CN112126716A - 一种坦布苏病毒的qRT-PCR检测用引物对及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种坦布苏病毒的qRT‑PCR检测用引物对，所述引物对的核苷酸序列如下：上游引物为TMUV‑F:ACTAAAGCCCCAGAACCAC；下游引物为TMUV‑R：CTGCGTTACTATTCACCTTC；并将该引物对应用于检测坦布苏病毒的试剂盒中，具有较高的特异性，检出率达75.38％，说明其灵敏度高，且该引物对具有良好扩增效率，扩增效率为110％，R2为0.9906，表明该扩增曲线具有良好的线性关系，最低检测限为10拷贝。将该引物对应用于用多种水禽坦布苏病毒进行特异性分析中，能实现定量检测，本发明中的qRT‑PCR检测的成本较低，适用于临床大样本检测与监测。

Description

一种坦布苏病毒的qRT-PCR检测用引物对及其应用
技术领域
本发明涉及核酸检测技术领域，具体而言，涉及一种坦布苏病毒的qRT-PCR检测用引物对及其应用。
背景技术
坦布苏病毒(Tembusu Virus)属于黄病毒科黄病毒属病毒，病毒粒子呈球型。病毒核酸为单股正链不分节段的RNA，长度约11kb，只有一个长的开放阅读框，但通过裂解和加工，可形成10个蛋白。坦布苏病毒于1955年在马来西亚吉隆坡库蚊体内首次分离，而从2010年开始，我国鸭群开始爆发TMUV感染，感染鸭群主要表现为蛋鸭产蛋下降，甚至停产；雏鸭生产性能下降等。坦布苏病毒从江苏、福建等东南沿海地区，不断蔓延至全国各地，造成严重的经济损失，已成为危害我国养殖业的重要疾病之一。
目前，坦布苏病毒实验室检测方法大致分为血清学检测及分子生物学检测这两种方法。其中血清学检测包括有琼脂扩散试验、中和试验、间接免疫荧光等，这些方法存在敏感性低、特异性不高或者操作困难，不适应于临床快速诊断等缺点。虽探针法qRT-PCR较染料法qRT-PCR特异性更强，但是成本较高，不适用于临床大样本的检测与监测。
综上，在坦布苏病毒的检测领域，仍然存在亟待解决的上述问题。
发明内容
基于此，为了解决现有技术中坦布苏病毒检测敏感性低、检测特异性不高、操作困难以及成本高，不适应于临床快速诊断的问题，本发明提供了一种坦布苏病毒的qRT-PCR检测用引物对及其应用，具体技术方案如下：
一种坦布苏病毒的qRT-PCR检测用引物对，所述引物对的核苷酸序列如下：
上游引物为TMUV-F:ACTAAAGCCCCAGAACCAC；
下游引物为TMUV-R：CTGCGTTACTATTCACCTTC。
上述坦布苏病毒的qRT-PCR检测用引物对在制备检测坦布苏病毒的试剂或试剂盒中的应用。
另外，提供一种坦布苏病毒的qRT-PCR检测试剂盒，所述qRT-PCR检测的试剂盒含有所述的引物对。
进一步地，所述qRT-PCR检测的试剂盒中还包括：标准质粒和反应试剂。
进一步地，所述标准质粒的制备方法如下：
以坦布苏病毒的NS5蛋白基因为模板，运用TMUV-F、TMUV-R所示的引物进行qRT-PCR扩增反应，得到扩增产物；将扩增产物经凝胶电泳后进行胶回收纯化；将纯化后的扩增产物与pMD18-T载体连接，转化至DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆菌株过夜摇菌扩大培养后，得到标准品重组质粒。
进一步地，所述反应试剂包括RealStar Green Fast Mixture和RNase-free H2O。
另外，还提供一种坦布苏病毒的qRT-PCR检测试剂盒检测的方法，所述方法包括如下步骤：
建立标准曲线：将标准品重组质粒作为模板，进行qRT-PCR扩增反应，反应结束后，根据qRT-PCR扩增反应物的Ct值和标准品质粒浓度绘制标准曲线；
运用Trizol法提取待检样品总RNA并洗脱至无酶水中，备用；
将备用的总RNA添加至反转录体系中得到待检测样品的cDNA，作为模板；
将待测样品的模板进行qRT-PCR扩增反应，得到待测样品的Ct值，判断结果并计算待测样品的核算含量。
进一步地，所述判断结果为：若待测样品的Ct值≥35时，判定为阴性，表示样品中不含有坦布苏病毒核酸；当ct值＜35且Tm值在80～85℃时，判定为阳性，指示样品中含有坦布苏病毒核酸。
进一步地，所述qRT-PCR扩增反应的体系为20μL，包括2×RealStar Green FastMixture 10μL、TMUV-F 1μL、TMUV-R 1μL、cDNA1μL、RNase-free H2O 7μL。
进一步地，所述扩增反应设置的反应程序为：在90-98℃的条件下进行预变性5min；后设置为：温度条件95℃下变性15s、温度条件为58℃的下退火20s、温度条件为72℃下延伸30s、并以此条件以及顺序进行40个循环。
上述方案中采用设计特异性定量qRT-PCR扩增引物并建立了检测方法，该方法不能扩增H5(禽流感H5亚型病毒)、H9(禽流感H5亚型病毒)、NDV(新城疫病毒)、NDRV(新型鸭呼肠孤病毒)、GPV(鹅细小病毒)、GoCV(鹅圆环病毒)、FAdV(禽4型腺病毒)等常见病毒核酸，具有较高的特异性，检出率达75.38％，说明其灵敏度高，且该引物对具有良好扩增效率，扩增效率为110％，R2为0.9906，表明该扩增曲线具有良好的线性关系，最低检测限为10拷贝。将该引物对应用于用多种水禽常见病毒核酸进行特异性分析中，能实现定量检测，本发明中的qRT-PCR检测的成本较低，适用于临床大样本检测与监测。
附图说明
图1是本发明实施例2中qRT-PCR扩增曲线回归线性方程图。
具体实施方式
为了使得本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合其实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不限定本发明的保护范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明实施例中未注明具体实验条件和方法的，通常按照常规条件。
一种坦布苏病毒的qRT-PCR检测用引物对，所述引物对的核苷酸序列如下：
上游引物为TMUV-F:ACTAAAGCCCCAGAACCAC(SEQ.ID.No.1)；
下游引物为TMUV-R：CTGCGTTACTATTCACCTTC(SEQ.ID.No.2)。
采用设计特异性定量qRT-PCR扩增引物并建立了检测方法，该方法不能扩增H5(禽流感H5亚型病毒)、H9(禽流感H5亚型病毒)、NDV(新城疫病毒)、NDRV(新型鸭呼肠孤病毒)、GPV(鹅细小病毒)、GoCV(鹅圆环病毒)、FAdV(禽4型腺病毒)等常见病毒核酸，具有较高的特异性，检出率达75.38％，说明其灵敏度高，且该引物对具有良好扩增效率，扩增效率为110％，R2为0.9906，表明该扩增曲线具有良好的线性关系，最低检测限为10拷贝。将该引物对应用于用多种水禽常见病毒核酸进行特异性分析中，能实现定量检测，本发明中的qRT-PCR检测的成本较低，适用于临床大样本检测与监测。
一种坦布苏病毒的qRT-PCR检测方法在制备检测坦布苏病毒的试剂或试剂盒中的应用。
另外，提供一种坦布苏病毒的qRT-PCR检测试剂盒，所述坦布苏病毒的qRT-PCR检测的试剂盒含有所述的引物对。
在其中一个实施例中，所述qRT-PCR检测的试剂盒中还包括：标准质粒和反应试剂。
在其中一个实施例中，所述标准质粒的制备如下：
以坦布苏病毒的NS5蛋白基因为模板，运用TMUV-F、TMUV-R所示的引物进行qRT-PCR扩增反应，得到扩增产物；将扩增产物经凝胶电泳后进行胶回收纯化；将纯化后的扩增产物与pMD18-T载体连接，转化至DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆菌株过夜摇菌扩大培养后，得到标准品重组质粒。
在其中一个实施例中，所述反应试剂包括RealStar Green Fast Mixture和RNase-free H2O。
另外，还提供一种坦布苏病毒的qRT-PCR检测试剂盒检测的方法，所述方法包括如下步骤：
建立标准曲线：将标准品重组质粒作为模板，进行qRT-PCR扩增反应，反应结束后，根据qRT-PCR扩增反应物的Ct值和标准品质粒浓度绘制标准曲线；
运用Trizol法提取待检样品总RNA并洗脱至无酶水中，备用；
将备用的总RNA添加至反转录体系中得到待检测样品的cDNA，作为模板；
将待测样品的模板进行qRT-PCR扩增反应，得到待测样品的Ct值，判断结果并计算待测样品的核算含量。
在其中一个实施例中，所述判断结果为：若待测样品的Ct值≥35时，判定为阴性，表示样品中不含有坦布苏病毒核酸；当ct值＜35且Tm值在80～85℃时，判定为阳性，指示样品中含有坦布苏病毒核酸。
在其中一个实施例中，所述qRT-PCR扩增反应的体系为20μL，包括2×RealStarGreen Fast Mixture 10μL、TMUV-F 1μL、TMUV-R 1μL、cDNA 1μL、RNase-free H2O 7μL。
在其中一个实施例中，所述扩增反应设置的反应程序为：在90-98℃的条件下进行预变性5min；后设置为：温度条件95℃下变性15s、温度条件为58℃的下退火20s、温度条件为72℃下延伸30s、并以此条件以及顺序进行40个循环。
在其中一个实施例中，所述检测方法可用于非疾病的诊断和/或治疗方法方面的用途。
为了将引物组适用于临床应用的大样本检测与监测，本发明中优化了定量qRT-PCR条件，减少操作，既保证灵敏度，又最大限度降低各种污染，确保结果的科学、精确。
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1
引物的设计与合成：对Genbank数据库中已有的坦布苏病毒毒株各个开放阅读框核苷酸序列进行特异性及保守性分析，并利用BioEdit7.9软件进行基因序列比对分析，通过BEAST1.8软件分析比较个基因序列的进化速率，结果表明ORF1b最为保守，ORF2相对变异较大，而ORF1a相对于ORF1b以及ORF2特异且保守，利用PrimerExpress3.0软件，设置并筛选特异性引物序列，具体如表1所示：
表1：
引物名称 序列
TMUV-F ACTAAAGCCCCAGAACCAC
TMUV-R CTGCGTTACTATTCACCTTC
将上述制备的引物对经qRT-PCR扩增反应后分别分析其扩增效率、相关系数及其特异性，但结果发现，采用本发明的引物对进行坦布苏病毒毒株的检测效果佳。
对比例1：通过引物设计，获得以下的引物对作为对比：
TMUV-F:GCTGAAAGGAATGACCTACCCGATG；
TMUV-R:AGCCCCATCCACAATAGCAG。
在试验的过程中，发现，该引物对对坦布苏病毒的特异性差。
实施例2：
1)试剂盒的制备
本实施例中制备坦布苏病毒的qRT-PCR检测试剂盒，用于检测坦布苏病毒，所述试剂盒中包含：标准质粒、2×RealStar Green Fast Mixture10μL、TMUV-F 1μL、TMUV-R 1μL、RNase-free H2O 7μL、cDNA 1μL。
标准品质粒的制备如下：
以坦布苏病毒的NS5蛋白基因为模板，运用TMUV-F、TMUV-R所示的引物进行qRT-PCR扩增反应，得到扩增产物；将扩增产物经凝胶电泳后进行胶回收纯化；将纯化后的扩增产物与pMD18-T载体连接，反应体系为：cDNA片段4μL，pMD18-T载体1μL，SolutionI5μL。反应条件为16℃连接过夜，获得连接产物；将连接产物转化至DH5α感受态细胞，按照常规操作步骤将转化后的感受态细胞均匀涂布于LB-Amp+平板，37℃过夜培养。挑取形态、大小均匀的单个菌落进行培养。通过质粒提取试剂盒按照操作步骤提取质粒，使用pMD18-T通用引物M13F/R进行PCR检测，选取阳性重组质粒，得到标准品重组质粒，标准品重组质粒稀释至1010～101copies/ul，-20℃保存备用。
2)检测坦布苏病毒的方法，包括以下步骤：
建立标准曲线：将标准品重组质粒作为模板，进行qRT-PCR扩增反应，反应结束后，根据qRT-PCR扩增反应物的Ct值和标准品质粒浓度绘制标准曲线；
运用Trizol法提取待检样品总RNA并洗脱至无酶水中，备用；
将备用的总RNA添加至反转录体系中得到待检测样品的cDNA，作为模板；
构建qRT-PCR反应体系进行扩增反应，收集待测样品的荧光信号；
对收集的荧光信号进行数据处理，得到Ct值和扩增曲线。
在本实施例中，所述反转录体系20μL，其包括反转录酶1μL、dNTP1μL、Oligo(dT)1μL、5X Buffer 4μL、RNase-free H2O 8μL。
在本实施例中，扩增反应设置的反应程序为：在90-98℃的条件下进行预变性5min；后设置为：温度条件95℃下变性15s、温度条件为58℃的下退火20s、温度条件为72℃下延伸30s、并以此条件以及顺序进行40个循环。
3)提取标准质粒测量其浓度，并根据公式计算其拷贝数，原始浓度质粒用RNase-free H2O调整至1×10n copies/μL(n为整数)后再用ddH2O进行10倍梯度稀释。在本实施例中优选为，选取1×1010—1×101copies/μL 9个稀释度，以各稀释度质粒标准质粒作为模板，且每个稀释度设置3个重复进行qRT-PCR扩增。以生成的Ct值作为横坐标，标准质粒浓度的对数作为纵坐标构建标准曲线。如附图1结果显示，qRT-PCR反应在1×1010copies/μL–1×101copies/μL模板范围内取得良好扩增并具有良好线性关系，标准曲线相关系数(R2)为0.99斜率为-3.097，标准曲线回归方程为：y＝-3.097x+37.444。
4)qRT-PCR灵敏性：用RNase-free H2O对调整后的标准质粒进行稀释，从1×106copies/μL稀释至1×102copies/μL，然后以稀释的质粒为模板进行qRT-PCR扩增，观察不同拷贝数的扩增效率。灵敏度结果显示当标准质粒稀释至1×101方时仍具有良好扩增效率。
4)qRT-PCR特异性：向上述制备的qRT-PCR反应体系中分别加入H5、H9、NDV、NDRV、GPV、GoCV、FAdV等水禽常见病毒cDNA或DNA为模板分别进行扩增反应，观察有无特异性扩增。特异性结果显示坦布苏病毒于1×101copies/μL时仍有良好特异性扩增，而H5、H9、NDV、NDRV、GPV、GoCV、FAdV均未出现有特异性扩增。说明了试剂盒具有较强的特异性，与其他鹅源病毒都没有交叉反应。
应用该试剂盒，进行该试剂盒的特异性试验，结果显示试剂盒对除坦布苏病毒外的病毒无反应信号，不能进行有效扩增。
5)qRT-PCR稳定性：选取1×106、1×105、1×104copies/μL三个已知浓度的标准质粒进行qRT-PCR扩增反应，每个浓度设置3个重复，比较批内重复值，将3个已知浓度质粒分4次进行qRT-PCR扩增，比较批间重复值，计算批内、批间重复的变异系数。结果如下表2所示，批内批间变异系数均小于2.5％表明构建的qRT-PCR具有良好的重复性。
表2：
Figure BDA0002711185600000091
Figure BDA0002711185600000101
说明应用该试剂盒，结果也具有显著的重复性，批间重复变异系数(CV)低于5％，说明本发明的试剂盒具有极高的重复性，即稳定性佳。
实施例3：
临床应用实验
取临床疑似坦布苏病毒感染的肝组织、肾组织，匀浆，采用Trizol法提取组织总RNA，按照试剂盒操作步骤将RNA反转录成cDNA，放于-20℃保存备用。
在qRT-PCR管中加入2×RealStar Green Fast Mixture 10μL，TMUV-F 1μL、TMUV-R 1μL、cDNA 1μL、RNase-free H2O 7μL，反应体系共计20μL。在qRT-PCR仪中进行反应，反应条件：95℃预变性5min，扩增40个循环(95℃，15s；58℃，20s；72℃，30s)。
使用实施例2的方法制备标准质粒和制作标准曲线。
结果判定：所述判断结果为：若待测样品的Ct值≥35时，判定为阴性，表示样品中不含有坦布苏病毒核酸；当ct值＜35且Tm值在80～85℃时，判定为阳性，指示样品中含有坦布苏病毒核酸。
临床实验采用65份疑似样品进行检测，结果发现，显示检出率达75.38％。对相关阳性样品实时qRT-PCR反应结束后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，切取目的条带进行胶回收。将目的条带回收产物连接在Pmd18-T载体上，然后转化在DH5a克隆感受态细胞后涂布平板过夜，随机挑取10份单菌落，摇菌3h后，进行菌液PCR，将筛选的阳性菌液进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，均为坦布苏病毒片段，说明本申请的检测准确率高。
对比临床应用实验：
随机选择坦布苏病毒PCR试剂盒检测作为对比例临床试验，且该试剂盒中含对比例1中的引物对。选择65份疑似坦布病毒样品进行检测，检测方法如下：
取临床疑似坦布苏病毒感染的肝组织、肾组织，匀浆，采用Trizol法提取组织总RNA，按照试剂盒操作步骤将RNA反转录成cDNA，放于-20℃保存备用。
对比临床应用实验选择同样的65份疑似坦布苏病毒感染样品作为试验，将疑似坦布苏病毒转录得到的cDNA作为模板，使用普通的坦布苏病毒PCR试剂盒，按照PCR反应体系和优化的反应条件进行多重PCR扩增，显示结果检测27份阳性样品，检出率为41.53％，说明了本方案中的qRT-PCR检测试剂盒具有更佳的检出敏感性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种坦布苏病毒的qRT-PCR检测用引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如下：
上游引物为TMUV-F:ACTAAAGCCCCAGAACCAC；
下游引物为TMUV-R：CTGCGTTACTATTCACCTTC。
2.权利要求1所述的坦布苏病毒的qRT-PCR检测用引物对在制备检测坦布苏病毒的试剂或试剂盒中的应用。
3.一种坦布苏病毒的qRT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述qRT-PCR检测试剂盒含有如权利要求1所述的引物对。
4.根据权利要求3所述的坦布苏病毒的qRT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述qRT-PCR检测试剂盒中还包括：标准质粒和反应试剂。
5.根据权利要求4所述的坦布苏病毒的qRT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述标准质粒的制备方法如下：
以坦布苏病毒的NS5蛋白基因为模板，运用TMUV-F、TMUV-R所示的引物进行qRT-PCR扩增反应，得到扩增产物；将扩增产物经凝胶电泳后进行胶回收纯化；将纯化后的扩增产物与pMD18-T载体连接，转化至DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆菌株过夜摇菌扩大培养后，得到标准品重组质粒。
6.根据权利要求4所述的坦布苏病毒的qRT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述反应试剂包括RealStar Green Fast Mixture和RNase-free H2O。
7.一种坦布苏病毒的qRT-PCR检测试剂盒检测的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
建立标准曲线：将标准品重组质粒作为模板，进行qRT-PCR扩增反应，反应结束后，根据qRT-PCR扩增反应物的Ct值和标准品质粒浓度绘制标准曲线；
运用Trizol法提取待检样品总RNA并洗脱至无酶水中，备用；
将备用的总RNA添加至反转录体系中得到待检测样品的cDNA，作为模板；
将待测样品的模板进行qRT-PCR扩增反应，得到待测样品的Ct值，判断结果并计算待测样品的核算含量。
8.根据权利要求7所述的坦布苏病毒的qRT-PCR检测试剂盒检测的方法，其特征在于，所述判断结果为：若待测样品的Ct值≥35时，判定为阴性，表示样品中不含有坦布苏病毒核酸；当ct值＜35且Tm值在80℃～85℃时，判定为阳性，指示样品中含有坦布苏病毒核酸。
9.根据权利要求8所述的坦布苏病毒的qRT-PCR检测试剂盒检测的方法，其特征在于，所述qRT-PCR扩增反应的体系为20μL，包括2×RealStar Green Fast Mixture 10μL、TMUV-F 1μL、TMUV-R 1μL、cDNA1μL、RNase-free H2O 7μL。
10.根据权利要求9所述的坦布苏病毒的qRT-PCR检测试剂盒检测的方法，其特征在于，所述扩增反应设置的反应程序为：在90-98℃的条件下进行预变性5min；后设置为：温度条件95℃下变性15s、温度条件为58℃的下退火20s、温度条件为72℃下延伸30s、并以此条件以及顺序进行40个循环。
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