CN104450966B - 一种用于同时检测反刍动物携带的四种病毒的多重pcr试剂盒 - Google Patents

一种用于同时检测反刍动物携带的四种病毒的多重pcr试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于同时检测反刍动物携带的四种病毒的多重PCR试剂盒，该试剂盒含有四对特异性引物。实验证明，应用本发明可同时检测反刍动物临床样品中蓝舌病、口蹄疫、小反刍兽疫和水泡性口炎病毒核酸，试剂盒具有敏感性强、特异性高、操作简单的特点，可节约检测时间和减少检测中出现DNA污染的情况。

Description

一种用于同时检测反刍动物携带的四种病毒的多重PCR试剂盒
技术领域
本发明涉及一种用于同时检测反刍动物携带的四种病毒的多重PCR试剂盒；尤其属于一种同时检测反刍动物蓝舌病、口蹄疫、小反刍兽疫和水泡性口炎病毒的多重PCR检测试剂盒，属于病毒检测领域。
背景技术
多重PCR(multiplexPCR)是在普通PCR的基础上加以改进，于一个PCR反应体系中加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。多重PCR主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定和病原微生物、某些遗传病及癌基因的分型鉴定。多重PCR的特点有：1.高效性，在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型；2.系统性，多重PCR很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒、肠道致病性细菌的同时检测；3.经济简便性，多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。
蓝舌病(Bluetongue，BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒引起的经媒介昆虫传播的动物传染病。BT主要感染反刍动物牛、羊，表现为高烧、黏膜水肿和糜烂等症状，致死率为20％-30％。1940年前，本病报道仅限于撒哈拉以南的非洲大陆少数几个国家。Gambles(1949)首次报道在非洲大陆以外的塞浦路斯，随后的30年间，该病在土耳其(1944，1946，1947)、以色列(1949)、美国(1952)、伊比利亚半岛(1956-1960)、葡萄牙(1956)、西班牙(1957)、巴勒斯坦、印度、中国等国均有爆发。
口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的动物急性、烈性传染病，主要危害牛、羊等偶蹄动物。易感动物的发病率几乎为100％；成年动物的死亡率较低，不超过5％；有文献记载牛和瞪羚的死亡率分别高达30％和50％，与此形成鲜明对比的是，幼畜的死亡率高达90％以上。
小反刍兽疫(PPR)又称羊瘟，是由小反刍兽疫病毒引起的山羊、绵羊等小反刍动物的一种高度接触性传染病。牛感染但不发病。PPR对动物的致死率高达50％～90％，分布于非洲、亚洲等地，在全球呈现由西向东扩散趋势。
水泡性口炎(Vesicularstomatitis，VS)是由水泡性口炎病毒所引起的人畜共患高度接触性传染病。反刍动物主要感染牛，羊不发生自然感染，牛的VS临床症状不易区分于口蹄疫。
蓝舌病、口蹄疫、小反刍兽疫和水泡性口炎四种病毒同属于反刍动物可感染的病毒，在检验检疫中均属被检对象。感染这四种病毒中的一种后，病畜在临床上均表现为精神沉郁，体温升高、黏膜水肿和糜烂等症状，在临床诊断上不易于区分。针对反刍动物临床易混合感染疫病-蓝舌病、口蹄疫、水泡性口炎、小反刍兽疫，临床诊断易混淆，传统的病毒学试验耗时耗力，普通PCR检测需要不同的反应体系，耗时费力的特点，加强研发快速检测试剂是疫病检测的需求所在。
发明内容
本发明的目的是要提供一种特异性强、敏感性高、操作简便快速的用于同时检测蓝舌病、口蹄疫、小反刍兽疫和水泡性口炎四种病毒核酸的多重PCR检测试剂盒及快速检测方法。
为了实现本发明目的，本发明采用以下技术方案实现。
一种用于同时检测反刍动物携带的四种病毒的多重PCR试剂盒，本发明的试剂盒包括四对特异性引物，其中，用于蓝舌病病毒检测的引物分别为BTV-F和BTV-R；用于口蹄疫病毒检测的引物分别为FMDV-F和FMDV-R；用于小反刍兽疫病毒检测的引物分别为PPRV-F和PPRV-R；用于水泡性口炎病毒检测的引物分别为VSV-F和VSV-R；
用于蓝舌病病毒检测的引物是针对蓝舌病病毒的NS3基因设计，引物序列分别为BTV-F和BTV-R为，BTV-F：5’-ATGCTATCCGGGCTGATCCRA-3’；
BTV-R：5’-TCACRTCATCACGAAACGCTTC-3’；扩增片段大小为268bp，通过特性试验表明：
1.使用该对引物对蓝舌病病毒进行检测，具有较高的特异性，与口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒、水泡性口炎病毒均无交叉反应。
2.使用该对引物对蓝舌病病毒进行检测，具有很好的可重复性，对于蓝舌病病毒不同血清型都可以被检出。
3.使用该对引物对蓝舌病病毒进行检测，检测灵敏性高，最小核酸检出量为103copies/μL。
用于口蹄疫病毒检测的引物序列是针对口蹄疫病毒的3D基因设计，引物序列分别为FMDV-F和FMDV-R，
FMDV-F：5’-GGACCATMCAGGAGAAGTTGA-3’；
FMDV-R：5’-CGCAGGTAAAGTGATCTGTAGC-3’；扩增片段大小为130bp，通过特性试验表明：
1.使用该对引物对口蹄疫病毒进行检测，具有较高的特异性，与蓝舌病病毒、小反刍兽疫病毒、水泡性口炎病毒均无交叉反应。
2.使用该对引物对口蹄疫病毒进行检测，具有很好的可重复性，对于口蹄疫病毒不同血清型都可以被检出。
3.使用该对引物对口蹄疫病毒进行检测，检测灵敏性高，最小核酸检出量为102copies/μL。
用于小反刍兽疫病毒检测的引物序列是针对小反刍兽病毒的N基因设计，引物序列分别为PPRV-F和PPRV-R，
PPRV-F：5’-TCTCGGAAATCGCCTCRCAGRCTG-3’；
PPRV-R：5’-CCTCCTCCTGGTCCTCCARAATCY-3’；扩增片段大小为351bp，通过特性试验表明：
1.使用该对引物对小反刍兽疫病毒进行检测，具有较高的特异性，与蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒均无交叉反应。
2.使用该对引物对小反刍兽疫病毒进行检测，具有很好的可重复性，对于小反刍兽疫病毒疫苗株可以被检出。
3.使用该对引物对小反刍兽疫病毒进行检测，检测灵敏性高，最小核酸检出量为103copies/μL。
用于水泡性口炎病毒检测的引物序列是针对水泡性口炎病毒的N基因设计，引物序列分别为VSV-F和VSV-R，VSV-F：5’-GAAACTACTGGACGGGCTTGA-3’；
VSV-R：5’-GAGACTATGGTTCCGTATCTGATTG-3’；扩增片段大小为198bp，通过特性试验表明：
1.使用该对引物对水泡性口炎病毒进行检测，具有较高的特异性，与蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒均无交叉反应。
2.使用该对引物对水泡性口炎病毒进行检测，具有很好的可重复性，对于水泡性口炎病毒不同血清型都可以被检出。
3.使用该对引物对水泡性口炎病毒进行检测，检测灵敏性高，最小核酸检出量为103copies/μL。
本发明BTV-F、BTV-R、FMDV-F、FMDV-R、PPRV-F、PPRV-R、VSV-F、VSV-R的摩尔比分别为1：1：4.7：4.7：4.3：4.3：3.3：3.3。
本发明该试剂盒还包括引物液、阳性对照、阴性对照、反转录液、PCR混合液、去离子水。
本发明使用BTV-F和BTV-R、FMDV-F和FMDV-R、PPRV-F和PPRV-R、VSV-F和VSV-R四对引物在多重PCR扩增时的退火温度为54℃-60℃。优选的多重PCR扩增退火温度为57℃。
本发明所述引物BTV-F和BTV-R、FMDV-F和FMDV-R、PPRV-F和PPRV-R、VSV-F和VSV-R在多重PCR反应体系中的终浓度分别为0.15μmol/L、0.7μmol/L、0.65μmol/L、0.5μmol/L。
本发明的有益效果为，1、一个试剂盒即可同时检测反刍动物携带的四种病毒；2、检测结果没有交叉，可以达到对反刍动物蓝舌病、口蹄疫、小反刍兽疫和水泡性口炎病毒做到唯一检测，特异性非常高；3、重复性好；4、灵敏度非常高；5、检测过程简便；6、检测时间短，完全可以满足现有检验检疫的需要。
附图说明
图1为PPRV特异性引物验证结果：M：DL2000Marker；1：PPRV疫苗株；
图2为BTV特异性引物验证结果：M：DL2000Marker；1：BTV4型；2：BTV8型；3：BTV9型；4：BTV15型；5：BTV17型；6：BTV18型；
图3为VSV特异性引物验证结果：M：DL2000Marker；1：VSVNJ型；2：VSVIND型；
图4为FMDV特异性引物验证结果：M：DL2000Marker；1：FMDVO型；2：FMDVA型；3：FMDVAsiaI型；
图5为多重PCR特异性扩增结果，利用优化好的多重PCR反应条件，对PPRV、BTV、VSV和FMDV的克隆质粒人为混合后进行多重PCR扩增，结果含有PPRV、BTV、VSV和FMDV的核酸样品均扩增出与试验设计相符的电泳条带，分别为351bp、268bp、198bp和130bp，且无其他非特异性条带扩增；M：DL2000Marker；1：PPRV；2：BTV；3：VSV；4：FMDV；5：PPRV+BTV；6：PPRV+VSV；7：PPRV+FMDV；8：BTV+VSV；9：BTV+FMDV；10：VSV+FMDV；11：PPRV+BTV+VSV；12：PPRV+BTV+FMDV；13：BTV+VSV+FMDV；14：PPRV+BTV+VSV+FMDV；
图6为多重PCR敏感性结果，在引物终浓度分别为PPRV0.65μmol/L、BTV0.15μmol/L、VSV0.5μmol/L、FMDV0.7μmol/L时，该多重PCR能检测出的最低拷贝数分别为PPRV103copies/μL、BTV103copies/μL、VSV103copies/μL、FMDV102copies/μL；M：DL2000Marker；1：PPRV108copies/μL、BTV108copies/μL、VSV108copies/μL、FMDV108copies/μL；2：PPRV107copies/μL、BTV107copies/μL、VSV107copies/μL、FMDV107copies/μL；3：PPRV106copies/μL、BTV106copies/μL、VSV106copies/μL、FMDV106copies/μL；4：PPRV105copies/μL、BTV105copies/μL、VSV105copies/μL、FMDV105copies/μL；5：PPRV104copies/μL、BTV104copies/μL、VSV104copies/μL、FMDV104copies/μL；6：PPRV103copies/μL、BTV103copies/μL、VSV103copies/μL、FMDV103copies/μL；7：PPRV102copies/μL、BTV102copies/μL、VSV102copies/μL、FMDV102copies/μL；8：PPRV101copies/μL、BTV101copies/μL、VSV101copies/μL、FMDV101copies/μL；
图7为PPRV特异性引物扩增的目的序列；
图8为BTV特异性引物扩增的目的序列；
图9为VSV特异性引物扩增的目的序列；
图10为FMDV特异性引物扩增的目的序列。
具体实施方式
一种用于同时检测反刍动物携带的四种病毒的多重PCR试剂盒，本发明的试剂盒包括四对特异性引物，其中，用于蓝舌病病毒检测的引物分别为BTV-F和BTV-R；用于口蹄疫病毒检测的引物分别为FMDV-F和FMDV-R；用于小反刍兽疫病毒检测的引物分别为PPRV-F和PPRV-R；
用于水泡性口炎病毒检测的引物分别为VSV-F和VSV-R；
用于蓝舌病病毒检测的引物序列是针对蓝舌病病毒的NS3基因设计，引物序列分别为BTV-F和BTV-R，BTV-F：5’-ATGCTATCCGGGCTGATCCRA-3’；
BTV-R：5’-TCACRTCATCACGAAACGCTTC-3’；扩增片段大小为268bp，通过特性试验表明：
1.使用该对引物对蓝舌病病毒进行检测，具有较高的特异性，与口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒、水泡性口炎病毒均无交叉反应。
2.使用该对引物对蓝舌病病毒进行检测，具有很好的可重复性，对于蓝舌病病毒不同血清型都可以被检出。
3.使用该对引物对蓝舌病病毒进行检测，检测灵敏性高，最小核酸检出量为103copies/μL。
用于口蹄疫病毒检测的引物序列是针对口蹄疫病毒的3D基因设计，引物序列分别为FMDV-F和FMDV-R，
FMDV-F：5’-GGACCATMCAGGAGAAGTTGA-3’；
FMDV-R：5’-CGCAGGTAAAGTGATCTGTAGC-3’；扩增片段大小为130bp，通过特性试验表明：
1.使用该对引物对口蹄疫病毒进行检测，具有较高的特异性，与蓝舌病病毒、小反刍兽疫病毒、水泡性口炎病毒均无交叉反应。
2.使用该对引物对口蹄疫病毒进行检测，具有很好的可重复性，对于口蹄疫病毒不同血清型都可以被检出。
3.使用该对引物对口蹄疫病毒进行检测，检测灵敏性高，最小核酸检出量为102copies/μL。
用于小反刍兽疫病毒检测的引物序列是针对小反刍兽病毒的N基因设计，引物序列分别为PPRV-F和PPRV-R，
PPRV-F：5’-TCTCGGAAATCGCCTCRCAGRCTG-3’；
PPRV-R：5’-CCTCCTCCTGGTCCTCCARAATCY-3’；扩增片段大小为351bp，通过特性试验表明：
1.使用该对引物对小反刍兽疫病毒进行检测，具有较高的特异性，与蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒均无交叉反应。
2.使用该对引物对小反刍兽疫病毒进行检测，具有很好的可重复性，对于小反刍兽疫病毒疫苗株可以被检出。
3.使用该对引物对小反刍兽疫病毒进行检测，检测灵敏性高，最小核酸检出量为103copies/μL。
用于水泡性口炎病毒检测的引物序列是针对病毒N基因设计，引物序列分别为VSV-F和VSV-R，VSV-F：5’-GAAACTACTGGACGGGCTTGA-3’；
VSV-R：5’-GAGACTATGGTTCCGTATCTGATTG-3’；扩增片段大小为198bp，通过特性试验表明：
1.使用该对引物对水泡性口炎病毒进行检测，具有较高的特异性，与蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒均无交叉反应。
2.使用该对引物对水泡性口炎病毒进行检测，具有很好的可重复性，对于水泡性口炎病毒不同血清型都可以被检出。
3.使用该对引物对水泡性口炎病毒进行检测，检测灵敏性高，最小核酸检出量为103copies/μL。
本发明BTV-F、BTV-R、FMDV-F、FMDV-R、PPRV-F、PPRV-R、VSV-F、VSV-R的摩尔比分别为1：1：4.7：4.7：4.3：4.3：3.3：3.3。
本发明该试剂盒还包括引物液、阳性对照、阴性对照、反转录液、PCR混合液、去离子水。
本发明使用BTV-F和BTV-R、FMDV-F和FMDV-R、PPRV-F和PPRV-R、VSV-F和VSV-R四对引物在多重PCR扩增时的退火温度为54℃-60℃。优选的多重PCR扩增退火温度为57℃。
本发明所述引物BTV-F和BTV-R、FMDV-F和FMDV-R、PPRV-F和PPRV-R、VSV-F和VSV-R在多重PCR反应体系中的终浓度分别为0.15μmol/L、0.7μmol/L、0.65μmol/L、0.5μmol/L。
实施例
1材料和方法
1.1阳性\阴性对照
阳性对照：携带蓝舌病病毒NS3基因的质粒、携带口蹄疫病毒3D基因的质粒、携带小反刍兽疫疫苗株N基因的质粒和携带水泡性口炎病毒N基因的质粒混合物由云南出入境检验检疫局动检实验室和重庆出入境检验检疫局动检实验室保存，并赠送给深圳出入境检验检疫局动检实验室；公众可从上述单位任一一家获得，或委托大连宝生物生物有限公司或其它生物有限公司合成。
阴性对照：不含PPRV、BTV、VSV和FMDV的去离子水。
1.2引物液
表1中引物由大连宝生物生物有限公司合成，不同引物，每管配置成20μM；BTV-F、BTV-R、FMDV-F、FMDV-R、PPRV-F、PPRV-R、VSV-F和VSV-R引物按1：1：4.7：4.7：4.3：4.3：3.3：3.3的摩尔比例混合。
表1多重PCR引物序列
1.3其它试剂
TrizolReagent，5×RTMasterMix、2×PremixTaq，均为商品化试剂，购自大连宝生物生物有限公司，分装以后作为试剂盒中成份。
1.4试剂盒操作步骤
1.4.1反转录
根据样品检测数，取1.5mL灭菌Eppendorf管，对每管进行编号标记。
每管加入750μLTrizol，然后分别加入待检样品、阳性对照和阴性对照各250μL，混匀，静置5min；加入200μL三氯甲烷，混均，静置5min，于4℃条件下，12000r/min离心15min。
取相同数量的1.5mL灭菌Eppendorf管，加入500μL异丙醇，对各个管进行对应编号。吸取离心后各管中的上清液转移至相应的新管中，上清液约吸取500μL(不要吸出中间白色絮状层)，轻轻颠倒均匀。
于4℃条件下，12000r/min离心15min。取出Eppendorf管，轻轻倒去上清液，加入1mL75％乙醇，颠倒洗涤。
于4℃条件下，12000r/min离心15min。取出Eppendorf管，轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。
每管加入20μL灭菌DEPC水，轻轻混均，溶解管壁上的RNA，瞬时离心，冰上保存备用。提取的RNA需立即进行RT-PCR扩增或放置于-70℃冰箱保存备用。
1.4.2cDNA的合成
取上述提取的RNA8μL加入2μL5×RTMasterMix于20μLEppendorf管，放入PCR仪中进行反转录，反转录条件为：37℃25min、50℃5min、98℃5min，4℃保存。
1.4.3PCR反应
以获得的cDNA为模板进行扩增，反应体系25uL：2×PremixTaq12.5μL；引物液2.5μL；模板cDNA2μL；去离子水8μL。
反应条件：预变性95℃5min；每个循环条件为95℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸30s，35个循环；产物末端72℃延伸10min；4℃保存。
1.4.4琼脂糖凝胶电泳
将PCR反应产物与6倍LoadingBuffer混匀后在2％的琼脂糖凝胶中进行电泳，100V电泳40min后，观察产物条带，结果如图5所示。当样品中有PPRV存在时，在351bp附近出现特异性条带，当样品中有BTV存在时，在268bp附近出现特异性条带，当样品中VSV存在时，在198bp附近出现特异性条带，当样品中FMDV存在时，在130bp附近出现特异性条带。
本发明的试剂盒含有可以同时检测反刍动物蓝舌病、口蹄疫、小反刍兽疫和水泡性口炎四种病毒的引物；可以在各检疫口岸中大量推广。由于本试剂盒引物的特异性非常高，完全可以做到对这四种病毒唯一检测，因此，若有试剂盒仅包含本发明内容中的一对检测引物时，亦在本发明保护范围内。

Claims (6)

1.一种用于同时检测反刍动物携带的四种病毒的多重PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括四对特异性引物，其中，用于蓝舌病病毒检测的引物分别为BTV-F和BTV-R；用于口蹄疫病毒检测的引物分别为FMDV-F和FMDV-R；用于小反刍兽疫病毒检测的引物分别为PPRV-F和PPRV-R；用于水泡性口炎病毒检测的引物分别为VSV-F和VSV-R；用于蓝舌病病毒检测的引物序列是针对蓝舌病病毒的NS3基因设计，引物序列分别为BTV-F和BTV-R，
BTV-F：5’-ATGCTATCCGGGCTGATCCRA-3’；
BTV-R：5’-TCACRTCATCACGAAACGCTTC-3’；用于口蹄疫病毒检测的引物序列是针对口蹄疫病毒的3D基因设计，引物序列分别为FMDV-F和FMDV-R，
FMDV-F：5’-GGACCATMCAGGAGAAGTTGA-3’；
FMDV-R：5’-CGCAGGTAAAGTGATCTGTAGC-3’；用于小反刍兽疫病毒检测的引物序列是针对小反刍兽病毒N基因设计，引物序列分别为PPRV-F和PPRV-R，
PPRV-F：5’-TCTCGGAAATCGCCTCRCAGRCTG-3’；
PPRV-R：5’-CCTCCTCCTGGTCCTCCARAATCY-3’；用于水泡性口炎病毒检测的引物序列是针对病毒N基因设计，引物序列分别为VSV-F和VSV-R，
VSV-F：5’-GAAACTACTGGACGGGCTTGA-3’；
VSV-R：5’-GAGACTATGGTTCCGTATCTGATTG-3’。
2.根据权利要求1所述的一种用于同时检测反刍动物携带的四种病毒的多重PCR试剂盒，其特征在于，BTV-F、BTV-R、FMDV-F、FMDV-R、PPRV-F、PPRV-R、VSV-F、VSV-R的摩尔比分别为1：1：4.7：4.7：4.3：4.3：3.3：3.3。
3.根据权利要求1所述的一种用于同时检测反刍动物携带的四种病毒的多重PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括阳性对照、阴性对照、反转录液、PCR混合液、去离子水。
4.根据权利要求2所述的一种用于同时检测反刍动物携带的四种病毒的多重PCR试剂盒，其特征在于，使用BTV-F和BTV-R、FMDV-F和FMDV-R、PPRV-F和PPRV-R、VSV-F和VSV-R四对引物在多重PCR扩增时的退火温度为54℃-60℃。
5.根据权利要求4所述的一种用于同时检测反刍动物携带的四种病毒的多重PCR试剂盒，其特征在于，使用BTV-F和BTV-R、FMDV-F和FMDV-R、PPRV-F和PPRV-R、VSV-F和VSV-R四对引物在多重PCR的扩增的退火温度为57℃。
6.根据权利要求4所述的一种用于同时检测反刍动物携带的四种病毒的多重PCR试剂盒，其特征在于，所述引物BTV-F和BTV-R、FMDV-F和FMDV-R、PPRV-F和PPRV-R、VSV-F和VSV-R在多重PCR反应体系中的终浓度分别为0.15μmol/L、0.7μmol/L、0.65μmol/L、0.5μmol/L。
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