CN109554491A - 一种鉴别检测羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫的试剂及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可鉴别检测羊巴贝斯虫未定种及莫氏巴贝斯虫的试剂和方法。本发明的试剂包括有SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5的五条人工序列。本发明首次使用套式PCR，多重PCR进行组合，将两种PCR的优点集中于一个方法，且通过技术优化，克服了两种方法的缺点，将反应体系于PCR仪中一步法两个反应过程完成。本发明克服了传统的病原学检测方法难于区分巴贝斯虫种类和敏感性低、操作繁琐、检测成本高等缺点，具有检测速度快、有较高的特异性、灵敏度和可重复性，使用步骤简单的优点，适合于生产实践中临床动物或传播媒介蜱体内羊巴贝斯虫的鉴别检测和大规模的分子流行病学调查。

Description

一种鉴别检测羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫的试剂及 方法

技术领域

本发明涉及一种用于鉴别检测羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫的试剂，以及非疾病检测目的的鉴别检测羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫的方法。

背景技术

巴贝斯虫是一类寄生于动物和人红细胞内的隶属于顶复门（Apicomplexa）、孢子虫纲（Sporozoea）、梨形虫目（Piroplasmida）、巴贝斯科（Babesiidae）、巴贝斯属（Babesia）的蜱传性血液原虫。到目前为止，世界范围内报道的巴贝斯虫共有100 多个种，目前被报道并命名的感染羊的巴贝斯虫主要有莫氏巴贝斯虫（B. motasi ）、绵羊巴贝斯虫（B. ovis）、粗糙巴贝斯虫（B. crassa）、叶状巴贝斯虫（B. foliata）和泰氏巴贝斯虫（B. taylori）。绵羊巴贝斯虫和莫氏巴贝斯虫的传播媒介分别为扇头蜱（Rhipicephalus）和血蜱（Haemaphysalis）属的蜱种，其他巴贝斯虫的传播媒介尚不清楚。莫氏巴贝斯虫的不同地理分离株生物学特性存在较大差异，根据致病性的不同，目前的观点是其至少包含两个种或亚种（Uilenberg, 2006）。

动物感染巴贝斯虫后即患巴贝斯虫病（babesiosis），该病又被称为蜱传热、红尿热等，严重危害着畜牧业的发展。巴贝斯虫病的潜伏期为4～15 d，一旦感染巴贝斯虫病，病畜主要表现为高热、贫血、黄疸、血红蛋白尿、消瘦、器官衰竭、甚至死亡。我国羊巴贝斯虫病最早报道于20 世纪80 年代，首先发现于四川和黑龙江省，此后又相继在河南、山西、甘肃和云南等省被发现。中国农业科学院兰州兽医研究所先后从河北、辽宁、甘肃、新疆和湖北等地分离到了9 株羊巴贝斯虫，通过分子分类学和生物学特性研究表明这些巴贝斯虫可以分为2个种，即莫氏巴贝斯虫（Babesia. Motasi Bm）和巴贝斯虫未定种 (Babesia sp.Bsp) (Guan et al., 2002,2009; Liu et al., 2007; Niu et al., 2009)。而莫氏巴贝斯虫不同分离株又可分为两个亚种，代表株分别为临潭/天祝株和宁县/河北株(Bai etal. 2002; Guan et al. 2002; Liu et al.,2007b; Niu et al. 2009a)。莫氏巴贝斯虫（Babesia. motasi）是引起我国羊巴贝斯虫病的主要病原，专一性感染羊，实验性感染健康羊后，在血涂片上能检测到虫体，在自然条件下有病例发生；而羊巴贝斯虫未定种在自然条件下未有病例发生的报道。实验条件下，健康动物感染后虽然用分子检测技术可以检测到病原，但在血涂片上检测不到虫体。2012-2013年间，Guan等和Wang等利用莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫未定种的可溶性虫体抗原建立的ELISA方法，对我国22个省份羊巴贝斯虫病的流行状况进行调查，结果显示在这22个省份中莫氏巴贝斯虫的平均阳性率为43.5%（Guanet al. 2012a），羊巴贝斯虫未定种的为31.66%（Wang et al. 2013）。这些结果表明羊巴贝斯虫病在我国普遍流行，严重危害我国养羊业的健康持续发展。

建立快速、灵敏、准确、操作方便的检测方法，以配合该病的防控计划的实施，是控制该病在我国的流行的先决条件。现阶段羊巴贝斯虫病的检测技术主要有血涂片显微镜镜检、酶联免疫吸附试验（ELISA）和以聚合酶链反应（PCR）为代表的分子生物学检测技术等。在临床上，根据临床症状和流行病学可对巴贝斯虫病做出初步诊断，如患病动物是否表现高热、贫血、血红蛋白尿等症状，发病季节、地点和是否有蜱叮咬史等流行病学数据，但确诊必须查到病原。确诊该病常用的诊断方法主要借助显微镜进行形态学观察，该方法常作为该病诊断的金标准方法。但在带虫期和感染初期，由于染虫率较低，血涂片中很难查到虫体，加之各种巴贝斯虫在形态上较为相似，涂片制作、染色过程中易造成虫体变形，所以常导致难于进行羊巴贝斯虫种的鉴定，非长期从事该病研究的人员很难确认出其为何种巴贝斯虫。以间接荧光抗体试验（IFTA）和ELISA为代表的血清学检测方法只能对血清抗体进行检测，不能反映宿主的实时感染状况，也不适用于媒介蜱感染情况的检测。

发明内容

本发明针对我国现有羊巴贝斯虫分子检测方法需要多次操作检测来区分不同巴贝斯虫种类的缺点，为了提高检测效率、缩短检测时间和节约检测成本，提供一种用于鉴别检测羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫的试剂，以及非疾病检测目的的鉴别检测羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫的方法。

本发明的鉴别检测羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫的试剂中包括有序列分别为 SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5的五条人工序列。

为方便使用，本发明的鉴别检测羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫的试剂中还有：上样缓冲液，TAE缓冲液，琼脂糖凝胶。

优选地，本发明的鉴别检测羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫的试剂中还有：标准羊巴贝斯虫未定种阳性基因组DNA，标准莫氏巴贝斯虫临潭亚种基因组DNA，标准莫氏巴贝斯虫河北亚种基因组。

本发明用于非疾病检测目的鉴别检测的羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫的方法是：自待检样品中提取基因组DNA，将DNA样品与PCR反应预混缓冲液水和本发明试剂中的扩增引物混匀，在PCR仪中进行扩增，反应分两个过程进行，然后扩增产物在1%琼脂糖凝胶中电泳并观察，根据扩增产物片段的位置及大小即可确认被检样本中是否感染羊巴贝斯虫未定种、莫氏巴贝斯虫。

本发明是一种套式+多重PCR试剂及检测方法。以PCR、多重PCR、巢式PCR（nestedPCR）、LAMP、RLB、实时荧光定量PCR（Real-time PCR）为代表的分子生物学检测方法，因具有操作简单、灵敏度高、特异性强、重复性好、快速等优点，常被作为牛羊和媒介蜱体内病原检测的方法，用于该病的诊断和流行病学调查。套式PCR 在传统PCR 方法的基础上，设计内、外2 对特异性引物，通过2 轮扩增，提高了检测的特异性和敏感性。多重PCR在一个PCR反应管中就可以快速、特异的鉴别检测同一份样本中感染多种巴贝斯虫的种类。因此本发明将套式PCR与多重PCR进行组合，建立套式+多重PCR检测试剂及检测方法。

本发明以巴贝斯虫AMA1基因为检测标识，设计羊巴贝斯虫未定种、莫氏巴贝斯虫LZ亚种和莫氏巴贝斯虫NB亚种六个虫株的全覆盖外部通用引物，羊巴贝斯虫未定种、莫氏巴贝斯虫特异的多重PCR引物，可用于检测和区分羊巴贝斯虫未定种、莫氏巴贝斯虫。

本发明实际上是一种采用套式+多重PCR扩增技术建立的区分巴贝斯虫种类的分子检测方法。套式+多重PCR是在同一PCR管中加入一对羊巴贝斯虫通用引物，两对特异性引物和多个DNA模板，第一过程通用引物可以全覆盖与羊巴贝斯虫靶标分子AMA1基因结合，两对特异引物可以特异性的分别与其对应虫种的靶标分子模板反应，在一个PCR反应中同时扩增多个目标DNA分子，从而实现在同一样本中同时鉴别检测多种微生物的目的。相比其他分子检测技术，该方法操作简单、快速，不仅具有高效性，而且节约成本，适用于病原的快速检测，使其很快成为科研、临床诊断的热点技术。目前，国内可鉴别检测羊巴贝斯虫未定种、莫氏巴贝斯虫的PCR方法均存在一定的缺陷，敏感性低或不能特异性的区分特定的虫种，本发明则较好地解决现有技术存在的问题。本发明的利用顶复门寄生虫入侵宿主细胞过程中的参与虫体入侵和黏附宿主细胞功能的AMA1蛋白基因为鉴别检测两种巴贝斯虫的靶标基因，该基因在种内高度保守相似性为89.5%-100%，两个种种间差异较大，种间相似性为62.2%-62.8%。本发明准确利用该基因的这一特点，设计通用引物和特异性鉴别检测这两种寄生虫感染的套式+多重PCR引物，该引物只能特异性的检测到对应的巴贝斯虫种，未能检测到感染牛，羊的其他梨形虫和无浆体，且灵敏度较高。从而提供了一种快速、灵敏、准确、操作方便的可在一个PCR管中同时鉴别检测羊巴贝斯虫种类的方法，为羊巴贝斯虫的流行病学调查和临床诊断提供技术支持。从现有技术层面分析，目前，国内尚无这样优化的进行鉴别检测羊巴贝斯虫的套式+多重PCR方法。本发明中，所用的特异性引物是基于羊的这两种巴贝斯虫AMA1蛋白基因的保守区与变异区设计的，这一点恰好体现了所选的靶标基因在种间差异性较大的特点。通过对该方法条件的优化，使本发明具有良好的特异性、敏感性和重复性，可用于羊和传播媒介蜱体内不同种羊巴贝斯虫的快速鉴别检测。

附图说明

图1为本发明的套式PCR通用引物反应性评价结果。其中M为DNA标准分子量DL2000,1、羊巴贝斯虫未定种新疆株基因组，2、羊巴贝斯虫未定种敦煌株基因组，3、莫氏巴贝斯虫临潭株基因组，4、莫氏巴贝斯虫天祝株基因组，5、莫氏巴贝斯虫河北株基因组，6、莫氏巴贝斯虫宁县株基因组，7、阴性对照。

图2为本发明的多重PCR巴贝斯虫未定种引物特异性评价结果。其中M为DNA标准分子量DL2000,1羊巴贝斯虫未定种新疆株的基因组DNA，2莫氏巴贝斯虫临潭株的基因组DNA，3莫氏巴贝斯虫河北株的基因组DNA，4尤氏泰勒虫；5吕氏泰勒虫；6绵羊无浆体；7牛无浆体；8双芽巴贝斯虫；9牛巴贝斯虫；10大巴贝斯虫；11环形泰勒虫；12中华泰勒虫；13：阴性对照。

图3本发明的多重PCR莫氏巴贝斯虫引物特异性评价结果。其中M为DNA标准分子量DL2000,1羊巴贝斯虫未定种新疆株的基因组DNA，2莫氏巴贝斯虫临潭株的基因组DNA，3莫氏巴贝斯虫河北株的基因组DNA，4尤氏泰勒虫；5吕氏泰勒虫；6绵羊无浆体；7牛无浆体； 8双芽巴贝斯虫；9牛巴贝斯虫；10大巴贝斯虫；11环形泰勒虫；12中华泰勒虫；13：阴性对照。

图4本发明的多重PCR引物反应性评价结果。其中M为DNA标准分子量DL2000,1、羊巴贝斯虫未定种基因组，2、莫氏巴贝斯虫基因组，3、羊巴贝斯虫未定种、莫氏巴贝斯虫混合基因组。

图5本发明的套式+多重PCR特异性评价结果。其中M为DNA标准分子量DL2000,1羊巴贝斯虫未定种新疆株的基因组DNA，2莫氏巴贝斯虫临潭株的基因组DNA，3莫氏巴贝斯虫河北株的基因组DNA，4尤氏泰勒虫；5吕氏泰勒虫；6绵羊无浆体；7牛无浆体； 8双芽巴贝斯虫；9牛巴贝斯虫；10大巴贝斯虫；11环形泰勒虫；12中华泰勒虫；13：阴性对照。

图6本发明的套式+多重PCR的敏感性评价结果。其中M为DNA标准分子量DL2000,1：羊巴贝斯虫未定种新疆株；2：莫氏巴贝斯虫临潭株；3,4,5,6,7,8,9,10,11：羊巴贝斯虫未定种新疆株、莫氏巴贝斯虫临潭株混合基因组浓度分别为1ng/μL 、750 pg/μL、500 pg/μL、250 pg/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、0.1pg/ul阴性对照。

具体实施方式

以下提供本发明的具体实施方式，本发明的检测方法在200μL的PCR管中进行，所用引物和试剂如下：

（1）通用性引物

羊巴贝斯虫未定种, 莫氏巴贝斯虫的通用正向和反向引物：

Babesia-F 5' AGCCCTCGATACAGGGGTTT 3'（SEQ ID No.1）

Babesia-R 5' GGCAGCCTCTCCCCAGAT 3'（SEQ ID No.2）

扩增的目的片段大小为1310bp。

(2)羊巴贝斯虫未定种特异性正向和反向引物：

Bsp-F：5' GAACAAGGTCAATTAACAAATATTCC 3'（SEQ ID No.3）

Bsp-R: 5' GGCATCGTAGTGTTTGGTGG 3'（SEQ ID No.4）

扩增的目的片段大小为253bp。

(3)莫氏巴贝斯虫的特异性正向和反向引物：

Babesia-F 5' AGCCCTCGATACAGGGGTTT 3'（SEQ ID No.1）

Bm-R：5' CGTATTCGTACTTGCTCATTAGCC 3'（SEQ ID No.5）

扩增的目的片段大小为1230bp。

（4）标准羊巴贝斯虫未定种阳性基因组DNA（30 ng/μL）。

（5）标准莫氏巴贝斯虫临潭亚种基因组DNA（30 ng/μL）。

（6）标准莫氏巴贝斯虫河北亚种基因组DNA（30 ng/μL）。

（7）PCR用水（同时作为阴性质控标准品）。

（8）预混PCR反应缓冲液PreMix Taq（2×）。

（9）10×上样缓冲液（0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青、40%的蔗糖水溶液）。

（10）1×TAE缓冲液（0.04M的Tris-乙酸，0.001M的EDTA）。

（11）1%琼脂糖凝胶（50mL1×TAE缓冲液中加入0.5g琼脂糖，加热融化并冷却到大约60℃后加入溴化乙锭或其他核酸染色试剂）。

具体操作方法和套式+多重PCR引物反应性评价：

套式+多重PCR反应体系为25μL：PreMix Taq（2×）12.5μL，两条通用引物Babesia-F 2μL、Babesia-R 1μL，三条特异性引物各1μL（其中Bsp-F/Bsp-R和Bm-R的终浓度为1μM），基因组DNA模板2μL（阳性对照反应管中加入两种巴贝斯虫基因组DNA混合物，每种巴贝斯虫基因组DNA的终浓度为2ng/μL）,PCR用水4.5μL。将上述反应液混匀后在PCR仪中进行扩增，一个反应，两个过程，第一个过程，通用引物Babesia-F、Babesia-R与模板DNA充分反应，扩增条件为：94℃预变性3min，然后94℃ 30s、55℃ 40s、72℃ 1.5min，扩增10个循环；第二个过程主要由特异引物与对应虫种模板DNA充分反应，并且进行种的区分，扩增条件为：94℃预变性5min，然后94℃ 30s、63℃ 30s、72℃ 1min，扩增34个循环，72℃延伸10min，最后12℃保存。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶（含0.5μg/mL溴化乙锭或其他核酸染色试剂）电泳，紫外凝胶成像仪中观察扩增结果。结果如图4至图6所显示。

图4中，1：羊巴贝斯虫未定种新疆株；2：莫氏巴贝斯虫临潭株；3：羊巴贝斯虫未定种新疆株和莫氏巴贝斯虫临潭株混合基因组，得到的目的条带大小分别为1230bp和253bp，与预期结果相符。另外通过序列测定分析结果显示，混合基因组反应管中扩增出的两条条带的序列分别对应于羊巴贝斯虫未定种、莫氏巴贝斯虫AMA1蛋白基因的序列，与原序列相似性为100%，表明该套式+多重PCR的引物反应性的良好。

图5结果表明，该方法具有较好的特异性，只特异的与羊的两种巴贝斯虫反应，而与牛巴贝斯虫、牛羊泰勒虫和牛羊无浆体均不反应，因此本发明的试剂及方法可用于鉴别检测感染我国羊的两种巴贝斯虫。

图6的结果显示，当加入的两种巴贝斯虫基因组DNA浓度大于10pg/μL时，可扩增出对应的两个条带，即该方法可检测到3种巴贝斯虫的最低基因组DNA量为10pg，对应的染虫率为0.0001%（Guan et al.,2008）。结果表明该多重PCR方法具有较高的敏感性，可用于生产实践中临床动物的紧急诊断和田间鉴别检测这两种羊巴贝斯虫的流行病学调查。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种鉴别检测羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫的试剂及方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列 羊巴贝斯虫未定种莫氏巴贝斯虫的通用正向引物(Babesia-F)

<400> 1

agccctcgat acaggggttt 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列 羊巴贝斯虫未定种莫氏巴贝斯虫的通用反向引物(Babesia-R)

<400> 2

ggcagcctct ccccagat 18

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列 羊巴贝斯虫未定种特异性正向引物(Bsp-F)

<400> 3

gaacaaggtc aattaacaaa tattcc 26

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列 羊巴贝斯虫未定种特异性正向引物(Bsp-R)

<400> 4

ggcatcgtag tgtttggtgg 20

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列 莫氏巴贝斯虫的特异性反向引物(Bm-R)

<400> 5

cgtattcgta cttgctcatt agcc 24

Claims (4)

1.一种鉴别检测羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫的试剂，其特征在于其中包括有序列分别为 SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5的五条人工序列。

2.根据权利要求1所述的鉴别检测羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫的试剂，其特征在于所述的试剂中还有：上样缓冲液，TAE缓冲液，琼脂糖凝胶。

3.根据权利要求1所述的鉴别检测羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫的试剂，其特征在于的试剂中还有：标准羊巴贝斯虫未定种阳性基因组DNA，标准莫氏巴贝斯虫临潭亚种基因组DNA，标准莫氏巴贝斯虫河北亚种基因组。

4.用于非疾病检测目的鉴别检测的羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫的方法，其特征在于自待检样品中提取基因组DNA，将DNA样品与PCR反应预混缓冲液水和本发明试剂中的扩增引物混匀，在PCR仪中进行扩增，反应分两个过程进行，然后扩增产物在1%琼脂糖凝胶中电泳并观察，根据扩增产物片段的位置及大小确定被检样本中是否感染羊巴贝斯虫未定种、莫氏巴贝斯虫。