CN109825648B

CN109825648B - 检测绵羊肺炎支原体和小反刍兽疫病毒的引物组合物、试剂盒及应用

Info

Publication number: CN109825648B
Application number: CN201910260318.6A
Authority: CN
Inventors: 李文良; 霍晓丽; 毛立; 杨蕾蕾; 刘茂军; 郝飞; 李基棕; 孙敏
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-04-02
Filing date: 2019-04-02
Publication date: 2023-02-28
Anticipated expiration: 2039-04-02
Also published as: CN109825648A

Abstract

本发明提供检测绵羊肺炎支原体和小反刍兽疫病毒的引物组合物、试剂盒及应用，属于生物技术和分子生物学领域。检测绵羊肺炎支原体和小反刍兽疫病毒的引物组合物，包括引物对A和引物对B，所述引物对A包括引物1和引物2，所述引物对B包括引物3和引物4，所述引物1‑4的核苷酸序列如SEQ ID NO:1‑4所示。本发明引物组合物可以用于同时或单独检测绵羊肺炎支原体和小反刍兽疫病毒，操作简单、特异性强、敏感性高，显著提高了检测效率，避免了一次只能检测一种病原，节省时间、避免污染、方便临床呼吸道疾病样品的快速检测，具有广阔的应用前景。

Description

检测绵羊肺炎支原体和小反刍兽疫病毒的引物组合物、试剂盒及应用

技术领域

本发明属于生物技术和分子生物学领域，具体涉及检测绵羊肺炎支原体和小反刍兽疫病毒的引物组合物、试剂盒及应用。

背景技术

绵羊肺炎支原体 (Mycoplasma ovipneumoniae，MO) 是引起羊呼吸道疾病的主要病原之一，可导致山羊、绵羊和一些野生反刍动物的非典型性肺炎。不仅如此，感染绵羊肺炎支原体后宿主对其他病原的易感性增强。该病原目前在全球范围内均有分布，给养羊业造成了较大的经济损失。小反刍兽疫病毒（Peste des petits ruminants virus，PPRV）是副黏病毒科（Paramyxovirinae）麻疹病毒属（Morbillivirus）的成员，可导致山羊、绵羊等小反刍动物发热、眼鼻出现大量分泌物、肺炎、上消化道溃疡和腹泻等临床症状，亚临床感染的山羊可通过分泌物和排泄物持续排毒。

MO在全球范围内均有分布，本实验室的研究发现MO在我国羊群中具有很高的流行率；PPRV自2014年传入国内多数省区，虽已采用弱毒疫苗普遍免疫控制其暴发流行，但其仍存在地方流行的风险，二者均为引起羊呼吸道疫病的主要病原，临床上存在混合感染，需要通过分子生物学方法来区分。支原体分离培养和病毒分离是检测病原的常用方法，但其耗时较长且不利于临床快速诊断，PCR和RT-PCR方法与之相比更加简便快速，适合实验室诊断。但是，目前仅有单独检测MO和PPRV的PCR和RT-PCR方法，检测耗时较长，尚无同时检测MO和PPRV的方法报道应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单、特异性强、敏感性高、能单独或同时检测MO和PPRV的引物组合物、试剂盒及应用。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一种检测绵羊肺炎支原体和小反刍兽疫病毒的引物组合物，所述引物组合物包括引物对A和引物对B，所述引物对A包括引物1和引物2，所述引物对B包括引物3和引物4，所述引物1-4的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-4所示。

优选的技术方案中，引物1、引物2、引物3和引物4的浓度比为1：1：1：1。

本发明还提供检测绵羊肺炎支原体和小反刍兽疫病毒的试剂盒，包括引物1、引物2、引物3和引物4，所述引物1-4的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-4所示。

优选的技术方案中，各引物的浓度为10μmol/L。

在本发明中，所述试剂盒还包括2×R-Mix Buffer、E-Mix和绵羊肺炎支原体标准质粒和小反刍兽疫病毒标准质粒；所述绵羊肺炎支原体标准质粒是以绵羊肺炎支原体DNA为模板，以引物1和引物2为引物，PCR扩增获得目标片段1，将所述目标片段1插入载体，得到绵羊肺炎支原体标准质粒；所述小反刍兽疫病毒标准质粒是以小反刍兽疫病毒RNA为模板，以引物3和引物4为引物，经RT-PCR扩增获得目标片段2，将所述目标片段2插入载体，得到小反刍兽疫病毒标准质粒。

本发明还提供以非诊断为目的采用所述试剂盒检测绵羊肺炎支原体和小反刍兽疫病毒的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）提取待测样本中的DNA和RNA；

（2）以待测样本中的DNA和RNA为模板，以引物组合物为引物，进行双重RT-PCR反应；

（3）将扩增产物进行电泳，若扩增产物中仅出现359 bp的条带，则待测样本中存在绵羊肺炎支原体；若扩增产物中仅出现686bp的条带，则待测样本中存在小反刍兽疫病毒；若扩增产物中出现359 bp的条带和686bp的条带，则待测样本中存在绵羊肺炎支原体和小反刍兽疫病毒。

优选的技术方案中，所述双重RT-PCR反应体系如下：2×R-Mix Buffer 10 μL，引物1、2、3和4各0.5 μL，E-Mix 0.4 μL，核酸模板4 μL，无RNase水补至体积为20μL。

优选的技术方案中，双重RT-PCR反应程序如下：45 ℃反转录30 min；94 ℃预变性5min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30s，72 ℃ 45s，共35个循环；最后72 ℃延伸10min。

有益效果

本发明提供的引物组合物可以用于同时或单独检测绵羊肺炎支原体和小反刍兽疫病毒，操作简单、特异性强、敏感性高，显著提高了检测效率，避免了一次只能检测一种病原，节省时间、避免污染、方便临床呼吸道疾病样品的快速检测，具有广阔的应用前景。采用本发明试剂盒检测其他羊的病原体（山羊痘病毒、蓝舌病病毒、山羊副流感病毒3型、边界病病毒、山羊疱疹病毒I型、牛病毒性腹泻病毒1型和2型、丝状支原体和山羊支原体）均无反应；敏感性试验表明对MO和PPRV的最小检出量分别为10³拷贝/μL和10²拷贝/μL。

附图说明

图1：MO和PPRV双重RT-PCR扩增结果，M：Trans2K plus DNA Marker；1：MO和PPRV双重RT-PCR扩增产物。

图2：双重RT-PCR引物最佳浓度的筛选，M：Trans2K plus DNA Marker；1-5：固定MO引物的量为0.5 µL情况下，PPRV引物量分别为0.1µL、0.3µL、0.5µL、0.7µL、0.9µL；6：阴性对照。

图3特异性试验结果，其中1：MO和PPRV；2：PPRV；3：MO；4-12：依次为山羊痘病毒、山羊副流感病毒3型、蓝舌病病毒、边界病病毒、山羊疱疹病毒I型、牛病毒性腹泻病毒1型和2型、丝状支原体和山羊支原体；13：阴性对照；M：Trans2K plus DNA Marker。

图4敏感性试验结果，其中M：Trans2K plus DNA Marker；1-9：连续10倍稀释的质粒模板（1×10⁸ -1×10⁰拷贝/μL）；10：阴性对照。

具体实施方式

实施例1 引物设计与双重RT-PCR检验

1.引物设计与合成

引物设计是决定多重PCR成败的关键。本发明通过对MO和PPRV基因序列分析比对，从两种病毒基因中分别选择了多种靶基因设计了引物，以病毒DNA和RNA为模板，通过RT-PCR扩增，在确保能够同时正确鉴定两种病原的情况下，又要避免出现同种不同株病原的漏检情况。

申请人利用多重PCR引物设计系统MPprimer软件针对MO和PPRV基因分别设计了近百对引物组合，以期筛选最佳引物组合，同时检测两种病原。在设计多重引物时，除考虑单对引物的Tm值、GC含量和引物是否特异等因素外，还确保了这些引物对之间有相近的Tm值，同时对各个扩增产物的大小进行了限定，保证不同的扩增产物能够很清晰地用肉眼分辨；进而对各个引物对的特异性进行分析，确保引物对不存在非特异性扩增。通过试验验证筛选，最终仅找到了针对MO的引物对A和针对PPRV的引物对B可以用于同时检测MO和PPRV。引物对A是针对MO 16S基因序列（GenBank登录号：EF687778）设计得到的，引物对B是针对PPRVN基因（GenBank登录号：JN647718）中保守的片段设计得到的。

针对MO的引物对A，包括引物1和引物2：

引物1的核苷酸序列：5’- CAACGAAATATATTAGCTT -3’，

引物2的核苷酸序列：5’- ACTTCATCCTGCACTCTGT-3’。

针对PPRV的引物对B，包括引物3和引物4：

引物3的核苷酸序列：5’- ATTGTCCACTATTGAGTCCTTGAT -3’，

引物4的核苷酸序列：5’- TGTCGTTGTAGACCTGACTGTT -3’。

2. 双重RT-PCR检测

取MO培养液（Y98株，购自中国兽医药品监察所）和PPRV弱毒苗（PPRV Nigeria 75/1株，购自新疆天康畜牧生物技术股份有限公司），采用Axygen DNA/RNA提取试剂盒提取待测样本核酸（包括DNA和RNA）。然后采用引物对A和B进行RT-PCR扩增。反应体系为：在0.2 mlPCR反应管中加入2×R-Mix Buffer 10 μL，引物1、2、3、4（均为10μmol/L）各0.5 μL，E-Mix0.4 μL，提取的阳性核酸 4 μL，采用无RNase双蒸水补至20 μL，混匀。反应条件为：45 ℃反转录30 min；94 ℃预变性 5min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30s，72 ℃ 45s，共35个循环；最后72℃延伸10min。取PCR产物于1.2%的琼脂糖凝胶上电泳。从图1可见，MO和PPRV混合物的扩增产物中同时出现359 bp和686 bp两条条带，检测结果为阳性，证明该引物组合具有良好的检测效果。

另外，发现很多引物对可以实现分别检测PPRV和MO，但是不能实现在同一体系中通过双重RT-PCR同时检测PPRV和MO。例如针对PPRV的引物对C和D均可以对PPRV进行特异性扩增；针对MO的引物对E、F、G、H均可以对MO进行特异性扩增。但是，引物对组合C+E、C+G、C+H、D+F、B+F、B+E均不能实现在同一体系中通过双重RT-PCR同时检测PPRV和MO。

引物对C（针对PPRV）：

上游引物：5’-GCTGACTCAGAACTGAGAAGGTGG -3’，

下游引物：5’-CTGCAATCCTTGGCTTGTTACC -3’。

引物对D（针对PPRV）：

上游引物：5’-GATTTAGACAACGAGGCAGAC -3’ ，

下游引物：5’-AAACTCGTGGAGCCCTAAT -3’ 。

引物对E（针对MO）：

上游引物：5’-GAAGTCTTTCGGGATGTA -3’ ，

下游引物：5’-TTGTAGTAGCCATTGTAGC -3’ 。

引物对F（针对MO）：

上游引物：5’-CCAACGGAATATGTTAGCTT -3’，

下游引物：5’-ACTTCATCCTGCACTCTGT -3’。

引物对G（针对MO）：

上游引物：5’-GAAGTCTTTCGGGATGTA -3’ ，

下游引物：5’-TTCGCCTATTGGTGTTCTT -3’。

引物对H（针对MO）：

上游引物：5’-GGAGCGACACAGAGTGCAG-3’，

下游引物：5’-GCTGTGCTAGTGACTTTTGC -3’ 。

实施例2 双重RT-PCR检测方法的建立

1.标准质粒的制备

取200 μL MO培养液（10⁷ CCU/mL，Y98株，购自中国兽医药品监察所）置于1.5mL的EP管（RNase free）中，提取核酸，使用引物对A进行PCR扩增，反应体系为：在0.2 ml PCR反应管中加入2×PCR Mix 10 μL，引物各0.5 μL，核酸模板2 μL，无菌双蒸水加至总体积为20μL，混匀。反应程序为：94 ℃预变性 5min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30s，72 ℃ 30s，共35个循环；最后72 ℃延伸10min。电泳观察结果，回收纯化大小为359bp的PCR产物，克隆入pMD18T载体，经测序正确的阳性质粒即为MO标准品质粒。

取200 μL PPRV弱毒苗( 10⁴ TCID50/mL，PPRV Nigeria 75/1株，购自新疆天康畜牧生物技术股份有限公司)置于1.5mL的EP管（RNase free）中，提取核酸，使用引物对B进行RT-PCR扩增，反应体系为：在0.2 ml PCR反应管中分别加入2×R-Mix Buffer 10 μL，引物各0.5 μL，E-Mix 0.4 μL，核酸模板4 μL，无RNase双蒸水加至总体积为20μL，混匀。反应程序为：45 ℃ 反转录30 min；94 ℃预变性 5min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30s，72 ℃ 45s，共35个循环；最后72 ℃延伸10min。电泳观察结果，回收纯化大小为686bp的PCR产物，克隆入pMD18T载体，经测序正确的阳性质粒即为PPRV标准品质粒。

将两个质粒分别测定浓度后稀释为1×10⁸拷贝/μL用于后续试验。

2. 引物浓度的优化

引物1、2、3、4浓度均为10μmol/L。固定RT-PCR反应体系中针对MO的引物1、2各为0.5 µL，针对PPRV的引物3、4体积相等且设置5个体积梯度（0.1µL、0.3µL、0.5µL、0.7µL和0.9µL），使用标准质粒作为模板进行双重RT-PCR反应，RT-PCR反应体系中其他组分和反应程序同实施例1。从图2可见，引物3、4的浓度均为0.5µL时，可使MO和PPRV的扩增结果最佳。

3. 退火温度的的优化

引物1、2、3、4浓度均为10μmol/L。固定RT-PCR反应体系中引物1、2、3、4的体积均为0.5 µL，RT-PCR反应体系中其他组分同实施例1。在RT-PCR扩增时设置6个梯度退火温度（58℃、56℃、54.4℃、51.2℃、49.7℃、48℃），其他反应程序同实施例1。结果发现温度在51.2-56℃间差异不显著，最终确定最佳退火温度为54℃。

实施例3试剂盒组装与样品检测

1. 试剂盒组装

检测绵羊肺炎支原体和小反刍兽疫病毒的双重RT-PCR检测试剂盒（缩写为本发明试剂盒）包括如下试剂：

（1）引物

引物包括引物1、引物2、引物3和引物4（同实施例1），各引物浓度均为10μmol/L。

（2）2×R-Mix Buffer

2×R-Mix Buffer购自北京全式金生物技术有限公司，是EasyScript One-StepRT-PCR SuperMix试剂盒中产品。

（3）E-Mix

E-Mix购自北京全式金生物技术有限公司，是EasyScript One-Step RT-PCRSuperMix试剂盒中产品。

（4）无RNase双蒸水

（5）阳性标准品

阳性标准品含有1×10⁶ 拷贝/μL的MO标准品质粒和1×10⁶ 拷贝/μL的PPRV

标准品质粒。

2. 采用本发明试剂盒检测样品的具体方法

取200 μL待测样本溶解液（鼻拭子等，加入无菌PBS振荡混匀，2000×g离心5min取上清），或充分研磨的动物组织样品溶解液（肺组织等，加入无菌PBS，研磨，-70℃反复冻融3次，1 2000 ×g 4℃离心10 min，取上清），采用Axygen DNA/RNA提取试剂盒提取待测样本核酸（包括DNA和RNA）。

按照实施例2中确定的反应体系与反应程序进行扩增反应。反应体系为：在0.2 mlPCR反应管中加入2×R-Mix Buffer 10 μL，引物1、2、3和4（均为10μmol/L）各0.5 μL，E-Mix0.4 μL，提取的待测样本核酸4 μL，采用无RNase双蒸水补至20 μL，混匀。反应条件为：45℃反转录30 min；94 ℃预变性 5min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30s，72 ℃ 45s，共35个循环；最后72 ℃延伸10min。阳性对照中以阳性标准品替代待测样本核酸，反应体系中其他组分及体积、反应程序不变。阴性对照中以无RNase双蒸水替代待测样本核酸，反应体系中其他组分及体积、反应程序不变。

结果判定：阳性对照出现359 bp和686 bp两条条带，阴性对照无扩增条带，说明实验结果可靠。若待测样本核酸扩增产物同时出现359 bp和686 bp两条条带，则检测结果为阳性，待测样本中同时存在绵羊肺炎支原体和小反刍兽疫病毒；若扩增产物中仅出现359bp的条带，则检测结果判为绵羊肺炎支原体阳性，即待测样本中存在绵羊肺炎支原体；若扩增产物中仅出现686 bp的条带，则检测结果判为小反刍兽疫病毒阳性，即待测样本中存在小反刍兽疫病毒；若无扩增产物，则检测结果为阴性，即待测样本中不存在绵羊肺炎支原体和小反刍兽疫病毒。

实施例4 特异性

以MO培养液（Y98株，购自中国兽医药品监察所）和PPRV弱毒苗（PPRV Nigeria 75/1株，购自新疆天康畜牧生物技术股份有限公司）作为阳性对照，使用本发明试剂盒分别对山羊痘病毒（ “痘必应”山羊痘活疫苗，购自哈药集团生物疫苗有限公司）、山羊副流感病毒3型（李文良等，山羊源副流感病毒3型的分离与分子鉴定. 畜牧兽医学报，2015，46（2）：344-348）、蓝舌病病毒（李文良等，血清15与21型蓝舌病病毒的分离与鉴定. 2018，31（3）：630-634）、边界病病毒（李文良等，Detection of border disease virus (BDV) in goatherds suffering diarrhea in eastern China. Virology Journal, 2013, 10:80）、山羊疱疹病毒I型（郝飞等，山羊疱疹病毒I型的分离鉴定.畜牧兽医学报，2018,49（8）：1797-1802）、牛病毒性腹泻病毒1型和2型（毛立等，山羊源牛病毒性腹泻病毒的分离与鉴定.中国兽医科学, 2013，43（7）：684-688；舒鑫等，2株牛病毒性腹泻病毒基因2型的分离鉴定.畜牧与兽医，2018，50（10）：105-109）、丝状支原体和山羊支原体（F38和PG3株，购自中国兽医药品监察所）进行检测，结果表明采用本发明试剂盒对MO扩增出大小为359 bp的条带，对PPRV扩增出686 bp的条带，对其他病原均未扩增出条带（图3），说明本发明试剂盒对MO和PPRV具有非常好的特异性。

实施例5 敏感性

制备MO和PPRV标准品质粒混合物。MO和PPRV标准品质粒混合物含有1×10⁸ 拷贝/μL的MO标准品质粒和1×10⁸ 拷贝/μL的PPRV标准品质粒。将MO和PPRV标准品质粒混合物10倍梯度稀释至各标准品质粒均为1×10⁰拷贝/μL，分别采用本发明试剂盒进行检测，以考察本发明试剂盒对MO和PPRV的灵敏度。每个稀释度取4 μL作为模板进行检测，观察阳性条带，以出现阳性条带所用模板量的最高稀释度计算其敏感性。结果如图4，可以看到该方法对MO的最小检出量为10³拷贝/μL，对PPRV的最小检出量为10²拷贝/μL。

实施例5 试剂盒的稳定性检测

应用同一批次本发明试剂盒，对MO培养液（Y98株，购自中国兽医药品监察所）和PPRV弱毒苗（PPRV Nigeria 75/1株，购自新疆天康畜牧生物技术股份有限公司）进行检测，进行三次重复，取PCR产物于1.2%的琼脂糖凝胶上电泳，均都能扩增出目的条带，而且目的条带的亮度一致。本实施例检测结果说明，本发明试剂盒稳定性较好。

实施例6采用本发明试剂盒对临床样品进行检测

采用本发明试剂盒对2014-2018年采集的150份样本（鼻拭子和肺脏）进行检测，另外以引物对A为引物采用单一PCR检测样品中是否存在MO（反应体系和程序见实施例2标题1中MO标准品质粒的制备），采用以引物对B为引物采用RT-PCR检测样品中是否存在PPRV（反应体系和程序见实施例2中PPRV标准品质粒的制备）。

本发明试剂盒检测结果：150份样本中有65份MO是阳性，有20份PPRV阳性，其中MO和PPRV混合感染的有12份。本发明试剂盒检测结果与单一PCR和RT-PCR的检测结果符合率分别为98%和95.3%。将部分临床病料中阳性PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，按照微量胶回收试剂盒（Axygen公司）使用说明回收DNA片段，测序并在NCBI网站进行BLAST比对分析，证实其为MO和PPRV基因序列。这表明本发明建立的双重RT-PCR检测方法可用于临床样品中MO和PPRV的快速同步检测。本实施例实验结果说明本发明试剂盒检测准确性较高。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 检测绵羊肺炎支原体和小反刍兽疫病毒的引物组合物、试剂盒及应用

<130> 20190402

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物1

<400> 1

caacgaaata tattagctt 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物2

<400> 2

acttcatcct gcactctgt 19

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物3

<400> 3

attgtccact attgagtcct tgat 24

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物4

<400> 4

tgtcgttgta gacctgactg tt 22

Claims

1.一种检测绵羊肺炎支原体和小反刍兽疫病毒的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括引物对A和引物对B，所述引物对A包括引物1和引物2，所述引物对B包括引物3和引物4，所述引物1-4的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-4所示。

2.根据权利要求1所述检测绵羊肺炎支原体和小反刍兽疫病毒的引物组合物，其特征在于，引物1、引物2、引物3和引物4的浓度比为1：1：1：1。

3.检测绵羊肺炎支原体和小反刍兽疫病毒的试剂盒，其特征在于包括引物1、引物2、引物3和引物4，所述引物1-4的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-4所示。

4.根据权利要求3所述检测绵羊肺炎支原体和小反刍兽疫病毒的试剂盒，其特征在于各引物的浓度为10μmol/L。

5.根据权利要求3或4所述检测绵羊肺炎支原体和小反刍兽疫病毒的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括2×R-Mix Buffer、E-Mix和绵羊肺炎支原体标准质粒和小反刍兽疫病毒标准质粒；所述绵羊肺炎支原体标准质粒是以绵羊肺炎支原体DNA为模板，以引物1和引物2为引物，PCR扩增获得目标片段1，将所述目标片段1插入载体，得到绵羊肺炎支原体标准质粒；所述小反刍兽疫病毒标准质粒是以小反刍兽疫病毒RNA为模板，以引物3和引物4为引物，经RT-PCR扩增获得目标片段2，将所述目标片段2插入载体，得到小反刍兽疫病毒标准质粒。