CN112795706A - 非洲猪瘟病毒p72基因的荧光探针引物组、试剂盒及其应用 - Google Patents

非洲猪瘟病毒p72基因的荧光探针引物组、试剂盒及其应用 Download PDF

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沈俊杰
凌勇
刘鸣慧
余杰
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Shanghang Aononghuai Pig Industry Development Co ltd
XIAMEN YINXIANG GROUP CO Ltd
Fujian Aonong Biological Technology Group Co Ltd
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Fujian Aonong Biological Technology Group Co Ltd
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Abstract

本发明涉及一种非洲猪瘟病毒P72基因的荧光探针引物组、试剂盒及其应用，引物包括：上游引物ASFV‑F：5’‑CCACGGGAGGAATACCAA‑3’；下游引物ASFV‑R：5’‑GCAGATGCCGATACCACA‑3’；荧光探物ASFV‑P：含有片段5’‑TCATATTAACGTATCCAGAGCAAGA‑3’，并在5’端标记荧光报告基团，在3’端标记荧光淬灭基团。试剂盒包括荧光探针引物组、阳性对照、阴性对照和PCR扩增液。应用具体为：1)提取待测样品的总DNA；2)以步骤1)中得到的总DNA为模板，利用试剂盒配制荧光反应体系进行荧光扩增；3)利用阳性对照建立标准曲线，并分析荧光扩增产物，根据扩增反应结果判定待测样品为非洲猪瘟病毒核酸阳性或阴性。与现有技术相比，本发明能够最大限度识别目前流行的所有ASFV毒株，且使引物的灵敏度提高到1.15×101copise/μL。

Description

非洲猪瘟病毒P72基因的荧光探针引物组、试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于动物病原检测领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒P72基因的荧光探针引物组、试剂盒及其应用。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(African swinefever virus，ASFV)引起猪的急性、发热、高度接触传染性疾病。家猪与野猪普遍易感，软蜱为ASFV的贮藏宿主和媒介。ASFV的潜伏期为5-15天，一旦爆发病程短，病死率高，可达100％。非洲猪瘟的临床症状复杂且难以与其他疾病进行区分，多表现为高热、皮肤充血、流产、水肿及脏器出血。非洲猪瘟发病后并没有有效的治疗措施，且非洲猪瘟病毒具有复杂的免疫逃避机制，缺乏典型的中和抗体，也没有有效的疫苗防疫，因此建立一种快速、灵敏、准确的检测方法显得尤为重要。
ASFV是一种直径约为170-200nm的正20面体病毒，由内部的双链DNA和外周的衣壳及囊膜组成，大小约170～190kb。ASFV基因组的两端通过部分碱基配对形成发夹环，中间区域较为保守，两端靠近发夹环部位有末端重复序列和可变区，ASFV基因组大小变化由可变区决定。ASFV的整个基因组含有151个开放阅读框(ORFs)，可以编码150-200种蛋白质，大致可分成5大种类，包括分泌性蛋白、假定膜蛋白、参与核甘酸和核酸代谢(DNA修复)的酶以及蛋白修饰的酶。P72蛋白是病毒的主要衣壳蛋白，位于ASFV的较保守的编码区，经过近半个世纪的遗传进化，仍保持较高的同源性，然而P72存在部分变异频率较高的区域，因此P72也被用于ASFV的基因分型。引物设计要避开变异区才能够有效地识别所有毒株。
发明内容
本发明的目的就是提供一种非洲猪瘟病毒P72基因的荧光探针引物组、试剂盒及其应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种非洲猪瘟病毒P72基因的荧光探针引物组，所述引物组包括：
上游引物ASFV-F：5’-CCACGGGAGGAATACCAA-3’，如SEQ ID NO：1所示；
下游引物ASFV-R：5’-GCAGATGCCGATACCACA-3’，如SEQ ID NO：2所示；
荧光探物ASFV-P：含有片段5’-TCATATTAACGTATCCAGAGCAAGA-3’，如SEQ ID NO：3所示，并在5’端标记荧光报告基团，在3’端标记荧光淬灭基团。
所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为TAMRA。
一种包含如上述所述的荧光探针引物组的试剂盒，所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照和PCR扩增液。
所述阳性对照为含有125bp目的片段的重组质粒；
所述阴性对照为无核酸水(即RNase free H2O)；
所述PCR扩增液为荧光定量qPCR Mix(2×)。
在使用时，按上游引物ASFV-F、下游引物ASFV-R和荧光探针ASFV-P的摩尔比为1:1:1取引物组进行混合得到PCR Mix。
所述PCR扩增液为TKARA qPCR Mix(2×)，也为商品化产品。
一种如上述所述的试剂盒的应用，所述应用具体包括以下步骤：
1)提取待测样品的总DNA；
2)以步骤1)中得到的DNA为模板，利用试剂盒配制荧光反应体系进行荧光扩增；
3)利用阳性对照建立标准曲线，并分析荧光扩增产物，根据荧光扩增反应结果判定待测样品为非洲猪瘟病毒核酸阳性或阴性。
步骤2)中，反应体系的组成为：总DNA、阴性对照、上游引物ASFV-F、下游引物ASFV-R、荧光探物ASFV-P、PCR扩增液的体积比为2μL：7.5μL：1μL：1μL：1μL：12.5μL。
步骤2)中，所述荧光扩增的反应程序具体为：95℃30s，循环为95℃15s，60℃34s(采集荧光信号)，共计40个循环。
步骤3)中，建立标准曲线过程具体为：先取阳性对照稀释成终浓度为1.15×1010copise/μL的溶液，之后进行10倍系列梯度稀释再作为模板进行敏感度测定，并以此建立标准曲线，所述10倍系列梯度的浓度为1.15×108～1.15×100copise/μL。
敏感度测定的具体浓度分别为：1.15×108、1.15×107、1.15×106、1.15×105、1.15×104、1.15×103、1.15×102、1.15×101、1.15×100copise/μL。
步骤3)中，质控标准为：阳性对照Ct值＜30并出现特异的S型扩增曲线，阴性对照无Ct值且无特异的扩增曲线，实验结果成立；
结果判定：①待测样品Ct值＜35并出现、特异的S型扩增曲线，判为非洲猪瘟病毒核酸阳性；②待测样品无Ct值且无特异的扩增曲线，判为非洲猪瘟病毒核酸阴性；③待测样品的CT值为(35,40]并出现特异的扩增曲线，判为非洲猪瘟病毒核酸可疑，可疑样品需重新取样提取DNA，进行复检，Ct值＜40判为阳性，否则判为阴性；④对于未呈现S型扩增曲线，但本底较高(本底的具体数值跟仪器和条件有关，根据实际情况进行判断)的待测样品，判为阴性。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
1)P72蛋白是病毒的主要衣壳蛋白，位于ASFV的较保守的编码区，然而P72存在部分变异频率较高的区域，因此P72也被用于ASFV的基因分型。本发明通过分析ASFV的遗传进化树，选取与国内流行的ASFV毒株同源性最高的几个分支以及近几年各国流行的ASFV典型毒株，参照NCBI GenBank中公布的ASFV毒株的P72蛋白的基因序列进行比对，根据比对结果，以国内流行的ASFV毒株的P72基因中后段的同源性较高的保守序列作为模板设计引物，目的片段约为125bp，能够最大限度识别目前流行的所有ASFV毒株，并研制方便诊断的试剂盒，建立相应的检测方法。
2)本发明选取的引物序列进行修饰，提高引物的Tm值，增强引物的扩增效率，使引物的灵敏度提高到1.15×101copise/μL。
3)本发明的引物、试剂盒的特异性均较强，对于猪瘟病毒，猪伪狂犬病毒，猪蓝耳病毒，猪圆环病毒，猪细小病毒和猪乙型脑炎病毒，均未出现相应的特异性扩增曲线，保证检测的准确性。
4)本发明建立了一个快速精准检测ASFV病毒的试剂盒，具有灵敏性高、特异性强、重复性和稳定性好的特点。
附图说明
图1为实施例1中制备阳性对照时得到的目的片段的特意性条带；
图2为实施例1中非洲猪瘟病毒基因的荧光扩增曲线图；
图3为实施例1中非洲猪瘟病毒基因的标准曲线图；
图4为重复性实验得到的荧光扩增曲线图；
图5为特异性实验得到的荧光扩增曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例
一种非洲猪瘟病毒P72基因的荧光探针引物组，包括：
上游引物ASFV-F：5’-CCACGGGAGGAATACCAA-3’；
下游引物ASFV-R：5’-GCAGATGCCGATACCACA-3’；
荧光探物ASFV-P：含有片段5’-TCATATTAACGTATCCAGAGCAAGA-3’，并在5’端标记荧光报告基团，在3’端标记荧光淬灭基团，荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为TAMRA。
一种包含如上述所述的荧光探针引物组的试剂盒，还包括阳性对照、阴性对照和PCR扩增液，阳性对照为含有125bp目的片段的重组质粒(序列为CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTGGTCATATTAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTTATATTAGTTGGGACACGGATTACGTGGGGTCTATCACTACGGCTGATCTTGTGGTATCGGCATCTGC，如SEQ ID NO：4所示，该序列是通过对17个国内流行以及其他几个国际近年流行的毒株(具体包括China-2018-AnhuiXCG、China-CAS19-01-2019、CN-2019-InnerMongol、Wuhan 2019-1、BA71V、47-Ss-2008、Belgium 2018-1、Belgium-Etalle-wb-2、CzechRepublic 2017-、Estonia 2014、GZ201801、Liv13-33、Ken05-Tk1、Moldova 2017-1、N10、E78、R35、60Nu-1997、97-Ot-2012、22653-Ca-2014、Benin 97-1、P0l17-31177-O81、SY18)，进行氨基酸序列比对，发现570-646aa即3’端的序列很保守，同源性为100％，因此选取该段基因序列进行引物设计(此比对由前十七个毒株进行比对)，目的片段为P72基因的第1761-1885bp，同源性为100％(此比对由全部的毒株进行比对)；阴性对照为无核酸酶水；PCR扩增液为荧光定量qPCR Mix(2×)。
1、取临床发病猪场的疑似病猪的组织样品(为血清)作为待测样品，按照天根生化科技(北京)有限公司的DNA病毒提取试剂盒，进行总DNA的提取，并分成多份进行备用。
2、阳性对照或阳性标准品的制备
试剂盒中含有阳性对照可直接使用。
本实施例中的阳性对照采用以下步骤得到：
取临床发病猪场的ASFV阳性确诊病猪的组织样品(为血清)，按照天根的DNA病毒提取试剂盒，进行总DNA的提取，备用。
采用25μL的普通反应体系，普通反应体系的组成具体为：上游引物ASFV-F 1μL，下游引物ASFV-R 1μL，DNA 2μL，2×Platinum SuperFi II DNA预混液(含有高保真聚合酶，为赛默飞的商品化产品)12.5μL以及RNase free H2O(无核酸酶水)8.5μL。
之后进行普通PCR扩增，具体程序为：94℃5min；循环94℃30s，55℃30s，72℃30s，共30个循环；再72℃延伸10min。扩增完成后，所有产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，图1为得到的特意性条带。鉴定为阳性的PCR产物(即125bp目的片段)用天根的胶回收试剂盒进行纯化回收，连接到pEASY-T1载体并转化到DH5ɑ感受态细胞，挑取阳性克隆，用LB培养液摇菌扩增后，将菌液送到至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，之后便可作为阳性对照进行使用。
3、标准曲线的建立
取阳性对照，即步骤(2)得到的阳性克隆，用NanoDrop 2000核酸浓度测定仪检测浓度为520ng/ul，换算稀释为终浓度为1.15×1010copise/μL，之后进行10倍系列梯度稀释后作为模板，取其中浓度为1.15×108、1.15×107、1.15×106、1.15×105、1.15×104、1.15×103、1.15×102、1.15×101、1.15×100copise/μL进行敏感度测定，按照步骤(4)中的荧光扩增反应体系和荧光扩增程序进行荧光定量PCR，数据如表1所示。
表1
Figure BDA0002999650940000061
根据该结果绘制标准曲线，具体如图3所示，结果显示在稀释的现行浓度范围内，模板量与对应的Ct值呈较好的线性关系，相关系数R2＝0.999，Ct值为12.5、15.5、19.2、22.5、26.0、29.3、33.2、36.7、0，标准曲线斜率为-3.386，截距为36.074，直线方程y＝-3.386x+36.074，其中y表示Ct值，x表示Log(病毒数量)，单位为copise/μL，所以本发明荧光定量PCR的最低检测量为1.15×101copise/μL，因此本发明建立的荧光定量PCR具有较高的敏感性。
4、荧光扩增反应
取步骤(1)得到的总DNA，采用25μL的荧光反应体系，荧光反应体系的组成具体为：上游引物ASFV-F 1μL，下游引物ASFV-R 1μL，荧光探物ASFV-P 1μL，DNA 2μL，TAKARA qPCRMix(2×)12.5μL、RNase free H2O(无核酸酶水)7.5μL。
之后进行荧光PCR扩增，具体程序为：95℃30s，循环为95℃15s，60℃34s，共计40个循环，荧光定量PCR的动力学曲线图详见图2。
质控标准：阳性对照Ct值＜30并出现特异的S型扩增曲线，阴性对照无Ct值且无特异的扩增曲线，实验结果成立。
结果判定：①待测样品Ct值＜35并出现、特异的S型扩增曲线，判为非洲猪瘟病毒核酸阳性；②待测样品无Ct值且无特异的扩增曲线，判为非洲猪瘟病毒核酸阴性；③待测样品的CT值为(35,40]并出现特异的扩增曲线，判为非洲猪瘟病毒核酸可疑，可疑样品需重新取样提取DNA，进行复检，Ct值＜40判为阳性，否则判为阴性；④对于未呈现S型扩增曲线，但本底较高的待测样品，判为阴性。
本实施例中的待测样品的CT值为25.8，即该样品呈S型扩增曲线。
5、重复性试验
分别以5个浓度的10倍系列梯度稀释的阳性标准品为模板，终浓度分别为1.15×108、1.15×107、1.15×106、1.15×105、1.15×104copise/μL，按步骤(4)中提供的荧光定量反应体系及程序进行荧光定量PCR，每个梯度设定3个重复，验证该方法的重复性，每次重复实验的数据如表2所示，扩增曲线如图4所示。结果表明，本发明的重复实验变异系数(CV值)均在0.5％以下，表明本发明具有很好的重复性。
表2
Figure BDA0002999650940000071
6、特异性试验
以市售的猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒和猪乙型脑炎病毒阳性样品作为模板，用本发明中的引物及探针进行荧光定量PCR扩增，结果显示，只有PEDV出现特异性的S型扩增曲线为阳性，Ct值为25.8，其他样品均无特异性扩增，实验结果如图5所示，A代表非洲猪瘟病毒阳性对照扩增曲线，B代表猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒和猪乙型脑炎病毒阳性样品扩增曲线，此图表明本发明具有较强的特异性。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 福建傲农生物科技集团股份有限公司；上杭傲农槐猪产业发展有限公司；乐山傲新育种有限公司；厦门银祥集团有限公司
<120> 非洲猪瘟病毒P72基因的荧光探针引物组、试剂盒及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccacgggagg aataccaa 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcagatgccg ataccaca 18
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcatattaac gtatccagag caaga 25
<210> 4
<211> 125
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccacgggagg aataccaacc cagtggtcat attaacgtat ccagagcaag agaattttat 60
attagttggg acacggatta cgtggggtct atcactacgg ctgatcttgt ggtatcggca 120
tctgc 125

Claims (10)

1.一种非洲猪瘟病毒P72基因的荧光探针引物组，其特征在于，所述引物组包括：
上游引物ASFV-F：5’-CCACGGGAGGAATACCAA-3’；
下游引物ASFV-R：5’-GCAGATGCCGATACCACA-3’；
荧光探物ASFV-P：含有片段5’-TCATATTAACGTATCCAGAGCAAGA-3’，并在5’端标记荧光报告基团，在3’端标记荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒P72基因的荧光探针引物组，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为TAMRA。
3.一种包含如权利要求1或2所述的荧光探针引物组的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照和PCR扩增液。
4.根据权利要求3所述的一种包含荧光探针引物组的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有125bp目的片段的重组质粒；
所述阴性对照为无核酸酶水；
所述PCR扩增液为荧光定量qPCR Mix(2×)。
5.根据权利要求4所述的一种包含荧光探针引物组的试剂盒，其特征在于，在使用时，按上游引物ASFV-F、下游引物ASFV-R和荧光探针ASFV-P的摩尔比为1:1:1取引物组进行混合；
所述PCR扩增液为TKARA qPCR Mix(2×)。
6.一种如权利要求3-5任一项所述的试剂盒的应用，其特征在于，所述应用具体包括以下步骤：
1)提取待测样品的总DNA；
2)以步骤1)中得到的总DNA为模板，利用试剂盒配制荧光反应体系进行荧光扩增；
3)利用阳性对照建立标准曲线，并分析荧光扩增产物，根据荧光扩增反应结果判定待测样品为非洲猪瘟病毒核酸阳性或阴性。
7.根据权利要求6所述的一种试剂盒的应用，其特征在于，步骤2)中，所述荧光反应体系的组成为：总DNA、阴性对照、上游引物ASFV-F、下游引物ASFV-R、荧光探物ASFV-P、PCR扩增液的体积比为2μL：7.5μL：1μL：1μL：1μL：12.5μL。
8.根据权利要求6所述的一种试剂盒的应用，其特征在于，步骤2)中，所述荧光扩增的反应程序具体为：95℃30s，循环为95℃15s，60℃34s，共计40个循环。
9.根据权利要求6所述的一种试剂盒的应用，其特征在于，步骤3)中，建立标准曲线过程具体为：先取阳性对照稀释成终浓度为1.15×1010copise/μL的溶液，之后进行10倍系列梯度稀释再作为模板进行敏感度测定，并以此建立标准曲线，所述10倍系列梯度的浓度为1.15×108～1.15×100copise/μL。
10.根据权利要求6所述的一种试剂盒的应用，其特征在于，步骤3)中，质控标准为：阳性对照Ct值＜30并出现特异的S型扩增曲线，阴性对照无Ct值且无特异的扩增曲线，实验结果成立；
结果判定：①待测样品Ct值＜35并出现、特异的S型扩增曲线，判为非洲猪瘟病毒核酸阳性；②待测样品无Ct值且无特异的扩增曲线，判为非洲猪瘟病毒核酸阴性；③待测样品的CT值为(35,40]并出现特异的扩增曲线，判为非洲猪瘟病毒核酸可疑，可疑样品需重新取样提取DNA，进行复检，Ct值＜40判为阳性，否则判为阴性；④对于未呈现S型扩增曲线，但本底较高的待测样品，判为阴性。
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