的兩個較佳的TaqMan探針展現出實質相同的Tm
。這些是本發明的又一些區別。E. 進行本發明檢驗法的較佳平台
在一較佳實施例中,上述的較佳引子和探針使用由LIAISON® MDX (DiaSorin Molecular LLC) rRt-PCR平台所處理的Direct Amplification Disc (DiaSorin Molecular LLC)和SIMPLEXA® Direct Chemistry (DiaSorin Molecular LLC),來檢驗SARS-CoV-2的存在。DiaSorin Molecular LLC的LIAISON®MDX rRt-PCR平台、SIMPLEXA® Direct Chemistry和Direct Amplification Disc的操作原理已在美國專利號9,067,205、美國專利公開號2012/0291565 A1、EP 2499498 B1、EP 2709760 B1中揭露,所有內容透過引用整體併入本文。
簡而言之,LIAISON® MDX (DiaSorin) rRt-PCR平台是一種額外提供離心和反應處理能力之小型可攜式熱循環儀。此裝置能夠介導樣品加熱(> 5 °C/秒)和冷卻(> 4 °C/秒),且能夠將溫度調節到± 0.5 °C (從室溫到99 °C的範圍)。LIAISON® MDX rRt-PCR平台具有激發475 nm、475 nm、520 nm、580 nm和640 nm的螢光標記的能力,且具有分別測量520 nm、560 nm、610 nm和682 nm的螢光。
Direct Amplification Disc是能夠一次處理最多8個(50 µL)臨床樣品中的目標序列(如果存在)的擴增之徑向定向(radially oriented)的多腔流體裝置。可將樣品以細胞材料或裂解物的形式直接提供給Direct Amplification Disc,而無需任何事前的DNA或RNA提取。
簡而言之,等份的臨床樣品和反應試劑(即DNA聚合酶、反轉錄酶、一或多對SARS-CoV-2特異性引子(較佳地,上述較佳的正向和反向ORF1ab引子和上述較佳的正向和反向S基因引子)、二或多種SARS-CoV-2特異性探針(較佳地,上述較佳的ORF1ab探針和上述較佳的S基因探針)和去氧核苷酸三磷酸(deoxynucleotide triphosphate,dNTP) 和緩衝液)分別被提供給Direct Amplification Disc的供應區域(provision area)(請參閱,美國專利號9,067,205、美國專利公開號2012/0291565 A1、EP 2709760 B1)。較佳地,使用市售可得(Applied Biosystems;ThermoFisher Scientific,etc
.)的「主混合液(master mixes)」,來提供rRT-PCR所需的反應試劑。可提供濃度在0.1和0.5 µM之間的引子(5-25 pmol /50 µl反應)。可提供濃度在0.05到0.25 µM之間的探針分子(2.5-12.5 pmol /50 µl反應)。
LIAISON® MDX裝置將Direct Amplification Disc離心,從而迫使一部分樣品和試劑分別移入反應室的貯存槽中。離心會將多餘的樣品或試劑移至保存室。然後,LIAISON® MDX裝置內的雷射打開第一閥,使樣品流入反應室。然後將腔室加熱(例如至95 °C);高溫和離心用於裂解樣品中可能存在的細胞。然後,LIAISON® MDX裝置內的雷射打開第二閥,使試劑樣品流入反應室且與樣品混合。然後,LIAISON® MDX裝置開始對反應進行PCR熱循環。內部對照可用於監測成功的儀器和樣品處理以及用於偵測RT-PCR失敗和/或抑制。
可使用內部對照,以確認反應條件適合用於目標擴增和偵測。例如,合適的內部對照是擴增MS2噬菌體序列的對照。合適的正向 MS2 噬菌體內部控制引子
具有序列(SEQ ID NO: 13 tgctcgcggatacccg);合適的反向 MS2 噬菌體內部控制引子
具有序列(SEQ ID NO: 14 aacttgcgttctcgagcgat)。可使用具有序列(SEQ ID NO: 15
acctcgggtttccgtcttgctcgt)的TaqMan探針(MS2 噬菌體內部對照探針
),來偵測由此種內部對照引子介導的擴增。或者,可採用其他MS2內部對照引子(Dreier, J.et al
. (2005) “Use of Bacteriophage MS2 as an Internal Control in Viral Reverse Transcription-PCR Assays
,” J. Clin. Microbiol. 43(9):4551-4557)。探針可用Quasar 670
螢光團標記且與BHQ2
淬滅劑複合、或用任何其他螢光團標記且與能夠淬滅此種螢光團的螢光的任何淬滅劑複合。
LIAISON MDX軟體運行預熱循環,以使SARS-CoV-2病毒外殼蛋白變性,從而釋放SARS-CoV-2 RNA。此步驟之後是反轉錄和隨後的擴增。在PCR循環的延長階段,DNA聚合酶的5’核酸酶活性會使反應中任何與擴增產物雜交的探針降解,從而使探針的螢光標記與探針的淬滅劑分離。此種分離允許螢光訊號被偵測到。在每個循環中,額外的螢光標記分子會從其各自的探針上切割下來,從而增加螢光強度。
經由LIAISON® MDX的軟體,來監測反應結果且將其呈現給用戶。此種軟體提供了易於理解的結果,且具有在運行後檢查擴增曲線的能力。此軟體亦可繪製QC圖表,且可與LIS進行雙向接口,以便輕鬆整合至實驗室工作流程中。The LIAISON® MDX允許隨機存取個別樣品,因此允許用戶開始新樣品的分析,而無需等待先前開始的分析完成。檢驗結果可在一小時或更短的時間內獲得。表 1
顯示了此檢驗法的診斷演算法。
表 1 | |||
SARS-CoV-2 CT 值 (ORF1ab 目標 ) | SARS-CoV-2 CT 值 (S 基因目標 ) | RNA IC CT 值 | 詮釋 |
≤40, ≠0 | ≤40, ≠0 | N/A | SARS-CoV-2 RNA:偵測到 |
≤40, ≠0 | N/A | N/A | SARS-CoV-2 RNA:偵測到 |
N/A | ≤40, ≠0 | N/A | SARS-CoV-2 RNA:偵測到 |
0 | 0 | ≤40, ≠0 | SARS-CoV-2 RNA:未偵測到 |
0 | 0 | 0 | 結果無效 重複檢驗: 如果重複後,RNA IC仍為0,則使用新樣品測試,若有臨床保證 |
因此,如果病人檢體的ORF1ab和S基因的CT值均≤40,則SARS-CoV-2 RNA的結果報告為「偵測到」。內部對照不適用。如果病人檢體的ORF1ab的CT值≤40,而S基因的CT值為0,則SARS-CoV-2 RNA的結果報告為「偵測到」。內部對照不適用。如果病人檢體的ORF1ab的CT值為0,而S基因的CT值≤40,則SARS-CoV-2 RNA的結果報告為「偵測到」。內部對照不適用。如果病人檢體的ORF1ab和S基因的CT值均為0,而內部對照CT為非零且≤45,則SARS-CoV-2 RNA的結果報告為「未偵測到」。如果病人檢體的ORF1ab和S基因的CT值均為0,而內部對照CT也為0,則結果報告為「無效」。此檢體應重新檢驗。 如果重複後的檢驗的內部對照仍為0,則應使用新樣品重複測試,若有臨床保證。F. 套組
本發明還包含用於進行上述檢驗法的套組。在一實施例中,此種套組將包含含有用於特異性偵測SARS-CoV-2的ORF1ab的試劑(例如,正向ORF1ab引子、反向ORF1ab引子、和ORF1ab探針)的一或多個容器及使用此種試劑來偵測SARS-CoV-2的說明書。此種套組可包含變異體正向ORF1ab引子、變異體反向ORF1ab引子和/或變異體ORF1ab探針。最佳地,此種套組將包含上述較佳的ORF1ab正向引子、上述較佳的ORF1ab反向引子和上述較佳的ORF1ab探針。
在第二實施例中,此種套組將包含含有用於特異性偵測SARS-CoV-2的S基因的試劑(例如,正向S基因引子、反向S基因引、和S基因探針)的一或多個容器及使用此種試劑來偵測SARS-CoV-2的說明書。此種套組可包含變異體正向S基因引子、變異體反向S基因引子和/或變異體S基因探針。最佳地,此種套組將包含上述較佳的S基因正向引子、上述較佳的S基因反向引子和上述較佳的S基因探針。
在第三實施例中,此種套組將包含含有用於特異性偵測SARS-CoV-2的ORF1ab和S基因兩者的試劑(例如,正向ORF1ab引子、反向ORF1ab引子、ORF1ab探針、正向S基因引子、反向S基因引子、和S基因探針)的一或多個容器及使用此種試劑來偵測SARS-CoV-2的說明說,且將最佳地包含上述較佳的ORF1ab正向引子、上述較佳的ORF1ab反向引子、上述較佳的ORF1ab探針、上述較佳的S基因正向引子、上述較佳的S基因反向引子和上述較佳的S基因探針。
此種套組的容器將是小瓶、試管等,且試劑可為液體形式或可被凍乾。或者,此種容器將是能夠處理此種引子的擴增之多腔流體裝置。例如,本發明的套組可為已經預裝載用於擴增上述SARS-CoV-2基因序列的試劑的Direct Amplification Disc (美國專利號9,067,205)。G. 本發明的實施例
現在已大體上描述了本發明,透過參考以下編號的實施例(「E
」),將更容易理解相同概念,除非另有說明,否則這些實施例是作為說明提供,且無意於限制本發明:E1
. 一種具有5’端和3’端的寡核苷酸,其中寡核苷酸具有由以下核苷酸序列所組成、實質上由以下核苷酸序列所組成、或包含以下核苷酸序列的核苷酸序列:SEQ ID NO: 1 、 SEQ ID NO: 2 、 SEQ ID NO: 3 、 SEQ ID NO: 4 、 SEQ ID NO: 5 、 SEQ ID NO: 6 、 SEQ ID NO: 7 、 SEQ ID NO: 8 、 SEQ ID NO: 9 、 SEQ ID NO: 10 、 SEQ ID NO: 11 或 SEQ ID NO: 12
。E2
. 一種具有5’端和3’端的寡核苷酸,其中寡核苷酸具有由以下核苷酸序列所組成的核苷酸序列:SEQ ID NO: 1 、 SEQ ID NO: 2 、 SEQ ID NO: 3 、 SEQ ID NO: 4 、 SEQ ID NO: 5 、 SEQ ID NO: 6 、 SEQ ID NO: 7 、 SEQ ID NO: 8 、 SEQ ID NO: 9 、 SEQ ID NO: 10 、 SEQ ID NO: 11 或 SEQ ID NO: 12
。E3
. 如E1
或E2
所述的寡核苷酸,其中寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列的核苷酸序列。E4
. 如E1
或E2
所述的寡核苷酸,其中寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列的核苷酸序列。E5
. 如E1
或E2
所述的寡核苷酸,其中寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 3
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 3
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 3
的核苷酸序列的核苷酸序列。E6
. 如E1
或E2
所述的寡核苷酸,其中寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 4
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 4
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 4
的核苷酸序列的核苷酸序列。E7
. 如E1
或E2
所述的寡核苷酸,其中寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 5
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 5
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 5
的核苷酸序列的核苷酸序列。E8
. 如E1
或E2
所述的寡核苷酸,其中寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 6
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 6
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 6
的核苷酸序列的核苷酸序列。E9
. 如E1
或E2
所述的寡核苷酸,其中寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 7
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 7
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 7
的核苷酸序列的核苷酸序列。E10
. 如E1
或E2
所述的寡核苷酸,其中寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 8
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 8
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 8
的核苷酸序列的核苷酸序列。E11
. 如E1
或E2
所述的寡核苷酸,其中寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 9
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 9
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 9
的核苷酸序列的核苷酸序列。E12
. 如E1
或E2
所述的寡核苷酸,其中寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列的核苷酸序列。E13
. 如E1
或E2
所述的寡核苷酸,其中寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 11
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 11
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 11
的核苷酸序列的核苷酸序列。E14
. 如E1
或E2
所述的寡核苷酸,其中寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列的核苷酸序列。E15
. 如E1
所述的寡核苷酸,其中寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 9
的核苷酸序列或SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 9
的核苷酸序列或SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 9
的核苷酸序列或SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列的核苷酸序列,其中寡核苷酸具有以螢光團標記的5’端和與螢光團的螢光淬滅劑複合的3’端。E16
. 如E15
所述的寡核苷酸,其中螢光團的激發波長在約352-690 nm的範圍內,而發射波長在約447-705 nm的範圍內。E17
. 如E15
所述的寡核苷酸,其中螢光團是JOE
或FAM
。E18
. 如E1
所述的寡核苷酸,其中寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 11
的核苷酸序列或SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 11
的核苷酸序列或SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 11
的核苷酸序列或SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列的核苷酸序列,其中寡核苷酸具有以螢光團標記的5’端和與螢光團的螢光淬滅劑複合的3’端。E19
. 如E18
所述的寡核苷酸,其中螢光團的激發波長在約352-690 nm的範圍內,而發射波長在約447-705 nm的範圍內。E20
. 如E18
所述的寡核苷酸,其中螢光團是JOE
或FAM
。E21
. 一種於臨床樣品中偵測SARS-CoV-2存在的方法,其中此方法包含:
(I) 在以下所述存在的情況下,體外(in vitro
)培養臨床樣品:
(1) 反轉錄酶和具有5’→3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶;和
(2) 正向ORF1ab引子,其具有由SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列的核苷酸序列;和
(3) 反向ORF1ab引子,其具有由SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列的核苷酸序列;和
(4) ORF1ab探針,此ORF1ab探針是具有由SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸,其中ORF1ab探針寡核苷酸具有以螢光團標記的5’端和與螢光團的螢光淬滅劑複合的3’端;
且其中在足以允許以下條件的反應中進行培養步驟:
(a) 如果臨床樣品中存在SARS-CoV-2,則正向和反向ORF1ab引子得以介導SARS-CoV-2的ORF1ab的區域的聚合酶連鎖反應擴增,從而產生擴增的ORF1ab寡核苷酸分子;
(b) ORF1ab探針得以與擴增的ORF1ab寡核苷酸分子雜交;和
(c) 5’→3’核酸外切酶活性得以水解雜交的ORF1ab探針,從而使其螢光團與淬滅劑分離,使螢光訊號變成可偵測的;以及
(II) 藉由判斷螢光團的螢光訊號是否變成可偵測的,來判斷臨床樣品中是否存在SARS-CoV-2。E22
. 如E21
所述的方法,其中螢光團的激發波長在約352-690 nm的範圍內,而發射波長在約447-705 nm的範圍內。E23
. 如E21
所述的方法,其中螢光團是JOE
或FAM
。E24
.一種於臨床樣品中偵測SARS-CoV-2存在的方法,其中此方法包含:
(I) 在以下所述存在的情況下,體外(in vitro
)培養臨床樣品:
(1) 反轉錄酶和具有5’→3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶;和
(2) 正向S基因引子,其具有由SEQ ID NO: 5
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 5
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 5
的核苷酸序列的核苷酸序列;
(3) 反向S基因引子,其具有由SEQ ID NO: 6
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 6
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 6
的核苷酸序列的核苷酸序列;和
(4) S基因探針,此S基因探針是具有由SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸,其中S基因探針寡核苷酸具有以螢光團標記的5’端和與螢光團的螢光淬滅劑複合的3’端;且
其中在足以允許以下條件的反應中進行培養步驟:
(a) 如果臨床樣品中存在SARS-CoV-2,則正向和反向S基因引子得以介導SARS-CoV-2的S基因的區域的聚合酶連鎖反應擴增,從而產生擴增的S基因寡核苷酸分子;
(b) S基因探針得以與擴增的S基因寡核苷酸分子雜交;和
(c) 5’→3’核酸外切酶活性得以水解雜交的S基因探針,從而使其螢光團與淬滅劑分離,使螢光訊號變成可偵測的;以及
(II) 藉由判斷螢光團的螢光訊號是否變成可偵測的,來判斷臨床樣品中是否存在SARS-CoV-2。E25
. 如E24
所述的方法,其中螢光團的激發波長在約352-690 nm的範圍內,而發射波長在約447-705 nm的範圍內。E26
. 如E24
所述的方法,其中螢光團是JOE
或FAM
。E27
. 一種於臨床樣品中偵測SARS-CoV-2存在的方法,其中此方法包含:
(I) 在以下所述存在的情況下,體外(in vitro
)培養臨床樣品:
(1) 反轉錄酶和具有5’→3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶;和
(2) 正向S基因引子,其具有由SEQ ID NO: 5
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 5
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 5
的核苷酸序列的核苷酸序列;
(3) 反向S基因引子,其具有由SEQ ID NO: 6
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 6
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 6
的核苷酸序列的核苷酸序列;
(4) S基因探針,此S基因探針是具有由SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸,其中S基因探針寡核苷酸具有以螢光團標記的5’端和與螢光團的螢光淬滅劑複合的3’端;和
(5) 正向ORF1ab引子,其具有由SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列的核苷酸序列;
(6) 反向ORF1ab引子,其具有由SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列的核苷酸序列;和
(7) ORF1ab探針,此ORF1ab探針是具有由SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸,其中ORF1ab探針寡核苷酸具有以螢光團標記的5’端和與螢光團的螢光淬滅劑複合的3’端;其中ORF1ab探針的螢光團的螢光和S基因探針的螢光團的螢光是可區分的;
且其中在足以允許以下條件的反應中進行培養步驟:
(a) 如果臨床樣品中存在SARS-CoV-2,則正向和反向S基因引子得以介導SARS-CoV-2的S基因的區域的聚合酶連鎖反應擴增,從而產生擴增的S基因寡核苷酸分子;
(b) S基因探針得以與擴增的S基因寡核苷酸分子雜交;和
(c) 5’→3’核酸外切酶活性得以水解雜交的S基因探針,從而使其螢光團與淬滅劑分離,使螢光訊號變成可偵測的;以及
(II) 藉由判斷螢光團的螢光訊號是否變成可偵測的,來判斷臨床樣品中是否存在SARS-CoV-2。E28
. 如E24
所述的方法,其中在以下所述額外存在的情況下培養臨床樣品:
(5) 正向ORF1ab引子,其具有由SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列的核苷酸序列;
(6) 反向ORF1ab引子,其具有由SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列由前述核苷酸序列所組成或基本上由前述核苷酸序列所組成的核苷酸序列;和
(7) ORF1ab探針,此ORF1ab探針是具有由SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸,其中ORF1ab探針寡核苷酸具有以螢光團標記的5’端和與螢光團的螢光淬滅劑複合的3’端;其中ORF1ab探針的螢光團的螢光和S基因探針的螢光團的螢光是可區分的;
且其中在足以允許以下條件下,額外培養反應:
(a) 如果臨床樣品中存在SARS-CoV-2,則正向和反向ORF1ab引子得以介導SARS-CoV-2的ORF1ab的區域的聚合酶連鎖反應擴增,從而產生擴增的ORF1ab寡核苷酸分子;
(b) ORF1ab探針得以與擴增的ORF1ab寡核苷酸分子雜交;和
(c) 5’→3’核酸外切酶活性得以水解雜交的ORF1ab探針,從而使其螢光團與淬滅劑分離,使螢光訊號變成可偵測的;
且其中藉由判斷所述ORF1ab探針或所述S基因探針螢光團中的至少一者的螢光訊號是否變成可偵測的,來判斷所述SARS-CoV-2存在於所述臨床樣品中。E29
. 如E28
所述的方法,其中ORF1ab探針的螢光團和S基因探針的螢光團的激發波長在約352-690 nm的範圍內,而發射波長在約447-705 nm的範圍內。E30
. 如E28
所述的方法,其中ORF1ab探針和S基因探針的螢光團中的一者是JOE
,而此種螢光團的另一者為FAM
。E31
. 一種於臨床樣品中偵測SARS-CoV-2存在的套組,其中此套組包含:
(I) 用於偵測SARS-CoV-2的ORF1ab的試劑,其中SARS-CoV-2的ORF1ab的針測試劑包含:
(1) 正向ORF1ab引子,其具有由SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列的核苷酸序列;
(2) 反向ORF1ab引子,其具有由SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列的核苷酸序列;和
(3) ORF1ab探針,此ORF1ab探針是具有由SEQ ID NO: 9 或 SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 9 或 SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列所組成、包括SEQ ID NO: 9 或 SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸,其中ORF1ab探針寡核苷酸具有以螢光團標記的5’端和與螢光團的螢光淬滅劑複合的3’端;和
(II) 使用此種針測試劑來偵測臨床樣品中是否存在SARS-CoV-2的說明書。E32
. 如E31
所述的套組,其中ORF1ab探針的螢光團的激發波長在約352-690 nm的範圍內,而發射波長在約447-705 nm的範圍內。E33.
如E31
所述的套組,其中ORF1ab的螢光團是JOE
或FAM
。E34
. 一種於臨床樣品中偵測SARS-CoV-2存在的套組,其中此套組包含:
(I) 用於偵測SARS-CoV-2的S基因的試劑,其中SARS-CoV-2的S基因的偵測試劑包含:
(1) 正向S基因引子,其具有由SEQ ID NO: 5
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 5
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 5
的核苷酸序列的核苷酸序列;
(2) 反向S基因引子,其具有由SEQ ID NO: 6
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 6
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 6
的核苷酸序列的核苷酸序列;和
(3) S基因探針,此S基因探針是具有由SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸,其中S基因探針寡核苷酸具有以螢光團標記的5’端和與螢光團的螢光淬滅劑複合的3’端;和
(II) 使用此種偵測試劑來偵測臨床樣品中是否存在SARS-CoV-2的說明書。E35
. 如E34
所述的套組,其中S基因探針的螢光團的激發波長在約352-690 nm的範圍內,而發射波長在約447-705 nm的範圍內。E36
. 如E34
所述的套組,其中S基因的螢光團是JOE
或FAM
。E37
. 一種於臨床樣品中偵測SARS-CoV-2存在的套組,其中此套組包含:
(I) (A) 用於珍測SARS-CoV-2的ORF1ab的試劑,其中SARS-CoV-2的ORF1ab的偵測試劑包含:
(1) 正向ORF1ab引子,其具有由SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 1
的核苷酸序列的核苷酸序列;
(2) 反向ORF1ab引子,其具有由SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 2
的核苷酸序列的核苷酸序列;和
(3) ORF1ab探針,此ORF1ab探針是具有由SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 9
或SEQ ID NO: 10
的核苷酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸,其中ORF1ab探針寡核苷酸具有以螢光團標記的5’端和與螢光團的螢光淬滅劑複合的3’端;和
(B) 用於偵測SARS-CoV-2的S基因的試劑,其中SARS-CoV-2的S基因的偵測試劑包含:
(1) 正向S基因引子,其具有由SEQ ID NO: 5
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 5
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 5
的核苷酸序列的核苷酸序列;
(2) 反向S基因引子,其具有由SEQ ID NO: 6
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 6
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 6
的核苷酸序列的核苷酸序列;和
(3) S基因探針,此S基因探針是具有由SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 11
或SEQ ID NO: 12
的核苷酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸,其中S基因探針寡核苷酸具有以螢光團標記的5’端和與螢光團的螢光淬滅劑複合的3’端;其中S基因探針的螢光團的螢光和ORF1ab探針的螢光團的螢光是可區分的;以及
(II) 使用此種試劑來偵測臨床樣品中是否存在SARS-CoV-2的說明書。E38
. 如E37
所述的套組,其中ORF1ab探針的螢光團和S基因探針的螢光團的激發波長在約352-690 nm的範圍內,而發射波長在約447-705 nm的範圍內。E39
. 如E37
所述的套組,其中ORF1ab探針和S基因探針的螢光團中的一者是JOE
而此種螢光團的另一者是FAM
。
[實施例]
現在已大體上描述了本發明,透過參考以下實施例,將更容易理解相同概念,除非另有說明,否則這些實施例是作為說明提供,且無意於限制本發明。實施例 1 較佳引子和探針的設計
兩組引子和探針設計為用於SARS-CoV-2的特異性偵測。每組引子/探針本身已均顯示出可提供靈敏和特異性的SARS-CoV-2的偵測,且未偵測到或與其他冠狀病毒無交叉反應。SARS-CoV-2參考序列(NC_045512.2
;武漢海鮮市場肺炎病毒分離株Wuhan-Hu-1,完整基因組)用來設計此種引子和探針。
CoVs的基因組比對顯示出在不同冠狀病毒之間,非結構蛋白編碼區的相似度為58%、結構蛋白編碼區的相似度為43%、在整個基因體層級上的相似度為54%。這表明非結構蛋白更保守,且結構蛋白展現出更高的多樣性以適應其不同的環境(Chen, Y,et al
. (2020) “Emerging Coronaviruses: Genome Structure, Replication, And Pathogenesis
,” J. Med. Virol. 92:418-423)。
進行比較SARS-CoV-2的序列與可能感染人類且引發呼吸道疾病的其他六種CoV的序列的分析,以選擇一個能夠偵測出SARS-CoV-2且從其它CoV中特異性區分出SARS-CoV-2的區域。分析專注於編碼此病毒獨有的結構蛋白的基因體區域(Ji, W.et al
. (2020) “Cross‐Species Transmission Of The Newly Identified Coronavirus 2019‐nCoV
,” J Med. Virol. 92:433-440)。然而,由於此種區域可能經常重組,所以同時設計了針對編碼非結構蛋白的基因體區域的引子。
關於S基因的選擇,可藉由橫跨第21500和24000位(2500bp)之間的區域內的同源重組,產生SARS-CoV-2,前述區域覆蓋大部分S基因序列。(Chen, Y,et al
. (2020) “Emerging Coronaviruses: Genome Structure, Replication, And Pathogenesis
,” J. Med. Virol. 92:418-423)。詳細而言,在這2500 bp區域內,Chen, Y等人(2020)鑑定出獨特的序列,對應至在S基因的5’端的頭783個核苷酸。 除武漢海鮮市場肺炎病毒分離株Wuhan-Hu-14之外,對783個核苷酸片段的BLAST分析顯示與NCBI數據庫中存在的任何序列均不匹配。
關於ORF1ab序列的選擇,SARS-CoV-2具有特徵性的非結構蛋白編碼區域,覆蓋其基因體長度的約三分之二且編碼16個非結構蛋白(nsp1-16); 序列顯示出與其他CoV的序列具有58%的相似度(Chen, Y,et al
. (2020) “Emerging Coronaviruses: Genome Structure, Replication, And Pathogenesis
,” J. Med. Virol. 92:418-423)。此約20kb的區域選來設計對SARS-CoV-2有特異性的不同引子組。
使用Geneious Prime軟體,已在全球共享所有流感數據倡議(Global Initiative on Sharing All Influenza Data,GISAID)數據庫中可得的SARS-CoV2完整基因體序列上,測試了所有設計來針對ORF1ab和S基因的引子組。將序列映射到SARS-CoV-2的參考序列(NC_045512.2
),且針對一致性測試鑑定出的引子和探針。分析顯示了由鑑定出的引子和探針所辨識出的所有區域與所有可得的SARS-CoV-2序列具有100%的同源性。
除了驗證設計的特異性之外,還檢驗了六種可感染人類並引起呼吸道疾病的CoV(即HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV)的序列 。此種序列的登錄號為:NC_002645.1
(人類冠狀病毒229E);NC_006213.1
(人類冠狀病毒OC43株ATCC VR-759);NC_005831.2
(人類冠狀病毒NL63)、NC_006577.2
(人類冠狀病毒HKU1)、NC_004718.3
(SARS冠狀病毒)和NC_019843.3
(中東呼吸道症候群冠狀病毒)。
透過此種分析鑑定出上述較佳的正向和反向ORF1ab引子(分別為SEQ ID NO: 1
和SEQ ID NO: 2
)、上述較佳的正向和反向S基因引子(分別為SEQ ID NO:
5和SEQ ID NO: 6
)、上述較佳的ORF1ab探針(SEQ ID NO:
9)和上述較佳的S基因探針(SEQ ID NO:
11)的序列。實施例 2 SARS-CoV-2 檢驗的特異性
在電腦模擬(in silico
)分析後,發現使用上述較佳的正向和反向ORF1ab和S基因引子及上述較佳的ORF1ab和S基因探針的SIMPLEXA™ SARS-CoV-2 Direct檢驗法,可偵測出所有SARS-CoV-2病毒株,且未與非SARS-CoV-2物種有交叉反應。
除了電腦模擬之外,還進行了特異性的體外分析。表 2
中列出了體外檢體測試的結果。
表 2 | ||||
生物體 | 測試的濃度 | 定性百分比偵測 (# 檢測到 / # 測試 ) | ||
S 基因 (FAM) | ORF1ab (JOE) | 內部對照 (Q670) | ||
腺病毒1 | 1 x 105 U/mL | 0% (0/3) | 0% (0/3) | 100% (3/3) |
百日咳嗜血桿菌 | 1 x 106 CFU/mL | 0% (0/3) | 0% (0/3) | 100% (3/3) |
肺炎披衣菌 | 1 x 106 IFU/mL | 0% (0/3) | 0% (0/3) | 100% (3/3) |
冠狀病毒229E | 1 x 105 TCID50 /mL | 0% (0/3) | 0% (0/3) | 100% (3/3) |
冠狀病毒NL63 | 1 x 105 U/mL | 0% (0/3) | 0% (0/3) | 100% (3/3) |
冠狀病毒OC43 | 1 x 105 TCID50 /mL | 0% (0/3) | 0% (0/3) | 100% (3/3) |
腸病毒68 | 1 x 105 TCID50 /mL | 0% (0/3) | 0% (0/3) | 100% (3/3) |
流感嗜血桿菌 | 1 x 106 CFU/mL | 0% (0/3) | 0% (0/3) | 100% (3/3) |
人類間質肺炎病毒(hMPV-9) | 1 x 105 TCID50 /mL | 0% (0/3) | 0% (0/3) | 100% (3/3) |
A型流感H3N2 香港8/68 | 1 x 105 TCID50 /mL | 0% (0/3) | 0% (0/3) | 100% (3/3) |
B型流感 普吉島3073/2013 | 1 x 105 TCID50 /mL | 0% (0/3) | 0% (0/3) | 100% (3/3) |
嗜肺性退伍軍人桿菌 | 1 x 106 CFU/mL | 0% (0/3) | 0% (0/3) | 100% (3/3) |
MERS冠狀病毒 (提取的RNA) | 1:3 稀釋 | 0% (0/3) | 0% (0/3) | 100% (3/3) |
結核分枝桿菌 (基因體DNA) | 1 x 106 拷貝/mL | 0% (0/3) | 0% (0/3) | 100% (3/3) |
1型副流感 | 1 x 105 U/mL | 0% (0/3) | 0% (0/3) | 100% (3/3) |
2型副流感 | 1 x 105 U/mL | 0% (0/3) | 0% (0/3) | 100% (3/3) |
3型副流感 | 1 x 105 TCID50 /mL | 0% (0/3) | 0% (0/3) | 100% (3/3) |
4A型副流感 | 1 x 105 U/mL | 0% (0/3) | 0% (0/3) | 100% (3/3) |
鼻病毒B14 | 1 x 105 U/mL | 0% (0/3) | 0% (0/3) | 100% (3/3) |
RSV A Long | 1 x 105 TCID50 /mL | 0% (0/3) | 0% (0/3) | 100% (3/3) |
RSV B Washington | 1 x 105 TCID50 /mL | 0% (0/3) | 0% (0/3) | 100% (3/3) |
SARS-冠狀病毒 (純化的RNA) | 1 x 105 拷貝/mL | 0% (0/3) | 0% (0/3) | 100% (3/3) |
SARS-冠狀病毒 HKU39849 (提取的RNA) | 1:10稀釋 | 0% (0/3) | 0% (0/3) | 100% (3/3) |
肺炎鏈球菌 | 1 x 106 CFU/mL | 0% (0/3) | 0% (0/3) | 100% (3/3) |
化膿性鏈球菌 | 1 x 106 CFU/mL | 0% (0/3) | 0% (0/3) | 100% (3/3) |
人類白血球 (人類基因體DNA) | 1 x 106 西胞/mL | 0% (0/3) | 0% (0/3) | 100% (3/3) |
匯集人類鼻液 | 1:5 稀釋 | 0% (0/3) | 0% (0/3) | 100% (3/3) |
還發現此檢驗法對陰性基質具有100%的特異性(通用運送培養基(Universal Transport Medium,UTM);Copan Diagnostics)。沒有觀察到非特異性訊號。
總而言之,發現上述較佳的正向和反向ORF1ab引子和上述較佳的ORF1ab探針能夠偵測到SARS-CoV-2而不會對人類DNA或其他病原體的DNA(或cDNA)展現出交叉反應。另外,發現上述較佳的正向和反向S基因引子和上述較佳的S基因探針能夠偵測到SARS-CoV-2而不會對人類DNA或其他病原體的DNA (或cDNA)展現出交叉反應。 因此,此檢驗法對SARS-CoV-2具有特異性。
當僅採用此種引子和探針組中的一者(即,針對ORF1ab的探針和引子組或針對S基因的探針和引子組)時,本發明的檢驗法報導了偵測到SARS-CoV-2的觀察結果表示,藉由同時使用這兩組探針和引子,可在低病毒載量的情況下提高檢驗靈敏度,且在COVID-19於人口中傳播的期間可能發生的任何點突變都不會損害此檢驗的準確性。
為了證明使用兩組較佳的引子和探針均可改善檢驗靈敏度,以10-5
至10-8
TCID50
/mL的劑量,對在口腔拭子-UTM基質中製備SARS-CoV2病毒顆粒(來自分離株2019nCoV/italy-INMI1)進行了測試。如表 3
和表 4
中所報告,相對於偵測ORF1ab序列或S基因序列,發現同時使用兩組較佳的引子和探針可增加檢驗的靈敏度,實現10-8
TCID50
/mL劑量的偵測而不是10-7
TCID50
/mL。
表 3 | |||||
樣品 | ORF1ab 目標 | S 基因 目標 | 結果 | ||
代表 | TCID50 /mL | 拷貝 /mL | |||
1-40 | 10-7 | 4000 | 偵測到 | 偵測到 | 陽性 |
1-3 | 10-8 | 400 | 偵測到 | 偵測到 | 陽性 |
4 | 偵測到 | 未偵測到 | 陽性 | ||
5 | 未偵測到 | 偵測到 | 陽性 | ||
6 | 未偵測到 | 未偵測到 | 陰性 | ||
7 | 偵測到 | 偵測到 | 陽性 | ||
8 | 未偵測到 | 偵測到 | 陽性 | ||
9 | 偵測到 | 偵測到 | 陽性 | ||
10 | 未偵測到 | 未偵測到 | 陰性 | ||
11 | 偵測到 | 未偵測到 | 陽性 | ||
12-13 | 偵測到 | 偵測到 | 陽性 | ||
14 | 未偵測到 | 偵測到 | 陽性 | ||
15-18 | 偵測到 | 偵測到 | 陽性 | ||
19 | 未偵測到 | 未偵測到 | 陰性 |
表 4
中總結了以10-8
TCID50
/mL (400 拷貝/mL)的濃度所獲得的結果。
表 4 ( 於 400 病毒 RNA 拷貝 /mL 的檢驗偵測能力 ) | |||
ORF1ab | S 基因 | ORF1ab 和 S 基因 | |
偵測到的複製數 | 13/19 | 14/19 | 16/19 |
偵測到的百分比 | 68% | 73.7% | 84.2% |
表4中使用的數據是基於10-8
TCID50
/mL (400拷貝/mL)的病毒劑量。 當樣品含有500個病毒RNA拷貝/mL時,本發明的檢驗法展現出100%偵測SARS-CoV-2的能力(表 5
)。
表 5 ( 於 500 病毒 RNA 拷貝 /mL 的檢驗偵測能力 ) | |||
ORF1ab | S 基因 | ORF1ab 和 S 基因 | |
偵測到的複製數 | 34/47 | 46/48 | 48/48 |
偵測到的百分比 | 72.3% | 95.8% | 100% |
這種靈敏程度(用基因體病毒RNA判斷)反映了使用含有SARS-CoV-2的臨床樣品可獲得的結果類型。 因此,本發明的檢驗法將為醫護人員提供使他們能夠在臨床實踐中更好地解釋檢驗法的結果的分析指示。
在本說明書中提到的所有出版物和專利都以相同的程度透過引用併入本文,就好像每個個別的出版物或專利申請被具體地和個別地表示為透過引用整體併入。儘管已結合本發明的特定實施例對本發明進行了描述,但應當理解的是,本發明能夠進行進一步的修改,且本申請旨在涵蓋基本上遵循本發明的原理的任何變化、使用或修改,且包含偏離本揭露的任何變化、使用或修改,如本發明所屬技術領域內的已知或慣用實踐之內且可應用於前文闡述的基本特徵的任何變化、使用或修改。
無
圖 1
提供了SARS-CoV-2的結構及其開放閱讀框(ORF)的圖式說明。呈現的序列是參考SARS-CoV-2序列的序列(GenBank NC_045512)。
圖 2
顯示了本發明的正向 ORF1ab 引子
和反向 ORF1ab 引子
的比對和定向,和這些引子在SARS-CoV-2的rRT-PCR檢驗中擴增的ORF1ab的區域。引子序列以劃底線的大寫字母顯示;探針序列以方框大寫字母顯示。
圖 3
顯示了本發明的正向 S 基因 引子
和反向 S 基因 引子
的比對和定向,和這些引子在SARS-CoV-2的rRT-PCR檢驗中擴增的S基因的區域。引子序列以劃底線的大寫字母顯示;探針序列以方框大寫字母顯示。
無
Claims (19)
- 一種寡核苷酸,具有5’端和3’端,其中該寡核苷酸具有由以下核苷酸序列所組成、實質上由以下核苷酸序列所組成、或包括以下核苷酸序列的一核苷酸序列:SEQ ID NO: 1 、 SEQ ID NO: 2 、 SEQ ID NO: 3 、 SEQ ID NO: 4 、 SEQ ID NO: 5 、 SEQ ID NO: 6 、 SEQ ID NO: 7 、 SEQ ID NO: 8 、 SEQ ID NO: 9 、 SEQ ID NO: 10 、 SEQ ID NO: 11 或SEQ ID NO: 12 。
- 如請求項1所述的寡核苷酸,其中該寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 11 或SEQ ID NO: 12 的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 11 或SEQ ID NO: 12 的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 11 或SEQ ID NO: 12 的核苷酸序列的一核苷酸序列,其中該寡核苷酸具有以一螢光團標記的5’端和與該螢光團的一螢光淬滅劑複合的3’端。
- 如請求項1所述的寡核苷酸,其中該寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 9 或SEQ ID NO: 10 的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 9 或SEQ ID NO: 10 的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 9 或SEQ ID NO: 10 的核苷酸序列的一核苷酸序列,其中該寡核苷酸具有以一螢光團標記的5’端和與該螢光團的一螢光淬滅劑複合的3’端。
- 一種於一臨床樣品中偵測SARS-CoV-2存在的方法,其中該方法包括: (I) 在以下所述存在的情況下,體外(in vitro )培養該臨床樣品: (1) 一反轉錄酶和具有5’→3’核酸外切酶活性的一DNA聚合酶;和 (2) 一正向S基因引子,其具有由SEQ ID NO: 5 的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 5 的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 5 的核苷酸序列的一核苷酸序列; (3) 一反向S基因引子,其具有包括由SEQ ID NO: 6 的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 6 的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 6 的核苷酸序列的一核苷酸序列; (4) 一S基因探針,該S基因探針為一寡核苷酸,該寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 11 或SEQ ID NO: 12 的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 11 或SEQ ID NO: 12 的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 11 或SEQ ID NO: 12 的核苷酸序列的一核苷酸序列,其中該S基因探針寡核苷酸具有以一螢光團標記的5’端和與該螢光團的一螢光淬滅劑複合的3’端; 且其中在足以允許以下條件的反應中進行該培養步驟: (a) 如果該臨床樣品中存在該SARS-CoV-2,則該些正向和反向S基因引子得以介導SARS-CoV-2的該S基因的一區域的聚合酶連鎖反應擴增,從而產生擴增的S基因寡核苷酸分子; (b) 該S基因探針得以與擴增的S基因寡核苷酸分子雜交; (c) 該5’→3’核酸外切酶活性得以水解雜交的S基因探針,從而使該S基因探針的該螢光團與該S基因探針的該淬滅劑分離,並使一螢光訊號變成可偵測的;以及 (II) 判斷該螢光團的一螢光訊號是否變成可偵測的,來判斷該臨床樣品中是否存在該SARS-CoV-2。
- 如請求項4所述的方法,其中該螢光團的一激發波長在約352-690 nm的範圍內,而一發射波長在約447-705 nm的範圍內。
- 如請求項5所述的方法,其中該螢光團是JOE 或FAM 。
- 一種於一臨床樣品中偵測SARS-CoV-2存在的方法,其中該方法包括: (I) 在以下所述存在的情況下,體外(in vitro )培養該臨床樣品: (1) 一反轉錄酶和具有5’→3’核酸外切酶活性的一DNA聚合酶;和 (2) 一正向ORF1ab引子,其具有由SEQ ID NO: 1 的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 1 的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 1 的核苷酸序列的一核苷酸序列; (3) 一反向ORF1ab引子,其具有由SEQ ID NO: 2 的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 2 的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 2 的核苷酸序列的一核苷酸序列; (4) 一ORF1ab探針,該ORF1ab探針為一寡核苷酸,該寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 9 或SEQ ID NO: 10 的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 9 或SEQ ID NO: 10 的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 9 或SEQ ID NO: 10 的核苷酸序列的一核苷酸序列,其中該ORF1ab探針寡核苷酸具有以一螢光團標記的5’端和與該螢光團的一螢光淬滅劑複合的3’端; 且其中在足以允許以下條件的反應中進行該培養步驟: (a) 如果該臨床樣品中存在該SARS-CoV-2,則該些正向和反向ORF1ab引子得以介導SARS-CoV-2的該ORF1ab的一區域的聚合酶連鎖反應擴增,從而產生擴增的ORF1ab寡核苷酸分子; (b) 該ORF1ab探針得以與擴增的ORF1ab寡核苷酸分子雜交; (c) 該5’→3’核酸外切酶活性得以水解雜交的ORF1ab探針,從而使該ORF1ab探針的該螢光團與該ORF1ab探針的該淬滅劑分離,並使一螢光訊號變成可偵測的;以及 (II) 判斷該螢光團的一螢光訊號是否變成可偵測的,來判斷該臨床樣品中是否存在該SARS-CoV-2。
- 如請求項7所述的方法,其中該螢光團的一激發波長在約352-690 nm的範圍內,而一發射波長在約447-705 nm的範圍內。
- 如請求項8所述的方法,其中該螢光團是JOE 或FAM 。
- 如請求項4所述的方法,其中在以下所述額外存在的情況下培養該臨床樣品: (5) 一正向ORF1ab引子,其具有由SEQ ID NO: 1 的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 1 的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 1 的核苷酸序列的一核苷酸序列; (6) 一反向ORF1ab引子,其具有由SEQ ID NO: 2 的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 2 的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 2 的核苷酸序列的一核苷酸序列; (7) 一ORF1ab探針,該ORF1ab探針為一寡核苷酸,該寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 9 或SEQ ID NO: 10 的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 9 或SEQ ID NO: 10 的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 9 或SEQ ID NO: 10 的核苷酸序列的一核苷酸序列,其中該ORF1ab探針寡核苷酸具有以一螢光團標記的5’端和與該螢光團的一螢光淬滅劑複合的3’端;其中該ORF1ab探針的該螢光團的螢光和該S基因探針的該螢光團的螢光是可區分的; 且其中在足以允許以下條件的情況下,額外培養該反應: (a) 如果該臨床樣品中存在該SARS-CoV-2,則該些正向和反向ORF1ab引子得以介導SARS-CoV-2的該ORF1ab的一區域的聚合酶連鎖反應擴增,從而產生擴增的ORF1ab寡核苷酸分子; (b) 該ORF1ab探針得以與擴增的ORF1ab寡核苷酸分子雜交; (c) 該5’→3’核酸外切酶活性得以水解雜交的ORF1ab探針,從而使該ORF1ab探針的該螢光團與該ORF1ab探針的該淬滅劑分離,並使一螢光訊號變成可偵測的; 且其中判斷該ORF1ab探針或該S基因探針螢光團中的至少一者的一螢光訊號是否變成可偵測的,來判斷該SARS-CoV-2存在於該臨床樣品中。
- 如請求項10所述的方法,其中該ORF1ab探針的該螢光團和該S基因探針的該螢光團具有的在約352-690 nm範圍內的一激發波長,以及在約447-705 nm範圍內的一發射波長。
- 如請求項10所述的方法,其中該ORF1ab探針和該S基因探針的該些螢光團中的一者是JOE ,而該些螢光團的另一者為FAM 。
- 一種於臨床樣品中偵測SARS-CoV-2存在的套組,其中該套組包括: (I) 用於偵測SARS-CoV-2的S基因的試劑,其中該些SARS-CoV-2的S基因的偵測試劑包括: (1) 一正向S基因引子,其具有由SEQ ID NO: 5 的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 5 的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 5 的核苷酸序列的一核苷酸序列; (2) 一反向S基因引子,其具有由SEQ ID NO: 6 的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 6 的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 6 的核苷酸序列的一核苷酸序列;和 (3) 一S基因探針,該S基因探針為一寡核苷酸,該寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 11 或SEQ ID NO: 12 的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 11 或SEQ ID NO: 12 的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 11 或SEQ ID NO: 12 的核苷酸序列\的一核苷酸序列,其中該S基因探針寡核苷酸具有以一螢光團標記的5’端和與該螢光團的一螢光淬滅劑複合的3’端;以及 (II) 使用該些偵測試劑以於該臨床樣品中偵測SARS-CoV-2存在的說明書。
- 一種於一臨床樣品中偵測SARS-CoV-2存在的套組,其中該套組包括: (I) 用於偵測SARS-CoV-2的ORF1ab的試劑,其中該些SARS-CoV-2的ORF1ab的偵測試劑包括: (1) 一正向ORF1ab引子,其具有由SEQ ID NO: 1 的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 1 的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 1 的核苷酸序列的一核苷酸序列; (2) 一反向ORF1ab引子,其具有由SEQ ID NO: 2 的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 2 的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 2 的核苷酸序列的一核苷酸序列;和 (3) 一ORF1ab探針,該ORF1ab探針是具有由SEQ ID NO: 9 或SEQ ID NO: 10 的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 9 或SEQ ID NO: 10 的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 9 或SEQ ID NO: 10 的核苷酸序列的一核苷酸序列的一寡核苷酸序列,其中該ORF1ab探針寡核苷酸具有一螢光團標記的5’端和與該螢光團的一螢光淬滅劑複合的3’端;以及 (II) 使用該些偵測試劑以於該臨床樣品中偵測SARS-CoV-2存在的說明書。
- 如請求項13或14所述的套組,其中該螢光團的一激發波長在約352-690 nm的範圍內,而一發射波長在約447-705 nm的範圍內。
- 如請求項15所述的套組,其中該螢光團是JOE 或FAM 。
- 一種於一臨床樣品中偵測SARS-CoV-2存在的套組,其中該套組包括: (I) (A) 用於偵測SARS-CoV-2的ORF1ab的試劑,其中該些SARS-CoV-2的ORF1ab的偵測試劑包括: (1) 一正向ORF1ab引子,其具有由SEQ ID NO: 1 的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 1 的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 1 的核苷酸序列的一核苷酸序列; (2) 一反向ORF1ab引子,其具有由SEQ ID NO: 2 的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 2 的核苷酸序列所組成、包括SEQ ID NO: 2 的核苷酸序列的一核苷酸序列;和 (3) 一ORF1ab探針,該ORF1ab探針為一寡核苷酸,該寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 9 或SEQ ID NO: 10 的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 9 或SEQ ID NO: 10 的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 9 或SEQ ID NO: 10 的核苷酸序列的一核苷酸序列,其中該ORF1ab探針寡核苷酸具有以一螢光團標記的5’端和與該螢光團的一螢光淬滅劑複合的3’端;以及 (B) 用於偵測SARS-CoV-2的S基因的試劑,其中該些SARS-CoV-2的S基因的偵測試劑包括: (1) 一正向S基因引子,其具有由SEQ ID NO: 5 的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 5 的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 5 的核苷酸序列的一核苷酸序列; (2) 一反向S基因引子,其具有由SEQ ID NO: 6 的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 6 的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 6 的核苷酸序列的一核苷酸序列;和 (3) 一S基因探針,該S基因探針為一寡核苷酸,該寡核苷酸具有由SEQ ID NO: 11 或SEQ ID NO: 12 的核苷酸序列所組成、實質上由SEQ ID NO: 11 或SEQ ID NO: 12 的核苷酸序列所組成、或包括SEQ ID NO: 11 或SEQ ID NO: 12 的核苷酸序列的一核苷酸序列,其中該S基因探針寡核苷酸具有以一螢光團標記的5’端和與該螢光團的一螢光淬滅劑複合的3’端; 其中該S基因探針的該螢光團的螢光和該ORF1ab探針的該螢光團的螢光是可區分的;以及 (II) 使用該些偵測試劑以於該臨床樣品中偵測SARS-CoV-2存在的說明書。
- 如請求項17所述的套組,其中該ORF1ab探針的該螢光團和該S基因探針的該螢光團的一激發波長在約352-690 nm的範圍內,而一發射波長在約447-705 nm的範圍內。
- 如請求項18所述的套組,其中該ORF1ab探針和該S基因探針的該些螢光團中的一者是JOE ,而該些螢光團的另一者為FAM 。
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