CN103695566A - 用于检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的多重pcr引物、探针和基因芯片 - Google Patents

用于检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的多重pcr引物、探针和基因芯片 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的多重PCR引物、探针和基因芯片，所述多重PCR引物和探针为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列；所述基因芯片包括固相载体、点样质控探针、阳性杂交质控探针、检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的多重PCR引物和对应的探针。本发明采用荧光标记3种病毒的正向引物，在多重RT-PCR的基础上建立动物皮毛中携带3种病毒的基因芯片检测技术，能够高通量、灵敏、特异性检测皮毛中的RNA病毒，一次检测实现3种病毒的同时筛查，改变了原先每种病毒都需要一种特定方法的状况，节约了诊断时间，满足进出境检验检疫部门、进出口皮毛企业大批量进出口皮毛样品快速检测的需求，具有较大的应用价值。

Description

用于检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的多重PCR引物、探针和基因芯片
技术领域
本发明涉及用于检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的多重PCR引物、探针和基因芯片，属于动物病毒检测技术领域。
背景技术
我国已经成为世界上最大的皮毛进口国，进口皮张来源广泛。但是由于各国皮毛动物养殖状况不同，动物疾病的流行情况不同等原因，导致进口皮张存在携带病毒种类繁多、性质差异大等问题。目前，进境皮毛中携带的RNA病毒主要有蓝舌病病毒（Bluetongue virus，BTV）、口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus，FMDV）、牛病毒性腹泻病毒（Bovine viraldiarrhea virus，BVDV）等3种病毒。这些病毒危害严重，通过皮毛传播的风险较高，因此对BTV、FMDV、BVDV等3种病毒进行快速、高通量检测，防止其通过进境皮毛入境，对于保护皮毛产业健康发展具有重要意义。迄今为止，国内外只有零星的几篇对皮毛携带一种或两种的病毒的检测方法的报道。检测方法主要依靠经典的血清学和PCR法，缺少对皮毛携带病毒的高通量检测方法，已经无法适应进出口皮毛快速、大批量的检测要求。
基因芯片（gene chip），又称基因微阵列（gene microarray），是20世纪90年代发展起来的前沿生物技术，该技术可对样品进行快速、准确、高效的检测，具有高通量、多样性、微型化以及自动化等特点，适用于大批量样品的快速诊断。因此开发一种能够快速、准确、高效、灵敏检测BTV、FMDV、BVDV的基因芯片具有重大意义。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种用于检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的多重PCR引物、探针和基因芯片，能够高通量、灵敏、准确检测进口皮毛中携带的RNA病毒。
本发明解决的技术方案是，用于检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的多重PCR引物和探针，所述多重PCR引物和探针为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列；其中，检测蓝舌病病毒的正向引物和反向引物分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，检测蓝舌病病毒的探针为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；检测口蹄疫病毒的正向引物和反向引物分别为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，检测口蹄疫病毒的探针为SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；检测牛病毒性腹泻病毒的正向引物和反向引物分别为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列，检测牛病毒性腹泻病毒的探针为SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。
所述检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的正向引物的5’端标记TAMARA荧光基团。
所述检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的探针的5’端加T碱基补足35bp，并在5’端对探针进行氨基化修饰。
本发明所解决的技术方案还在于提供一种用于检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的基因芯片，所述基因芯片包括固相载体、点样质控探针、阳性杂交质控探针、检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的多重PCR引物和对应的探针；其中，点样质控探针为SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列；阳性杂交质控探针为SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列。
本发明的固相载体可以为带有活性基团的玻璃基片，也可以为本领域常用的其他基片。
本发明检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的方法，包括以下步骤：
（1）检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的多重PCR引物的设计与合成
在NCBI上查找蓝舌病病毒（BTV）、口蹄疫病毒（FMDV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）等3种病毒的基因组序列，并BLAST分析比较，利用Prime5.0软件分别设计3种病毒的引物和探针。每条正向引物的5’端标记TAMARA荧光基团，探针碱基长度小于35bp的探针5’端加T碱基到35bp，并在5’端对探针进行氨基化修饰，引物和探针的合成和标记由宝生物工程（大连）有限公司合成。同时，设计的点样质控探针、阳性杂交质控探针、3种病毒的多重PCR引物和探针的核苷酸序列如下：
（2）基因芯片的制备
使用芯片点样液[博奥（北京）生物有限公司的晶芯
Figure BDA0000456868880000033
基因芯]将BTV、FMDV、BVDV3种病毒的寡核苷酸探针和点样质控探针、阳性杂交质控探针稀释至终浓度为30μmol/L，用SmartArrayerTM48芯片点样仪对购买的空白基片点样，点样矩阵布局见图1，具体为：A行和第1列为点样质控探针，各11个重复点；B行和K行（除第一个点外）为阳性杂交质控探针，各10个重复点；J行（除第一个点外）依次为芯片点样液和空白对照（水）各5个重复点。C行前5个（除第一个点外）探针点为BTV探针，E行前5个（除第一个点外）探针点为FMDV探针，H行前5个探针点（除第一个点外）为BVDV探针。点样完毕将制备的芯片80℃固定探针2h后，4℃保存备用。
（3）多重PCR检测方法的建立
根据病毒核酸提取试剂盒MiniBEST Viral RNA Extraction Kit Ver.4.0的使用说明，分别提取BTV、FMDV和BVDV3种病毒核酸，并以BTV、FMDV和BVDV3种病毒核酸为模板，建立三重RT-PCR方法。
PCR反应体系（25.0μL）：逆转录酶1.0μL，2×Taq PCR MasterMix12.5μL，3种病毒的正、反向引物（20μmol/L）各0.5μL，3种病毒核酸模板各2.0μL，补水至25.0μL。
PCR反应条件：42℃反转录30min；94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min。
（4）芯片的杂交与洗涤
取42℃预热的杂交液8μL（100%甲酰胺3.75μL，20×SSC2.25μL，100g/L SDS0.3μL，50×Denhardt’s1.5μL，纯水0.2μL）与PCR产物7μL混匀；在95℃变性10min，然后迅速冰浴5min，得到杂交样品。参照晶芯基因芯片杂交盒说明将杂交样品点加到基因芯片每个阵列中。在芯片杂交仪中42℃5r/m摇转杂交4h；杂交完毕，在芯片清洗仪中使用洗液Ⅰ（2×SSC，0.2％SDS）42℃振荡洗涤3min，重复3次；洗液Ⅱ（0.2×SSC）洗涤3次；超纯水清洗2次后，300r/m离心甩干后扫描。
（5）芯片结果的扫描与判定
选择cy3激光通道，预热基因芯片扫描仪。置待检测芯片于扫描仪中，使用5μm分辨率，调整激光强度，扫描芯片。当点样质控位点为绿色荧光，阳性杂交质控位点也出现明显的绿色荧光，而芯片点样液和空白对照（水）位点为无荧光信号，判定结果成立。当某种病毒用的检测探针位点出现绿色荧光，判定为检测出该种病毒。
在牛、羊等动物皮毛中携带的RNA病毒主要为蓝舌病病毒（BTV）、口蹄疫病毒（FMDV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）等，其中BTV、FMDV属于动物高风险疫情疫病病毒，通过皮毛及其相关制品传播的风险较高，动物一旦感染，病死率较高，并且极难消除，一旦形成爆发和流行趋势，将对我国畜牧业以及经济发展造成重大影响，同时对家畜和皮毛相关从业人员健康造成重大危害。本发明采用荧光标记3种病毒的正向引物，在多重RT-PCR的基础上建立动物皮毛中携带3种病毒的基因芯片检测技术，能够高通量、灵敏、特异性检测皮毛中的RNA病毒，一次检测实现3种病毒的同时筛查，改变了原先每种病毒都需要一种特定方法的状况，节约了诊断时间，满足进出境检验检疫部门、进出口皮毛企业大批量进出口皮毛样品快速检测的需求，具有较大的应用价值。
附图说明
图1为本发明基因芯片的点样矩阵布局；
图2为本发明基因芯片检测BTV、FMDV、BVDV3种病毒基因芯片的特异性结果；
图3为本发明基因芯片检测送检的2号、26号和32号皮毛样品结果；
图4为市售BTV病毒核酸检测试剂盒检测的2号、26号皮毛样品的结果；其中，
M为100bp DNA Marker；1为皮毛样品2号PCR检测结果；2为皮毛样品26号PCR检测结果；3为阴性对照；
图5为市售FMDV病毒核酸检测试剂盒检测的2号和32号皮毛样品的结果；其中，
M为100bp DNA Marker；1为皮毛样品2号PCR检测结果；2为皮毛样品32号PCR检测结果；3为阴性对照；
图6为市售BVDV病毒核酸检测试剂盒检测的2号皮毛样品的结果；其中，
M为100bp DNA Marker；1为阴性对照；2为皮毛样品2号PCR检测结果。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
毒株为蓝舌病病毒（Bluetongue virus，BTV）、病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）、O型口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus serotype O，FMDV/O）、猪繁殖和呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）HN-2株、禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）HN-1株、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）HN-5株，均由河南出入境检验检疫局技术中心微生物实验室保存。
主要试剂：MasterMix Taq酶、TIANscript M-MLV逆转录酶、100bp DNA Marker，购自天根生化科技（北京）有限公司；DNA MakerⅠ，购自北京索莱宝科技有限公司；MiniBEST病毒核酸提取试剂盒、pMDTM18-T Vector试剂盒，购于宝生物工程（大连）有限公司；蓝舌病病毒（BTV）、通用型口蹄疫病毒（FMDV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）核酸检测试剂盒购于广州维伯鑫生物科技有限公司；晶芯
Figure BDA0000456868880000051
基因芯片点样液、光学级氨基基片等购买于博奥（北京）生物有限公司。
实施例1本发明基因芯片的特异性分析
（1）检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的多重PCR引物的设计与合成
在NCBI上查找蓝舌病病毒（BTV）、口蹄疫病毒（FMDV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）等3种病毒的基因组序列，3种病毒的靶基因序列如下：
BTV的靶基因序列：
ATCCGGGCTGATCCAAAGGTTCGAGGAAGAAAAAATGAAACATAATCAGGATAGAGTTGAGGAATTGAGTTTAGTGCGTGTGGATGATACCATTTCTCAACCACCAAGATATGCTCCAAGTGCGCCGATGCCATCATCTATGCCGACGGTTGCCCTTGAAATACTGGACAAAGCGATGTCAAACACAACTGGTGCAACGCAAACACAGAAGGCGGAGAAGG
FMDV的靶基因序列：
TGGGACCATACAGGAGAAGTTGATCTCCGTGGCAGGACTCGCCGTCCATTCTGGACCCGACGAGTACCGGCGTCTCTTTGAGCCCTTCCAAGGCCTCTTTGAGATTCCAAGCTACAGATCACTTTACCTGCGTTGG
BVDV的靶基因序列：
GTGGTGAGTTCGTTGGATGGCTGAAGCCCTGAGTACAGGGTAGTCGTCAGTGGTTCGACGCTTTGGACGTCAAGCCTCGAGATGCCACGTGGACGAGGGCATGCCCACAGCACATCTTAACCTGGACGGGGGTCGTTCAGGTGAAAACGGTTTAACCAACCGCTACGAATACAGCCTGATAGGGTGCTGCAGAGGCCCACTGTATTGCTACTGA
BLAST分析比较3种病毒序列，利用Prime5.0软件分别设计3种病毒的引物和探针。每条正向引物的5’端标记TAMARA荧光基团，探针碱基长度小于35bp的探针5’端加T碱基到35bp，并在5’端对探针进行氨基化修饰，引物和探针的合成和标记由宝生物工程（大连）有限公司合成。同时，设计的点样质控探针、阳性杂交质控探针、3种病毒的多重PCR引物和探针的核苷酸序列如下：
Figure BDA0000456868880000061
（2）基因芯片的制备
使用芯片点样液[博奥（北京）生物有限公司的晶芯
Figure BDA0000456868880000062
基因芯]将BTV、FMDV、BVDV3种病毒的寡核苷酸探针和点样质控探针、阳性杂交质控探针稀释至终浓度为30μmol/L，用SmartArrayerTM48芯片点样仪对购买的空白基片点样，每张基片设12个矩阵，每个矩阵为11×11阵列，点样矩阵布局见图1，具体为：A行和第1列为点样质控探针，各11个重复点；B行和K行（除第一个点外）为阳性杂交质控探针，各10个重复点；J行（除第一个点外）依次为芯片点样液和空白对照（水）各5个重复点。C行前5个（除第一个点外）探针点为BTV探针，E行前5个（除第一个点外）探针点为FMDV探针，H行前5个探针点（除第一个点外）为BVDV探针。点样完毕将制备的芯片80℃固定探针2h后，4℃保存备用。
（3）多重PCR检测方法的建立
根据病毒核酸提取试剂盒MiniBEST Viral RNA Extraction Kit Ver.4.0的使用说明，分别提取BTV、FMDV、BVDV、PRRS、AIV、NDV6种病毒核酸，并以这6种病毒核酸为模板，进行PCR扩增，其PCR产物分别与制备的基因芯片杂交，观察、记录结果。
PCR反应体系（25.0μL）：逆转录酶1.0μL，2×Taq PCR MasterMix12.5μL，3种病毒的正、反向引物（20μmol/L）各0.5μL，模板2.0μL，补水至25.0μL。
PCR反应条件：42℃反转录30min；94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min。
（4）芯片的杂交与洗涤
取42℃预热的杂交液8μL（100%甲酰胺3.75μL，20×SSC2.25μL，100g/L SDS0.3μL，50×Denhardt’s1.5μL，纯水0.2μL）分别与6种病毒的PCR产物7μL混匀；在95℃变性10min，然后迅速冰浴5min，得到杂交样品。参照晶芯基因芯片杂交盒说明将15μL杂交样品点加到基因芯片每个阵列中。在芯片杂交仪中42℃5r/m摇转杂交4h；杂交完毕，在芯片清洗仪中使用洗液Ⅰ（2×SSC，0.2％SDS）42℃振荡洗涤3min，重复3次；洗液Ⅱ（0.2×SSC）洗涤3次；超纯水清洗2次后，300r/m离心甩干后扫描。
（5）芯片结果的扫描与判定
选择cy3激光通道，预热基因芯片扫描仪。置待检测芯片于扫描仪中，使用5μm分辨率，调整激光强度，扫描芯片。结果发现，点样质控位点为绿色荧光，阳性杂交质控位点也出现明显的绿色荧光，而芯片点样液和空白对照（水）位点为无荧光信号，结果成立。同时，扩增的BTV、FMDV和BVDV的PCR产物在相应的检测探针位点出现绿色荧光信号，而其他PRRS、AIV、NDV等病毒的PCR产物未出现杂交信号，见图2，因此可以证明，各病毒探针之间无交叉反应，本发明制备的基因芯片具有很强的特异性。
实施例2本发明基因芯片的灵敏性分析
（1）构建3种病毒的质粒
根据病毒核酸提取试剂盒MiniBEST Viral RNA Extraction Kit Ver.4.0的使用说明，分别提取BTV、FMDV、BVDV3种病毒核酸，并以这3种病毒核酸为模板，参照实施例1的方法进行PCR扩增。回收目的PCR产物，TA克隆于pMD18-T质粒。挑选阳性重组体，使用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ进行单、双酶切鉴定，并进行序列测定。
（2）基因芯片检测
用微量核酸蛋白仪分别测定提取的BTV、FMDV、BVDV等3种病毒重组质粒浓度，分别为124.08ng/μL（1.5×1011copies/mL）、78.53ng/μL（1.0×1011copies/mL）、160.74ng/μL（2.0×1011copies/mL），用超纯水做100倍梯度稀释，共做5个稀释度，以10-2-10-10稀释度核酸为模板进行芯片检测，参照实施例1的方法进行PCR扩增，然后与制备的基因芯片杂交（基因芯片的点样矩阵布局同实施例1），研究基因芯片的敏感性。结果表明，病毒基因芯片可检测到BTV、FMDV、BVDV阳性杂交信号核酸最低浓度分别约为20copies数、10copies数和20copies数。
应用实施例
使用本发明的基因芯片方法对送检的151份皮毛样品进行检测，同时使用市售的BTV、FMDV、BVDV商品化病毒核酸检测试剂盒平行诊断，将其结果与病毒基因芯片检测结果进行比较。具体如下：
1、皮毛中病毒核酸的提取
参照MiniBEST核酸提取试剂盒说明书提取皮毛样品中病毒RNA。
2、基因芯片方法检测
三重RT-PCR扩增提取的皮毛样品病毒RNA，采用25.0μL反应体系：逆转录酶1.0μL，2×Taq PCR MasterMix12.5μL，正、反向引物各（20μmol/L）0.5μL，模板2.0μL，补水至25.0μL。三重RT-PCR反应条件为：42℃反转录30min；94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min。取42℃预热的杂交液（100%甲酰胺3.75μL，20×SSC2.25μL，100g/L SDS0.3μL，50×Denhardt’s1.5μL，纯水0.2μL）8μL与PCR产物7μL混匀，95℃变性10min，迅速冰浴5min。参照晶芯
Figure BDA0000456868880000081
基因芯片杂交盒说明，将杂交样品点加到基因芯片每个阵列中（基因芯片的点样矩阵布局同实施例1）。在芯片杂交仪中42℃、5r/m摇转杂交4h。杂交完毕，在芯片清洗仪中使用洗液Ⅰ（2×SSC，0.2％SDS）42℃振荡洗涤3min，重复3次；洗液Ⅱ（0.2×SSC）洗涤3次；超纯水清洗2次后，300r/m离心甩干后扫描。
3、结果
对151份皮毛样品的检测结果表明，基因芯片检测2号皮毛样品为BTV、FMDV和BVDV阳性，26号皮毛样品为BTV阳性，32号皮毛样品芯片为FMDV阳性，具体见图3，其他结果为阴性。该结果和市售的BTV、FMDV、BVDV商品化病毒核酸检测试剂盒结果一致，采用商品化核酸检测试剂盒检测的2号、26号和32号皮毛样品的结果见图4、5、6。因此可以证明，本发明的基因芯片3种RNA病毒检测方法与市售的商业化试剂盒检测符合率为100％，适用于进出境皮毛的快速筛检。
Figure IDA0000456868960000011
Figure IDA0000456868960000021
Figure IDA0000456868960000041

Claims (4)

1.用于检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的多重PCR引物和探针，其特征在于，所述多重PCR引物和探针为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列；其中，检测蓝舌病病毒的正向引物和反向引物分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，检测蓝舌病病毒的探针为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；检测口蹄疫病毒的正向引物和反向引物分别为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，检测口蹄疫病毒的探针为SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；检测牛病毒性腹泻病毒的正向引物和反向引物分别为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列，检测牛病毒性腹泻病毒的探针为SEQID NO.9所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的多重PCR引物和探针，其特征在于，所述检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的正向引物的5’端标记TAMARA荧光基团。
3.根据权利要求1所述的多重PCR引物和探针，其特征在于，所述检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的探针的5’端加T碱基补足35bp，并在5’端对探针进行氨基化修饰。
4.一种用于检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的基因芯片，其特征在于，所述基因芯片包括固相载体、点样质控探针、阳性杂交质控探针、检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的多重PCR引物和对应的探针；其中，点样质控探针为SEQ IDNO.10所示的核苷酸序列；阳性杂交质控探针为SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列。
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