CN108588275A - Btv-10型、20型、23型基因型分型的多重rt-pcr试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Btv-10型、20型、23型基因型分型的多重rt-pcr试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于蓝舌病病毒(BTV)10型、20型、23型基因分型的多重RT‑PCR试剂盒及其检测方法，用于单管同时鉴别检测蓝舌病病毒10型、20型、23型。本方法根据蓝舌病各基因型病毒VP2基因序列保守区设计了3对PCR特异性引物来构建多重RT‑PCR方法。利用优化的多重PCR体系及条件，可单管同时鉴别检测这3种基因型中的一种或多种，对BTV其它基因型及PPRV、FMDV核酸无特异性扩增，最低检测浓度可达到pg级。本发明建立了一种灵敏度高、特异性强、节时省力并且易于观察结果的RT‑PCR方法用于鉴别检测BTV‑10型、20型、23型。

Description

BTV-10型、20型、23型基因型分型的多重RT-PCR试剂盒及其检 测方法
技术领域
本发明属于分子生物学检测方法及检测试剂领域，PCR技术领域。具体而言，具体涉及蓝舌病病毒(BTV)10型、20型、23型多重RT-PCR检测用试剂盒和检测方法。
背景技术
蓝舌病(Bluetongue，BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属成员蓝舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)引起的，以昆虫为传播媒介的反刍动物的一种非接触性传染病，分布广泛，除南极洲外的各个大洲都发生蓝舌病的报道。BTV能感染大多数反刍动物，以绵羊最易感，且表现典型的临床症状，牛及山羊多为隐性感染，没有明显症状，但可长期带毒，野生动物及骆驼也可感染该病。由于病羊发病死亡，或即使不死，但其生产性能严重下降(如产肉产奶量下降，胎儿畸形、羊毛破坏、羔羊发育不良等)，造成巨大的经济损失，且严重影响国际贸易，OIE将其列为法定通报疫病，我国将其列为一类动物传染病。BTV血清型众多，已经被证实的有27个，分别以BTV1-27命名，各血清型之间交叉保护性低，混合感染的情况也时常出现，故对病毒分型亦很有必要。目前适用的检测方法主要有病毒分离培养、琼脂糖免疫扩散试验、血清中和试验(VNT)、ELISA、抗原捕获ELISA、RT-PCR、qRT-PCR及基因芯片技术。除VNT外均不能对病毒分型，而VNT虽能分型，但耗时长，成本过高，且对用于检测的血清质量要求高，不适合常规检测。国内外学者对病毒的分型做了相关研究，但只能单管对一型病毒分型，单管高通量对多型病毒分型的方法还未见报道。BTV-10、20、23型主要存在于欧洲、美洲及大洋洲的一些国家和南非，印度也有发生，而且在有的国家呈现优势血清型。我国目前还未有BTV-10、20型病毒的报道，但我国每年都从美国、澳大利亚等进口牛、羊或其产品，对蓝舌病病毒的检测很有必要。1995年，在我国云南峨山曾发现1株BTV-23，近年来未见发生。我国与世界各国有牛羊及其产品贸易，对蓝舌病的检测非常重要，以预防病毒传入或传出。多重PCR是一种利用多条特异性引物在同一PCR反应体系中同时扩增出多个核酸片段的方法，具有操作简单、快速、特异性好和敏感性高等有点。
发明内容
本发明的目的是提供一种灵敏度高、特异性强、节时省力并且易于观察结果的多重RT-PCR试剂盒和检测方法用于同时鉴别检测蓝舌病病毒(BTV)10型、20型、23型。
为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：BTV-10型、20型、23型在同一RT-PCR反应体系中进行特异性扩增。
BTV-10型、20型、23型基因型分型鉴别多重RT-PCR试剂盒，包括Mix Primer管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，所述Mix Primer管由以下引物组成：
序列为SEQ ID NO.1的20μmol/L的BTV-10上游引物1μL；
序列为SEQ ID NO.2的20μmol/L的BTV-10下游引物1μL；
序列为SEQ ID NO.3的20μmol/L的BTV-20上游引物0.2μL；
序列为SEQ ID NO.4的20μmol/L的BTV-20下游引物0.2μL；
序列为SEQ ID NO.5的20μmol/L的BTV-23上游引物0.2μL；
序列为SEQ ID NO.6的20μmol/L的BTV-23下游引物0.2μL；
合计2.8μL，为单次反应的用量。
所述阳性对照管：管内为BTV-10、BTV-20、BTV-23阳性重组质粒混合物。阳性重组质粒由如下步骤获得：分别以如下引物组：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQID NO.4，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，按常规RT-PCR扩增，分别将PCR目的产物与PMD19-T载体进行连接，转化到DH5α后扩大培养提取质粒，并PCR鉴定、测序和NCBI-BLAST比对获得。
所述阴性对照管：管内为无BTV-10、BTV-20、BTV-23牛肉肌肉组织DNA样品。
所述灭菌去离子水管：500μL。
用所述试剂盒进行BTV-10、BTV-20、BTV-23多重RT-PCR检测方法,步骤如下：
(1)待测样品模板制备：按照商品化病毒RNA提取试剂盒提取待测样品全基因组，获得待检模板；
(2)PCR扩增反应体系：宝生物一步法反转录试剂盒(TaKaRa PrimeScriptTM OneStep RT-PCR kit)中的2X 1step Buffer 12.5μL，primeScript 1step Enzyme Mix 1μL，本试剂盒中的Mix Primer 2.8μL，灭菌去离子水5.7μL，待检模板或阳性对照或阴性对照3μL，反应总体积为25μL；
(3)PCR扩增反应条件：50℃ 30min，94℃ 5min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 5min。
(注：反应体系中所用的宝生物一步法反转录PCR试剂盒中的试剂在具体应用中可由其它商品化一步法反转录PCR试剂盒的相关试剂及用量代替，引物用量，反应总体积与本试剂盒所述保持不变；反应条件中，反转录一步跟随所用的反转录试剂盒要求，其余条件不变)
(4)结果判定：PCR产物经2％琼脂糖凝胶100V 40min电泳后，阳性对照在293bp(BTV-20)、356bp(BTV-23)、696bp(BTV-10)处出现3条带，阴性对照无条带出现，样品在阳性对照位置相同的位置出现条带则判定为该基因型阳性，无条带出现则判定为该基因型阴性；阳性质控未出现目的条带或阴性对照出现条带，则结果无效。
本发明的原理是：针对BTV-10型、20型、23型VP2型特异性基因的保守序列设计特异性强、退火温度相似、彼此无互补或互补性很小的3对特异性引物，对PCR体系及反应条件优化，筛选出能把这三型病毒都扩增良好的方法。BTV的基因组中，VP3、VP7等都高度保守，VP5变异较小，VP2基因在不同型之间变异最大，是型特异性抗原，但在不同地区同一型病毒的VP2也存在高达30％的变异性，故在设计引物时，既对不同型的VP2基因序列进行比对，也对多个地区同型BTV的VP2基因序列进行比对,设计多对待选引物一一验证，最终选出合适的引物。
多重PCR是一种利用多条特异性引物在一PCR反应体系中同时扩增出多个核酸片段的方法，具有操作简单、快速、特异性和敏感性高等优点，在动物病原诊断中被广泛应用。避免了传统方法(病理解剖、病原分离、血清学方法等)操作繁琐，费时费力，敏感性低等问题。
本发明的优点是(1)单管可检测3中血清型，省时，省成本；(2)快速、高效：检测时间在3h左右；(3)高特异性：对这3型病毒外的其它BTV型及痘病毒、口蹄疫病毒均无扩增；(4)灵敏度高：最低检测浓度为BTV-101.70×103copies/μL，BTV-20 1.38×103copies/μL，BTV-23 1.32×103copies/μL；(5)不需要昂贵的分析仪器，对试验人员要求不高。
附图说明
图1引物优化结果；图中，M：DL2000 DNA相对分子质量标准；1～5分别为：BTV-10引物浓度(μM)均为0.8，BTV20、23引物终浓度(μM)依次均为0.8、0.64、0.48、0.32、0.16；6：阴性对照；
图2温度优化结果；图中，M：DL2000 DNA相对分子质量标准；1～6分别表示：退火温度依次为55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃；7.阴性对照；
图3多重RT-PCR扩增结果；图中，M:DNA分子质量标准；1：BTV-10+20+23；2：BTV-10；3：BTV-20；4：BTV-23；5：阴性对照；
图4特异性试验结果；图中，M:DNA分子质量标准；1～4：模板依次为BTV-10+BTV-20+BTV-23、BTV-10、BTV-20、BTV-23；5～13：模板依次为BTV-1～BTV-9；14～22：模板依次为BTV-11～BTV-19；23：BTV-21；24：BTV-22；25～28：模板依次为BTV-24～BTV-27；
图5敏感性试验结果；图中，M：DNA分子质量标准；1～10：χ×(109～100)copies/μL质粒模板；11：阴性对照；
图6组内重复试验；图中，M:DNA分子质量标准；1～3：χ×105copies/μL模板；4～6：χ×104copies/μL模板；7～9：χ×103copies/μL模板；10：阴性对照；
图7组间重复试验；图中，M:DNA分子质量标准；1～10：χ×(109～100)copies/μL质粒模板；11：DEPC水阴性对照。
具体实施方式
下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明技术的应用不限于以下实施例。
实施例1，引物的设计合成
根据Genbank网站上公布的BTV10型、20型、23型病毒的VP2基因序列利用PrimerPremier 5.0生物软件设计PCR引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6，送往华大基因合成。引物序列如下：
实施例2，阳性重组质粒构建
按照TaKaRa Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit试剂盒提取病毒RNA。分别用各特异性引物按PrimeScriptTM One Step RT-PCR kit扩增；按照OMEGA GelEetraction Kit试剂盒说明书回收目的片段，将其连接至PMD19-T载体并转化至DH5a，增菌后按试剂盒AXGYEN AxyPreP Plasmid Minippep kit提取质粒，并进行PCR鉴定，PCR阳性质粒送往华大基因测序，测序结果在NCBI中比对，比对正确即为阳性质粒。利用分光光度计对阳性重组质粒进行浓度测定，并计算拷贝数。
实施例3多重RT-PCR构建及优化
将三种阳性重组质粒均稀释成1.0×109copies/μL，取等量混匀，以该混合物及单质粒为模板构建体系，并进行引物浓度的优化(BTV20、23引物终浓度范围为0.16μmol/L、0.32μmol/L、0.48μmol/L、0.64μmol/L及0.8μmol/L，BTV10引物终浓度为0.8μmol/L)及退火温度优化(55～60℃)。最终以三种病毒的核酸为模板，用一步法试剂盒PrimeScriptTM OneStep RT-PCR kit按上述优化好的引物浓度及退火温度对该方法进行验证。
参考图1的结果显示，BTV-10引物终浓度为0.8μmol/L，BTV-20、23引物终浓度为0.16μmol/L时3种血清型均扩增良好。
参考图2的结果显示：退火温度为56℃时扩增最好。
参考图3的结果显示：用一步法验证该方法能扩增出相符的目的条带。
实施例4特异性试验
以3种病毒及3种病毒混合物及BTV其它型型病毒、小反刍兽疫病毒PPRV、口蹄疫病毒的基因组作模板，用上述实施例3优化建立好的方法进行扩增。
参考图4的结果显示：该方法所建立的三重RT-PCR方法只对BTV-10型、20型、23型病毒模板有特异性扩增，而对BTV其它型、小反刍兽疫病毒、口蹄疫病毒无特异扩增。
实施例5敏感性试验
将测定好浓度的三种阳性质粒进行10倍稀释，组成χ×(10n～100)copies/μL共n+1个浓度梯度，以各浓度为模板，按实施例3的方法进行扩增，测定该方法的敏感性。
参考图5的结果显示:该方法最低检测浓度为BTV-10 1.70×103copies/μL，BTV-20 1.38×103copies/μL，BTV-23 1.32×103copies/μL。
实施例6多重PCR重复性试验
选取χ×105～3copies/μL 3个浓度的模板，每个模板进行三次重复，作为组内重复试验；将不同批次提取的质粒按敏感性试验方法扩增，进行2次重复，作为组间重复。
参考图6的结果显示：组内重复结果良好。
参考图7的结果显示：组间重复结果良好。
实施例8试剂的制备
Mix Primer管：20μmol/L的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2各1μL，20μmol/L的SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6各0.2μL，共2.8μL为单次反应的量，每个试剂盒供足做50个反应的量≧130μL。
阳性对照管：按实施例2的方法制备阳性质粒，把各型病毒的阳性质粒均稀释为108copies/μL,取等体积混匀，每管装155μL。
阴性对照管：用试剂盒提取无BTV-10、BTV-20、BTV-23的牛肉肌肉组织DNA样品，用灭菌去离子水稀释至浓度为15～20ng/μL,每管装155μL。
灭菌去离子水管：每管500μL。
实施例9试剂盒的组装
如实施例8所配制的Mix Primer管、阳性对照管、阴性对照管、灭菌去离子水管各1支，贴上生产日期、有效期及产品标签，低温保存及运输。
SEQUENCE LISTING
<110> 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120> BTV-10型、20型、23型基因型分型的多重RT-PCR试剂盒及其检测方法
<160> 6
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ ID NO.1
ttatcaggtt gggacgca 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ ID NO.2
tgagttgttt ctttaggc 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ ID NO.3
aaatcgtgag cgaagtgg 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ ID NO.4
ggcagcaatg gcaatgag 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ ID NO.5
ggcgacaaca tggcttac 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ ID NO.6
gggtgcgtta taggaaca 18

Claims (4)

1.BTV-10型、20型、23型基因型分型的多重RT-PCR试剂盒，其特征是：包括Mix Primer管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，所述Mix Primer管由以下引物组成：
DNA序列为SEQ ID NO.1的20μmol/L的BTV-10上游引物1μL；
DNA序列为SEQ ID NO.2的20μmol/L的BTV-10下游引物1μL；
DNA序列为SEQ ID NO.3的20μmol/L的BTV-20上游引物0.2μL；
DNA序列为SEQ ID NO.4的20μmol/L的BTV-20下游引物0.2μL；
DNA序列为SEQ ID NO.5的20μmol/L的BTV-23上游引物0.2μL；
DNA序列为SEQ ID NO.6的20μmol/L的BTV-23下游引物0.2μL；
合计2.8μL，为单次反应的用量；
所述阳性对照管：管内为BTV-10、BTV-20、BTV-23阳性重组质粒混合物；
所述阴性对照管：管内为无BTV-10、BTV-20、BTV-23牛肉肌肉组织DNA样品；
所述灭菌去离子水管：500μL。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于：所述阳性重组质粒由如下步骤获得：分别以如下引物组：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，按常规RT-PCR扩增，分别将PCR目的产物与PMD19-T载体进行连接，转化到DH5α后扩大培养提取质粒，并PCR鉴定、测序和NCBI-BLAST比对获得。
3.根据权利要求1或2所述述试剂盒，其特征在于：将BTV-10、BTV-20、BTV-23置于同一PCR反应管中进行特异性扩增，根据扩增片段的大小，将这3种基因型进行鉴别与区分。
4.利用权利要求1或2或3所述试剂盒进行BTV-10、BTV-20、BTV-23多重RT-PCR非疾病诊断目的的检测方法：包括如下步骤：
(1)待测样品模板制备：按照商品化病毒RNA提取试剂盒提取待测样品全基因组，获得待测模板；
(2)PCR扩增反应体系：TaKaRa PrimeScriptTM One Step RT-PCR kit中的2X 1stepBuffer 12.5μL，primeScript 1step Enzyme Mix 1μL，本试剂盒中的Mix Primer 2.8μL，灭菌去离子水5.7μL，待检模板或阳性对照或阴性对照3μL，反应总体积为25μL；
(3)PCR扩增反应条件：50℃30min，94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min；
(4)结果判定：PCR产物经2％琼脂糖凝胶100V 40min电泳后，阳性对照在293bp、356bp、696bp处出现3条带，分别为为BTV-20、BTV-23、BTV-10，阴性对照无条带出现，样品在阳性对照位置相同的位置出现条带则判定为该基因型阳性，无条带出现则判定为该基因型阴性；阳性质控未出现目的条带或阴性对照出现条带，则结果无效。
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