CN110438264A - 利用二重实时荧光定量rt-pcr检测猪流行性腹泻病毒和b型猪肠道病毒的方法 - Google Patents

利用二重实时荧光定量rt-pcr检测猪流行性腹泻病毒和b型猪肠道病毒的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及利用二重实时荧光定量RT‑PCR检测猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的方法。本发明提供用于猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的二重实时荧光定量RT‑PCR检测的引物和探针组，以及包含该引物和探针组的检测试剂盒和检测方法。该方法的检测特异性高、重复性好、灵敏度高，同时具有操作简便，检测时间短等优势，可实现对猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的鉴别诊断和排除检测，在猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的快速检测中具有较高的应用价值。

Description

利用二重实时荧光定量RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒和B型 猪肠道病毒的方法
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及用于二重实时荧光定量RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的特异性引物和探针，本发明还涉及利用该特异性引物、探针进行二重实时荧光定量RT-PCR检测或鉴别猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的方法和试剂盒。
背景技术
随着养猪业的发展，仔猪腹泻对养猪业造成的危害严重，引起仔猪腹泻的原因有病毒性、细菌性、饲料因素和环境因素等，其中，病毒性腹泻对仔猪的危害尤为严重，病毒性腹泻致病原的早期快速鉴别诊断对成功治疗和预防疾病的爆发至关重要。
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的以猪呕吐、急性水样腹泻、脱水以及仔猪的高死亡率为临床特征的一种接触性的肠道传染病。PEDV可以感染各个年龄阶段的猪，对1周龄以内的仔猪感染最为严重，在无母源抗体保护情况下，发病率100％，死亡率为90-100％，给世界各国养猪业带来巨大经济损失。
猪肠道病毒(Porcine enteroviruses,PEVs)属于小核糖核酸病毒科，可引起猪的消化道疾病、神经系统疾病、繁殖障碍和表皮损伤等病症，在英国、匈牙利、韩国和中国均有分离到该病毒的报道。依据病毒致细胞病变(Cytopathic effect,CPE)和血清学试验特性，肠道病毒可分为3个群。B型猪肠道病毒Ch-SDbz-W2Y毒株(保藏编号为CGMCC No.10405)属于III型细胞病变群，该毒株也可致哺乳仔猪发生腹泻、呕吐等症状，并导致死亡，与PEDV具有非常相似的临床症状，仅仅依靠临床解剖无法进行鉴别诊断，因此需要开发实验室快速检测方法进行辅助确诊。
实时荧光PCR检测技术已经广泛应用到各个研究领域，具有操作简单、敏感性高、特异性强、可实现多通道快速检测等优点，是动物疾病快速检测的首选方法。目前，已经建立PEDV的实验室检测方法，包括普通PCR和荧光定量PCR方法。然而国内外还未见有PEDV与PEV-B鉴别诊断的实验室方法。
发明内容
本发明的目的在于提供用于二重实时荧光定量RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的特异性引物和探针，以及具有高度特异性和灵敏度、可重复性好的猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的检测方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
在数据库中检索并下载猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的基因组序列，基于序列分析和比对结果筛选在不同的猪流行性腹泻病毒之间具有高度保守性以及在B型肠道病毒不同毒株之间具有高度保守性且具有B型特异性的序列作为检测的靶序列，最终确定以PEDV的N基因片段和PEV-B的5’-UTR片段为靶序列。根据上述靶序列分别设计特异性引物和探针，经大量筛选和人工优化获得序列如SEQ ID NO.1-4所示的特异性引物，该引物可单独或配合序列如SEQ ID NO.5-6所示的探针实现特异高效的荧光定量RT-PCR扩增，基于此，本发明开发了PEDV和PEV-B的二重实时荧光定量RT-PCR检测方法。
具体地，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供用于猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的二重实时荧光定量RT-PCR检测的引物组，所述引物组包含2对特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-4所示。
上述特异性引物中，针对猪流行性腹泻病毒的特异性引物序列如SEQ ID NO.1-2所示，针对B型猪肠道病毒的特异性引物序列如SEQ ID NO.3-4所示。
SEQ ID NO.1：PEDV-F：5’-GGCAATAATAATAACAATAACAAGTC-3’；
SEQ ID NO.2：PEDV-R：5’-ACCTTGACAGCAGCCACCA-3’；
SEQ ID NO.3：PEV-B/F：5’-AGCCATAGGACGCCATTTC-3’；
SEQ ID NO.4：PEV-B/R：5’-CGAGTGCTCCGTGGTTAG-3’。
上述特异性引物能够高效特异地结合猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的靶序列，在同一个PCR体系中相互之间不会产生干扰，能够保证二重实时荧光定量RT-PCR检测的特异性和灵敏度。
本发明还提供与序列如SEQ ID NO.1-4所示的引物组配套使用的探针组，所述探针组包含2条探针，其核苷酸序列如SEQ IDNO.5-6所示。
上述探针中，针对猪流行性腹泻病毒的探针如SEQ ID NO.5所示，针对B型猪肠道病毒的探针序列如SEQ ID NO.6所示。
SEQ ID NO.5：PEDV-P：5’-CMAGTCCAAGARCAGRAACCAGTCAAATG-3’；
SEQ ID NO.6：PEV-B/P：5’-TATTGAGCTAGTTGGTAGTCCTCCGG-3’。
上述特异性引物和探针配合使用能够高效特异地结合猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的靶序列，在同一个PCR体系中相互之间不会产生干扰，能够更好地促进二重实时荧光定量RT-PCR检测的特异性和灵敏度的提高。
本发明提供用于猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的二重实时荧光定量RT-PCR检测的引物探针组合，其包含2对特异性引物和2条探针；所述特异性引物的序列如SEQ IDNO.1-4所示，所述探针的序列如SEQ ID NO.5-6所示。
优选地，所述探针的5’端标记的荧光基团为选自FAM、HEX、CY5、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX中的任一种；所述探针的3’端标记的淬灭基团为选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl中的任一种。
更优选地，如SEQ ID NO.5所示的探针的5’端标记的荧光基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为BHQ1；如SEQ ID NO.6所示的探针的5’端标记的荧光基团为HEX，3’端标记的淬灭基团为BHQ1。
第二方面，本发明提供所述引物组和/或所述探针组在制备用于猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒检测的试剂盒中的应用。
第三方面，本发明提供所述引物组和/或所述探针组在用于猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒检测或鉴别中的应用。
第四方面，本发明提供一种猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的检测试剂盒，其包含序列如SEQ ID NO.1-4所示的引物组。
优选地，所述检测试剂盒还包含序列如SEQ ID NO.5-6所示的探针组。
更优选地，所述检测试剂盒还包含一步法RT-PCR反应液、酶混合液、无核酸酶纯化水、阳性对照和阴性对照中的一种或多种。
所述一步法RT-PCR反应液包含如下组分：50mM Tris-HCl，70mM KCl，350μM dNTP，5mM MgCl2，0.15mg/ml BSA，3％甘油，pH 8.3。
所述阳性对照可以为灭活的PEDV毒株和PEV-B毒株。
所述阳性对照的制备可采用常规方法，例如：将vero细胞培养至单层，分别接种PEDV和PEV-B毒株，在PEDV毒株的培养液中加入终浓度为3μg/mL胰酶，至72h时后，细胞出现聚集、融合形成合胞体等典型细胞病变，细胞病变率达80％左右时，冻融收集细胞毒，8000rpm离心10min，分别收集上清后，将上清进行1:1混合，在80℃进行热灭活30min，8000rpm离心10min，收集上清，即得。
所述阴性对照可以为高压灭菌处理DEPC水。
更优选地，所述检测试剂盒在工作时的反应程序如下：50℃10min；95℃、2min；95℃、5s，57℃、10s，72℃、10s，采集荧光信号，40个循环。
更优选地，所述检测试剂盒在工作时的25μL反应体系如下：2×RT-PCR反应液12.5μL，酶混合液1μL，引物探针混合液1μL，待检测RNA模板2μL、无核酸酶纯化水8.5μL；所述引物探针混合液包含10μM引物混合液和5μM探针混合液；所述酶混合液包含逆转录酶和DNA聚合酶。
第五方面，本发明提供一种猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的二重实时荧光定量RT-PCR检测方法，包括：以待测样品中的病毒RNA为模板，利用序列如SEQ ID NO.1-4所示的引物组和序列如SEQ ID NO.5-6所示的探针组，或者利用所述检测试剂盒进行二重实时荧光定量RT-PCR检测，根据扩增曲线和/或Ct值判断检测结果。
本发明的二重实时荧光定量RT-PCR检测方法可实现一步法荧光定量PCR检测。
所待测样品可以为细胞培养物、腹泻样品、肠组织研磨物等。
所述待测样品中的病毒RNA可采用本领域常规技术手段经提取制备得到。
本发明经优化确定了最佳的二重实时荧光定量RT-PCR的检测反应体系和反应程序。
优选地，所述二重实时荧光定量RT-PCR的反应程序如下：50℃10min；95℃、2min；95℃、5s，57℃、10s，72℃、10s，采集荧光信号，40个循环。
所述二重实时荧光定量RT-PCR的反应结果的检测通道根据探针的荧光基团标记确定，例如，当猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的探针分别采用FAM和HEX标记时，反应结果在FAM、HEX两个通道进行检测。
优选地，所述二重实时荧光定量RT-PCR的反应体系如下：2×RT-PCR反应液12.5μL，酶混合液1μL，引物探针混合液1μL，待检测RNA模板2μL、无核酸酶纯化水8.5μL；所述引物探针混合液包含10μM引物混合液和5μM探针混合液；所述酶混合液包含逆转录酶和DNA聚合酶。
作为本发明的优选方案，所述猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的二重实时荧光定量RT-PCR检测方法包括如下步骤：
(1)检测样本的制备
取疑似感染样本(细胞培养物、腹泻样品、肠组织研磨物等)于8000r/min离心5分钟，取上清，用商品化的RNA/DNA快速提取试剂盒进行总核酸物质的提取；
(2)二重实时荧光定量RT-PCR反应体系的建立和扩增
取荧光定量PCR反应管，加入2×RT-PCR反应液12.5μL，酶混合液1μL，引物探针混合液1μL，待检测RNA模板2μL、无核酸酶纯化水8.5μL，建立二重实时荧光定量RT-PCR的反应体系；所述引物探针混合液包含10μM引物混合液(SEQ ID NO.1-4)和5μM探针混合液(SEQID NO.5-6)；所述酶混合液包含逆转录酶和DNA聚合酶。
二重实时荧光定量RT-PCR的反应条件为：50℃、10min；95℃、2min；95℃、5s，57℃、10s，72℃、10s，采集FAM、HEX荧光信号，进行40个循环；
(3)检测结果判定
反应结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果，结果判断依据如下：阴性对照无Ct值或Ct值>38，并且无扩增曲线；阳性对照Ct值<30，并出现典型扩增曲线；若检测样品扩增反应的Ct值≤35且扩增曲线良好，则直接判定为阳性；若检测样品扩增反应的Ct值大于35且小于38，重复检测一次，若Ct值仍大于35且小于38，则判定为阳性；若检测样品扩增反应的Ct值≥38，则判定为阴性。
基于上述技术方案，本发明实现的有益效果至少包括：
(1)特异性高、重复性好、灵敏度高：本发明通过对靶序列的特异选择以及特异性引物和探针的筛选和人工优化，得到的引物探针组合能够实现高效特异的二重实时荧光定量RT-PCR扩增。在特异性方面，本发明的检测方法仅对PEDV和PEV-B能够进行扩增，对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、圆环病毒(PCV2)、蓝耳病毒(PRRSV)、乙脑病毒(JEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)均无法扩增；在重复性方面，对阳性样品检测结果的重复性100％，批内和批间检测的变异系数均小于5％；在灵敏度方面，本发明的检测方法较常用商品化PEV-B一步法RT-PCR检测试剂盒和商品化PEDV一步法RT-PCR检测试剂盒的敏感性高出100倍；
(2)操作简便，省时省力：本发明的PEDV和PEV-B检测方法可结合商品化的核酸快速提取试剂盒、一步法RT-PCR试剂使用，直接对待测样本中提取的病毒RNA进行检测，能够在1h内完成检测，与常规的RT-PCR检测方法相比具有操作简便，省时省力的优势；
(3)可实现鉴别检测：本发明的PEDV和PEV-B检测方法在一个检测循环后，可实现对PEDV和PEV-B的鉴别诊断，也可实现PEDV和PEV-B的排除检测，为疫病的有效临床诊疗提供技术支持，在PEDV和PEV-B的快速检测中具有较高的应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例3中PEDV和PEV-B的二重实时荧光定量RT-PCR的扩增曲线图；其中，A为PEDV的荧光定量RT-PCR扩增曲线图；B为PEV-B的荧光定量RT-PCR扩增曲线图。
图2为本发明实施例5中PEDV和PEV-B的二重实时荧光定量RT-PCR检测方法对PEDV的检测敏感性分析结果图；其中A为PEDV不同稀释梯度模板的扩增曲线图；B为PEDV不同稀释梯度模板采用商品化PEDV一步法RT-PCR检测试剂盒的检测结果。
图3为本发明实施例5中PEDV和PEV-B的二重实时荧光定量RT-PCR检测方法对PEV-B的检测敏感性分析结果图；其中，A为PEV-B不同稀释梯度模板的扩增曲线图；B为PEV-B不同稀释梯度模板采用商品化PEV-B一步法RT-PCR检测试剂盒的检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 用于PEDV和PEV-B检测的特异性引物和探针的设计
本发明在完成了B型猪肠道病毒Ch-SDbz-W2Y株(已于2015年03月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址：中国.北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号：CGMCC No.10405，分类命名：B型猪肠道病毒，Porcine enterovirus B)全基因组测序的基础之上，对该病毒株的各个基因(5’UTR，3’UTR，VP4，VP3，VP2，VP1，2A，2B，2C，3A，3B，3C，3D)与GenBank中已经录入的不同类型的肠道病毒(GenBank登陆号：Y14459(PEV-9，UKG)、AF363455(PEV-10，LP54)、HM131607(PEV-9，Ch-ah-f1)、JQ818253(PEV-B，KOR)、HQ702854(PEV-3H，K23)、AF363453(PEV-9，UKG)的核苷酸同源性进行分析。序列分析结果表明，在5’UTR和3’UTR基因序列的同源性较高，分别在85.5-93％和87-97％之间，相对较为保守；进一步分析表明，选取5’UTR为引物设计靶序列区域较为适合，既兼顾了B型猪肠道病毒的保守区域，又可与其它相关病毒加以区分，在5’UTR基因的前、中、后段分别设计不同的引物进行筛选。同时，本发明从数据库下载不同PEDV毒株的基因组序列，通过比对分析确定以PEDV的N基因作为检测靶标，并依据分析结果在N基因的前、中、后段分别设计引物进行筛选。为提高检测的特异性、灵敏度，实现高效的二重实时荧光定量RT-PCR检测，本发明针对引物、探针与靶序列的亲和力、引物之间的二级结构以及引物与靶序列之间的二级结构、引物的GC含量、Tm值、长度和扩增片段长度等进行了大量人工优化设计和筛选。最终获得了如SEQ ID NO.1-6所示的效果最优的引物和探针组合。
以下为本发明设计的大量候选引物和探针的部分罗列及效果说明。
表1 针对PEDV、PEV-B设计的特异性引物/探针的部分列举
注：上述探针中，Y代表T或C，M代表A或C，R代表A或G；PEDV的探针的5’端标记FAM，3’端标记BHQ1；PEV-B的探针的5’端标记HEX，3’端标记BHQ1。
在进行引物的初步筛选中，通过构建分别含有B型猪肠道病毒5’UTR基因和猪流行性腹泻病毒N基因的重组质粒子，并计算出相应每微升体积含有的拷贝数，进行引物的敏感性和特异性检测，确定最优引物。实验结果如表2、表3、表4和表5所示，结果表明，表1中列举的引物均具有很好的特异性，但是，针对PEV-B的引物和探针中，PEV-B/F(R/P)、PEDV/F(R/P)引物(探针)组的敏感性最高；针对PEDV的引物和探针中，PEV-B/F(R/P)、PEDV/F(R/P)引物(探针)组的敏感性最高。
表2 PEV-B引物/探针的敏感性检验结果
注：“+”表示结果为阳性；“-”表示结果为阴性；“Unde”表示未检测到荧光信号。
表3 PEV-B引物/探针的特异性检验结果
注：“+”表示结果为阳性；“-”表示结果为阴性；“Unde”表示未检测到荧光信号。
表4 PEDV引物/探针的敏感性检验结果
注：“+”表示结果为阳性；“-”表示结果为阴性；“Unde”表示未检测到荧光信号。
表5 PEDV引物/探针的特异性检验结果
注：“+”表示结果为阳性；“-”表示结果为阴性；“Unde”表示未检测到荧光信号。
实施例2 PEDV和PEV-B的检测试剂盒
本实施例提供用于PEDV和PEV-B的二重实时荧光定量RT-PCR检测的试剂盒，该试剂盒包含以下组分：2×RT-PCR反应液、酶混合液(包含逆转录酶和DNA聚合酶)、引物探针混合液(引物PEDV-F、PEDV-R、PEV-F及PEV-R的浓度均为10μM，探针PEDV-P和PEV-P浓度均为5μM)、无核酸酶纯化水、阳性对照和阴性对照。
其中，2×RT-PCR反应液、酶混合液均为宝生物工程(大连)有限公司(产品代码RR064A)的商品化市购产品。
阳性对照为灭活的PEDV毒株和Ch-SDbz-W2Y毒株的细胞培养上清，其制备方法如下：将vero细胞培养至单层，分别接种PEDV和PEV-B的Ch-SDbz-W2Y毒株，在PEDV毒株的培养液中加入终浓度为3μg/mL胰酶，至72h时后，细胞出现聚集、融合形成合胞体等典型细胞病变，细胞病变率达80％左右时，冻融收集细胞毒，8000rpm离心10min，分别收集上清后，将上清进行1:1混合，在80℃进行热灭活30min，8000rpm离心10min，收集上清，即得。
阴性对照为高压灭菌处理的DEPC水。
该检测试剂盒的组成(50T/盒)及保存条件如表6所示，该检测试剂盒的有效期为12个月。
表6 检测试剂盒的组成及保存条件
实施例3 PEDV和PEV-B的二重实时荧光定量RT-PCR检测方法
本实施例提供一种PEDV和PEV-B的二重实时荧光定量RT-PCR检测方法，具体如下：
(1)检测样本的制备
取疑似感染样品(细胞培养物、腹泻样品、肠组织研磨物等)，8000r/min离心5分钟，取上清，用商品化的RNA/DNA快速提取试剂盒进行总核酸物质的提取。
(2)二重实时荧光定量RT-PCR的反应体系建立和扩增
以步骤(1)提取得到的核酸作为检测模板，采用实施例1筛选得到的序列如SEQ IDNO.1-6所示的引物和探针进行二重实时荧光定量RT-PCR检测：
取荧光定量PCR反应管，加入2×RT-PCR反应液12.5μL、酶混合液(包含逆转录酶和DNA聚合酶)1μL、引物探针混合液(引物PEDV-F、PEDV-R、PEV-F及PEV-R的浓度均为10μM，探针PEDV-P和PEV-P浓度为5μM)1μL、待检测模板2μL、无核酸酶纯化水8.5μL，得到反应体系；
二重实时荧光定量RT-PCR的反应条件为：50℃、10min；95℃、2min；95℃、5s，57℃、10s，72℃、10s(收集FAM、HEX荧光信号)，进行40个循环。
(3)二重实时荧光定量RT-PCR检测结果的判定
反应结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果，结果判断依据如下：阴性对照无Ct值或Ct值>38，并且无扩增曲线；阳性对照Ct值<30，并出现典型扩增曲线；若检测样品扩增反应的Ct值≤35且扩增曲线良好，则直接判定为阳性；若检测样品扩增反应的Ct值大于35且小于38，重复检测一次，若Ct值仍大于35且小于38，则判定为阳性；若检测样品扩增反应的Ct值≥38，则判定为阴性。
利用上述方法检测PEDV和PEV-B的阳性结果的扩增曲线如图1所示。
实施例4 检测方法的特异性分析
采用实施例2的检测试剂盒和实施例3提供的PEDV和PEV-B的二重实时荧光定量RT-PCR检测方法，分别以PEDV、PEV-B(Ch-SDbz-W2Y株)、TGEV、RV、PRV、PCV2、PRRSV、JEV、CSFV为模板，对该方法的特异性进行评估。
实验结果显示，在FAM通道，只有PEDV样品呈阳性扩增反应，而其它病毒对照均无扩增曲线形成，呈阴性反应；在HEX通道，只有PEV-B样品呈阳性扩增反应，而其它病毒对照均无扩增曲线形成，呈阴性反应；表明本发明提供的PEDV和PEV-B的二重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒和检测方法具有较高的特异性，与其它病毒样品无交叉反应。
实施例5 检测方法的敏感性分析
将PEDV和PEV-B(Ch-SDbz-W2Y株)抗原(含有病毒抗原的细胞培养上清液)作10倍梯度稀释，分别采用实施例2的检测试剂盒配合实施例3的二重实时荧光定量RT-PCR检测方法以及商品化的PEV-B一步法RT-PCR检测试剂盒(购于山东绿都生物科技有限公司，批号20190412)和商品化的PEDV一步法RT-PCR检测试剂盒(购于山东绿都生物科技有限公司，批号20190518)进行扩增，对该方法的敏感性进行评估。
结果显示，针对PEDV和PEV-B，实施例3的二重实时荧光定量RT-PCR检测方法较常用的商品化一步法RT-PCR检测试剂盒的灵敏度均高出100倍(如图2和图3所示)，说明本发明提供的二重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒和检测方法具有较高的检测灵敏度。
实施例6 检测方法的变异性分析
分别采用实施例5制备的等量的4份不同浓度梯度的样品作为模板，利用实施例2的检测试剂盒配合实施例3提供二重实时荧光定量RT-PCR检测方法进行扩增，每份模板每个浓度做3个重复，以确定该方法的批内差异；在不同的时间段对4份不同浓度梯度的模板进行3次实时荧光RT-PCR试验，以确定该方法的批间差异。
结果如表7所示，批内变异试验结果显示，变异系数在0.20％～2.15％，批间变异试验结果显示，变异系数在1.10％～2.18％，均小于5％，表明本发明提供的二重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒和检测方法的重复性良好。
表7 变异性试验分析结果
实施例7 临床样品的检测
采用实施例2的检测试剂盒配合实施例3的二重实时荧光定量RT-PCR检测方法，对保存的60份腹泻临床样品进行检测，并设置阴性对照(高压灭菌处理的DEPC水)和阳性对照(灭活的PEDV毒株和Ch-SDbz-W2Y毒株的细胞培养上清)。
结果显示，仅检测到PEDV的临床样品共计42份，检出率为70％(42/60)，仅检测到PEV-B的临床样品共计14份，检测率为23.3％(14/60)，PEDV和PEV-B均检测到的临床样品共计4份，检出率为6.7％(4/60)。
将相同的临床样本采用商品化的PEV-B一步法RT-PCR检测试剂盒(购于山东绿都生物科技有限公司，批号20190412)和商品化的PEDV一步法RT-PCR检测试剂盒(购于山东绿都生物科技有限公司，批号20190518)进行检测，PEDV检出率为66.7％(40/60)，PEV-B检出率为26.7％(16/60)；本发明提供的PEDV和PEV-B的二重荧光定量PCR检测试剂盒与常用商品化一步法RT-PCR检测试剂盒的的符合率分别为93.3％和96.7％，并且本发明提供的PEDV和PEV-B的二重荧光定量PCR检测试剂盒的检出率要高于商品化一步法RT-PCR检测试剂盒。结果表明，本发明提供的二重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒和检测方法可应用于临床检测应用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 深圳市康百得生物科技有限公司
山东省滨州畜牧兽医研究院
<120> 利用二重实时荧光定量RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的方法
<130> KHP191113906.1
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggcaataata ataacaataa caagtc 26
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<210> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cmagtccaag arcagraacc agtcaaatg 29
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<400> 7
gatcgtggcc gcaaacgggt 20
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tgctggtcct tattcccctt attag 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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cttgtttcac aggtggatgc att 23
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cttctttcta tggggttttg cattc 25
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cacggtcgcc cgtggggta 19
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tagtaacatc aaagatctgt ct 22

Claims (10)

1.用于猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的二重实时荧光定量RT-PCR检测的引物组，其特征在于，所述引物组包含2对特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-4所示。
2.与权利要求1所述的引物组配套使用的探针组，其特征在于，所述探针组包含2条探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示。
3.根据权利要求2所述的探针组，其特征在于，所述探针的5’端标记的荧光基团为选自FAM、HEX、CY5、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX中的任一种；所述探针的3’端标记的淬灭基团为选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl中的任一种。
4.权利要求1所述的引物组或权利要求2或3所述的探针组在制备用于猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒检测的试剂盒中的应用。
5.一种猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的检测试剂盒，其特征在于，其包含权利要求1所述的引物组；
优选地，所述检测试剂盒还包含权利要求2或3所述的探针组。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包含一步法RT-PCR反应液、酶混合液、无核酸酶纯化水、阳性对照和阴性对照中的一种或多种。
7.根据权利要求5或6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒在工作时的反应程序如下：50℃ 10min；95℃、2min；95℃、5s，57℃、10s，72℃、10s，采集荧光信号，40个循环；
所述检测试剂盒在工作时的25μL反应体系如下：2×RT-PCR反应液12.5μL，酶混合液1μL，引物探针混合液1μL，待检测RNA模板2μL、无核酸酶纯化水8.5μL；
所述引物探针混合液包含10μM引物混合液和5μM探针混合液；所述酶混合液包含逆转录酶和DNA聚合酶。
8.一种猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的二重实时荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，包括：提取待测样品中的病毒RNA，以所述病毒RNA为模板，利用权利要求1所述的引物组和权利要求2或3所述的探针组，或者利用权利要求5或6所述的检测试剂盒进行二重实时荧光定量RT-PCR检测，根据扩增曲线和/或Ct值判断检测结果。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述二重实时荧光定量RT-PCR的反应程序如下：50℃ 10min；95℃、2min；95℃、5s，57℃、10s，72℃、10s，采集荧光信号，40个循环。
10.根据权利要求8或9所述的检测方法，其特征在于，所述二重实时荧光定量RT-PCR的反应体系如下：2×RT-PCR反应液12.5μL，酶混合液1μL，引物探针混合液1μL，待检测RNA模板2μL、无核酸酶纯化水8.5μL；
所述引物探针混合液包含10μM引物混合液和5μM探针混合液；所述酶混合液包含逆转录酶和DNA聚合酶。
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