CN111996191A

CN111996191A - 一种基于多重qPCR技术同时鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失株用引物组和试剂盒

Info

Publication number: CN111996191A
Application number: CN202011037229.4A
Authority: CN
Inventors: 于江; 吴家强; 孟凯; 张玉玉; 刘娜; 孙文博; 陈智; 任素芳
Original assignee: Institute Animal Science and Veterinary Medicine of Shandong AAS
Current assignee: Institute Animal Science and Veterinary Medicine of Shandong AAS
Priority date: 2020-09-28
Filing date: 2020-09-28
Publication date: 2020-11-27

Abstract

本发明提供了一种基于多重qPCR技术同时鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失株用引物组和试剂盒，属于病毒检测技术领域。基于多重qPCR技术同时鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失株用引物探针组，包括p72基因特异引物探针、CD2v基因特异引物探针和MGF基因特异引物探针。试剂盒包括引物探针组。采用试剂盒进行多重qPCR检测，ASFV的保守基因p72基因特异引物可扩增野生毒株和基因缺失疫苗株，而CD2v基因和MGF基因的特异引物只能扩增野生毒株，三对引物组合使用可实现同时鉴别ASFV野生毒株和基因缺失疫苗株。本发明具有检测准确、灵敏、高效率、成本低等优点，对临床样品的诊断及养殖业有较强的实用价值。

Description

一种基于多重qPCR技术同时鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失株用引物组和试剂盒

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种基于多重qPCR技术同时鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失株用引物组和试剂盒。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine fever，East African Swine fever，ASF)，是一种急性，发热传染性很高的滤过性病毒所引起的猪病，其特征是发病过程短，但死亡率高达100％，病猪临床表现为发热，皮肤发绀，淋巴结、肾、胃肠粘膜明显出血。非洲猪瘟病毒(ASFV)是非洲猪瘟科非洲猪瘟病毒属的重要成员，病毒粒子的直径为175-215nm，呈20面体对称，有囊膜。基因组为双股线状DNA，大小170-190kb。目前，根据ASFV的p72基因(B646L)末端核苷酸的差异，可将ASFV分为24个基因型，基于病毒是否会引起红细胞吸附的特性，已鉴定出至少8个血清群。

ASFV可以通过受体介导的内吞作用或非特异性的巨胞饮作用入侵单核-巨噬细胞系统，通过抑制细胞凋亡、宿主免疫应答等策略逃逸宿主免疫防御系统。由于该病毒基因组巨大，功能性蛋白超过200个。因此，基因缺失疫苗被认为是短期内最有希望开发成功的疫苗，具有同源保护作用，同时也能抵抗异源毒株的攻击。2020年3月，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所发文称遴选出一株具有7个基因缺失的病毒HLJ/18-7GD(缺失MGF505-1R，MGF505-2R，MGF505-3R，MGF360-12L，MGF360-13L，MGF360-14L，CD2v)，该缺失株符合弱毒活疫苗安全性标准，可对ASFV强毒株的致死性攻击提供有效免疫保护。军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所构建了多基因家族(MGF)和CD2v基因缺失的ASFV基因缺失疫苗候选株，接种猪能够100％抵抗亲本毒株SY18株的攻击。

目前，鉴定ASFV的方法主要是采用荧光定量PCR技术检测p72基因，无法区分ASF野毒株和基因缺失疫苗株。一旦确定是ASFV，扑杀焚烧是唯一的处理方法，以免造成更多猪群感染。因此，建立一种能够快速鉴别ASFV野毒株和基因缺失疫苗株的诊断方法，是防控ASF的关键。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于多重qPCR技术同时鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失株用引物组和试剂盒，具有特异性强、准确度高，低成本、灵敏度高、闭管操作安全可靠的特点，为ASFV野毒株和基因缺失疫苗株的同时快速鉴别检测及有效防控ASF提供了新的途径。

本发明提供了一种基于多重qPCR技术同时鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失株用引物组，包括ASFV p72基因特异引物、ASFV CD2v基因特异引物和ASFV MGF基因特异引物；

所述ASFV p72基因特异引物包括如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的正向引物p72-F和如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的反向引物p72-R；

所述ASFV CD2v基因特异引物包括如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的正向引物CD2v-F和如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的反向引物CD2v-R；

所述ASFV MGF基因特异引物包括如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的正向引物MGF-F和如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的反向引物MGF-R。

优选的，还包括探针组；

检测ASFV p72基因用探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

检测ASFV CD2v基因用探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

检测ASFV MGF基因用探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

优选的，所述探针的5’端修饰有报告基团，所述报告基团为FAM、HEX和CY5；所述探针的3’端修饰有淬灭基团，所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2和BHQ3；三种探针采用不同的报告基团和猝灭基团修饰。

本发明提供了一种基于多重qPCR技术同时鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失株的试剂盒，包括所述引物组。

优选的，还包括阳性对照标准品和多重qPCR扩增反应用试剂。

优选的，所述阳性对照标准品为包含ASFV p72基因片段的重组质粒、包含ASFVCD2v基因片段的重组质粒和包含ASFV MGF基因片段的重组质粒。

优选的，所述ASFV p72基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

所述ASFV CD2v基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

所述ASFV MGF基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

优选的，所述ASFV p72基因片段、ASFV CD2v基因片段和ASFV MGF基因片段通过多重PCR扩增获得；

所述多重PCR扩增的反应条件为95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共32个循环；72℃再延伸10min。

优选的，还包括阴性对照品；所述阴性对照品为无RNA酶水。

本发明提供了一种同时鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失株的分子标记，包括ASFV p72基因的分子标记、ASFV CD2v基因的分子标记和ASFV MGF基因的分子标记；

所述ASFV p72基因的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

所述ASFV CD2v基因的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

所述ASFV MGF基因的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

本发明提供的基于多重qPCR技术同时鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失株用引物组，对ASFV野生毒株和基因缺失疫苗株(缺失CD2v和MGF)进行多重实时荧光定量PCR检测，ASFV的保守基因p72基因特异引物对野生毒株和基因缺失疫苗株均可以扩增出来，以ASFV的CD2v基因和MGF基因为模板分别设计引物，CD2v基因特异引物和MGF基因特异引物只能扩增出野生毒株，通过三组引物的扩增结果判断样本为野生毒株和基因缺失株。通过特异性、灵敏度的验证，并通过Sanger法测序验证方法准确性，结果显示可以准确的将ASFV野生毒株和基因缺失疫苗株区分开，且灵敏度可达到10个单拷贝数。

同时本发明提供的引物组在同一个反应体系中扩增，具有较高的特异性且不会产生特异性扩增，大大简化了检测操作。

本发明提供的试剂盒，在整个检测过程都是闭管操作，从而大大减少了体系的污染，且在诊断时间上与传统的普通PCR方法比较自获得待检样品到DNA提取、反应体系配置直到出现检测结果，整个过程仅用1.5h即可完成，大大缩短了时间，一个反应即可完成ASFV野生毒株和基因缺失疫苗株的定性检测，大大节约了成本。综上，本发明提供的检测试剂盒具有准确、灵敏、高效率、成本低等优点，对临床样品的准确诊断及养猪业的发展具有很强的实用价值。

附图说明

图1为当FAM、HEX、CY5荧光修饰探针均有扩增曲线时，且满足FAM和HEX的Ct≤35，CY5的Ct≤32时，说明待检样本为ASFV野生毒株；

图2为当仅FAM荧光修饰探针有扩增曲线，HEX、CY5荧光修饰探针无扩增曲线时，且满足FAM的Ct≤35，说明待检样本为ASFV基因缺失疫苗株；

图3为ASFV p72-probe特异性探针灵敏度扩增曲线图；

图4为ASFV CD2v-probe特异性探针灵敏度扩增曲线图；

图5为ASFV MGF-probe特异性探针灵敏度扩增曲线图；

图6为用p72-F/R、CD2v-F/R、MGF-F/R引物进行普通PCR检测的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种基于多重qPCR技术同时鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失株用引物组，包括ASFV p72基因特异引物、ASFV CD2v基因特异引物和ASFV MGF基因特异引物。

在本发明中，所述ASFV p72基因特异引物以ASFV的保守基因p72为模板设计得到，所述ASFV p72基因特异引物能够同时扩增野生毒株和基因缺失疫苗株。ASFV CD2v基因特异引物以ASFV的CD2v基因为模板设计得到，针对CD2v基因缺失疫苗株进行检测时，无法扩增出目标条带，仅能扩增野生毒株。ASFV MGF基因特异引物以ASFV的MGF基因为模板设计得到，针对MGF基因缺失疫苗株进行检测时，无法扩增出目标条带，仅能扩增野生毒株。因此，采用本发明提供的引物组对ASFV进行多重荧光定量PCR检测时，当检测出三条扩增曲线时，则判断ASFV为野生毒株；当p72基因特异引物扩增得到目标条带时，同时ASFV CD2v基因特异引物未扩增得到目标条带，表明ASFV为CD2v基因缺失疫苗株；当p72基因特异引物扩增得到目标条带时，同时ASFV MGF基因特异引物未扩增得到目标条带，则判断ASFV为MGF基因缺失疫苗株。

在本发明中，所述ASFV p72基因特异引物包括如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的正向引物p72-F和如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的反向引物p72-R；所述ASFV CD2v基因特异引物包括如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的正向引物CD2v-F和如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的反向引物CD2v-R；所述ASFV MGF基因特异引物包括如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的正向引物MGF-F和如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的反向引物MGF-R。本发明提供的3对引物具有较高的扩增特异性，能准确结合相应基因模板，不产生非特异性扩增且引物之间不形成引物二聚体，因此，即便在同一个体系中，能够准确扩增得到相应的目标片段。因此，所述三对引物能够用于多重荧光定量PCR检测或用于多重PCR检测。本发明对所述引物组的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的引物合成方法即可。在本发明实施例中，所述引物组委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

在本发明中，所述引物组还优选包括探针组；检测ASFV p72基因用探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；检测ASFV CD2v基因用探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；检测ASFV MGF基因用探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。所述探针的5’端优选修饰有报告基团，所述报告基团优选为FAM、HEX和CY5；所述探针的3’端优选修饰有淬灭基团，所述淬灭基团优选为BHQ1、BHQ2和BHQ3；三种探针采用不同的报告基团和猝灭基团修饰，以便清楚区分不同基因特异引物的扩增结果。三种探针能特异性结合到目标基因片段上，且三种探针与上述三对引物用于多重荧光定量PCR扩增，能够准确得到相应的扩增曲线。本发明对所述探针组的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的探针合成方法即可。在本发明实施例中，所述探针组委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

本发明提供了一种基于多重qPCR技术同时鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失株的试剂盒，包括所述引物组。所述试剂盒优选还包括阳性对照标准品和多重qPCR扩增反应用试剂。所述阳性对照标准品优选为包含ASFV p72基因片段的重组质粒、包含ASFV CD2v基因片段的重组质粒和包含ASFV MGF基因片段的重组质粒。三种重组质粒优选以pGH载体为基础载体，在多克隆位点处插入三个外源基因片段。所述ASFV p72基因片段的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.10所示；所述ASFV CD2v基因片段的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.11所示；所述ASFV MGF基因片段的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.12所示。所述ASFV p72基因片段、ASFV CD2v基因片段和ASFV MGF基因片段优选以病毒DNA为模版，用上述3对引物通过多重PCR扩增获得。所述多重PCR扩增的反应条件为95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共32个循环；72℃再延伸10min。所述pGH载体和3种基因片段连接时使用EcoRV平末端连接。上述三种重组质粒的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的重组质粒的构建方法即可，例如将ASFV p72基因片段、ASFV CD2v基因片段和ASFV MGF基因片段分别与pGH载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α感受态细胞，涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12～16h。经蓝白斑筛选后，用质粒(小量)提取试剂盒提取质粒，得到3种重组质粒。将制备的3种重组质粒稀释到10ng/μl计算出其拷贝数分别为3.00×10⁹copies/μl，2.99×10⁹copies/μl，3.00×10⁹copies/μl。本发明的试剂盒利用3.00×10⁹copies/μl，2.99×10⁹copies/μl，3.00×10⁹copies/μl浓度的质粒作为阳性对照以及10倍梯度比稀释后作为标准曲线。

在本发明中，所述多重qPCR扩增反应用试剂包括2×Pro TaqHS Probe Premix(镁离子浓度为2.5mM，4种dNTP的终浓度各为250μM，Taq酶的用量为1U/反应)。

在本发明中，所述试剂盒优选还包括阴性对照品；所述阴性对照品为无RNA酶水。

在本发明中，采用试剂盒同时鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失株的检测方法，优选包括以下步骤：

(1)ASFV的DNA提取：对待测样品进行病毒DNA提取；

(2)多重实时荧光定量PCR反应：以步骤(1)提取的DNA为模板，使用所述试剂盒配制反应体系进行多重实时荧光定量PCR扩增；

(3)设立各病毒类型的阳性对照、阴性对照及空白对照品，分析实验结果，给出第n个循环时的荧光增加值ΔRn与扩增曲线Ct值，根据不同探针荧光信号及扩增曲线Ct值来判定是ASFV野毒株还是基因缺失疫苗株。

在本发明中，所述待测样品为血清或组织匀浆液。所述反应体系优选如表1所示。

表1多重实时荧光定量PCR反应体系

在本发明中，所述多重实时荧光定量PCR扩增的扩增程序：95℃30s；95℃5s；60℃30s，在此收集荧光信号，40个循环。可根据不同型号的PCR仪的不同要求可以对标记荧光号进行相应的调整。本发明检测结果的判断方法与引物组检测结果的判断方法一致，在此不做赘述。

基于本发明提供的引物组扩增的结果能够准确鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失株，因此，引物组扩增的目标片段可以作为分子标记用于区分野生毒株和基因缺失株，因此，本发明提供了一种同时鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失株的分子标记，包括ASFVp72基因的分子标记、ASFV CD2v基因的分子标记和ASFV MGF基因的分子标记；所述ASFVp72基因的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述ASFV CD2v基因的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述ASFV MGF基因的分子标记的核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示。所述分子标记优选采用上述引物组进行多重PCR扩增得到。所述分子标记在同时鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失疫苗株中的应用。基于所述分子标记判断检测样品的结果与所述引物组的判断方法一致，在此不做赘述。

下面结合实施例对本发明提供的一种基于多重qPCR技术同时鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失株用引物组和试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例中用到实验试剂材料如无特殊说明，均可通过商业手段获得。本发明中所用实验材料、试剂与仪器如下：

实验材料：ASFV野生毒株DNA和基因缺失疫苗株DNA以及猪繁殖与呼吸综合征病毒(SX-1株)、猪细小病毒、猪流行性腹泻病毒，猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型病毒由山东省农科院畜牧兽医研究所猪病研究室保存。

所用试剂：DNA分子量MakerDL2000、电泳上样缓冲液等PCR反应试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。引物与探针由生工生物工程(上海)有限公司负责合成。2×Pro TaqHSProbe Premix为湖南艾科瑞生物工程有限公司产品。DNA测序由山东省农业科学院生物技术中心测序中心完成。

所用仪器：Bio-Rad CFX96TM荧光定量PCR仪器为Bio-Rad公司产品，PCR扩增仪为德国Eppendorf公司产品。台式低温冷冻离心机为Sigma公司产品。

实施例1

1、特异引物及特异探针的设计：在Genbank中下载多个ASFV全基因(HLJ/2018、SY18、N10/2018、AnhuiXCGQ)，用BioEdit软件包进行Clustalw比对，根据以上病毒的p72基因保守序列，利用Primer 5.0软件设计特异性TaqMan探针、引物。根据中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的减毒活疫苗株HLJ/18-7GD的缺失序列(HLJ/2018毒株缺失73394-74476位核苷酸(CD2v)和27942-35500位核苷酸(MGF))和军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所构建的多基因家族(MGF)和CD2v基因缺失的ASFV基因缺失疫苗株(SY18株缺失73368-74452位核苷酸(CD2v)和27942-35500位核苷酸(MGF))的共有缺失片段，利用Primer 5.0软件设计CD2v基因和MGF基因的特异性TaqMan探针、引物。

2、引物及探针合成：由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

3、引物、探针序列及探针修饰见表2。

表2引物及序列信息

4、样品模板制备

(1)病毒DNA/RNA的提取：使用博日基因组RNA/DNA核酸共提试剂盒提取待检样品(血清或组织匀浆液)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(SX-1株)、猪细小病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型病毒的DNA或RNA，使用TAKARA反转录试剂盒将猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流行性腹泻病毒的RNA反转录成cDNA，方法按照试剂盒说明书进行。

(2)荧光定量PCR扩增：以步骤4(1)中提取的DNA或反转录成的cDNA为模板，使用南艾科瑞生物工程有限公司的2×Pro TaqHS Probe Premix及引物、探针进行扩增，扩增体系见表1，反应条件为：95℃30s；95℃5s；60℃30s，在此收集荧光信号，40个循环，根据不同型号的PCR仪的不同要求可以对标记荧光号进行相应的调整。

5、结果分析：每次试验设立阳性对照、阴性对照及空白对照，试验结束后打开分析软件，分析实验结果，给出ΔRn(第n个循环时的荧光增加值)与扩增曲线Ct值，根据探针荧光信号及扩增曲线Ct值来判定待测样品毒株类型。

结果见图1，当FAM、HEX、CY5荧光修饰探针均有扩增曲线时，且满足FAM和HEX的Ct≤35，CY5的Ct≤32时，说明待检样本为ASFV野生毒株；图2显示当仅FAM荧光修饰探针有扩增曲线，HEX、CY5荧光修饰探针无扩增曲线时，且满足FAM的Ct≤35时，说明待检样本为ASFV基因缺失疫苗株。

6、阳性重组质粒的构建

以ASFV阳性样品DNA为模板，分别使用p72-F/R、CD2v-F/R、MGF-F/R引物进行PCR扩增，将PCR产物与pGH载体连接，构建重组质粒，重组质粒DNA抽提纯化按照试剂盒说明书进行，并送往山东省农科院生物技术研究中心测序中心测序鉴定标准品的准确性，通过测序结果比对重组质粒均为目的基因一致。

实施例2

多重实时荧光方法验证

1.特异性验证

利用本发明试剂盒方法分别以ASFV野毒株DNA和基因缺失疫苗株DNA、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒2型病毒(PCV2)的DNA以及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)的cDNA为模板进行多重实时荧光PCR扩增验证其引物和探针的特异性。其结果见表3，结果表明本发明所设计的引物及探针具有很强的特异性。

表3特异性验证试验

2、灵敏度评价

将ASFV p72基因、CD2v基因、MGF基因的阳性标准品分别定量到107拷贝/μL，依次10倍梯度稀释为1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10¹单拷贝/μL，进行灵敏度实验。

结果见图3～图6，结果表明本方法的p72基因、CD2v基因和MGF基因的检测灵敏度分别为1.0×10²、1.0×10¹、1.0×10¹拷贝/μL，而普通PCR方法的p72基因、CD2v基因和MGF基因的检测灵敏度分别为1.0×10⁴、1.0×10⁴、1.0×10³拷贝/μL，说明本方法的灵敏度比普通PCR灵敏度高100倍。

实施例3

临床可疑样本检测

本发明所建立的同时鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失疫苗株的多重实时荧光PCR检测方法对12份临床可疑样本进行检测，样本类型包括猪肺、淋巴结、组织和血清。同时将阳性样本进行普通PCR检测，并行测序分析。

结果见表4，结果显示本发明所建立的方法与普通PCR检测结果和测序结果一致，本方法准确、可靠。

表4临床样本检测结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 山东省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种基于多重qPCR技术同时鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失株用引物组和试剂盒

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgttgcatag gagagggcca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agttcggatg tcacaacgct 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgcgtccct caacacaacc 20

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttgggtggag aataggattc agc 23

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcaaacgtga tcggagcatc a 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agacatgttg ccttccctgc 20

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttccctccac cgatacctcc tggccaa 27

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cccaaaccat gtccgccacc caaacca 27

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcgtgggcac gcattgtcca gccaa 25

<210> 10

<211> 124

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgttgcatag gagagggcca ctggttccct ccaccgatac ctcctggcca accaagtgct 60

tatatccagt cattttatcc cctgggatgc aaaatttgcg cacaagcgtt gtgacatccg 120

aact 124

<210> 11

<211> 134

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgcgtccct caacacaacc actcaaccca tttcccttac ctaaaccgtg tcctccaccc 60

aaaccatgtc cgccacccaa accatgtcct ccacctaaac catgtccttc agctgaatcc 120

tattctccac ccaa 134

<210> 12

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tcaaacgtga tcggagcatc atgccaccat aggtcataac actttaaaag ataatgttgg 60

ttcgtgggca cgcattgtcc agccaacacc tttttggtca gagattgcag ggaaggcaac 120

atgtct 126

Claims

1.一种基于多重qPCR技术同时鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失株用引物组，其特征在于，包括ASFVp72基因特异引物、ASFV CD2v基因特异引物和ASFV MGF基因特异引物；

所述ASFVp72基因特异引物包括如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的正向引物p72-F和如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的反向引物p72-R；

2.根据权利要求1所述引物组，其特征在于，还包括探针组；

检测ASFVp72基因用探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

检测ASFV CD2v基因用探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

检测ASFV MGF基因用探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

3.根据权利要求2所述引物组，其特征在于，所述探针的5’端修饰有报告基团，所述报告基团为FAM、HEX和CY5；所述探针的3’端修饰有淬灭基团，所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2和BHQ3；三种探针采用不同的报告基团和猝灭基团修饰。

4.一种基于多重qPCR技术同时鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失株的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3任意一项所述引物组。

5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照标准品和多重qPCR扩增反应用试剂。

6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述阳性对照标准品为包含ASFVp72基因片段的重组质粒、包含ASFV CD2v基因片段的重组质粒和包含ASFVMGF基因片段的重组质粒。

7.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述ASFV p72基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

所述ASFV CD2v基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

所述ASFV MGF基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述ASFVp72基因片段、ASFV CD2v基因片段和ASFV MGF基因片段通过多重PCR扩增获得；

9.根据权利要求4～8任意一项所述试剂盒，其特征在于，还包括阴性对照品；所述阴性对照品为无RNA酶水。

10.一种同时鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失株的分子标记，其特征在于，包括ASFVp72基因的分子标记、ASFV CD2v基因的分子标记和ASFV MGF基因的分子标记；

所述ASFVp72基因的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

所述ASFV CD2v基因的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

所述ASFV MGF基因的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。