CN113293230A - 新型冠状病毒covid-19荧光定量pcr检测引物和探针、试剂盒及检测方法 - Google Patents

新型冠状病毒covid-19荧光定量pcr检测引物和探针、试剂盒及检测方法 Download PDF

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刘丽娜
郭振东
张春茂
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Abstract

本发明涉及一种新型冠状病毒COVID‑19荧光定量PCR检测引物和探针、试剂盒及检测方法，所述新型冠状病毒COVID‑19荧光定量PCR检测引物和探针，包括针对新型冠状病毒COVID‑19N基因的特异性引物如SEQ ID NO.1‑2所示，及第一探针如SEQ ID NO.3所示。本发明提供的新型冠状病毒COVID‑19检测试剂盒能够快速、准确且灵敏地检测检测出小鼠组织中新型冠状病毒COVID‑19，检测灵敏度高达10拷贝/mL，在对小鼠组织中病毒定性分析的同时还能进行定量分析，定量线形范围好。本发明用于检测实验小鼠组织中的新型冠状病毒COVID‑19，具有较大的应用价值。

Description

新型冠状病毒COVID-19荧光定量PCR检测引物和探针、试剂盒 及检测方法
技术领域
本发明属于包含酶、核酸或微生物的测定或检测方法技术领域，具体涉及一种用于小鼠实验的新型冠状病毒COVID-19荧光定量PCR检测引物、探针、试剂盒及检测方法。
背景技术
新型冠状病毒COVID-19能够引起人呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等，在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。新型冠状病毒COVID-19在全球肆虐，严重危害了人类健康。
目前全球都在加紧开展针对新型冠状病毒COVID-19的疫苗和药物的研发，无论是疫苗制备还是药物研发都离不开动物模型，小鼠模型在传染性疾病研究中具有极为重要的作用。研究表明新型冠状病毒可以感染ACE2转基因小鼠，ACE2转基因小鼠是研究新型冠状病毒COVID-19的一种重要动物模型。目前没有用于检测实验小鼠的新型冠状病毒COVID-19核酸检测试剂盒，因此有必要开发针对检测小鼠组织中的新型冠状病毒COVID-19核酸检测试剂盒，以满足小鼠实验中定性和定量检测新型冠状病毒COVID-19的需要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的上述不足，提供一种用于小鼠实验的新型冠状病毒COVID-19实时荧光定量PCR检测引物、探针、试剂盒及检测方法，能够满足小鼠实验中对小鼠各组织的新型冠状病毒COVID-19定性和定量的检测的需求。
本发明的第一方面提供了一种新型冠状病毒COVID-19荧光定量PCR检测引物和探针，包括针对新型冠状病毒COVID-19N基因的特异性引物如SEQ ID NO.1-2所示，及第一探针如SEQ ID NO.3所示。
本发明的第二方面提供了一种新型冠状病毒COVID-19荧光定量PCR检测试剂盒，其包括上述的新型冠状病毒COVID-19荧光定量PCR检测引物和探针，还包括检测小鼠内参基因beta actin的特异性引物及内控探针，所述引物如SEQ ID NO.4-5所示，所述内控探针如SEQ ID NO.6所示。
按上述方案，所述试剂盒包括分开包装的PCR反应A液和PCR反应B液；
所述PCR反应A液包括引物对集、探针组、dNTP Mixture和PCR buffer；
所述的引物对集由第一引物对和内标引物对组成，所述的第一引物对包括特异性引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2(第一引物对是针对新型冠状病毒COVID-19的N基因设计的检测引物，包括SEQ ID NO.1所示的正向引物和如SEQ ID NO.2所示的反向引物)，所述内标引物对包括特异性引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5(内标引物对是针对小鼠内参基因Beta actin设计的引物，包括SEQ ID NO.4所示的正向引物和如SEQ ID NO.5所示的反向引物)；
所述探针组由第一探针SEQ ID NO.3和内控探针SEQ ID NO.6组成；所述的第一探针是针对第一引物对扩增序列设计的探针，所述内控探针是针对内标引物对扩增序列所设计的探针；
所述PCR反应B液由热启动DNA聚合酶、逆转录酶以及RNA酶抑制剂组成。
进一步地，所述试剂盒还包括：
阳性对照：含新型冠状病毒COVID-19N基因扩增序列质粒以及小鼠内参基因Betaactin扩增序列质粒的混合液；
阴性对照：无核酸酶水(RNase Free Water)。
进一步地，所述试剂盒还包括阳性标准品，所述阳性标准品为含浓度梯度的新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒的多个标准品。阳性标准品一方面可以定量本试剂盒检测的线性范围，另一方面根据阳性标准品的的扩增曲线，计算本试剂盒检测的标准曲线，从而定量出检测样品中新型冠状病毒COVID-19RNA的拷贝数。
作为优选地，所述阳性标准品包括标准品1，新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒浓度为1×107拷贝/mL；标准品2，新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒浓度为1×106拷贝/mL；标准品3，新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒浓度为1×105拷贝/mL；标准品4，新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒浓度为1×104拷贝/mL；标准品5，新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒浓度为1×103拷贝/mL，标准品6，新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒浓度为1×102拷贝/mL；标准品7，新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒浓度为1×101拷贝/mL，标准品8，新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒浓度为1×100拷贝/mL。
本发明第三方面提供了一种新型冠状病毒COVID-19荧光定量PCR检测方法，包括：以提取的小鼠组织样本的RNA为模板，配置扩增反应体系并进行实时荧光定量PCR扩增，每管PCR扩增同时检测ROX和CY3荧光信号，即同时检测新型冠状病毒COVID-19的N基因和小鼠内参基因beta actin，实时记录所述PCR扩增过程中的Ct值和PCR扩增曲线，对PCR扩增曲线进行分析并做出判断；
所述的小鼠组织样本包括小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、小肠等组织；
所述扩增反应体系包括上述的新型冠状病毒COVID-19荧光定量PCR检测引物和探针，以及小鼠内参基因beta actin的特异性引物及内控探针。
按上述方案，所述扩增反应体系包括：模板、PCR反应A液(新型冠状病毒COVID-19荧光定量PCR检测引物和探针、检测小鼠内参基因beta actin的特异性引物及内控探针)、PCR反应B液(热启动DNA聚合酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂)以及阴性对照和阳性对照；所述实时荧光定量PCR扩增程序为：50℃20min；95℃5min；94℃5sec、55℃45sec，45个循环；25℃10sec。
进一步地，对PCR扩增曲线进行分析并做出判断的原则为：
阴性对照品：ROX和CY3荧光通道无扩增曲线；
阳性对照品：ROX和CY3荧光通道有扩增曲线，且Ct值≤35；
上述ROX为新型冠状病毒COVID-19扩增信号，CY3为小鼠内参基因扩增信号；
以上两项需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，实验需要重新进行；
当ROX荧光通道中Ct≤40时，CY3荧光通道有扩增曲线，判断样品为新型冠状病毒COVID-19阳性；
当ROX荧光通道中40<Ct≤45时，重复一次实验，如果Ct还是在此范围之内或小于40就判断样品为新型冠状病毒COVID-19阳性，否则判断样品为新型冠状病毒COVID-19阴性；
当ROX荧光通道中无扩增曲线时，CY3通道有扩增曲线，判断样品为新型冠状病毒COVID-19阴性；
当ROX荧光通道中无扩增曲线时，且CY3荧光通道也无扩增曲线时，判断本次实验异常，需要重新提取标本RNA重新扩增。
本发明还包括上述新型冠状病毒COVID-19荧光定量PCR检测引物和探针、检测试剂盒在制备用于检测新型冠状病毒COVID-19的试剂盒中的应用。
本发明的主要优点有：
本发明提供的新型冠状病毒COVID-19检测试剂盒能够快速、准确且灵敏地检测检测出小鼠组织中新型冠状病毒COVID-19，检测灵敏度高达10拷贝/mL，在对小鼠组织中病毒定性分析的同时还能进行定量分析，定量线形范围好。
本发明采用单管双荧光通道(ROX和CY3荧光通道)同时检测新型冠状病毒COVID-19和小鼠内参基因beta actin的存在，本发明设计的内参基因可对样本核酸的提取和扩增整个过程进行质量监控，能监控RNA是否成功提取以及后续的逆转录和PCR是否顺利进行，监控是否出现人工操作失误而导致的假阴性。
本发明将引物对集、探针组、dNTP Mixture和PCR buffer放于PCR反应A液，将热启动DNA聚合酶、逆转录酶和RNA酶抑制剂放于PCR反应B液，降低了配置PCR反应体系过程中多次加样可能造成污染的风险。
本发明采用的是One Step RT-PCR反应，将RNA的反转录和荧光定量PCR反应置于同一个反应容器内进行，与先反转录RNA再转移到另外容器进行荧光定量PCR相比，污染的风险进一步降低。
本发明用于检测实验小鼠组织中的新型冠状病毒COVID-19，目前新型冠状病毒COVID-19的疫苗和药物的研发以及致病机理研究都需要进行大量小鼠实验，因此本发明具有较大的应用价值。
附图说明
图1为新型冠状病毒COVID-19的N基因质粒标准品扩增曲线；
图2为新型冠状病毒COVID-19阳性标准品浓度标准曲线；
图3为新型冠状病毒感染小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、小肠组织中新型冠状病毒COVID-19实时荧光定量PCR扩增曲线；
图4为新型冠状病毒感染小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、小肠组织内参基因Beta actin实时荧光定量PCR扩增曲线。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明作进一步详细描述，但本发明并不限于以下所述的具体方法和和实验条件。以下本发明实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。
在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
实施例1
一种用于小鼠实验的新型冠状病毒COVID-19荧光定量PCR检测检测试剂盒，该试剂盒主要组成成分见表1。
表1
Figure BDA0003071449810000051
表1中引物对集由第一引物对和内标引物对组成，第一引物对是针对新型冠状病毒COVID-19的N基因设计的检测引物，包括SEQ ID NO.1所示的正向引物和如SEQ ID NO.2所示的反向引物，内标引物对是针对小鼠内参基因Beta actin设计的引物，包括SEQ IDNO.4所示的正向引物和如SEQ ID NO.5所示的反向引物。探针组由第一探针SEQ ID NO.3和内控探针SEQ ID NO.6组成，所述的第一探针是针对第一引物对扩增序列设计的探针，所述内控探针是针对内标引物对扩增序列所设计的探针。
上述特异性检测样品中新型冠状病毒(COVID-19)N基因的试剂盒，其中用于检测N基因的引物序列为：
正向引物SEQ ID NO.1：5’-AAAGATCACATTGGCACCCG-3’和反向引物SEQ ID NO.2：5’-CCATTGCCAGCCATTCTAGC-3’，
对应的检测探针的序列为SEQ ID NO.3：5’-ROX-TTCAACTCCAGGCAGCAGTA-BHQ1-3’。
所述试剂盒还包括内标引物和内控探针；内标引物序列分别为：
正向引物SEQ ID NO.4：5’-GTGGGAATGGGTCAGAAGGA-3’和反向引物SEQ ID NO.5：5’-TCATCTTTTCACGGTTGGCC-3’，
对应的检测探针的序列为SEQ ID NO.6：5’-CY3-ACTGGGACGACATGGAGAAG-BHQ2-3’。
检测新型冠状病毒N基因片段的核酸序列如下：
AAAGATCACATTGGCACCCGCAATCCTGCTAACAATGCTGCAATCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGG(SEQID NO.:7)
检测小鼠内标基因beta actin片段的核酸序列如下：
GTGGGAATGGGTCAGAAGGACTCCTATGTGGGTGACGAGGCCCAGAGCAAGAGAGGTATCCTGACCCTGAAGTACCCCATTGAACATGGCATTGTTACCAACTGGGACGACATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTGGCCCCTGAGGAGCACCCTGTGCTGCTCACCGAGGCCCCCCTGAACCCTAAGGCCAACCGTGAAAAGATGA(SEQ ID NO.:8)
试剂盒的使用和结果判定：
1.RNA样本的制备：取新型冠状病毒COVID-19感染的ACE2转基因小鼠肺组织，利用匀浆仪进行匀浆，将匀浆液12000g离心2min。取200μL上清液，按照RNA提取试剂盒说明书提取样本中的RNA。
2.设置PCR反应，反应体系为50μL。按照组成配置PCR反应液(n为反应的管数)，PCR反应A液为26μL×n，PCR反应B液为4μL×n；将PCR反应A液和PCR反应B液混合震荡混匀并离心数秒，共30μL分装至PCR反应管，然后将提取的RNA样本20μL、阴性对照20μL、阳性对照20μL、阳性标准品20μL，分别加入每一份PCR反应管，盖好管盖，瞬时离心后进行PCR扩增反应。
所用所述阳性标准品包括标准品1，新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒浓度为1×107拷贝/mL；标准品2，新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒浓度为1×106拷贝/mL；标准品3，新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒浓度为1×105拷贝/mL；标准品4，新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒浓度为1×104拷贝/mL；标准品5，新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒浓度为1×103拷贝/mL，标准品6，新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒浓度为1×102拷贝/mL；标准品7，新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒浓度为1×101拷贝/mL，标准品8，新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒浓度为1×100拷贝/mL。
3.PCR扩增检测
将PCR反应管放入荧光定量PCR仪中进行扩增检测；
循环参数设定见表2：
表2
Figure BDA0003071449810000071
4.荧光定量PCR仪荧光通道选择：ROX为新型冠状病毒COVID-19扩增信号，CY3为小鼠内参基因扩增信号。
5.质量控制
阴性对照品：ROX和CY3荧光通道无扩增曲线；
阳性对照品：ROX和CY3荧光通道有扩增曲线，且Ct值≤35；
以上两项需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，实验需要重新进行；
6.结果分析：(请参照不同仪器说明书进行设置，本发明以BioRad CFX96仪器为例)
如果检测样品的ROX荧光通道无扩增曲线，且该CY3荧光通道有扩增曲线，可判样品为未检测到新型冠状病毒(COVID-19)RNA，新型冠状病毒COVID-19阴性；
如果检测样品的ROX荧光通道有扩增曲线，且Ct值≤40，CY3荧光通道有扩增曲线，可判样品为新型冠状病毒阳性。
如果检测样品的ROX荧光通道有扩增曲线，40<Ct≤45时，重复一次实验，如果Ct还是在此范围之内或小于40就判断样品为新型冠状病毒COVID-19阳性，否则判断样品为新型冠状病毒COVID-19阴性；
当ROX荧光通道中无扩增曲线时，且CY3通道也无扩增曲线时，判断本次实验异常，需要重新提取标本RNA和重新扩增。
标准曲线的测定
将阳性标准品1、标准品2、标准品3、标准品4、标准品5、标准品6、标准品7，标准品8用上述确定的检测体系和循环参数进行检测。图1为新型冠状病毒COVID-19的N基因质粒标准品扩增曲线，图2为新型冠状病毒COVID-19标准品浓度标准曲线，所述标准浓度曲线方程为：y＝-3.04x+41.43，其中x是浓度的log值，y是Ct值。通过标准浓度曲线可以定量到10拷贝/mL，即检测灵敏度为10拷贝/mL。
新型冠状病毒COVID-19小鼠实验样本检测
用上述方法对新型冠状病毒COVID-19感染小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑和小肠进行检测，取新型冠状病毒COVID-19感染小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑组织，利用组织匀浆仪(Qiagen)分别对各组织进行匀浆，12000g离心5min后取200μL上清，按照磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒(DP438)(TIANGEN)说明书，提取样本的RNA，得到核酸样本。取20μL核酸样本配置PCR反应检测体系，用上述确定的检测体系和循环参数对小鼠各组织样本进行检测。结果如图3所示，新型冠状病毒COVID-19感染小鼠的肺和小肠有扩增曲线(其他组织没有扩增曲线，说明不含有病毒)，肺脏中病毒含量为106.6拷贝/mL，阳性对照和阴性对照正常，同时样本和阳性对照的内参基因beta actin扩增曲线正常(图4)，说明核酸提取和扩增正常，阴性和阳性结果准确。因此，本方法可用于新型冠状病毒COVID-19感染小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑和小肠等组织的检测。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所
<120> 新型冠状病毒COVID-19荧光定量PCR检测引物和探针、试剂盒及检测方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaagatcaca ttggcacccg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccattgccag ccattctagc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttcaactcca ggcagcagta 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgggaatgg gtcagaagga 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcatcttttc acggttggcc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
actgggacga catggagaag 20
<210> 7
<211> 215
<212> DNA
<213> 新型冠状病毒N基因(COVID-19)
<400> 7
aaagatcaca ttggcacccg caatcctgct aacaatgctg caatcgtgct acaacttcct 60
caaggaacaa cattgccaaa aggcttctac gcagaaggga gcagaggcgg cagtcaagcc 120
tcttctcgtt cctcatcacg tagtcgcaac agttcaagaa attcaactcc aggcagcagt 180
aggggaactt ctcctgctag aatggctggc aatgg 215
<210> 8
<211> 226
<212> DNA
<213> 小鼠内标基因(beta actin)
<400> 8
gtgggaatgg gtcagaagga ctcctatgtg ggtgacgagg cccagagcaa gagaggtatc 60
ctgaccctga agtaccccat tgaacatggc attgttacca actgggacga catggagaag 120
atctggcacc acaccttcta caatgagctg cgtgtggccc ctgaggagca ccctgtgctg 180
ctcaccgagg cccccctgaa ccctaaggcc aaccgtgaaa agatga 226

Claims (10)

1.一种新型冠状病毒COVID-19荧光定量PCR检测引物和探针，其特征在于，其包括针对新型冠状病毒COVID-19N基因的特异性引物如SEQ ID NO.1-2所示，及第一探针如SEQ IDNO.3所示。
2.一种新型冠状病毒COVID-19荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的新型冠状病毒COVID-19荧光定量PCR检测引物和探针，还包括检测小鼠内参基因beta actin的特异性引物及内控探针，所述引物如SEQ ID NO.4-5所示，所述内控探针如SEQ ID NO.6所示。
3.根据权利要求2所述的新型冠状病毒COVID-19荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括分开包装的PCR反应A液和PCR反应B液；
所述PCR反应A液包括引物对集、探针组、dNTP Mixture和PCR buffer；
所述的引物对集由第一引物对和内标引物对组成，所述的第一引物对包括特异性引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，所述内标引物对包括特异性引物SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5；
所述探针组由第一探针SEQ ID NO.3和内控探针SEQ ID NO.6组成；所述的第一探针是针对第一引物对扩增序列设计的探针，所述内控探针是针对内标引物对扩增序列所设计的探针；
所述PCR反应B液由热启动DNA聚合酶、逆转录酶以及RNA酶抑制剂组成。
4.根据权利要求2所述的新型冠状病毒COVID-19荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：
阳性对照：含新型冠状病毒COVID-19N基因扩增序列质粒以及小鼠内参基因Betaactin扩增序列质粒的混合液；
阴性对照：无核酸酶水。
5.根据权利要求2所述的新型冠状病毒COVID-19荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性标准品，所述阳性标准品为含浓度梯度的新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒的多个标准品。
6.根据权利要求5所述的新型冠状病毒COVID-19荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性标准品包括标准品1，新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒浓度为1×107拷贝/mL；标准品2，新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒浓度为1×106拷贝/mL；标准品3，新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒浓度为1×105拷贝/mL；标准品4，新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒浓度为1×104拷贝/mL；标准品5，新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒浓度为1×103拷贝/mL，标准品6，新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒浓度为1×102拷贝/mL；标准品7，新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒浓度为1×101拷贝/mL，标准品8，新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒浓度为1×100拷贝/mL。
7.一种新型冠状病毒COVID-19荧光定量PCR检测方法，其特征在于，该检测方法包括：以提取的小鼠组织样本的RNA为模板，配置扩增反应体系并进行实时荧光定量PCR扩增，每管PCR扩增同时检测ROX和CY3荧光信号，即同时检测新型冠状病毒COVID-19的N基因和小鼠内参基因beta actin，实时记录所述PCR扩增过程中的Ct值和PCR扩增曲线，对PCR扩增曲线进行分析并做出判断；
所述的小鼠组织样本包括小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、小肠等组织；
所述扩增反应体系包括上述的新型冠状病毒COVID-19荧光定量PCR检测引物和探针，以及小鼠内参基因beta actin的特异性引物及内控探针。
8.根据权利要求7所述的新型冠状病毒COVID-19荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述扩增反应体系包括：模板、PCR反应A液、PCR反应B液以及阴性对照和阳性对照；所述实时荧光定量PCR扩增程序为：50℃20min；95℃5min；94℃5sec、55℃45sec，45个循环；25℃10sec。
9.根据权利要求7所述的新型冠状病毒COVID-19荧光定量PCR检测方法，其特征在于，对PCR扩增曲线进行分析并做出判断的原则为：
阴性对照品：ROX和CY3荧光通道无扩增曲线；
阳性对照品：ROX和CY3荧光通道有扩增曲线，且Ct值≤35；
上述ROX为新型冠状病毒COVID-19扩增信号，CY3为小鼠内参基因扩增信号；
以上两项需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，实验需要重新进行；
当ROX荧光通道中Ct≤40时，CY3荧光通道有扩增曲线，判断样品为新型冠状病毒COVID-19阳性；
当ROX荧光通道中40<Ct≤45时，重复一次实验，如果Ct还是在此范围之内或小于40就判断样品为新型冠状病毒COVID-19阳性，否则判断样品为新型冠状病毒COVID-19阴性；
当ROX荧光通道中无扩增曲线时，CY3通道有扩增曲线，判断样品为新型冠状病毒COVID-19阴性；
当ROX荧光通道中无扩增曲线时，且CY3荧光通道也无扩增曲线时，判断本次实验异常，需要重新提取标本RNA重新扩增。
10.权利要求1所述的新型冠状病毒COVID-19荧光定量PCR检测引物和探针、权利要求2-6任一所述的检测试剂盒在制备用于检测新型冠状病毒COVID-19的试剂盒中的应用。
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