CN105400906A - 一种同时检测猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒、猪细小病毒三重pcr的引物组及其应用 - Google Patents

一种同时检测猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒、猪细小病毒三重pcr的引物组及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时检测猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒、猪细小病毒三重PCR的引物组及其应用。本发明从已发表的文献中筛选出具有猪圆环病毒2型(PCV2)特点的ORF2编码基因、猪伪狂犬病毒(PRV)的gB(gⅡ)编码基因以及猪细小病毒(PPV)的VP2蛋白的编码基因，作为PCR检测的三个基因靶点的扩增引物。其将扩增该3个基因片段的3对引物放在一个PCR反应体系，通过对退火温度、特异性等各项参数调整优化，建立直接从样品中一次检测猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒编以及猪细小病毒的三重PCR检测方法。本发明的多重PCR检测引物用于检测时，特异性强、灵敏度高，提高了检测效率。

Description

一种同时检测猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒、猪细小病毒三重PCR的引物组及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种同时检测猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒、猪细小病毒三重PCR的引物组及其应用。
背景技术
猪圆环病毒Ⅱ型(PorcinecircovirusⅡ,PCV2)、猪细小病毒(porcineparvovirus,PPV)、猪伪狂犬病病毒(Porcinepseudorabiesvirus,PRV)是我国集约化养猪场普遍流行的重要病原，给养猪业造成了严重的经济损失。由于这三种病毒常呈混合感染，增加了分析判断群体感染和发病的难度。目前，常规的分析方法如病毒分离、血清学方法等存在着耗时长、敏感度低的缺陷，已不能满足现实生产及防病需要。
目前，由猪圆环病毒Ⅱ型、猪细小病毒以及猪伪狂犬病病毒感染引起猪免疫抑制及繁殖障碍等病症已经成为影响我国乃至全球养猪业的一种疾病，造成巨大经济损失。我国是养猪大国，研究针对三种病原混合感染的快速准确的分析方法对于养猪业健康发展具有重要意义。传统的病毒分离鉴定等方法耗时耗力，对于实验条件要求比较苛刻，在一般实验室及基层单位较难进行，同时受采样条件所限，分离率往往也较低，并且传统的血清型诊断方法有操作繁琐复杂，耗时耗力，特异性和灵敏性低等多种不足。随着分子生物学的发展，PCR检测方法能够快速、高效的检测出病原体。。
聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)具有快速、敏感、特异等优点，自发明以来在病原的特异性检测方面表现出明显的优势，多重PCR方法不仅保持了普通PCR敏感性高和特异性强的优点，且具有一次检测多种病原的优势，更适于混合感染的快速诊断。本发明针对三种病毒的保守基因设计了特异性引物，拟构建能够同时检测猪三种常见病毒感染的多重PCR方法并初步应用于临床样品的检测。
多重PCR(multiplexPCR)是在普通PCR的基础上加以改进，于一个PCR反应体系中加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染。所以建立检测猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒、猪细小病毒的三重PCR方法对于猪关节病的防治具有重要意义，可以为其防治提供有力的技术手段。
发明内容
鉴于三种病毒是当前集约化猪场的常见重要病原体，且往往与多种病毒和细菌混合感染，引起猪免疫抑制及繁殖障碍等疾病，传统的分析鉴定技术费时费力，不适于临床快速检验分析，也不适于大规模的流行病学调查的现状，本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种同时检测猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒、猪细小病毒三重PCR的引物组及其应用。
本发明针对实际生产中猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒、猪细小病毒混合感染，且临床很难区分的情况，本着从样品中同时分析鉴定三种病原体的目标，从已发表的文献中筛选出具有病原体致病性特点的保护性片段的编码基因片段，作为PCR检测的三个基因靶点，得到同时检测猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒、猪细小病毒三重PCR的引物组。同时本发明将扩增这3个基因片段的引物组放在一个PCR反应体系，通过对退火温度、特异性等各项参数调整优化，建立了可直接从样品中鉴定分析三种病原体的三重PCR方法。
猪圆环病毒2型(PCV2)的ORF2编码病毒的Cap蛋白，血清学实验显示，对于无致病性的PCV1与致病性的PCV2，两者的Rep蛋白会产生抗原交叉性，而Cap蛋白不产生交叉反应，因此选择ORF2编码的结构蛋白作为检测目的片段；猪伪狂犬病毒(PRV)的gB(gⅡ)是PRV所有糖蛋白中最保守的，是病毒的一个重要包膜组分和中和抗原，是病毒感染宿主细胞必不可少的成份；而猪细小病毒(PPV)的VP2蛋白是构成PPV病毒粒子的主要保护性抗原，具有血凝活性和良好的免疫原性，可以诱导机体产生强烈的免疫反应。因此，与传统PCR不同，本发明选择上述三个基因片段作为三重PCR的靶标分子，这样一方面可及时验证目标病原体在样品中的存在，更重要的是可对所扩增的病毒保护性片段进行序列分析，实时监测病原主要保护性蛋白的变异，为及时掌握病毒致病性特点及其变异趋势和规律、选择合适的疫苗提供科学依据。
本发明是通过以下的技术方案实现的。
本发明提供一种同时检测猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒、猪细小病毒三重PCR的引物组，扩增猪圆环病毒2型的上游引物序列如SEQIDNO:1所示，扩增猪圆环病毒2型的下游引物序列如SEQIDNO:2所示；扩增伪狂犬病毒的上游引物序列如SEQIDNO:3所示，扩增伪狂犬病毒的上游引物序列如SEQIDNO:4所示；扩增猪细小病毒的上游引物如SEQIDNO:5所示，扩增猪细小病毒的上游引物序列如SEQIDNO:6所示。(见表1)
表1多重PCR引物组
本发明进一步提供上述三重PCR的引物组在制备同时检测猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒、猪细小病毒试剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明筛选具有猪圆环病毒2型(PCV2)特点的ORF2编码基因、猪伪狂犬病毒(PRV)的gB(gⅡ)编码基因以及猪细小病毒(PPV)的VP2蛋白的编码基因，作为PCR检测的三个基因靶点，得到检测猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒、猪细小病毒三重PCR的引物组；同时本发明在退火温度及其他反应体系参数等方面进行探索，确定灵敏度高、特异性强的多重PCR检测体系，建立直接从样品中检测三种病原体的三重PCR检测方法，实验证明，较现有报道的PCR检测方法，利用本发明的引物组的多重PCR检测方法特异性强、灵敏度高，检测效率高。
与传统PCR逐一扩增单一病原体不同，本发明针对病原体三个基因靶点，这样一方面可及时验证目标病原体在样品中的存在，更重要的是可对所扩增的病毒保护性片段进行序列分析，实时监测病原主要保护性蛋白的变异，为及时掌握病毒致病性特点及其变异趋势和规律、选择合适的疫苗提供科学依据。
附图说明
图1为多重PCR退火温度的确定图示；(M：DNA2000Marker；1为阴性对照；2～6退火温度分别为52℃、54℃、56℃、58℃、60℃)。
图2为多重PCR特异性测定结果图示；(M：DNA2000Marker；1～9模板分别为PPV、PCV2、PRV、PPV+PCV2+PRV、PRRSV、E.coli、PDEV、TGEV、ddH2O)。
图3为多重PCR敏感性测定结果图示；(M：DNA2000Marker；1为阴性对照；2～9.100～10-7倍比稀释的质粒多重PCR结果)。
具体实施方式
本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照试剂制造厂商所建议的条件。
实施例1扩增猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒保护性片段三重PCR体系退火温度的确定
对于PCR反应体系，特别是多重PCR反应体系中，退火温度是一个关键的因素。本发明为了摸索三重PCR体系中适合3对引物的退火温度，特设计三重PCR反应体系进行最佳退火温度确定。
1样品前处理
取约2g猪扁桃体组织样品于2mlEP管中，并加入1mlBufferA，利用全自动组织研磨机进行研磨。取上述研磨液上清250μl至无菌EP管，加10μlOBProtease和250μlBufferBL。再加入4μlLinearAcrylamide(每250μlBufferBL)剧烈振荡15s。65℃孵育10min，中间短暂震荡1次，加260μl无水酒精，剧烈振荡20s混合均匀，短暂离心以将盖子上液体全部收集。
2病毒DNA的提取
将柱子置入新2mlEP管，并用500μlBufferHB洗脱，8000g，1min，弃去液体，保留离心管。将柱子放回2mlEP管，并用700μlDNAwashBuffer(已加8ml酒精稀释)洗脱，8000g，1min离心，弃去离心管及液体。柱子置回EP管，13300g，2min离心，使柱子离干。(此步对于保证下面理想的洗脱非常重要。)将柱子置于1.5mlEP管，并加50～100μlElutionBuffer(预热至65℃)，室温下静置5min。8000g，1min离心以将DNA从柱子上洗脱，保存离心下的液体(含DNA)。将柱子置入第二个1.5mlEP管，再次加50～100μlElutionBuffer，室温静置5min，8000g，离心1min，取液体，保存在-20℃。
3PCR反应体系
将提取的PRV、PCV2、PPV的DNA浓度调整为100ng/μl，各1μl作为模板，3对上、下游引物(见表1)各0.5μl，PCRMix12.5μl，超纯水补充至25μl。95℃预变性5min，进入95℃60s,依次设定退火温度为52℃，54℃，56℃，58℃，60℃1min和72℃1min的循环，循环35次，最后72℃延伸5min，PCR结束后，取8μlPCR产物于1℅的凝胶琼脂上电泳检测，确定反应体系最佳退火温度。
4结果
采用不同的退火温度(52℃～60℃)进行多重PCR反应，结果如图1所示。琼脂糖凝胶电泳结果表明，多重PCR在不同的退火温度下都可以有较好的扩增效果，试验最终选择中间温度56℃作为退火温度。
实施例2扩增猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒保护性片段三重PCR方法体系特异性确定
特异性是PCR反应体系又一个关键的因素。本发明为了确保所建立的三重PCR体系的特异性，特设计PCR反应体系。
1样品前处理同实施例1
2DNA提取同实施例1
3PCR反应体系
在PCR反应体系中分别加入提取的PPV、PCV2、PRV及三种病毒混合物的DNA各1μl为模板，同时加入PRRSV、PEDV、TGEV的RNA反转录产物cDNA为模板(对照)，3对上、下游引物(序列分别如SEQIDNO1-6所示，见表1)各0.5μl，PCRMix12.5μl，以及ddH2O补充至25μl。PCR反应条件：95℃预变性5min，进入95℃60s,设定退火温度为56℃1min和72℃1min的循环，循环35次，最后72℃延伸5min，PCR结束后，取8μlPCR产物于1℅的凝胶琼脂上电泳检测。验证该体系的特异性，以体系只能扩增出PPV、PCV2、PRV三个目的基因片段，而对照组不能扩增出片段为特异性合格。
4结果
采用优化后的多重PCR扩增条件，分别以PPV、PCV2、PRV及三种病毒混合物的DNA为模板以及PRRSV、PEDV、TGEV的RNA反转录产物cDNA为模板，应用3对混合引物进行多重PCR扩增，以ddH2O作为阴性对照，试验结果显示，PPV、PCV2和PRV均扩增出与之相符合的条带，而其它病毒的核酸以及E.coli、ddH2O没有扩增条带，说明，说明利用本发明引物组的PCR体系、方法具有良好的特异性(见图2)。
实施例3扩增猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒保护性片段三重PCR方法体系灵敏度的确定
灵敏度是衡量PCR反应体系是否有效的另一个关键的因素。为确定建立的三重PCR方法的灵敏度。本发明特别制备三种病毒保护性片段PCR阳性模板质粒为参照样品，以调整后的100ng/μl作为PRV、PCV2、PPV质粒的初始浓度，混合均匀后用DEPC水进行倍比稀释(100～10-7)，采用优化后的多重PCR扩增条件进行多重PCR，以检测其敏感性。
1阳性模板质粒的构建
1.1PRV，PCV2以及PPV保护性片段扩增
PCR反应体系(12μl)：分别以提取的PRV，PCV2，PPV的DNA为模板1μl，PCRmix6μl,各自的上下游引物各0.5μl,ddH2O补充至12μl，PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，延伸72℃40s，循环30次，最后72℃延伸10min。
1.2目的片段的回收
紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，吸干凝胶表面液体并切碎。加入三个凝胶体积BufferDE-A,混合均匀后于75℃，直到凝胶块完全融化。加入0.5个BufferDE-A体积的BufferDE-B，混合均匀。吸取上述混合液，转移到DNA制备管，12000g离心1min，弃滤液。将制备管装回2ml离心管，加500μlBufferW1，12000g离心30s，弃滤液。将制备管装回2ml离心管，加700μlBufferW2，12000g离心30s，弃滤液。以同样的方法再洗2次，弃滤液，室温静置1min，12000g离心1min洗脱DNA。
1.3目的片段的连接转化
回收产物用T4DNA连接酶连接pMD18-T载体，连接体系如下：
pMD18-T载体1μl，PCR产物4μl，Solution1，5μl，Total10μl
16℃连接30min。
将上述连接产物转化DH5α感受态细胞。
1.4重组质粒的提取鉴定
将上述连接产物转化DH5α感受态细胞接种培养，过夜摇的浑浊菌液进行PCR鉴定，确定是所需菌液，并取对应菌液进行测序，将结果在NCBI网站进行比对，序列比对正确后进行质粒提取。用质粒抽提试剂盒提取重组质粒步骤为：取2ml的充分摇匀菌液，12000g离心1min，弃尽上清；加250μlBufferS1震荡悬浮细菌沉淀；加250μlBufferS2，温和并充分的颠倒离心管4-6次；加入350μlBufferS3，温和并充分颠倒混匀离心管6-8次；12000g离心10min；吸取上清移入制备管中，12000g离心1min，弃滤液，在吸附柱中加入500μlBufferW1溶液，12000g离心1min，弃滤液，在吸附柱中加入700μlBufferW2溶液，12000g离心1min，弃滤液并重复此步骤；将制备管移入一个新的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加入60μlEluent，室温静置10min后12000g离心1min，提取的质粒保存于-20℃。
2三重PCR反应体系
将提取的PRV、PCV2、PPV的重组质粒DNA浓度调整为100ng/μl,采用优化后的多重PCR扩增条件来扩增倍比稀释(100～10-7)的PRV，PCV，PPV质粒各1μl，PCRmix6μl,各自的上下游引物各0.5μl,ddH2O补充至12μl。95℃预变性5min，进入95℃60s,设定退火温度为56℃1min和72℃1min的循环，循环35次，最后72℃延伸5min，PCR结束后，取8μlPCR产物于1℅的凝胶琼脂上电泳检测。验证该体系的灵敏度，以体系扩增出PPV，PCV2，PRV三个目的基因片段量最多的时的模板稀释度为该体系的灵敏度。
3结果
如图3，最低检出限出现在倍比稀释10-4处，说明利用本发明引物组的PCR体系、方法检测灵敏度高。

Claims (2)

1.一种同时检测猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒、猪细小病毒三重PCR的引物组，其特征在于，扩增猪圆环病毒2型的上游引物序列如SEQIDNO:1所示，扩增猪圆环病毒2型的下游引物序列如SEQIDNO:2所示；
扩增伪狂犬病毒的上游引物序列如SEQIDNO:3所示，扩增伪狂犬病毒的上游引物序列如SEQIDNO:4所示；
扩增猪细小病毒的上游引物如SEQIDNO:5所示，扩增猪细小病毒的上游引物序列如SEQIDNO:6所示。
2.如权利要求1所述的三重PCR的引物组在制备同时检测猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒、猪细小病毒试剂中的应用。
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