CN105331742A - 一种用于同时检测绵羊和山羊六种病毒的多重pcr试剂盒 - Google Patents

一种用于同时检测绵羊和山羊六种病毒的多重pcr试剂盒 Download PDF

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Abstract

一种用于同时检测绵羊和山羊携带的六种病毒的多重PCR试剂盒，包括六对特异性引物，其中，用于蓝舌病病毒检测的引物分别为BTV-F和BTV-R；用于口蹄疫病毒检测的引物分别为FMDV-F和FMDV-R；用于小反刍兽疫病毒检测的引物分别为PPRV-F和PPRV-R；用于绵羊痘病毒检测的引物分别为SPPV-F和SPPV-R；用于山羊痘病毒检测的引物分别为GTPV-F和GTPV-R；用于羊口疮病毒检测的引物分别为ORFV-F和ORFV-R；引物序列分别为SEQ？ID？NO:1～12的核苷酸序列。本发明能同时检测绵羊和山羊临床样品中蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒和羊口疮病毒六种病毒核酸，且具有敏感性强、特异性高、操作简单、节约检测时间的特点。

Description

一种用于同时检测绵羊和山羊六种病毒的多重PCR试剂盒
技术领域
本发明涉及一种用于同时检测绵羊和山羊携带的六种病毒的多重PCR试剂盒，具体涉及一种同时检测绵羊和山羊蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒和羊口疮病毒的多重PCR检测试剂盒。
背景技术
多重PCR(multiplexPCR)是在普通PCR的基础上加以改进，于一个PCR反应体系中加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。多重PCR主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定和病原微生物、某些遗传病及癌基因的分型鉴定，其特点有：高效性，在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型；系统性，多重PCR很适宜于成组病原体的检测；经济简便性，多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。
蓝舌病(Bluetongue，BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒引起的通过吸血昆虫-库蠓叮咬传播，感染牛羊等反刍动物的一种非接触性传染病，全球已知至少有24个不同血清型的BTV，不同血清型对牛羊的致病性不同，且型间不能产生交叉保护。蓝舌病主要感染反刍动物牛、羊，表现为高烧、黏膜水肿和糜烂等症状，致死率为20％～30％。该病发病率高，传播迅速，而又极难防制，被国际兽医局列为A类传染病。
口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的动物急性、烈性传染病，主要危害牛、羊等偶蹄动物，易感动物的发病率几乎为100％。该病主要特点是流行广、传播快、发病率高，被国际兽疫局列为A类传染病之首，对畜牧业生产危害性极大，是世界各国检测和防疫的重点对象。
小反刍兽疫(PPR)又称羊瘟，是由小反刍兽疫病毒引起的山羊、绵羊等小反刍动物的一种急性、高度接触性传染病，牛感染但不发病。PPR对动物的致死率高达50％～90％，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病，我国将其列为一类动物疾病，该病分布于非洲、亚洲等地，在全球呈现由西向东扩散趋势。
绵羊痘是由痘病毒科(Poxciridae)脊椎动物痘病毒亚科(Chordopoxvirdae)羊痘病毒属(Capripoxvirus)的绵羊痘病毒(Sheeppoxvirus,SPPV)引起绵羊的一种急性、热性、接触性传染病。主要表现为发热、无毛或少毛部位皮肤黏膜发生丘疹和疱疹，有较高的死亡率。羊痘在非洲中北部、亚洲中部和西南部以及印度大部分地区呈地方性流行，对养羊业造成严重的危害和巨大经济损失。因而，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病，在我国也被列为一类传染病。
山羊痘(Goatpoxdisease)是由痘病毒科(Poxciridae)脊椎动物痘病毒亚科(Chordopoxvirdae)羊痘病毒属(Capripoxvirus)的山羊痘病毒(Goatpoxvirus,GTPV)引起山羊及绵羊的一种急性热性高度接触性传染病，绵羊痘和山羊痘统称羊痘，羊痘能导致病羊消瘦，产乳量大幅度降低，严重时导致死亡，造成严重的经济损失。因而羊痘被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病，我国将其列为一类动物疾病。
羊口疮(Soremouthdisease)又称“羊传染性脓疱(Contagiousecthyma)”，是由痘病毒科副痘病毒属的传染性脓疱病毒(Contagiousecthymavirus)引起的绵羊、山羊的一种急性、接触性和嗜上皮性传染病，可感染人类。主要危害羔羊，以口腔黏膜出现红斑、丘疹、水疱，脓疱，形成疣状痂块为特征。该病是一种常发疾病，会引起羔羊生长发育迟缓和体重下降，给养羊业造成较大的经济损失。
蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒和羊口疮病毒六种病毒可感染绵羊和山羊，感染这六种病毒中的一种后，病畜在临床上均表现为精神沉郁，体温升高、口腔黏膜和乳头等处发生水泡及溃疡、黏膜水肿和糜烂等症状，而且临床症状极为相似，在临床诊断上不易于区分。目前，对这六种疫病的诊断多采用病原分离鉴定及常规的血清学方法，所需时间较长，普通PCR检测需要不同的反应体系，耗时费力。因此，亟需建立一种能同时、快速、精确检测鉴别蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒和羊口疮病毒六种病毒感染多重RT-PCR试剂盒。
发明内容
本发明解决其技术问题采用的技术方案是，提供一种特异性强、敏感性高、操作简便快速的用于同时检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒和羊口疮病毒六种病毒核酸的多重PCR检测试剂盒。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种用于同时检测绵羊和山羊携带的六种病毒的多重PCR试剂盒，包括六对特异性引物，其中，用于蓝舌病病毒检测的引物分别为BTV-F和BTV-R，引物序列分别为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2；用于口蹄疫病毒检测的引物分别为FMDV-F和FMDV-R，引物序列分别为SEQIDNO:3和SEQIDNO:4；用于小反刍兽疫病毒检测的引物分别为PPRV-F和PPRV-R，引物序列分别为SEQIDNO:5和SEQIDNO:6；用于绵羊痘病毒检测的引物分别为SPPV-F和SPPV-R，引物序列分别为SEQIDNO:7和SEQIDNO:8；用于山羊痘病毒检测的引物分别为GTPV-F和GTPV-R，引物序列分别为SEQIDNO:9和SEQIDNO:10；用于羊口疮病毒检测的引物分别为ORFV-F和ORFV-R，引物序列分别为SEQIDNO:11和SEQIDNO:12。
进一步，所述多重PCR试剂盒还包括阳性对照、阴性对照、反转录液、PCR混合液、去离子水。
进一步，所述BTV-F、BTV-R、FMDV-F、FMDV-R、PPRV-F、PPRV-R、SPPV-F、SPPV-R、GTPV-F、GTPV-R、ORFV-F、ORFV-R的摩尔比分别为2：2：2：2：2：2：2：2：3：3：1：1。
进一步，所述BTV-F和BTV-R、FMDV-F和FMDV-R、PPRV-F和PPRV-R、SPPV-F和SPPV-R、GTPV-F和GTPV-R、ORFV-F和ORFV-R六对引物在多重PCR扩增时的退火温度为54℃～60℃(优选退火温度为55℃)。
进一步，所述引物BTV-F和BTV-R、FMDV-F和FMDV-R、PPRV-F和PPRV-R、SPPV-F和SPPV-R、GTPV-F和GTPV-R、ORFV-F和ORFV-R在多重PCR反应体系中的终浓度分别为1.0pmol/μL、1.0pmol/μL、1.0pmol/μL、1.0pmol/μL、1.5pmol/μL、0.5pmol/μL。
本发明可同时检测绵羊和山羊携带的六种病毒，检测结果没有交叉，可以达到对绵羊和山羊蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒和羊口疮病毒做到唯一检测，特异性高，重复性好，灵敏度高，检测过程简便，检测时间短，完全可以满足现有检验检疫的需要,填补了国内空白。
附图说明
图1为FMDV特异性引物验证结果：M：DL2000Marker；1-5：FMDV疫苗株。
图2为BTV特异性引物验证结果：M：DL2000Marker；1-5BTV疫苗株。
图3为PPRV特异性引物验证结果：M：DL2000Marker；1-5：PPRV疫苗株。
图4为SPPV特异性引物验证结果：M：DL2000Marker；1-5SPPV疫苗株。
图5为GTPV特异性引物验证结果：M：DL2000Marker；1-5：GTPV疫苗株。
图6为ORFV特异性引物验证结果：M：DL2000Marker；1-5：ORFV疫苗株。
图7为多重PCR特异性扩增结果。其中，M：DL1000Marker；1：PPRV；2：BTV；3：SPPV；4：FMDV；5：GTPV；6：ORFV；7：PPRV+BTV+FMDV+SPPV+GTPV+ORFV；8：PPV；9：PRV；10：CSFV；11：VERO细胞；12：BHK-21细胞；13：ddH2O。
图8为多重PCR敏感性结果。其中，M：DL1000Marker；1：PPRV107copies/μL、BTV107copies/μL、FMDV107copies/μL、SPPV107copies/μL、GTPV107copies/μL、ORFV107copies/μL；2：PPRV106copies/μL、BTV106copies/μL、FMDV106copies/μL、SPPV106copies/μL、GTPV106copies/μL、ORFV106copies/μL；3：PPRV105copies/μL、BTV105copies/μL、FMDV105copies/μL、SPPV105copies/μL、GTPV105copies/μL、ORFV105copies/μL；4：PPRV104copies/μL、BTV104copies/μL、FMDV104copies/μL、SPPV104copies/μL、GTPV104copies/μL、ORFV104copies/μL；5：PPRV103copies/μL、BTV103copies/μL、FMDV102copies/μL、SPPV103copies/μL、GTPV103copies/μL、ORFV103copies/μL；6：PPRV102copies/μL、BTV102copies/μL、FMDV102copies/μL、SPPV102copies/μL、GTPV102copies/μL、ORFV102copies/μL。
图9为多重PCR重复性结果。其中，M：DL1000Marker；1：PPRV106copies/μL、BTV106copies/μL、FMDV106copies/μL、SPPV106copies/μL、GTPV106copies/μL、ORFV106copies/μL第一次重复结果；2：PPRV105copies/μL、BTV105copies/μL、FMDV105copies/μL、SPPV105copies/μL、GTPV105copies/μL、ORFV105copies/μL；3：:PPRV104copies/μL、BTV104copies/μL、FMDV104copies/μL、SPPV104copies/μL、GTPV104copies/μL、ORFV104copies/μL；4-6：第二次重复结果；7-9：第三次重复结果；10：阴性对照。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步加以说明。
实施例1：同时检测绵羊和山羊携带的六种病毒的多重PCR试剂盒
试剂盒包括六对特异性引物，还包括阳性对照、阴性对照、反转录液、PCR混合液、去离子水。其中，用于蓝舌病病毒检测的引物分别为BTV-F和BTV-R；用于口蹄疫病毒检测的引物分别为FMDV-F和FMDV-R；用于小反刍兽疫病毒检测的引物分别为PPRV-F和PPRV-R；用于绵羊痘病毒检测的引物分别为SPPV-F和SPPV-R；用于山羊痘病毒检测的引物分别为GTPV-F和GTPV-R；用于羊口疮病毒检测的引物分别为ORFV-F和ORFV-R；
用于蓝舌病病毒检测的引物是针对蓝舌病病毒的NS3基因设计，引物序列分别为BTV-F和BTV-R，
BTV-F：5’-AGTGTCATGCTATCCGCTGCC-3’；
BTV-R：5’-GCGTACATGCAGGATGCGAC-3’；扩增片段大小为257bp。
用于口蹄疫病毒检测的引物序列是针对口蹄疫病毒的3D基因设计，引物序列分别为FMDV-F和FMDV-R，
FMDV-F：5’-GGACCGAGAAGTTGATACAGA-3’；
FMDV-R：5’-CGCAGGTGTAAAGATCTGTAGC-3’；扩增片段大小为130bp。
用于小反刍兽疫病毒检测的引物序列是针对小反刍兽病毒的N基因设计，引物序列分别为PPRV-F和PPRV-R，
PPRV-F：5’-ATTGTCCACTGAATTATCCTTGAT-3’；
PPRV-R：5’-TTGTCGACGTTGTAGACCTTGTTG-3’；扩增片段大小为687bp。
用于绵羊痘病毒检测的引物序列是针对病毒全基因中保守序列设计，引物序列分别为SPPV-F和SPPV-R，
SSPV-F：5’-ACTAAACTATTGTGTTACTGA-3’；
SSPV-R：5’-AACTTCTCATCATCAACATGA-3’；扩增片段大小为177bp。
用于山羊痘病毒检测的引物序列是针对病毒全基因中保守序列设计，引物序列分别为GTPV-F和GTPV-R，
GTPV-F：5’-TTTCAAAGCTTTTTGTTAACGTAGG-3’；
GTPV-R：5’-AAGTGCCGTGACAATAGAATGG-3’；扩增片段大小为413bp。
用于羊口疮病毒检测的引物序列是针对病毒011基因设计，引物序列分别为ORFV-F和ORFV-R，
ORFV-F：5’-CGAACTCACTTCCACACCACTCC-3’；
ORFV-R：5’-CCTTGTCGCCCTTACGATGCT-3’；扩增片段大小为507bp。
通过特异性试验，实验结果见图1～6。由图1～6可知，采用上述6对特异引物对6种病毒进行检测，具有较高的特异性，均无交叉反应；还具有很好的可重复性，同时检测灵敏性高，最小核酸检出量为103copies/μL。
实施例2：蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒和羊口疮病毒的快速检测
1、材料
(1)阳性\阴性对照
阳性对照：携带蓝舌病病毒NS3基因的质粒、携带口蹄疫病毒3D基因的质粒、携带小反刍兽疫疫苗株N基因的质粒和携带绵羊痘病毒全基因119555-119711段的质粒、携带山羊痘病毒全基因110977-111368段的质粒、携带羊口疮病毒011基因的质粒混合物由西北农林科技大学动物医学院兽疫微生物实验室构建保存，公众可从本单位获得，或委托大连宝生物生物有限公司或其它生物有限公司合成。
阴性对照：不含PPRV、BTV、、FMDV、SPPV、GTPV、和ORFV的去离子水。
(2)引物液
表1中引物由大连宝生物生物有限公司合成，不同引物，每管配置成20μM；BTV-F和BTV-R、FMDV-F和FMDV-R、PPRV-F和PPRV-R、SPPV-F和SPPV-R、GTPV-F和GTPV-R、ORFV-F和ORFV-R引物按2：2：2：2：2：2：2：2：3：3：1：1的摩尔比例混合。
表1-多重PCR引物序列
病毒 引物 引物序列(5′-3′) 位置 产物长度
SSPV SSPVF ACTAAACTATTGTGTTACTGA 119555-119576 177bp
SSPVR AACTTCTCATCATCAACATGA 119731-119711
GTPV GTPVF TTTCAAAGCTTTTTGTTAACGTAGG 110977-111001 413bp
GTPVR AAGTGTGCCGACAATAGAATGG 111386-111368
ORFV ORFVF CGAACTCACTTCCACACCACTCC 572-594 507bp
ORFVR CCTTGTCGCCCTTACGATGCT 1078-1058
FMDV FMDVF GGACCGAGAAGTTGATACAGA 1359-1382 130bp
FMDVR CGCAGGTGTAAAGATCTGTAGC 1273-1253
BTV BTVF AGTGTCATGCTATCCGCTGCC 8-29 257bp
BTVR GCGTACATGCAGGATGCGAC 264-245
PPRV PPRVF ATTGTCCACTGAATTATCCTTGAT 1646-1669 687bp
PPRVR TTGTCGACGTTGTAGACCTTGTTG 1006-983
(3)其它试剂：TrizolReagent，5×RTMasterMix、2×PremixTaq，均为商品化试剂，购自大连宝生物生物有限公司；AxygenRNA/DNAMiniKit病毒基因组提取试剂盒购自美国Axygen公司；胶回收试剂盒均购自上海华舜生物技术有限公司；所有试剂分装后作为试剂盒中成份。
2、多重PCR试剂盒操作步骤
(1)一步法提取病毒核酸(DNA和RNA)
按照AxygenRNA/DNAMiniKit(Axygen,SanFrancisco,USA)病毒基因组提取试剂盒操作方法提取病毒基因组，具体操作如下：
①取病毒培养液上清200μL加入1.5mL离心管中，并向离心管中加入200μLbufferV-L,振荡混匀，感作5min。
②加入75μLbufferV-N，振荡混匀，12000r/min离心5min。
③取上清液并移到新的2mL离心管中，加入300μL异丙醇(1％冰乙酸)，颠倒混匀。
④将制备管置于2mL离心管中，将混合液移入制备管中，6000r/min离心1min。弃滤液，加入500μLbufferW1,室温感作1min,12000r/min离心1min。
⑤弃滤液，将制备管插回离心管中，加入800μLbufferW2，12000r/min离心1min.
⑥弃滤液，12000r/min离心1min。
⑦将制备管移入清洁的1.5mL离心管中，在制备管膜中央加入40～60μLbufferTE,室温感作1min,12000r/min离心2min洗脱病毒核酸。
(2)cDNA的合成
利用M-MLV反转录酶试剂盒说明进行反转录，反转录试验，25μL反转录体系如表2。
表2-反转录体系
将上述试剂依次加入到PCR管中，37℃孵育60min进行cDNA的合成，95℃10min灭活M-MLV反转录酶，于4℃冷却，于-20℃保存。
(3)PCR反应
以获得的cDNA和DNA为模板进行扩增，反应体系25uL：2×PremixTaq12.5μL；引物液2.5μL；模板cDNA或者DNA2μL；去离子水8μL。
反应条件：预变性95℃5min；每个循环条件为95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸30s，35个循环；产物末端72℃延伸10min；4℃保存。
(4)琼脂糖凝胶电泳
将PCR反应产物与6倍LoadingBuffer混匀后在2％的琼脂糖凝胶中进行电泳，120V电泳40min后，观察产物条带，结果如图7～9所示。
由图7可知，利用优化好的多重PCR反应条件，对PPRV、BTV、FMDV、SPPV、GTPV和ORFV的克隆质粒混合后进行多重PCR扩增，结果含有PPRV、BTV、FMDVSPPV、GTPV和ORFV的核酸样品均扩增出与试验设计相符的电泳条带，分别为687bp、507bp、413bp、257bp、177bp和130bp，且无其他非特异性条带扩增。由图8可知，在引物终浓度分别为BTV1.0pmol/μL、FMDV1.0pmol/μL、PPRV1.0pmol/μL、SPPV1.0pmol/μL、GTPV1.5pmol/μL、ORFV0.5pmol/μL时，该多重PCR能检测出的最低拷贝数分别为PPRV103copies/μL、BTV103copies/μL、FMDV102copies/μL、SPPV102copies/μL、GTPV103copies/μL、ORFV103copies/μL。由图9可知，在引物终浓度分别为BTV1.0pmol/μL、FMDV1.0pmol/μL、PPRV1.0pmol/μL、SPPV1.0pmol/μL、GTPV1.5pmol/μL、ORFV0.5pmol/μL时，对不同稀释度的质粒在不同时间、PCR仪及不同操作者的条件下，进行多重PCR扩增，三个不同稀释度的病毒核酸在不同条件下均能较好的扩增。
综上，由图7～9可知，当样品中有PPRV存在时，在687bp附近出现特异性条带；当样品中有BTV存在时，在257bp附近出现特异性条带；当样品中SSPV存在时，在177bp附近出现特异性条带；当样品中FMDV存在时，在131bp附近出现特异性条带；当样品中GTPV存在时，在413bp附近出现特异性条带；当样品中ORFV存在时，在507bp附近出现特异性条带。
本发明试剂盒含有可同时检测反刍动物蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒和羊口疮病毒六种病毒的引物，可在各检疫口岸中大量推广。由于本试剂盒引物的特异性非常高，可对这六种病毒唯一检测。因此，若有试剂盒仅包含本发明内容中的一对检测引物时，亦在本发明保护范围内。

Claims (6)

1.一种用于同时检测绵羊和山羊携带的六种病毒的多重PCR试剂盒，其特征在于，所述多重PCR试剂盒包括六对特异性引物，其中，用于蓝舌病病毒检测的引物分别为BTV-F和BTV-R，引物序列分别为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2；用于口蹄疫病毒检测的引物分别为FMDV-F和FMDV-R，引物序列分别为SEQIDNO:3和SEQIDNO:4；用于小反刍兽疫病毒检测的引物分别为PPRV-F和PPRV-R，引物序列分别为SEQIDNO:5和SEQIDNO:6；用于绵羊痘病毒检测的引物分别为SPPV-F和SPPV-R，引物序列分别为SEQIDNO:7和SEQIDNO:8；用于山羊痘病毒检测的引物分别为GTPV-F和GTPV-R，引物序列分别为SEQIDNO:9和SEQIDNO:10；用于羊口疮病毒检测的引物分别为ORFV-F和ORFV-R，引物序列分别为SEQIDNO:11和SEQIDNO:12。
2.根据权利要求1所述的用于同时检测绵羊和山羊携带的六种病毒的多重PCR试剂盒，其特征在于，所述多重PCR试剂盒还包括阳性对照、阴性对照、反转录液、PCR混合液、去离子水。
3.根据权利要求1或2所述的用于同时检测绵羊和山羊携带的六种病毒的多重PCR试剂盒，其特征在于，所述BTV-F、BTV-R、FMDV-F、FMDV-R、PPRV-F、PPRV-R、SPPV-F、SPPV-R、GTPV-F、GTPV-R、ORFV-F、ORFV-R的摩尔比分别为2：2：2：2：2：2：2：2：3：3：1：1。
4.根据权利要求3所述的用于同时检测绵羊和山羊携带的六种病毒的多重PCR试剂盒，其特征在于，所述BTV-F和BTV-R、FMDV-F和FMDV-R、PPRV-F和PPRV-R、SPPV-F和SPPV-R、GTPV-F和GTPV-R、ORFV-F和ORFV-R六对引物在多重PCR扩增时的退火温度为54℃～60℃。
5.根据权利要求4所述的用于同时检测绵羊和山羊携带的六种病毒的多重PCR试剂盒，其特征在于，所述BTV-F和BTV-R、FMDV-F和FMDV-R、PPRV-F和PPRV-R、SPPV-F和SPPV-R、GTPV-F和GTPV-R、ORFV-F和ORFV-R六对引物在多重PCR的扩增的退火温度为55℃。
6.根据权利要求3或4所述的用于同时检测绵羊和山羊携带的六种病毒的多重PCR试剂盒，其特征在于，所述引物BTV-F和BTV-R、FMDV-F和FMDV-R、PPRV-F和PPRV-R、SPPV-F和SPPV-R、GTPV-F和GTPV-R、ORFV-F和ORFV-R在多重PCR反应体系中的终浓度分别为1.0pmol/μL、1.0pmol/μL、1.0pmol/μL、1.0pmol/μL、1.5pmol/μL、0.5pmol/μL。
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