CN116445660A - 一种检测非洲猪瘟病毒的四重qPCR引物探针组及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测非洲猪瘟病毒的引物探针组，包括用于检测非洲猪瘟病毒B646L基因、Ⅰ型非洲猪瘟病毒EP402R基因、Ⅱ型非洲猪瘟病毒EP402R基因、非洲猪瘟病毒MGF_360‑13L基因的特异性引物对和探针，所述引物和探针核苷酸序列如SEQ IDNO：1‑12所示。本发明仅需一次qPCR扩增即可鉴别出ASFV毒株是否存在基因缺失和野毒株的基因型，具有效率高、成本低和检测时间短等优点，对于临床样品的检测及临床防控有较大的指导意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种检测非洲猪瘟病毒的引物探针组及其应用。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起猪的一种急性、热性、高度接触传染性疾病，致死率可高达100％。世界动物卫生组织(WOAH)将其列为必须报告动物疫病,我国将其列为一类动物疫病。自1921年肯尼亚首次爆发ASF后，一直到20世纪中期，ASFV仅在非洲地区流行传播，但1957年传播到了葡萄牙，并进一步在欧洲其他国家扩散开来，2007年格鲁吉亚发生非洲猪瘟并向周围扩散开来，2018年8月，中国沈阳首次发生非洲猪瘟病例，随后在我国各省市蔓延开来，对我国养猪业造成巨大损失。
非洲猪瘟病毒属于DNA病毒目，是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，是可以由虫媒传播的DNA病毒，病毒粒子呈二十面体对称，直径为约为200nm，外包囊膜，内部含有数个共同轴心的同心圆结构，基因组全长170～196kb，含有150～167个个开放阅读框，可编码150～200种蛋白，根据ASFV的B646L基因C末端序列的差异可分为24个基因型。目前我国已出现基因Ⅰ型和Ⅱ型，不同基因型毒株的B646L基因序列差异小，只能通过测序区分，本发明中通过比对基因Ⅰ型和Ⅱ型毒株的EP402R基因，发现存在序列差异，所以设计了针对基因Ⅰ型和Ⅱ型毒株的EP402R基因的引物探针。
目前，临床中检测非洲猪瘟的方法主要为荧光定量PCR方法，敏感度高，检测时间短，但是由于非洲猪瘟病毒已在我国出现三年多的时间，有研究证明已经出现了自然变异毒株，只检测B646L基因无法区分毒株是否存在基因缺失和毒株的基因型，因此，本发明结合荧光定量PCR方法的敏感性高和多通道的优点，建立一种能够同时区分ASFV野毒株的基因型和基因缺失株的多重荧光定量PCR方法，实现了ASFV的鉴别诊断，对临床的防控有很强的指导意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够同时区分基因Ⅰ/Ⅱ型非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的四重qPCR检测引物探针组和试剂盒，具有特异性强、灵敏度高、成本低等特点，在鉴别ASFV野毒株的基因型的同时区分野毒株与基因缺失株，为有效防控ASF提供了新的途径。
本发明是通过以下的技术方案实现的：
能够同时区分基因Ⅰ/Ⅱ型非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的四重qPCR检测引物探针组包括4组引物探针组合，具体序列如下：
组合1包括以下引物：
B646L-F:TTACTACTGCGAATACCCCG(SEQ ID NO:1)
B646L-R:TTCCCTCCACCGATACCTC(SEQ ID NO:2)
探针B646L-P：CY5-ACGACTTTATGAAAACGTAAGATTCGATGT-BHQ3(SEQ ID NO:9)
扩增产物的核苷酸序列：
TTACTACTGCGAATACCCCGGAGAACGACTTTATGAAAACGTAAGATTCGATGTAAATGGAAATTCCCTAGACGAATATAGTTCGGATGTCACAACGCTTGTGCGCAAATTTTGCATCCCAGGGGATAAAATGACTGGATATAAGCACTTGGTTGGCCAGGAGGTATCGGTGGAGGGAA
组合2包括以下引物：
Ⅰ型-EP402R-F:TTGTGAGTGGATTAATAATAGGT(SEQ ID NO:3)
Ⅰ型-EP402R-R:AGTGGTGTCATCGTGAGAAA(SEQ ID NO:4)
探针Ⅰ型-EP402R-P：FAM-CAATCATATCTGTATTATCTATACGAAG-MGB(SEQ ID NO:10)
扩增产物的核苷酸序列：
TTGTGAGTGGATTAATAATAGGTATTTTTATTTCAATCATATCTGTATTATCTATACGAAGAAAAAGAAAAAAACATGTTGAAGAAATAGAAAGTCCACCACCCTCTGAATCTAATGAAGAAGATATTTCTCACGATGACACCACT
组合3包括以下引物：
Ⅱ型-EP402R-F:GAAAAGCAGGTAACTTTTGTG(SEQ ID NO:5)
Ⅱ型-EP402R-R:TATATGTGATATTTGGGGGAG(SEQ ID NO:6)
探针Ⅱ型-EP402R-P：VIC-ATTTGATACAACATATCAAGTAGTATGG-MGB(SEQ ID NO:11)
扩增产物的核苷酸序列：
GAAAAGCAGGTAACTTTTGTGAATGTTCTAATTATAGTACATCAATATATAATATAACAAATAATTGTAGCTTAACTATTTTTCCTCATAATGATGTATTTGATACAACATATCAAGTAGTATGGAATCAAATAATTAATTATACAATAAAATTATTAACACCTGCTACTCCCCCAAATATCACATATA
组合4包括以下引物：
MGF_360-13L-F:GCAACATCAACCAAGCTATGC(SEQ ID NO:7)
MGF_360-13L-R:TGGCAAGGAAGCATCTGA(SEQ ID NO:8)
探针MGF_360-13L-P：CY5-5-ATGCCTTTGAAGAGGGTCGTGCC-BHQ3(SEQ ID NO:12)
扩增产物的核苷酸序列：
GCAACATCAACCAAGCTATGCTTACTTCAGTACAATATTATAACATCGGTAATATATTTTTCTGTATAGATTTGGGTGGTAATGCCTTTGAAGAGGGTCGTGCCATAGCGGAACAAAAAGGTTATAATTTTCTGAGCCATAGTTTGGCTTTGGATATTTACAGCTCAGATGCTTCCTTGCCA
所述组合1、2、3、4的引物探针分别是用于检测ASFV的B646L基因、基因Ⅰ型ASFV的EP402R基因、基因Ⅱ型ASFV的EP402R基因和MGF_360-13L基因。
所述的引物探针组在制备非洲猪瘟病毒检测试剂盒中的应用，用于区分基因Ⅰ型和Ⅱ型非洲猪瘟病毒并对野毒株和EP402R基因、MGF_360-13L基因缺失毒株进行鉴定，所述检测试剂盒是四重qPCR试剂盒。
本发明进一步提供一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒，所述试剂盒含有以上所述的引物探针组。
进一步地，所述试剂盒还含有qPCR扩增反应试剂、阴性对照和阳性对照标准品。
本发明还提供了一种检测非洲猪瘟病毒的方法，包括以下步骤：
(1)样品处理：对血液、拭子、组织等样品进行预处理，通过DNA提取试剂盒提取核酸；
(2)用以上所述的引物探针组配置扩增反应液，用提取的核酸作为模板进行四重qPCR反应；
(3)收集四个通道的荧光信号并进行结果判定。
优选地，所述反应体系总体积为25μL，包括模板5μL，反应试剂12.5μL，3对引物B646L-F/R(20μM)、Ⅰ型-EP402R-F/R(20μM)、Ⅱ型-EP402R-F/R(20μM)各0.5μL，1对引物MGF_360-13L-F/R(50μM)0.2μL，3条探针B646L-P(10μM)、Ⅰ型-EP402R-P(10μM)、MGF_360-13L-P(10μM)各1μL，1条探针Ⅱ型-EP402R-P(10μM)0.75μL，去离子水0.35μL。
优选地，所述四重qPCR反应的程序为50℃2min，95℃预变性30s，95℃变性10s，57℃退火40s，40个循环。
本发明通过荧光定量PCR仪自带软件绘制扩增曲线并读取相应的Ct值并进行结果判定，当CY5、FAM、CY5-5三个通道均有扩增曲线时说明为无基因缺失的基因Ⅰ型野毒株；当CY5、VIC、CY5-5三个通道均有扩增曲线时说明为无基因缺失的基因Ⅱ型野毒株；当CY5、CY5-5两个通道均有扩增曲线时说明为缺失EP402R基因毒株；当CY5、FAM两个通道均有扩增曲线时说明为缺失MGF_360-13L的基因Ⅰ型毒株；当CY5、VIC两个通道均有扩增曲线时说明为缺失MGF_360-13L的基因Ⅱ型毒株；当只有CY5一个通道有扩增曲线时说明为缺失EP402R基因和MGF_360-13L的基因双缺毒株。
该方法既可用于非洲猪瘟的疾病诊断，又能用于以非疾病诊断为目的的非洲猪瘟病毒实验室筛查鉴定。
本发明的有益效果是：
目前流行的ASFV毒株中不仅有野生型和基因缺失型毒株，还存在基因Ⅰ型和Ⅱ型毒株，所以在检测时不仅需要鉴定出阴阳性，还需要同时对毒株进行鉴别是否存在基因缺失和基因型，以便进行溯源，并且基因缺失毒株一般对猪只的致病力较弱，在临床中不易被发现，对于野毒株和缺失毒株需要采取不同的防控措施。还需要同时对毒株进行鉴别，以采取不同的防控措施。所以本发明针对ASFV的B646L基因、基因Ⅰ型和Ⅱ型的EP402R基因及MGF_360-13L基因设计了四组特异性引物和探针，建立了多重qPCR检测方法，能够一次qPCR扩增即可鉴别出ASFV毒株是否存在基因缺失和野毒株的基因型，并且本发明检测方法的检测下限为B646L基因12Copies/μL、基因I型Ep402R基因39Copies/μL、基因II型Ep402R基因110Copies/μL和MGF_360-13L基因40Copies/μL，与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等6种猪源无交叉反应，组内组间变异系数均小于5％。本发明具有快速、特异、准确的优点，可以为ASFV不同毒株的鉴别提供技术手段。
附图说明
图1：另一种引物探针组对混合质粒的扩增曲线。
图2：Ⅰ型-EP402R的引物、探针浓度优化试验结果。优化后的引物终浓度为0.4μmol/L，探针终浓度为0.5μmol/L。
图3：Ⅱ型-EP402R的引物、探针浓度优化试验结果。优化后的引物终浓度为0.4μmol/L，探针终浓度为0.3μmol/L。
图4：B646L的引物、探针浓度优化试验结果。优化后的引物终浓度为0.4μmol/L，探针终浓度为0.4μmol/L。
图5：MGF_360-13L的引物、探针浓度优化试验结果。优化后的引物终浓度为0.4μmol/L，探针终浓度为0.4μmol/L。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，所采用的为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1引物和探针设计
选取NCBI的GenBanK数据库中已公布的非洲猪瘟病毒(ASFV)的B646L基因、Ep402R基因、MGF_360-13L基因的高度保守且具有特异性的区域，并对基因Ⅰ型和Ⅱ型毒株的EP402R基因进行差异分析，最终设计了四组针对4个基因的引物探针组合。特别需要说明的是由于基因I型和II型的EP402R基因存在差异的区域的GC含量较低，对于引物探针设计的要求较高，申请人筛选出扩增良好且能够区分基因I型和II型的引物，相互无交叉反应，同时对探针的淬灭基团使用MGB基团，能够提高探针的溶解温度和识别模板的特异性。
组合1包括以下引物：
B646L-F:TTACTACTGCGAATACCCCG
B646L-R:TTCCCTCCACCGATACCTC
探针B646L-P：CY5-ACGACTTTATGAAAACGTAAGATTCGATGT-BHQ3
组合2包括以下引物：
Ⅰ型-EP402R-F:TTGTGAGTGGATTAATAATAGGT
Ⅰ型-EP402R-R:AGTGGTGTCATCGTGAGAAA
探针Ⅰ型-EP402R-P：FAM-CAATCATATCTGTATTATCTATACGAAG-MGB
组合3包括以下引物：
Ⅱ型-EP402R-F:GAAAAGCAGGTAACTTTTGTG
Ⅱ型-EP402R-R:TATATGTGATATTTGGGGGAG
探针Ⅱ型-EP402R-P：VIC-ATTTGATACAACATATCAAGTAGTATGG-MGB
组合4包括以下引物：
MGF_360-13L-F:GCAACATCAACCAAGCTATGC
MGF_360-13L-R:TGGCAAGGAAGCATCTGA
探针MGF_360-13L-P：CY5-5-ATGCCTTTGAAGAGGGTCGTGCC-BHQ3
另外，在设计第4组引物时，申请人还参考了CN 113122654A的MGF360-13L基因qPCR引物和探针，即
MGF_360-13L-F：TCCTCTAGTTTCTTTGG
MGF_360-13L-R：TCGTGTGGCATTAATAATAG
探针MGF_360-13L-P：CY5-5-CAACTCTCGGATGTGCTTCGTATTG-BHQ3
扩增曲线见图1，结果发现该引物会与另外三组引物探针发生非特异性反应。
实施例2检测条件优化
1.标准质粒的制备：
针对ASFV的B646L基因、基因I型的EP402R基因、基因II型的EP402R基因和MGF_360-13L基因设计引物，以ASFV的DNA为模板进行扩增，回收扩增产物，将纯化的扩增产物克隆至pMD18-T载体中，转化到DH5α感受态细胞，阳性克隆体在37℃下培养18～20h，提取质粒后进行PCR和测序鉴定。鉴定成功后将它们作为阳性标准品，并且分别命名为pASFV-B646L、pASFV-I型-EP402R、pASFV-Ⅱ型-EP402R和pASFV-MGF_360-13L，用仪器测定质粒浓度并换算为拷贝数(copies/μL)，pASFV-B646L、pASFV-I型-EP402R、pASFV-Ⅱ型-EP402R和pASFV-MGF_360-13L标准质粒的拷贝数分别为1.23×1010copies/μL、3.89×1010copies/μL、4.42×1010copies/μL和3.96×1010copies/μL。
2.引物探针的浓度和退火温度的优化：
利用矩阵法对引物浓度和探针浓度进行优化，使引物终浓度为0.2/0.3/0.4/0.5/0.6/0.7μmol/L、探针终浓度为0.1/0.2/0.3/0.4/0.5/0.6μmol/L，摸索最佳浓度；退火温度采用55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃；循环数采用40次；反应总体系采用25μL，确定后得到所述的反应液和反应程序。
试验结果：4对引物的终浓度为0.4μmol/L；探针B646L-P的终浓度为0.4μmol/L、探针Ⅰ型-EP402R-P的终浓度为0.5μmol/L、探针Ⅱ型-EP402R-P的终浓度为0.3μmol/L、探针MGF_360-13L-P的终浓度为0.4μmol/L(图2-5)。退火温度优选57℃。
实施例3检测效果验证
1.敏感性试验：
将制备的四个标准质粒按照107、106、105、104、103、102、50、25、10、1copies/μL进行梯度稀释，作为模板，使用优化好的反应液和反应程序进行扩增，得到四个标准质粒的扩增曲线，结果显示为B646L基因的检测下限为12Copies/μL、基因I型Ep402R基因的检测下限为39Copies/μL、基因II型Ep402R基因的检测下限为110Copies/μL、MGF_360-13L基因的检测下限为40Copies/μL。
2.特异性实验：
使用该方法同时扩增实验室保存的CSFV(猪瘟病毒)、PRRSV(猪蓝耳病毒)、PRV(猪伪狂犬病毒)、PCV2(圆环病毒Ⅱ型)、PCV3(猪圆环病毒3型)、PED(猪流行性腹泻病毒)共6种常见猪源病毒阳性核酸，结果为均无扩增曲线和CT值，具有较强的特异性。
3.标准质粒的标准曲线的绘制：
将制备的四个标准质粒按照107、106、105、104、103、102、10copies/μL进行梯度稀释，作为模板，使用优化好的反应液和反应程序进行扩增，得到四个基因的标准曲线，其中B646L基因的标准曲线为y＝-3.306x+38.421,E＝100.7％,R2＝0.999；基因I型Ep402R基因的标准曲线为y＝-3.472x+40.292,E＝94.1％，R2＝0.998；基因II型Ep402R基因的标准曲线为y＝-3.281x+38.575,E＝101.7％，R2＝1.000；MGF_360-13L基因的标准曲线为y＝-3.355x+38.856,E＝98.6％，R2＝0.999。
4.重复性实验：
将106、105、104copies/μL的质粒作为标准模板进行组内、组间重复实验，计算组内、组间变异系数。得出组内组间的变异系数均小于5％，说明重复性良好。
表1重复性实验结果
Claims (10)
1.一种检测非洲猪瘟病毒的引物探针组，其特征在于：包括用于检测非洲猪瘟病毒B646L基因的特异性引物对和探针、用于检测Ⅰ型非洲猪瘟病毒EP402R基因的特异性引物对和探针、用于检测Ⅱ型非洲猪瘟病毒EP402R基因的特异性引物对和探针、用于检测非洲猪瘟病毒MGF_360-13L基因的特异性引物对和探针，其中，
用于检测非洲猪瘟病毒B646L基因的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-2所示；
用于检测Ⅰ型非洲猪瘟病毒EP402R基因的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO:3-4所示；
用于检测Ⅱ型非洲猪瘟病毒EP402R基因的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO:5-6所示；
用于检测非洲猪瘟病毒MGF_360-13L基因的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO:7-8所示。
2.如权利要求1所述的引物探针组，其特征在于：用于检测非洲猪瘟病毒B646L基因的特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；用于检测Ⅰ型非洲猪瘟病毒EP402R基因的特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；用于检测Ⅱ型非洲猪瘟病毒EP402R基因的特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示、用于检测非洲猪瘟病毒MGF_360-13L基因的特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
3.如权利要求2所述的引物探针组，其特征在于：所述探针的5′端修饰有报告基团，所述报告基团为CY5、FAM、VIC或CY5-5；所述探针的3′端修饰有淬灭基团，所述淬灭基团为BHQ3或MGB。
4.权利要求1-3任一项所述的引物探针组在制备非洲猪瘟病毒检测试剂盒中的应用，用于区分基因Ⅰ型和Ⅱ型非洲猪瘟病毒并对野毒株和EP402R基因、MGF_360-13L基因缺失毒株进行鉴定，所述检测试剂盒是四重qPCR试剂盒。
5.一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1-3任意一项所述的引物探针组。
6.如权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有qPCR扩增反应试剂、阴性对照和阳性对照标准品。
7.一种非诊断目的检测非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)对样品进行预处理，通过DNA提取试剂盒提取核酸；
(2)用权利要求1-3任一项所述的引物探针组配制扩增反应液，用提取的核酸作为模板进行四重qPCR反应；
(3)收集四个通道的荧光信号并进行结果判定。
8.如权利要求7所述检测非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于：所述反应体系总体积为25μL，包括模板5μL，反应试剂12.5μL，3对引物B646L-F/R(20μM)、Ⅰ型-EP402R-F/R(20μM)、Ⅱ型-EP402R-F/R(20μM)各0.5μL，1对引物MGF_360-13L-F/R(50μM)0.2μL，3条探针B646L-P(10μM)、Ⅰ型-EP402R-P(10μM)、MGF_360-13L-P(10μM)各1μL，1条探针Ⅱ型-EP402R-P(10μM)0.75μL，去离子水0.35μL。
9.如权利要求7所述检测非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于：所述四重qPCR反应的程序为50℃2min，95℃预变性30s，95℃变性10s，57℃退火40s，40个循环。
10.如权利要求7所述检测非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于：通过荧光定量PCR仪自带软件绘制扩增曲线并读取相应的Ct值并进行结果判定，当CY5、FAM、CY5-5三个通道均有扩增曲线时说明为无基因缺失的基因Ⅰ型野毒株；当CY5、VIC、CY5-5三个通道均有扩增曲线时说明为无基因缺失的基因Ⅱ型野毒株；当CY5、CY5-5两个通道均有扩增曲线时说明为缺失EP402R基因毒株；当CY5、FAM两个通道均有扩增曲线时说明为缺失MGF_360-13L的基因Ⅰ型毒株；当CY5、VIC两个通道均有扩增曲线时说明为缺失MGF_360-13L的基因Ⅱ型毒株；当只有CY5一个通道有扩增曲线时说明为缺失EP402R基因和MGF_360-13L的基因双缺毒株。
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