CN103255234B - 一种用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的检测方法，通过设计一对引物和一条探针对样品的DNA模板进行实时荧光定量PCR检测，本发明还提供了利用上述检测方法检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒。本发明针对ORFV的保守区域H2L基因建立的实时定量方法特异性高，稳定性好；本发明用来检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒，操作简便，用户只需将待检样品的DNA加入反应管中，根据扩增曲线即可得出检测结果，省时省力，成本较低，时间由原来的3-4小时缩短到1-2小时；并且比普通PCR的灵敏度高，可用于检测低微含量的羊传染性脓包皮炎病毒，可适用于我国各级防控单位，基层兽医站，大中型养殖场等，具有较好的应用前景。

Description

一种用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的TaqMan Real-time试剂盒及其检测方法，具体涉及用TaqMan实时荧光定量PCR检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒及其检测方法。

背景技术

羊传染性脓疱皮炎病毒简称“羊口疮”病毒(Orf Virus,ORFV)，能引起羊属动物和人类接触性感染，甚至引发养羊业发展和环境安全问题。ORFV污染的环境对于幼年羊只和泌乳母羊存在极高的感染风险，它们主要侵害宿主皮肤或黏膜，并可导致其严重的持续性感染和继发性感染。ORFV拥有鲜明的种属特性和丰富的功能性基因，其基因组属于两端闭合的双股DNA，长约138kb，中央为核心区(88kb)，两端为反向重复序列(Inverted terminal repeat,ITR)，冠以环状发夹结构。中央核心区基因相对保守，主要调控病毒的复制、包装和输出。其编码的主要蛋白有dUTPase、42KDa蛋白、20KDa蛋白、DNA聚合酶、RNA螺旋酶、RNA聚合酶、RAP94、病毒粒子蛋白、后期基因转录蛋白、拓扑异构酶、后期基因反式作用子、核心蛋白等。近年该病在我国广泛流行，对养羊业及人类健康构成威胁。目前对ORFV难以防控的原因是多方面的，感染早期的诊断技术薄弱是主要原因。就目前ORFV的流行特点，要使其在流行病学方面得到控制，开展一系列的防控和净化工作势在必行。从经济角度上讲，国外检测试剂检测一份样品的价格往往是几十元甚至上百元人民币，成本过高导致养羊业主无法接受。目前检测羊传染性脓包皮炎病毒仅有普通PCR试剂盒，该试剂盒操作相对复杂，结果判定需靠电泳条带来确定，费时费力，而且电泳时凝胶中加入的溴化乙锭危害人体健康，操作时需格外小心。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种简便、准确、快速、特异性和灵敏性好以及低成本的用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒及其检测方法，本试剂盒及检测方法还适用于检测低微含量的羊传染性脓疱皮炎病毒。

本发明提供了一种用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的检测方法，其特征在于，通过针对羊传染性脓疱皮炎病毒保守区域H2L基因设计一对引物和一条探针对样品的DNA模板进行实时荧光定量PCR检测，所设计引物和和探针序列如下：

上游引物：5’-TCCACGCTGCCGACGCCAAAGT-3’

下游引物：5’-GCACCGCATCGAGAACGCCAAGAA-3’

探针：5’-FAM-TCGAGGCTGCGCGCGGCCGAGACC-TAMRA-3’。

所述样品的DNA模板使用宝生物工程有限公司的型号为D824A的基因组DNA提取试剂盒进行提取。

所述实时荧光定量PCR的反应体系为：

1)Premix Ex Taq12.5μL；

2)上下游引物及探针，其浓度均为10μM，各取1μL；

3)样品的DNA模板3μL；

4)无RNA酶水6μL；

5）50×ROX Reference Dye0.5μL。

所述实时荧光定量PCR的反应条件如下：94℃预变性2min；94℃40s，54℃40s，72℃50s，40个循环。

本发明还提供了一种用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒，包括Premix Ex Taq；阳性对照；阴性对照；扩增引物与探针的混合物和50×ROX Reference Dye；

所述扩增引物与探针的混合物的序列如下：

上游引物：5’-TCCACGCTGCCGACGCCAAAGT-3’

下游引物：5’-GCACCGCATCGAGAACGCCAAGAA-3’

探针：5’-FAM-TCGAGGCTGCGCGCGGCCGAGACC-TAMRA-3’。

所述阴性对照为无RNA酶水。

所述阳性对照为含有羊传染性脓疱皮炎病毒H2L基因的质粒。

试剂盒中上下游引物及探针的浓度均为10μM，体积配比为1:1:1。

本发明设计了针对ORFV的保守区域H2L设计扩增引物1对，探针1条，用于羊传染性脓疱皮炎病毒Taqman实时定量PCR检测，H2L基因高度保守，针对该基因建立的实时定量方法特异性高，稳定性好；本发明用来检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒，操作简便，用户只需将待检样品的DNA加入反应管中，根据扩增曲线即可得出检测结果，省时省力，成本较低，时间由原来的3-4小时缩短到1-2小时；并且比普通PCR的灵敏度高，可用于检测低微含量的羊传染性脓包皮炎病毒，可适用于我国各级防控单位，基层兽医站，大中型养殖场等，具有较好的应用前景。

附图说明

图1为3.1的分别以待检样品DNA、阴性对照和阳性对照为模板的实时荧光定量PCR结果。

图2为3.2的分别以羊口疮原代牛睾丸细胞毒、羊口疮病毒田间样品2份、羊痘牛睾丸细胞毒提取的DNA以及阴性对照无RNA酶水为模板的实时荧光定量PCR结果。

图3为3.3的以阳性对照为模板进行6个重复实时荧光定量PCR结果。

图4为3.4的以阳性对照构建的浓度为2.81×10⁷copies/μL的pMD-H2L质粒做10倍递减梯度稀释，以6个稀释度的质粒作为模板的实时荧光定量PCR结果。

具体实施方式

本发明提供了一种用于羊传染性脓疱皮炎病毒的检测试剂盒，由以下组分组成：

（1）Premix Ex Taq，购自宝生物工程(大连)有限公司，型号为RR390Q。

（2）阳性对照

本试剂盒发明的阳性对照为含有羊传染性脓疱皮炎病毒H2L基因的质粒，所述含有羊传染性脓疱皮炎病毒H2L基因的质粒的制备方法如下：从细胞分离的羊传染性脓疱皮炎病毒中扩增得到H2L基因，克隆至pMD-18T，转化大肠杆菌感受态细胞JM109感受态细胞，涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12～16小时。经蓝白斑筛选后，用质粒（小量）提取试剂盒提取质粒，将序列测定为阳性的质粒命名pMD-H2L，应用Nanodrop2000核酸蛋白分光光度计测出该质粒的浓度为90ng/μL，计算出其拷贝数浓度为2.81×10⁷copies/μL（copies/μL即拷贝/微升，下同），本发明的试剂盒所用阳性对照质粒浓度为2.81×10⁴copies/μL。

（3）阴性对照：无RNA酶水。

（4）扩增引物与探针的混合物。上下游扩增引物及探针的浓度均为10μM，体积配比为1:1:1。

（5）ROX Reference Dye(50×)。

使用上述试剂盒检测羊传染性脓疱皮炎病毒的方法：

1.引物设计与制备

参照GenBank查找多个毒株，进行序列比对，根据比对结果并参照文献[徐洪庆，陈俊芳，陆则基.羊口疮病毒的病原特性及诊断.畜禽业，2012,274:81]说明，针对ORFV的保守区域H2L基因设计了一对特异引物和一条探针，引物和探针的信息如表1所示：

表1

上述引物和探针均由宝生物工程(大连)有限公司合成。

所扩增的靶序列如下：

tccacgctgccgacgccaaagtcgtcgaggctgcgcgcggccgagaccgaaagcgggtccgcgttcttccactcggtaatgatcacgcgcacgcgcacgccgcggttgatggccgcgcgcagcagcgcgtcaatgatctgcggccagtactccacggcgctggcgtgcttgatcaccggcaccatcgagagcagcgagaggtcgatgctgttcttggcgttctcgatgcggtgc

2.待检样品DNA模板的提取

取2g采集的病料组织，按1:10(质量：体积)的比例加入20mlPBS，加入灭菌的石英砂，充分研磨，浸毒（即浸泡）10-12小时，8000转/分钟离心20分钟，吸取上清，使用基因组DNA提取试剂盒[宝生物工程（大连）有限公司的TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNAExtraction Kit Ver.4.0(型号为D824A)]，按照其试剂盒说明书对DNA进行提取，经提取的DNA保存于-20℃保存备用，检测时只需在反应液中加入3μL DNA即可。

3．TaqMan实时荧光定量PCR检测

3.1TaqMan实时荧光定量PCR检测羊传染性脓疱皮炎病毒

PCR反应总体系为25μL，向0.2mL扩增管中加入下列反应物配备反应液：

1)Premix Ex Taq12.5μL

2)扩增引物与探针的混合物3μL：为上述浓度为10μM的上下游引物及探针引物各1μL。

3)待检样品DNA模板3μL

4)无RNA酶水6.0μL

5）ROX Reference Dye(50×)0.5μL

反应液配好后9000转/分离心10秒后，将扩增管放入PCR扩增仪中进行扩增，设定PCR扩增条件如下：94℃预变性2min；94℃40s，54℃40s，72℃50s，40个循环。

阴性对照：以无RNA酶水取3μL代替上述待检样品DNA模板，同样条件下进行扩增。

阳性对照：以制备的浓度为2.81×10⁴copies/μL的pMD-H2L质粒取3μL代替上述待检样品DNA模板，同样条件下进行扩增。

实验结果分析与判定：

根据扩增结果判定：在NTC（无模板对照，即本试剂盒的阴性对照）没有Ct值的情况下，Ct值<35判为阳性；Ct值介于35-40为可疑，需重复检测，再次测定时该样品Ct值<35为阳性，Ct值≥35为阴性。

检测结果如图1显示，阴性对照即NTC没有Ct值，而阳性对照的Ct值为18.36，待检样品的Ct值为22.69，其Ct值均小于35，故待检样品判定为阳性，说明待检样品中有羊传染性脓包皮炎病毒。

3.2特异性检测

DNA模板的制备使用基因组DNA提取试剂盒[宝生物工程（大连）有限公司的TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction KitVer.4.0(型号为D824A)]，按照其试剂盒说明书分别提取羊口疮原代牛睾丸细胞毒（图中简标为羊口疮细胞毒）（由中国农业科学院兰州兽医研究所提供）、羊口疮病毒田间样品2份（图中简标为田间样品1和田间样品2）（由中国农业科学院兰州兽医研究所提供）和羊痘牛睾丸细胞毒（图中简标为羊痘病毒）（由中国农业科学院兰州兽医研究所提供）的DNA，无RNA酶水做为阴性对照（图中标识为阴性对照），各取3μL用于检测，反应条件同3.1进行的TaqMan实时荧光定量PCR扩增，其结果如图2所示。

结果表明，羊口疮原代牛睾丸细胞毒、2份羊口疮病毒田间样品提取的DNA模板均扩增出S形曲线，而羊痘病毒DNA及无核酶水均未扩增出S形曲线。由此可见，本发明建立的TaqMan实时荧光定量PCR具有较高的特异性。

3.3重复性检测

以3.1所用的阳性对照为模板，进行6个重复扩增，反应条件同3.1.进行的TaqMan实时荧光定量PCR扩增，扩增结果如图3所示。结果显示6个重复的变异系数小，说明试验稳定，重复性好。

3.4敏感性检测

将上述阳性对照构建的浓度为2.81×10⁷copies/μL的pMD-H2L质粒做10倍递减梯度稀释，将2.81×10⁵～2.81×10⁰copies/μL稀释的样品各取3μL，反应条件同3.1进行的TaqMan实时荧光定量PCR扩增，结果如图4所示。

结果显示，2.81×10⁵copies/μL至2.81×10¹copies/μL稀释度的重组质粒均扩增出了S形曲线，而2.81×10⁰copies/μL稀释度的重组质粒未扩增出任何峰线。

敏感性测定结果表明，本发明建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测羊传染性脓疱皮炎病毒的检测方法能检测出的最低拷贝数为2.81×10¹copies/μL，比常规PCR要高10倍。

Claims (1)

1.一种用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒，其特征在于，包括Premix Ex Taq、阳性对照、阴性对照、扩增引物与探针的混合物以及50×ROX Reference Dye； 

所述扩增引物与探针的混合物的序列如下： 

上游引物：5’-TCCACGCTGCCGACGCCAAAGT-3’ 

下游引物：5’-GCACCGCATCGAGAACGCCAAGAA-3’ 

探针：5’-FAM-TCGAGGCTGCGCGCGGCCGAGACC-TAMRA-3’； 

所述阴性对照为无RNA酶水； 

所述阳性对照为含有羊传染性脓疱皮炎病毒H2L基因的质粒； 

所述含有羊传染性脓疱皮炎病毒H2L基因的质粒的制备方法如下：从细胞分离的羊传染性脓疱皮炎病毒中扩增得到H2L基因，克隆至pMD-18T，转化大肠杆菌感受态细胞JM109感受态细胞，涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12～16小时，经蓝白斑筛选后，用质粒提取试剂盒提取质粒，将序列测定为阳性的质粒命名pMD-H2L，本发明的试剂盒所用阳性对照质粒浓度为2.81×10⁴copies/μL； 

试剂盒中上下游引物及探针的浓度均为10μM，体积配比为1:1:1。